JP5728228B2 - 臓器、組織、臓器細胞、組織細胞、および細胞培養物の保存のための、グロビン、グロビンプロトマー、または細胞外ヘモグロビンの使用方法 - Google Patents
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Description
〔技術分野〕
本発明は、少なくとも１種のグロビン、および／または、少なくとも１種のグロビンプロトマー、および／または、少なくとも１種の天然に細胞外のネイティブヘモグロビンの、臓器、組織、または臓器細胞、組織細胞、もしくは細胞培養物の保存のための、使用方法に関する。
本発明は、少なくとも１種のグロビン、および／または、少なくとも１種のグロビンプロトマー、および／または、少なくとも１種の天然に細胞外のネイティブヘモグロビンの、臓器、組織、または臓器細胞、組織細胞、もしくは細胞培養物の保存のための、使用方法に関する。
〔背景技術〕
環形動物は、それらが持つ細胞外ヘモグロビンのために、よく研究されてきた(Terwilliger, Molecular structure of the extracellular heme proteins, Vol. 13, C.P. Mangum (Ed.), 193-229, Springer-Verlag, ベルリン(1992); J.N. Lamy, B.N. Green, A. Toulmond, J.S. Wall, R.E. Weber and S.N. Vinogradov, Chem. Rev. 96 3113-3124 (1996))。細胞外ヘモグロビンの分子は、環形動物の３つの綱：多毛綱、貧毛綱、およびヒル綱に存在し、最近、多毛綱のシボグリヌム科に加えられたハオリムシ類にも存在する。これらの分子は巨大な生体高分子であり、６あるいは８種類の、約２００のポリペプチド鎖からなる。このポリペプチド鎖は、大きく２つのカテゴリーに分けられる。第１のカテゴリーには、１４４から１９２のペプチドが構成要素として含まれ、活性部位を持ち酸素と可逆的に結合可能な、いわゆる「機能性」ポリペプチド鎖が属する。これらはグロビン型の鎖で、その質量は１５〜１８ｋＤａであり、脊椎動物のαおよびβ型鎖に非常によく似ている。第２のカテゴリーには、３６から４２のペプチドが構成要素として含まれ、ほとんど、あるいは全く活性部位を持たないが、１２量体の集合を可能にする、いわゆる「構造」ポリペプチド鎖が属する。
環形動物は、それらが持つ細胞外ヘモグロビンのために、よく研究されてきた(Terwilliger, Molecular structure of the extracellular heme proteins, Vol. 13, C.P. Mangum (Ed.), 193-229, Springer-Verlag, ベルリン(1992); J.N. Lamy, B.N. Green, A. Toulmond, J.S. Wall, R.E. Weber and S.N. Vinogradov, Chem. Rev. 96 3113-3124 (1996))。細胞外ヘモグロビンの分子は、環形動物の３つの綱：多毛綱、貧毛綱、およびヒル綱に存在し、最近、多毛綱のシボグリヌム科に加えられたハオリムシ類にも存在する。これらの分子は巨大な生体高分子であり、６あるいは８種類の、約２００のポリペプチド鎖からなる。このポリペプチド鎖は、大きく２つのカテゴリーに分けられる。第１のカテゴリーには、１４４から１９２のペプチドが構成要素として含まれ、活性部位を持ち酸素と可逆的に結合可能な、いわゆる「機能性」ポリペプチド鎖が属する。これらはグロビン型の鎖で、その質量は１５〜１８ｋＤａであり、脊椎動物のαおよびβ型鎖に非常によく似ている。第２のカテゴリーには、３６から４２のペプチドが構成要素として含まれ、ほとんど、あるいは全く活性部位を持たないが、１２量体の集合を可能にする、いわゆる「構造」ポリペプチド鎖が属する。
初めて得られたアレニコラ（Arenicola）の細胞外ヘモグロビンの画像によって、六角形の構成要素が明らかにされた(J. Roche, M. Bessis and J.P. Thiery, Biochim. Biophys. Acta 41 182-184 (1960); J. Roche, M.T. Bessis and J.P. Thiery, C. R. Soc. Biol. 154 73-80 (1960))。ヘモグロビンの個々の分子は、重ね合わさった２つの六角形から成っている(O. Levin, J. Mol. Biol. 6 95-101 (1963); J. Roche, Electron microscope studies on high molecular weight erythrocruorins (invertebrate hemoglobins) and chloro-cruorins of annelids, D.A. Munday (Ed), 62-80, Pergamon Press, オックスフォード(1965))。これらは六角形状二重層と呼ばれており、それぞれの六角形は、６つの構成要素の集合によって、それ自身が、中空球形構造と呼ばれる水滴形状(F. De Haas, F. Zal, V. You, F.H. Lallier, A. Toulmond and J.N. Lamy, J. Mol. Biol. 264 111-120 (1996); F. De Haas, F. Zal, F.H. Lallier, A. Toulmond and J.N. Lamy, Proteins - structure function and genetics, 3 241-256 (1996); F. De Haas, N. Boisset, J.C. Taveau, O. Lambert, S.N. Vinogradov and J.N. Lamy, Biophys. J. 70 1973-1984 (1996))、あるいは１２量体(E.F.J. Van Bruggen and R.E. Weber, Biochim. Biophys. Acta 359 210-212 (1974); O.H. Kapp and A.V. Crewe, Biochim. Biophys. Acta 789 294-301 (1984))を形成している。天然の分子は、これらサブユニット（１２量体）の１２個から成り、この天然の分子の機能ユニットを構成する分子量は２００〜２５０ｋＤａである。
潮間帯生態系における多毛綱の環形動物であるアレニコラ マリナ（Arenicola marina）には、特に関心が寄せられている。加えて、その細胞外ヘモグロビンの構造は、すでに知られている(F. Zal, B.N. Green, F.H. Lallier, S.N. Vinogradov and A. Toulmond, Eur. J. Biochem. 243 85-92 (1997))。
臓器移植は、患者の罹病臓器を、移植臓器と呼ばれる、提供者からの健康な臓器と交換するものである。
人体の全ての臓器および組織への酸素の分配は、人間あるいは動物の血流中に存在するヘモグロビンにより確保されている。
