FR3100035A1 - Utilisation d'hémoglobine d'annélides in vitro - Google Patents
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Classifications
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- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
Abstract
UTILISATION D'HÉMOGLOBINE D'ANNÉLIDES IN VITRO La présente invention se rapporte à un procédé d’analyse d’un échantillon de cellules d’un patient ou d’un organoïde, comprenant : une première étape de mélange de l’échantillon de cellules du patient ou de l’organoïde avec au moins une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides, optionnellement, une seconde étape de préparation du mélange obtenu à la première étape, et une troisième étape d’analyse du mélange obtenu à la première ou à la seconde étape. Figure pour l'abrégé : aucune
Description
La présente invention concerne l’utilisation d’une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides, pour son usagein vitro. En particulier, la présente invention se rapporte à un procédé d’analyse d’un échantillon de cellules d’un patient ou d’un organoïde, comprenant :
une première étape de mélange de l’échantillon de cellules du patient ou de l’organoïde avec au moins une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides,
optionnellement, une seconde étape de préparation du mélange obtenu à la première étape, et
une troisième étape d’analyse du mélange obtenu à la première ou à la seconde étape.
Les examens de biologie médicale sont réalisés pour le dépistage et le suivi des maladies. Un examen biologique commence par le prélèvement d’un échantillon biologique chez un patient. Cet échantillon est ensuite analysé pour déterminer la valeur normale ou le déséquilibre d’un paramètre biologique, et ainsi identifier la nature, la cause ou le pronostic d’une maladie.
Parmi les différents échantillons biologiques utilisables, les échantillons comprenant des cellules d’un patient sont particulièrement délicats. En effet, le maintien en bon état et/ou la survie des cellules prélevées sont cruciaux pour la pertinence et la sensibilité des résultats qui en découlent.
Les cellules constituent un matériel biologique sensible ; des conditions de culture ou de stockage inadaptées peuvent induire leur mort, ce qui peut avoir pour conséquence de fausser les résultats des analyses, voire même de rendre leurs analyses impossibles.
Pourtant, les techniques actuelles de biologie médicale ne sont pas nécessairement appropriées pour maintenir une survie optimale des cellules.
Il est d’une part important d’obtenir des échantillons biologiques de bonne qualité, prélevés et préparés selon des standards de qualité (voir la publication Ziv et al, The Importance of Biopsy in the Era of Molecular Medicine, Cancer J, 2016 ; 22(6) :418-422).
D’autre part, l’utilisation de certains solvants, en particulier les solvants organiques volatils, pose des problèmes de santé et de sécurité : par exemple, le formaldéhyde (ou formol) est un composé cancérigène et fortement volatil. Lors de la préparation d’un échantillon biologique en vue de son analyse, ce solvant est à manipuler avec précaution.
Ainsi, il existe un besoin pour une méthode permettant de maintenir les cellules prélevées d’un patient vivantes, le plus longtemps possible. Cela permettrait d’effectuer des analyses de façon fiable, reproductible et sensible. En outre, cela permettrait de lire et/ou interpréter les résultats avec précision et dans des conditions optimales, car proches du contextein vivo. Enfin, il existe un besoin pour une méthode qui limite ou n’utilise pas de solvant organique volatil, et/ou qui substitue ce dernier, afin d’obtenir un environnement d’expérimentation plus sûr.
Par ailleurs, dans le domaine des testsin vitro, il est très courant d’utiliser des organoïdes comme matériel biologique mimant l’anatomie d’un organe. De telles structures ont des durées de vie limitées, et les mesures ne sont pas forcément effectuées dans de bonnes conditions.
Il existe donc un besoin pour une méthode permettant de préserver ce type de matériel biologique, afin d’assurer des mesures fiables et reproductibles.
La présente invention permet de répondre à ces attentes.