提供者からの摘出後、臓器には酸素が供給されないため、臓器移植の過程においては、提供者からの摘出後から患者への移植までの間、人体外で、できるだけ長く臓器を生きた状態に保つことが移植の成功に欠かせず、保存方法の開発が必要となる。
摘出後、移植臓器は生理環境外に置かれるため、非常に傷みやすい。正常体温（３７℃）では、臓器の血管新生が中断すると、臓器細胞の急速な壊死が起こる。臓器保存溶液は、これを防いで臓器を保護する。臓器保存の重要な原則の一つは、臓器の温度を３７℃から４℃へ急速に低下させることである。実際、組織の温度を低下させると、細胞代謝が停止することはないものの、低下する(Belzer F.O., Southard J.H., Principles of solid organ preservation by cold storage. Trans-plantation 1988; 45(4): 673-676)。冷却法と保存溶液の組成は、血液循環の停止による酸素・栄養枯渇の悪影響を抑え、組織の壊死につながる細胞死を遅らせることを可能にする。このように、保存溶液は、その浸透圧特性、および／または、抗酸化特性により、移植臓器の質と完全な状態を保つことに寄与する（形態学的および生化学的に）。保存溶液は、特に、生体外における生存を維持する：
・摘出の段階では、移植臓器をすすいで提供者の血液を除去するために、移植臓器を保存溶液で灌流する（「洗浄液」）。臓器を生きた提供者から摘出するか、あるいは死体から摘出するかによって、生体外で、あるいは生体内の原位置のいずれかで低温灌流を行い、続いて、臓器を冷却する。洗浄は、臓器を溶液の成分と平衡させることにも役立つ。
・提供者からの摘出の開始から、被提供者への移植の完了までの時間は、決定的に重要である。これは、この期間が完全な虚血の期間だからである。これまでに観察された多くの悪影響は、この段階が原因となっている。虚血は、栄養供給、酸素供給、および老廃物除去という、血流の３つの重要な機能が失われる、組織の血液供給が不十分な状態であると定義できる。
・摘出の段階では、移植臓器をすすいで提供者の血液を除去するために、移植臓器を保存溶液で灌流する（「洗浄液」）。臓器を生きた提供者から摘出するか、あるいは死体から摘出するかによって、生体外で、あるいは生体内の原位置のいずれかで低温灌流を行い、続いて、臓器を冷却する。洗浄は、臓器を溶液の成分と平衡させることにも役立つ。
・提供者からの摘出の開始から、被提供者への移植の完了までの時間は、決定的に重要である。これは、この期間が完全な虚血の期間だからである。これまでに観察された多くの悪影響は、この段階が原因となっている。虚血は、栄養供給、酸素供給、および老廃物除去という、血流の３つの重要な機能が失われる、組織の血液供給が不十分な状態であると定義できる。
温虚血期間、すなわち、すでに臓器が提供者の血液に灌流されていないものの、まだ冷蔵はされていない期間と、冷虚血期間、すなわち、臓器の洗浄および冷蔵の後、被提供者の体内での血行再建までの期間とは区別される。臓器の復温後、被提供者の血液で灌流するまで、二次的温虚血の期間が観察される。保存溶液の本質的な役割は、輸送中の移植臓器を保護することである（「保持溶液」）。
冷却法は、保存に不可欠な要素である。冷却法により組織代謝を低下させる。言い換えれば、細胞の生存に必要な触媒酵素活性を減速させる。組織代謝は、温度が３７℃から０℃へ低下すると、１２〜１３倍低下するといわれている(Belzer and Southard, Principles of solid organ preservation by cold storage. Transplantation 1988; 45(4): 673-676 (1988))。
移植臓器は虚血の状態にあるので、実際、移植臓器の酸素およびエネルギーの需要と消費を低下させる必要がある。このことは、組織から酸素が奪われることを示唆している。従って、ＡＴＰの形態をとるエネルギーの酸化的リン酸化反応による合成は確保されなくなり、嫌気的解糖によるその産生は、さらに低くなる。虚血組織は、ほとんどエネルギーを蓄積しておらず、急速に劣化する。
したがって、冷却法を使用する必要性を低減させることが重要である。移植後の再灌流の成功は、低温保存（約４℃）の質にかかっている。臓器を、砕いた氷で低温に維持した溶液に、無菌保証条件下で単に浸漬する（低温静的保存）。
移植臓器のその後の機能回復を確保できる許容時間は、臓器毎に異なる。例えば、心臓では約４〜５時間、肺では約４〜６時間、腸では約６時間、肝臓では約１０〜１６時間、腎臓では約２４〜３５時間、膵臓では約１２〜１８時間である（Melle Delphine FORNASによる論文（２００１年６月１５日）: Organ preservation solution: specification, regulatory status and registration in Europe; クロード・ベルナール大学−リヨン第１大学; 薬学部; 薬学・生物学研究所）。
このため、特に保存方法の開発について、研究がなされてきた。
米国特許７，２２０，５３８は、臓器または細胞の保存のための組成物に関するものであり、２つの特徴がある。第１の特徴は、栄養基本培地を含み、第２の特徴は、酸素と結合可能または酸素を供給可能な成分を含んだ溶液または懸濁液の形態を含む、ナノ粒子を含む。この成分は、溶血可能であり、化学修飾された細胞内ヘモグロビンとなる。この溶液は、約２０℃〜３０℃の非低体温温度に維持される。
米国特許６，９９４，６５４は、臓器および組織の保存のための溶液に関する。この溶液は、高カリウム含量の電解質をベースにした溶液と、添加剤とを含む。この添加剤は、提供、保存、移植、および／または、臓器または組織の出血を伴わない外科手術といったプロセスのための、ＰＥＧ−ヘモグロビンであってよい。ここでは、添加剤として使用される、酸素を運搬する分子は、「正常温度」灌流に使用されると述べられている。低温灌流の場合、酸素運搬物質は存在しない。これは、ヘモグロビンの酸素に対する親和力は温度に依存するため、低体温温度においては、前記特許に記載の分子が得られた脊椎動物のヘモグロビンが、３７℃の場合と同じ機能特性、特に、酸素に対する親和性を持たないためである。
米国特許出願２００６／００６３１４２は、臓器の監視、維持、および／または、修復のため、および、保持中または輸送中に臓器を保存するための、臓器灌流のための装置および方法に関する。
この方法は、溶液ですすいだ後、第１の医療液で、第１温度（好ましくは２５℃を超える温度）で臓器の灌流を行うこと含む。溶液は、VIASPAN（登録商標）、あるいは、デキストラン、ＨＥＳ（ヒドロキシエチルでんぷん）、またはその他同等の化合物を含んだその他のコロイド溶液であってよい。第１の医療液は、赤血球や架橋ヘモグロビンのような酸素運搬物質を含んでいてよい。さらに、この方法は、第１温度より低い第２温度（好ましくは、４℃〜１０℃）で、酸素を含まない第２の医療液で臓器の灌流を行うことを含む。
米国特許６，６４２，０４５は、ヘモグロビン、安定化ヘモグロビン、ヘモグロビンのポリオキシエチレン共役体、または組み換えヘモグロビンのような酸素運搬物質を含んでいてよい灌流液を使用する臓器または組織、を含んだ代謝支援システムに関する。
国際公開第０１／０１７７４号は、移植用臓器の保存のための組成物に関する。この組成物は、ウシＰＥＧ−ヘモグロビン、１種以上の必須電解質、少なくとも１種の可溶性タンパク、少なくとも１種の栄養調合物、および、心臓血管系に作用する少なくとも１種の物質を含む。
これらの文献では、使用されるヘモグロビンは、ヒトあるいは哺乳類由来のものであり、赤血球あるいはリポソーム中に存在する。あるいは、使用されるヘモグロビンは、ヘモグロビンが赤血球から分離される際、赤血球に存在する酵素の抗酸化活性の欠如により酸化されることはよく知られているので、酸化防止のためポリエチレングリコール(ＰＥＧ−ヘモグロビン)と架橋される(Savitsky JP, Doczi J, Black J and Arnold JD (1978) A clinical safety trial of stroma-free hemoglobin. Clin Pharmacol Ther 23, 73-80), (Chan WL, Tang NL, Yim CC, Lai FM and Tam MS (2000); New features of renal lesion induced by stroma-free hemoglobin, Toxicol Pathol 28, 635-642)。赤血球の使用においては、浸透圧の調整も必要となる。赤血球は、高浸透圧培地中では、２８９ ｍＯｓＭｏｌｅ（赤血球の通常の浸透圧）を超えると、水分を失う傾向がある。この物理的過程は、膜交換、特に、ナトリウム／塩素交換を阻害する (Hendry EB (1961) Osmolarity of human serum and chemical solution of biological importance. Clin. Chem., 2, 156-164)。
同様に、ヒトまたは哺乳類のヘモグロビンは、臓器保存のための正常温度においてのみ使用できる。これは、この温度を超えると、赤血球の機能が大きく損なわれるためである(Jensen FB, Wang T, Brahm J, 2001, Acute and chronic influence of temperature on red blood cell anion exchange, 204, 39-45)。さらに、脊椎動物のヘモグロビンを使用する場合、免疫反応を防ぐため、提供者と非提供者の血液型を知る必要が出てくる(Goodnough, Clin Orthop Relat Res. 1998 Dec; (357) 89-100)。
しかし、より長い虚血期間において移植臓器の生存性を向上させれば、免疫学や手術条件の研究向上につながり、その結果、移植の成功にもつながる。
同様に、移植臓器の酸素供給の向上と、その質の向上は、より迅速な機能回復を可能にする。
従って、本発明の目的の１つは、グロビン、および／または、グロビンプロトマー、および／または、細胞外ヘモグロビンを、臓器、組織、あるいは、臓器細胞または組織細胞の保存のための組成物を実現できる、臓器または細胞培養物保存のための培地と組み合わせて提供することである。
本発明の他の目的は、臓器、組織、臓器細胞、組織細胞、または、細胞培養物の保存のための、血液型判定を必要としない組成物を提供することである。
本発明の別の局面は、臓器、組織、臓器細胞、組織細胞、または、細胞培養物の保存のための、長時間の使用が可能で、低体温温度にて機能し得る組成物を提供することである。
本発明の別の局面は、低体温温度で機能し得る細胞培養物組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、臓器、組織、臓器細胞、組織細胞、または、細胞培養物の保存を可能にする臓器保存培地中にて、少なくとも１種のグロビン、および／または、少なくとも１種のグロビンプロトマー、および／または、少なくとも１種の細胞外ヘモグロビンを含む組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、臓器、組織、あるいは、臓器細胞または組織細胞の保存方法を提供することである。
本発明の別の局面は、臓器灌流の方法を提供することである。
本発明の別の目的は、細胞培養の方法を提供することである。
従って、本発明は、臓器、組織、臓器細胞、もしくは組織細胞の保存のための組成物、臓器もしくは組織の灌流のための、または、細胞培養のための組成物を作製するために、環形動物門から選択された無脊椎動物の少なくとも１種のグロビン、および／または、少なくとも１種のグロビンプロトマー、および／または、少なくとも１種の天然に細胞外のネイティブヘモグロビン、特に、アレニコラ マリナのような海洋虫の、少なくとも１種のグロビン、および／または、少なくとも１種のグロビンプロトマー、および／または、少なくとも１種の細胞外ヘモグロビンを、最終体積に対して、約０．６２５ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約０．６２５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは、約０．６２５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、特に好ましくは、１．２５ｍｇ／ｍｌで、臓器保存培地または細胞培地と組み合わせる方法に関する。
「グロビンプロトマー」は、グロビンの１２量体、または、ドデカマーを指す。
「ネイティブ」は、前記無脊椎動物由来のグロビン、または、グロビンプロトマー、または、ヘモグロビンを指す。
「天然に細胞外」は、グロビン、または、グロビンプロトマー、または、ヘモグロビンが、天然に細胞内には含まれておらず、従って、それらを化学修飾によって安定化および機能し得るようにしなくても、循環系を自由に循環できることを意味する。
アレニコラ マリナの細胞外ヘモグロビンは、質量約３００万〜４００万ダルトンの巨大な生体高分子で、２種類の約２００のポリペプチド鎖から成り立っている。その４分の３は、酸素（Ｏ２）と可逆的に結合可能なグロビンタイプの鎖であり、残りは、四次構造を維持する構造鎖（「リンカー」）である。これらは、この分子の抗酸化活性に関与していると考えられている。この分子の機能ユニットは、質量２００〜２５０ｋＤＡの１２量体である。
従って、動物の細胞外ヘモグロビン、あるいは、グロビンプロトマー、あるいは、グロビンは、単一のポリペプチド鎖から約数百のポリペプチド鎖により構成され、その分子量は、例えば、約１５，０００〜約８，０００，０００ダルトンである。
少なくとも１種のグロビン、および／または、少なくとも１種のグロビンプロトマー、および／または、少なくとも１種の細胞外ネイティブヘモグロビンの使用により、その固有のスーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯＤ）活性(Flohe and Ottingの方法により決定される; Flohe L, Otting F. Methods Enzymol (1984), 105, 93-104)を利用することができる。これによって、固有の抗酸化活性が得られる。その結果、赤血球内に抗酸化分子が含まれ、それらがヘモグロビンと結合していない哺乳類のヘモグロビンを使用する場合とは対照的に、機能するのに抗酸化物質を必要としなくなる。一方で、哺乳類、特にヒトのヘモグロビンとは違って、グロビン、または、グロビンプロトマー、または、細胞外ヘモグロビンは、機能するのに共同因子を必要としない。