Elle a en effet pour objet un procédé d’analyse d’un échantillon de cellules d’un patient ou d’un organoïde, comprenant :
une première étape de mélange de l’échantillon de cellules du patient ou de l’organoïde avec au moins une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides,
optionnellement, une seconde étape de préparation du mélange obtenu à la première étape, et
une troisième étape d’analyse du mélange obtenu à la première ou à la seconde étape.
Un tel procédé permet, grâce à la présence d’au moins une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides, de maintenir l’échantillon de cellules ou l’organoïde en vie dans de bonnes conditions.
En outre, l’échantillon présente une durée de vie significativement améliorée. Cette durée de vie est bien entendu dépendante de la taille de l’échantillon, et du volume dans lequel il est immergé.
En ce qui concerne l’organoïde, sa durée de vie est également améliorée, et permet des mesures fiables et reproductibles.
Le procédé selon l’invention présente l’avantage de pouvoir être mis en œuvre depuis le bloc opératoire où l’échantillon d’un patient, de préférence une biopsie, est prélevé, jusqu’au laboratoire d’analyses : en effet, dès le prélèvement, l’échantillon est mélangé avec au moins une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides, puis il subit les étapes subséquentes du procédé de manière inhérente (par exemple hotte aspirante dans le cas d’utilisation de solvant organique volatil).
La présente invention a également pour objet l’utilisation d’une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides, pour la conservation d’au moins un échantillon de cellules d’un patient ou d’un organoïde.
La molécule selon l’invention est choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides.
Cette molécule est un transporteur d’oxygène. Par « transporteur d’oxygène », on entend une molécule capable de transporter l’oxygène, de façon réversible, depuis l’environnement jusqu’aux cellules, tissus ou organes cibles.
L’hémoglobine extracellulaire d’Annélides est présente chez les trois classes d'Annélides: les Polychètes, les Oligochètes et les Achètes. On parle d’hémoglobine extracellulaire car elle est naturellement non contenue dans une cellule, et peut donc circuler librement dans le système sanguin sans modification chimique pour la stabiliser ou la rendre fonctionnelle.
L’hémoglobine extracellulaire d’Annélides est un biopolymère géant de poids moléculaire compris entre 2000 et 4000 kDa, constitué d'environ 200 chaînes polypeptidiques comprises entre 4 et 12 types différents que l'on regroupe généralement en deux catégories.
La première catégorie, comptant 144 à 192 éléments, regroupe les chaînes polypeptidiques dites "fonctionnelles" qui portent un site actif de type hème, et sont capables de lier réversiblement l'oxygène ; ce sont des chaînes de type globine (huit types au total pour l’hémoglobine d’Arenicola marina: a1, a2, b1, b2, b3, c, d1 et d2), dont les masses sont comprises entre 15 et 18 kDa. Elles sont très similaires aux chaînes de type α et β de vertébrés.
La deuxième catégorie, comptant 36 à 42 éléments, regroupe les chaînes polypeptidiques dites de « structure » ou « linkers » possédant peu ou pas de site actif mais permettant l'assemblage des sous-unités appelées douzièmes ou protomères. On compte deux types de linkers, L1 et L2.
Chaque molécule d'hémoglobine est constituée de deux hexagones superposés que l'on a nommés bicouche hexagonale (hexagonal bilayer) et chaque hexagone est lui-même formé par l'assemblage de six sous-unités (dodécamère ou protomère) en forme de goutte d'eau. La molécule native est formée de douze de ces sous-unités (dodécamère ou protomère). Chaque sous-unité a une masse moléculaire d’environ 250 kDa, et constitue l'unité fonctionnelle de la molécule native.