無脊椎動物とは、クラゲ、海綿動物、昆虫、甲殻類、軟体動物等、または、環形動物門に属する動物のような、脊柱を持たない動物を指す。
海洋虫であるアレニコラ マリナのヘモグロビン濃度は、血液１リットル当たり１００〜１７０ｇである(Toulmond A. (1975). Studies on the respiratory physiology of the polychete annelid Arenicola marina (L.). 科学博士論文, ピエールとマリー・キュリー大学 (パリ第六大学), パリ)。ヒトの場合、血液１リットル当たり約１４０ｇである(WHOデータ WHO/LEISH/96.40 付録５, ５７ページ）。従って、本発明で採用する濃度は、無脊椎動物または脊椎動物における生理学的濃度よりも、約１００倍低いことが好ましい。
少なくとも１種のグロビン、および／または、少なくとも１種のグロビンプロトマー、および／または、少なくとも１種の細胞外ネイティブヘモグロビンの使用により、赤血球の使用に必要な浸透圧の調整を回避できる。グロビン、グロビンプロトマー、および細胞外ネイティブヘモグロビンは、血液型を持たない。従って、血液型決定に関与する血球表面においてグリカンのタイプが異なった血球に含まれるヒトまたはウシのヘモグロビンのような、哺乳類の赤血球の使用により引き起こされる、あらゆる免疫反応の問題を回避することができる。アレニコラ マリナの細胞外ヘモグロビンは、細胞外にあり、グリコシル化されていないため、アレニコラ マリナは万能提供者であると考えられる。
臓器および組織は、動物、特に、ヒト由来であり、あるいは、哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類、または昆虫由来である。
組織は、同質の細胞、あるいは、少なくとも同じ由来で、共通の機能に関与する細胞の集まりである。組織の集まりが臓器である。
「保存培地」という表現は、臓器および／または細胞の最小限の代謝要求を満たしつつ、臓器および／または細胞を再灌流虚血の悪影響から保護できるあらゆる培地を指す。
保存培地は、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、塩素、および硫酸塩等の電解質を含む水溶液である。マンニトール、ラフィノース、スクロース、グルコース、フルクトース、ラクトビオン酸塩、またはグルコン酸塩等の非浸透性の物質を含有させる必要がある場合、アルブミン、ヒドロキシエチル・でんぷん、ポリエチレングリコール、またはデキストラン４０等のコロイドも含有させることができる。
細胞培地は市販のものが利用でき、実に様々なものがある。培地は前記のものに限定されず、例えば、インビトロジェン（Invitrogen）より入手可能な培地としては、D-Mem、D-Mem/F-12、Mem、Rpmi 1640、Medium 199等や、類似の培地がある。
溶液の例としては、本発明に限定されず、Melle Delphine Fornas の論文(Melle Delphine Fornasの論文（２００１年６月１５日）: Organ preservation solution: specification, regulatory status and registration in Europe; クロード・ベルナール大学−リヨン第１大学; 薬学部; 薬学・生物学研究所)の表１に示されている。
細胞培養物は、あらゆる種類の細胞、特に、初代培養を構成する、遊離微生物（バクテリアまたは酵母菌）または、生体から新たに採取（生検等）した「正常な」細胞等の原核細胞および真核細胞のものを指す。
また、細胞培養物は、無限の分裂能力（「培養における不死」と呼ばれる）を持つ細胞のものをも意味する。例えば、がん性細胞系、がん化の過程にある細胞、または人工的に「不死」にした正常細胞のものである。
本発明の好ましい実施形態によれば、前記のグロビン、および／または、前記のグロビンプロトマー、および／または、前記の天然ヘモグロビンは、ウイスコンシン大学液（UW, Viaspan（登録商標））、IGL1（登録商標）、Celcior（登録商標）、SCOT Maco（登録商標）、BMPS Belzer（登録商標）、Custodiol（登録商標） (HTK)、Euro-Collins（登録商標）、Soltran（登録商標）、Perfadex（登録商標）、Ringer lactate（登録商標）、またはPlegisol（登録商標）から好ましくは選択された臓器保存培地、または同様の溶液と組み合わせて使用される。
これらの臓器保存培地はすべて、市販の製品である。
本発明の別の実施形態によれば、前記のように定義された細胞培養物は、脊椎動物の細胞のものに相当する。
脊椎動物とは、哺乳類、爬虫類、両生類、鳥類、または魚類を指す。
前記脊椎動物の細胞は、脊椎動物のあらゆる種類の細胞に相当する。例えば、前記に限定されず、腎臓、肝臓、膵臓、心臓、肺、腸、胃、結腸の細胞であってよい。
本発明の別の実施形態によれば、前記のように定義された細胞培養物は、無脊椎動物の細胞のものに相当する。
無脊椎動物とは、脊柱を持たない動物を指す。例えば、昆虫、軟体動物、環形動物、刺胞動物、海綿動物等である。
前記無脊椎動物の細胞は、無脊椎動物のあらゆる種類の細胞に相当する。例えば、前記に限定されず、血管周囲組織／造血組織の細胞等であってよい。
好ましい実施形態によれば、前記に定義された、臓器、臓器細胞、または細胞培養物の保存のための組成物の温度は、約４℃〜約３７℃、好ましくは、約４℃〜約２５℃、より好ましくは、約４℃〜約１５、特に、４℃が好ましい。
低体温状態は、組織代謝を低下させる、言い換えれば、細胞の生存に必要な触媒酵素活性を減速させるので、少なくとも１種のグロビン、および／または、少なくとも一種のグロブリンプロトマー、および／または、少なくとも１種の細胞外ネイティブヘモグロビンを使用して、保存に不可欠な低体温条件下で機能し得る組成物を作製することができる。
また、少なくとも１種のグロビン、および／または、少なくとも１種のグロブリンプロトマー、および／または、少なくとも１種の細胞外ネイティブヘモグロビンは、これまで可能でなかった海生無脊椎動物の細胞培養を可能にする。実際、海生無脊椎動物の初代培養は、ある種の無脊椎動物に対しては行われているものの（一部は数ヶ月間維持されている）、細胞系は確立されていない(Rinkevich B, Mar Biotechnol (NY). 2005 Sep-Oct; 7(5): 429-39)。
別の実施形態によれば、臓器灌流または細胞培養のための組成物の温度は、約４℃〜約３７℃であり、好ましくは約１５℃〜約３７℃であり、より好ましくは約２５℃〜約３７℃であり、特に好ましくは約３７℃である。
臓器の灌流中は、灌流温度はおおむね正常温度でなければならない。言い換えれば、生理的温度に近くなければならない。従って、細胞外ヘモグロビンの使用により、正常温度条件下においても機能し得る組成物を作製することができる。
別の特徴によると、本発明は、環形動物門から選択された無脊椎動物の少なくとも１種のグロビン、および／または、少なくとも１種のグロビンプロトマー、および／または、少なくとも１種の細胞外ネイティブヘモグロビン、特に、アレニコラ マリナのような海洋虫の、少なくとも１種のグロビン、および／または、少なくとも１種のグロビンプロトマー、および／または、少なくとも１種の細胞外ヘモグロビンを、最終体積に対して、０．６２５ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約０．６２５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは、約０．６２５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、特に好ましくは、１．２５ｍｇ／ｍｌ含有する組成物、および臓器保存培地に関する。
前記組成物は、臓器もしくは組織、または臓器細胞もしくは組織細胞の保存、あるいは臓器または組織の灌流を可能にする。
好ましい実施形態によれば、前記臓器保存培地は、ウイスコンシン大学液（UW, Viaspan（登録商標））、IGL1（登録商標）、Celcior（登録商標）、SCOT Maco（登録商標）、BMPS Belzer（登録商標）、Custodiol（登録商標） (HTK)、Euro-Collins（登録商標）、Soltran（登録商標）、Perfadex（登録商標）、Ringer lactate（登録商標）、またはPlegisol（登録商標）から、または同様の溶液から選択されることが好ましいが、これらのコロイド溶液に限定されない。
別の局面によると、本発明は、環形動物門から選択された無脊椎動物の少なくとも１種のグロビン、および／または、少なくとも１種のグロビンプロトマー、および／または、少なくとも１種の細胞外ネイティブヘモグロビン、特に、アレニコラ マリナのような海洋虫の、少なくとも１種のグロビン、および／または、少なくとも１種のグロビンプロトマー、および／または、少なくとも１種の細胞外ヘモグロビンを、最終体積に対して、０．６２５ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約０．６２５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは、約０．６２５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、特に好ましくは、１．２５ｍｇ／ｍｌ含有する組成物、および細胞培地に関する。
前記組成物は、脊椎動物または無脊椎動物の細胞培養を可能にする。さらに別の局面によれば、本発明は、前記の組成中にて前記臓器の静的または動的灌流保存を行う段階を含む、臓器もしくは組織、または臓器細胞もしくは組織細胞の保存方法に関する。
好ましい実施形態では、前記臓器もしくは組織、または前記臓器細胞もしくは組織細胞の保存方法は、
・前記臓器もしくは前記組織、または前記臓器細胞もしくは組織細胞を摘出する段階、
・前記臓器もしくは前記組織、または前記臓器細胞もしくは前記組織細胞を、前記の組成物を使用して、約４℃〜３７℃にて、好ましくは、約４℃〜２５℃にて、より好ましくは、約４℃〜約１５℃にて、特に好ましくは約４℃にて、すすぐ段階、および
・前記組成物中にて、前記臓器もしくは前記組織、または前記臓器細胞もしくは前記組織細胞を、その種類に応じた所定の時間、約４℃〜３７℃にて、好ましくは約４℃〜２５℃にて、より好ましくは約４℃〜約１５℃にて、特に好ましくは約４℃にて、静的または動的灌流保存する段階を含む。
・前記臓器もしくは前記組織、または前記臓器細胞もしくは組織細胞を摘出する段階、
・前記臓器もしくは前記組織、または前記臓器細胞もしくは前記組織細胞を、前記の組成物を使用して、約４℃〜３７℃にて、好ましくは、約４℃〜２５℃にて、より好ましくは、約４℃〜約１５℃にて、特に好ましくは約４℃にて、すすぐ段階、および
・前記組成物中にて、前記臓器もしくは前記組織、または前記臓器細胞もしくは前記組織細胞を、その種類に応じた所定の時間、約４℃〜３７℃にて、好ましくは約４℃〜２５℃にて、より好ましくは約４℃〜約１５℃にて、特に好ましくは約４℃にて、静的または動的灌流保存する段階を含む。
「前記臓器もしくは前記組織、または前記臓器細胞もしくは組織細胞を、その種類に応じた所定の時間」とは、保存時間が、使用される臓器に固有で依存的であることを意味する。
移植臓器のその後の機能回復を確保できる許容時間は、臓器毎に異なる。例えば、心臓では約４〜５時間、肺では約４〜６時間、腸では約６時間、肝臓では約１０〜１６時間、腎臓では約２４〜３５時間、膵臓では約１２〜１８時間である。これらの数値はすべて、当業者には周知のものであり、例えば、Melle Delphine Fornasの論文に見出すことができる（Melle Delphine Fornasによる論文（２００１年６月１５日）: Organ preservation solution: specification, regulatory status and registration in Europe; クロード・ベルナール大学−リヨン第１大学; 薬学部; 薬学・生物学研究所）。
本発明の別の局面によれば、本発明は、前記の組成物中にて、細胞を培養する段階を含む、脊椎動物または無脊椎動物の臓器細胞または組織細胞を培養する方法に関する。
好ましい実施形態によれば、前記臓器の保存方法は、
・前記臓器を摘出する段階、
・前記臓器もしくは前記組織、または前記臓器細胞もしくは前記組織細胞を、前記の組成物を使用して、約４℃〜約３７℃にて、好ましくは、約１５℃〜約３７℃にて、より好ましくは、約２５℃〜約３７℃にて、すすぐ段階、および
・前記組成物中にて、前記臓器を、その種類に応じた所定の時間、約４℃〜約３７℃にて、好ましくは約１５℃〜約３７℃にて、より好ましくは約２５℃〜約３７℃にて、特に好ましくは約３７℃にて、静的または動的灌流保存する段階を含む。
・前記臓器を摘出する段階、
・前記臓器もしくは前記組織、または前記臓器細胞もしくは前記組織細胞を、前記の組成物を使用して、約４℃〜約３７℃にて、好ましくは、約１５℃〜約３７℃にて、より好ましくは、約２５℃〜約３７℃にて、すすぐ段階、および
・前記組成物中にて、前記臓器を、その種類に応じた所定の時間、約４℃〜約３７℃にて、好ましくは約１５℃〜約３７℃にて、より好ましくは約２５℃〜約３７℃にて、特に好ましくは約３７℃にて、静的または動的灌流保存する段階を含む。
「前記臓器を、その種類に応じた所定の時間」は、上で述べたように、保存時間が、使用される臓器に固有で依存的であることを意味する。
さらに別の局面によると、本発明は、
・脊椎動物から前記細胞を採取する段階、
・前記組成物中にて、前記細胞を、その種類に応じて、約４℃〜３７℃にて、好ましくは約１５℃〜約３７℃にて、より好ましくは約２５℃〜約３７℃にて、特に好ましくは約３７℃にて、所定の時間、培養する段階、および、
・細胞マットをすすぎ、溶解させて、前記細胞を採取する段階
を含む、脊椎動物の細胞を培養する方法に関する。
さらに別の局面によると、本発明は、
・脊椎動物から前記細胞を採取する段階、
・前記組成物中にて、前記細胞を、その種類に応じて、約４℃〜３７℃にて、好ましくは約１５℃〜約３７℃にて、より好ましくは約２５℃〜約３７℃にて、特に好ましくは約３７℃にて、所定の時間、培養する段階、および、
・細胞マットをすすぎ、溶解させて、前記細胞を採取する段階
を含む、脊椎動物の細胞を培養する方法に関する。
「所定の時間」および「その種類に応じて」は、培養時間が、使用される細胞または使用される細胞系の種類に固有で、依存的であることを意味する。
例えば、多核好中球のような血球の細胞培養では、培養時間は数時間から約１週間である。
通常、これらの細胞を、培地にて無期限に維持することはできない。これは特に、細胞分裂の回数が有限であることによる（ヘイフリックの限界）。
初代培養では、細胞培養物は組織から直接派生し、培養時間は通常、数日から数週間である。
この初代培養は、後に、コンフルエントな状態に達し、「二次培養」と呼ばれる培養物を生み出す。
最後に、不死化細胞の場合、培養時間は決まっておらず、理論的には無限であり得る。
本発明の別の局面では、本発明は、
・無脊椎動物から前記細胞を採取する段階、
・前記組成物中にて、前記細胞を、その種類に応じた所定の時間、約４℃〜３７℃にて、好ましくは約４℃〜約２５℃にて、より好ましくは約４℃〜約１５℃にて、特に好ましくは約４℃にて培養する段階、および、
・細胞マットをすすぎ、溶解させて、前記細胞を採取する段階
を含む、無脊椎動物の細胞を培養する方法に関する。
・無脊椎動物から前記細胞を採取する段階、
・前記組成物中にて、前記細胞を、その種類に応じた所定の時間、約４℃〜３７℃にて、好ましくは約４℃〜約２５℃にて、より好ましくは約４℃〜約１５℃にて、特に好ましくは約４℃にて培養する段階、および、
・細胞マットをすすぎ、溶解させて、前記細胞を採取する段階
を含む、無脊椎動物の細胞を培養する方法に関する。
「その種類に応じた所定の時間」は、培養時間が、使用される細胞または使用される細胞系の種類に固有で、依存的であることを意味する。
〔図面の簡単な説明〕
図１は、４つの臓器保存培地（白四角：UW（登録商標）、黒丸：IGL1（登録商標）、ばつ印：Celsior（登録商標）、白三角：BMPS Belzer（登録商標））中における、アレニコラ マリナのヘモグロビン（ＨｂＡｍ）の解離速度を示す。灰色の四角は、分子の精製に使用した緩衝液中における、アレニコラ マリナのヘモグロビンの安定性を示す。
図１は、４つの臓器保存培地（白四角：UW（登録商標）、黒丸：IGL1（登録商標）、ばつ印：Celsior（登録商標）、白三角：BMPS Belzer（登録商標））中における、アレニコラ マリナのヘモグロビン（ＨｂＡｍ）の解離速度を示す。灰色の四角は、分子の精製に使用した緩衝液中における、アレニコラ マリナのヘモグロビンの安定性を示す。
図２は、異なる臓器保存培地における、アレニコラ マリナのヘモグロビン（ＨｂＡｍ）の機能特性を示す。各培地について、アレニコラ マリナのヘモグロビンの、酸素に対する親和性を表すＰ５０の測定値（実線）、および、共同性を表すｎ５０の測定値（点線）を示す。
図３は、４℃にて２時間経た後、ブタ尿細管細胞LLC PK1によって保存上澄み液に遊離した乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）のパーセンテージ（y軸）を、臓器保存培地（Viaspan（登録商標）, Bristol-Myers Squibb）におけるアレニコラ マリナのヘモグロビン濃度（１．２５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ）の機能として示す。黒いバーはＨｂＡｍの異なる濃度について得られた結果であり、灰色のバーは、Viaspan（登録商標）のみを含む緩衝液を使用して得られた結果を示す。
図４は、４℃にて２４時間経た後、ブタ尿細管細胞LLC PK1によって保存上澄み液に遊離した乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）のパーセンテージ（y軸）を、臓器保存培地（Viaspan（登録商標）, Bristol-Myers Squibb）におけるアレニコラ マリナのヘモグロビン濃度（０．０３９ｍｇ／ｍｌ〜１．２５ｍｇ／ｍｌ； ｘ軸）の機能として示す。黒いバーはＨｂＡｍの異なる濃度について得られた結果である。
〔実施例〕
〔実施例１〕異なる臓器保存培地における、アレニコラ マリナのヘモグロビンの安定性
これらの研究を、異なる臓器保存培地（Ｔ． Ｈａｕｅｔ教授の研究室により提供された、現在臓器移植において使用されているコロイド溶液）におけるＨｂＡｍの安定性を評価するために、実験室において行った。この溶液は、UW（登録商標）、IGL1（登録商標）、Celsior（登録商標）、およびBMPS Belzer（登録商標）である。
〔実施例１〕異なる臓器保存培地における、アレニコラ マリナのヘモグロビンの安定性
これらの研究を、異なる臓器保存培地（Ｔ． Ｈａｕｅｔ教授の研究室により提供された、現在臓器移植において使用されているコロイド溶液）におけるＨｂＡｍの安定性を評価するために、実験室において行った。この溶液は、UW（登録商標）、IGL1（登録商標）、Celsior（登録商標）、およびBMPS Belzer（登録商標）である。
動態解析を、クロマトグラムの曲線下の領域および４１４ｎｍ（ヘムの吸収度に相当）における異なるサブユニットのパーセンテージに基づいて、４８時間以上行った。ＨｂＡｍのパーセンテージは、時間関数としての単一指数の法則に従う。すなわち、kdがＨｂＡｍの解離定数であるとき、［ＨｂＡｍ］ｔ／［ＨｂＡｍ］ｔ０＝ｅｘｐ（−ｋｄｔ）である。
これらの研究は、移植を待つ臓器の生存期間と完全に一致する少なくとも４８時間は、これらの異なる臓器保存培地において、ＨｂＡｍが安定しており、酸化されず、機能することを明らかにした（図１）。
異なる溶液について得られた解離定数および半減期は、４８時間以上テストされたこれらの異なる臓器保存培地において、ＨｂＡｍが安定していることを示している（解離＜３％、表１を参照）。表１に、テストした異なる培地中のＨｂＡｍの解離定数および半減期を示す。
〔実施例２〕異なる臓器保存培地におけるアレニコラ マリナのヘモグロビンの機能性
Ｐ５０の測定を、４℃にて４８時間、ヘモックス（hemox）法（A. Toulmond et al., Biol. Bull. 179 366-373 (1990)）により行った。
Ｐ５０の測定を、４℃にて４８時間、ヘモックス（hemox）法（A. Toulmond et al., Biol. Bull. 179 366-373 (1990)）により行った。
ｎ５０の測定を、ヘモックス法により得られた、呼吸色素の酸素飽和曲線に基づいて行った。
図２に示した結果は、観察されたＰ５０およびｎ５０の値が示すように、テストされた異なる臓器保存培地において、ＨｂＡｍが機能することを示した(UW（登録商標）, IGL1（登録商標）, Celsior（登録商標）, Scot Maco, BPMS（登録商標）)。ＨｂＡｍのＯ２に対する親和性は強く１〜３であり、SCOT Macoでは約０．２である。親和性は異なる臓器保存培地においてわずかに高く、特に、SCOT Macoでは高く、４８時間と少しの間、増加した。
共同性は、異なる保存培地の間で、約１．５と一定であり、ちょうどよい。
〔実施例３〕腎細胞の低温保存のインビトロモデルにおける、濃度１．２５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌであるアレニコラ マリナのヘモグロビンの効果のテスト
１）腎細胞系の低温保存
−生物材料
実験を、G Mauco教授により指揮されているポワティエ(Poitiers)のフランス国立衛生研究所(INSERM) E0324 「腎移植における虚血−再灌流」研究室より提供を受けた、ブタ細尿管細胞系LLC-PK1(CL-101, Lot 1928865)(ATCC, LGC-Promochem, モルスハイム, フランス)に対して行った。
１）腎細胞系の低温保存
−生物材料
実験を、G Mauco教授により指揮されているポワティエ(Poitiers)のフランス国立衛生研究所(INSERM) E0324 「腎移植における虚血−再灌流」研究室より提供を受けた、ブタ細尿管細胞系LLC-PK1(CL-101, Lot 1928865)(ATCC, LGC-Promochem, モルスハイム, フランス)に対して行った。
LLC-PK1系は、非形質転換細胞系であり、ブタの腎臓尿細管の上皮細胞より樹立したものである。
−LLC-PK1細胞の培養
LLC-PK1細胞を、３％ウシ胎仔血清(F7524, lot 085K3397, Sigma-Aldrich)、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン(P4333, Sigma-Aldrich)、および２ｍＭ Ｌ‐グルタミン（25030, Gibco-BrL）を添加したM119培地(Ref. 31150, Gibco-BrL, Invitrogen Life Technology)において培養した。細胞を９５％の空気と５％のＣＯ２とを含む湿潤雰囲気下で、３７℃で培養した。
LLC-PK1細胞を、３％ウシ胎仔血清(F7524, lot 085K3397, Sigma-Aldrich)、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン(P4333, Sigma-Aldrich)、および２ｍＭ Ｌ‐グルタミン（25030, Gibco-BrL）を添加したM119培地(Ref. 31150, Gibco-BrL, Invitrogen Life Technology)において培養した。細胞を９５％の空気と５％のＣＯ２とを含む湿潤雰囲気下で、３７℃で培養した。
−LLC-PK1細胞の低温保存
低温保存実験のため、細胞を、６ウェル培養皿(140675, Nunc)上に、各ウェル当たり２ｍｌの培地中に、濃度２×１０５細胞／ｍｌで播いた。４８時間の培養後、上澄みを除去し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS, 70011, Gibco-Brl)で細胞マットを２回洗浄した。その後、１．２ｍｌの市販の保存溶液および、事前にＨｂＡｍを０、０．１２５、２．５、５、１０、または２０ｍｇ／ｍｌの濃度添加したＵＷ溶液（ViaSpan（登録商標）, Bristol-Myers Squibb）の存在下で、２４時間、４℃にて細胞を保存した。
低温保存実験のため、細胞を、６ウェル培養皿(140675, Nunc)上に、各ウェル当たり２ｍｌの培地中に、濃度２×１０５細胞／ｍｌで播いた。４８時間の培養後、上澄みを除去し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS, 70011, Gibco-Brl)で細胞マットを２回洗浄した。その後、１．２ｍｌの市販の保存溶液および、事前にＨｂＡｍを０、０．１２５、２．５、５、１０、または２０ｍｇ／ｍｌの濃度添加したＵＷ溶液（ViaSpan（登録商標）, Bristol-Myers Squibb）の存在下で、２４時間、４℃にて細胞を保存した。
２）乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）遊離の検出
ＵＷ溶液中に、２４時間、４℃にて保持したLLC-PK1細胞の生存に対する、Hemorgan保持緩衝液中に保持されたＨｂＡｍの添加の影響を検討した。細胞生存能力は、低温保存後に細胞マットに存在するＬＤＨの量を検出し、当初、保存段階以前に細胞マットに存在したＬＤＨの量と比較して検討した。
ＵＷ溶液中に、２４時間、４℃にて保持したLLC-PK1細胞の生存に対する、Hemorgan保持緩衝液中に保持されたＨｂＡｍの添加の影響を検討した。細胞生存能力は、低温保存後に細胞マットに存在するＬＤＨの量を検出し、当初、保存段階以前に細胞マットに存在したＬＤＨの量と比較して検討した。
実際、細胞外培地への酵素の遊離は、細胞の原形質膜の透過性上昇と、その細胞死の反映である。
−方法
２４時間の保存後、上澄みを除去し、２ｍｌのＰＢＳで細胞マットを３回すすぎ、その後、付着細胞を、０．１％のTriton（登録商標） X-100(X100, Sigma-Aldrich)を含有する１．２ｍｌのＰＢＳ中にて溶解させた。細胞マットを掻き出した後に得られた懸濁液を、超音波装置で１０秒間、超音波処理し、その後、７分間、１，０００ｇで遠心分離した。
２４時間の保存後、上澄みを除去し、２ｍｌのＰＢＳで細胞マットを３回すすぎ、その後、付着細胞を、０．１％のTriton（登録商標） X-100(X100, Sigma-Aldrich)を含有する１．２ｍｌのＰＢＳ中にて溶解させた。細胞マットを掻き出した後に得られた懸濁液を、超音波装置で１０秒間、超音波処理し、その後、７分間、１，０００ｇで遠心分離した。
細胞マットに存在するＬＤＨの量は、製造者の使用説明(TOX7, Sigma-Aldrich)に従って比色分析によって決定した。この分析は、ピルビン酸塩が乳酸塩に変換される間の、ＮＡＤのＬＤＨによる還元を利用している。要約すれば、分析対象の２５μｌの試料を９６ウェルプレートに配置し、容積１の基質（L2402）、容積１の共因子(L2527)、および容積１の染料(L2277)を含有する２５μｌの反応混合物を添加した。その後、混合物を緩やかに均質化し、５分間、暗所・室温にてインキュベートした。反応は５μｌの１Ｎ ＨＣｌの添加により止めた。測光法により４９０ｎｍおよび６３０ｎｍにて測定された吸光度（プラスチックリファレンス）(Biotek社の、Gen5（登録商標） ソフトウェアが付属のELx800（登録商標）)は、試料に存在する酵素の量に正比例する。各試料を２回分析し、吸収度(OD490 - OD630)の違いから平均値を得る。
−結果
結果は、低温保存期間以前に細胞マット（Ｔ０における細胞）内で検出されたＬＤＨの量に対する、４℃にて保存した細胞マット内にて検出されたＬＤＨの量の百分率で表した。その後、ＬＤＨの遊離率を、以下の関係から算出した（図３および表２を参照）。
結果は、低温保存期間以前に細胞マット（Ｔ０における細胞）内で検出されたＬＤＨの量に対する、４℃にて保存した細胞マット内にて検出されたＬＤＨの量の百分率で表した。その後、ＬＤＨの遊離率を、以下の関係から算出した（図３および表２を参照）。
１００−［（細胞マットＬＤＨ）×１００／（Ｔ０におけるＬＤＨ細胞）］
表２に、緩衝液中又は異なる濃度のＨｂＡｍから得られたＬＤＨ遊離率（結果は３回の平均値）を示す。
表２に、緩衝液中又は異なる濃度のＨｂＡｍから得られたＬＤＨ遊離率（結果は３回の平均値）を示す。
−結論
ＵＷ溶液（ViaSpan）中において、２４時間、４℃にてLLC-PK1細胞を保存すると、かなりの細胞死を引き起こした（７４±９％）。
ＵＷ溶液（ViaSpan）中において、２４時間、４℃にてLLC-PK1細胞を保存すると、かなりの細胞死を引き起こした（７４±９％）。
さらに、ＵＷ保存溶液中における保持緩衝液Hemorganの存在は、ほとんど、あるいは全く腎細胞の生存能力を変化させない。
対照的に、ＨｂＡｍが保存溶液中に存在すると、ＨｂＡｍ濃度１．２５ｇ／ｌから、細胞マットの生存は完全に保護される。
〔実施例４〕腎細胞の低温保存のインビトロモデルにおける、濃度０．０３９ｍｇ／ｍｌ〜１．２５ｍｇ／ｍｌであるアレニコラ マリナのヘモグロビンの効果のテスト
生物材料、細胞培養、および低温保存を、実施例３と同様に準備および実施した。
生物材料、細胞培養、および低温保存を、実施例３と同様に準備および実施した。
−ＨｂＡｍの濃度
１．２ｍｌの市販の保存溶液および、事前にＨｂＡｍを０、０．０３９、０．０７８、０．１５６、０．３１２、０．６２５、または１．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で添加したＵＷ溶液（ViaSpan（登録商標）, Bristol-Myers Squibb）の存在下で、２４時間、４℃にて細胞を保存した。
１．２ｍｌの市販の保存溶液および、事前にＨｂＡｍを０、０．０３９、０．０７８、０．１５６、０．３１２、０．６２５、または１．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で添加したＵＷ溶液（ViaSpan（登録商標）, Bristol-Myers Squibb）の存在下で、２４時間、４℃にて細胞を保存した。
−結果
結果は、低温保存期間以前に細胞マット（Ｔ０における細胞）内で検出されたＬＤＨの量に対する、４℃にて保存した細胞マット内にて検出されたＬＤＨの量の百分率で表した。その後、ＬＤＨ遊離率を、この関係から算出した（図４および表３）。
結果は、低温保存期間以前に細胞マット（Ｔ０における細胞）内で検出されたＬＤＨの量に対する、４℃にて保存した細胞マット内にて検出されたＬＤＨの量の百分率で表した。その後、ＬＤＨ遊離率を、この関係から算出した（図４および表３）。
１００−［（細胞マットＬＤＨ）×１００／（Ｔ０におけるＬＤＨ細胞）］
表３に、異なる濃度のＨｂＡｍについて得られたＬＤＨ遊離率（結果は３回の平均値）を示す。
表３に、異なる濃度のＨｂＡｍについて得られたＬＤＨ遊離率（結果は３回の平均値）を示す。
−結論
ＵＷ溶液（ViaSpan）中において、２４時間、４℃にてLLC-PK1細胞を保存すると、かなりの細胞死を引き起こした（７４±７％）。ＬＤＨの腎臓細尿管細胞からの遊離は、ＨｂＡｍの存在下では著しく減少し、容量依存的であった。このように、０．６２５ｍｇ／ｍｌのＨｂＡｍは、腎細胞を保護し（２５±１２％ ＶＳ ７６±７％）、濃度１．２５ｇ／ｌのＨｂＡｍは、低温保存の２４時間によって引き起こされる細胞死から、完全に腎細胞を保護した（７±５％ ＶＳ ７６±７％）。
ＵＷ溶液（ViaSpan）中において、２４時間、４℃にてLLC-PK1細胞を保存すると、かなりの細胞死を引き起こした（７４±７％）。ＬＤＨの腎臓細尿管細胞からの遊離は、ＨｂＡｍの存在下では著しく減少し、容量依存的であった。このように、０．６２５ｍｇ／ｍｌのＨｂＡｍは、腎細胞を保護し（２５±１２％ ＶＳ ７６±７％）、濃度１．２５ｇ／ｌのＨｂＡｍは、低温保存の２４時間によって引き起こされる細胞死から、完全に腎細胞を保護した（７±５％ ＶＳ ７６±７％）。
Claims (3)
- 臓器を保存する方法であって、
組成物中にて、臓器を静的または動的に灌流保存する段階を含み、
前記組成物は、臓器を保存または灌流するための組成物を作製するための、アレニコラ マリナ（Arenicola marina）の、少なくとも１種の天然に細胞外のネイティブヘモグロビンの使用方法であって、上記少なくとも１種の天然に細胞外のネイティブヘモグロビンを、終濃度０．６２５ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌで、臓器をその最低限の代謝要求を満たしながら虚血の悪影響から保護できる臓器保存培地と組み合わせる使用方法によって作製されており、
事前に摘出した前記臓器を、４℃〜１５℃の前記組成物ですすぐ段階、および
前記組成物中にて、前記臓器を、その種類に応じた所定時間、４℃〜１５℃にて静的または動的に灌流保存する段階を含むことを特徴とする方法。 - 脊椎動物または無脊椎動物の臓器細胞または臓器組織を培養する方法であって、
組成物中にて細胞を培養する段階を含み、
前記組成物は、臓器組織または臓器細胞を保存するための組成物を作製するための、アレニコラ マリナ（Arenicola marina）の、少なくとも１種の天然に細胞外のネイティブヘモグロビンの使用方法であって、前記少なくとも１種の天然に細胞外のネイティブヘモグロビンを、終濃度０．６２５ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌで、細胞をその最低限の代謝要求を満たしながら虚血の悪影響から保護できる臓器保存培地と組み合わせる、使用方法によって作製されており、
前記組成物中にて、無脊椎動物から事前に採取した細胞を、その種類に応じた所定時間、４℃〜１５℃にて培養する段階、および
細胞マットをすすぎ、かつ溶菌させて、前記細胞を採取する段階
を含むことを特徴とする方法。 - 前記臓器保存培地は、ウイスコンシン大学液（ＵＷ，Ｖｉａｓｐａｎ（登録商標））、ＩＧＬ１（登録商標）、Ｃｅｌｃｉｏｒ（登録商標）、ＳＣＯＴ Ｍａｃｏ（登録商標）、ＢＭＰＳ Ｂｅｌｚｅｒ（登録商標）、Ｃｕｓｔｏｄｉｏｌ（登録商標） （ＨＴＫ）、Ｅｕｒｏ−Ｃｏｌｌｉｎｓ（登録商標）、Ｓｏｌｔｒａｎ（登録商標）、Ｐｅｒｆａｄｅｘ（登録商標）、Ｒｉｎｇｅｒ ｌａｃｔａｔｅ（登録商標）、もしくはＰｌｅｇｉｓｏｌ（登録商標）から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
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