De préférence, l'hémoglobine extracellulaire d’Annélides est choisie parmi les hémoglobines extracellulaires d’Annélides Polychètes et les hémoglobines extracellulaires d’Annélides Oligochètes. De préférence, l'hémoglobine extracellulaire d’Annélides est choisie parmi les hémoglobines extracellulaires de la famille desLumbricidae, les hémoglobines extracellulaires de la famille desArenicolidaeet les hémoglobines extracellulaires de la famille desNereididae. Encore plus préférentiellement, l'hémoglobine extracellulaire d’Annélides est choisie parmi l’hémoglobine extracellulaire deLumbricus terrestris, l’hémoglobine extracellulaire d’Arenicola spet l’hémoglobine extracellulaire deNereis sp,plus préférentiellement l’hémoglobine extracellulaire d’Arenicola marinaou deNereis virens. L’arénicoleArenicola marinaest un ver annélide polychète vivant essentiellement dans le sable.
Selon l’invention, le protomère de globine de l’hémoglobine extracellulaire d’Annélides constitue l’unité fonctionnelle de l’hémoglobine native, comme indiqué ci-dessus.
Enfin, la chaîne de globine de l’hémoglobine extracellulaire d’Annélides peut notamment être choisie parmi les chaînes de globine de type Ax et/ou Bx d’hémoglobine extracellulaire d’Annélides.
L’hémoglobine extracellulaire d’Annélides, ses protomères de globine et/ou ses globines ne nécessitent pas de cofacteur pour fonctionner, contrairement à l'hémoglobine de mammifère, notamment humaine. Enfin, l’hémoglobine extracellulaire d’Annélides, ses protomères de globine et/ou ses globines ne possédant pas de typage sanguin, ils permettent d'éviter tout problème de réaction immunologique ou allergique. L’hémoglobine extracellulaire d’Annélides, ses protomères de globine et/ou ses globines présentent une activité superoxide dismutase (SOD) intrinsèque. Par conséquent, cette activité anti-oxydante intrinsèque ne nécessite aucun antioxydant pour fonctionner, contrairement à l'utilisation d'une hémoglobine de mammifères pour laquelle les molécules antioxydantes sont contenues à l'intérieur du globule rouge et ne sont pas liées à l'hémoglobine.
L’hémoglobine extracellulaire d’Annélides, ses protomères de globine et/ou ses globines peuvent être natifs ou recombinants.
De préférence, l’hémoglobine extracellulaire est celle d’Arenicola marina.
Le procédé selon l’invention comprend une première étape de mélange de l’échantillon de cellules du patient ou de l’organoïde avec au moins une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides.
L’échantillon de cellules du patient est tout échantillon biologique dudit patient comprenant des cellules. L’échantillon de cellules peut être un ensemble de cellules isolées, un fragment de tissu biologique, ou bien encore un organe ou un fragment d’organe. Les cellules peuvent être eucaryotes ou procaryotes, de préférence eucaryotes, de préférence de mammifère, de préférence humaines.
Cet échantillon est de préférence un échantillon sanguin, une biopsie, un frottis ou une résection d’organe.
Un échantillon sanguin est de préférence un échantillon comprenant au moins des hématies.
Une biopsie est un prélèvement d’un fragment d’un organe ou d’un tissu, généralement effectué au moyen d’une aiguille ou d’un trocart.
Un frottis est un prélèvement effectué par grattage, généralement au moyen d’un écouvillon, d’une petite brosse ou d’une petite spatule.
Une résection d’organe, appelée également ablation, est un retrait par chirurgie d’une partie d’organe ou d’un tissu, généralement pathologique.
Le patient peut être tout animal vertébré ou invertébré ; de préférence il s’agit d’un mammifère, de préférence d’un humain.
De préférence, l’échantillon de cellules d’un patient est un échantillon d’une partie d’organe ou de tissu pathologique, notamment affecté par un cancer. Ainsi, de préférence, l’échantillon de cellules d’un patient est un échantillon d’une partie d’organe ou de tissu tumoral.
Selon une alternative, le procédé selon l’invention peut également comprendre une première étape de mélange de l’organoïde avec au moins une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides.
Par « organoïde », on entend une structure tridimensionnelle qui reproduitin vitrola micro-anatomie d’un organe. Un organoïde correspond donc à un modèle d’organe ; il est préparé hors de tout organisme vivant. Il est généralement obtenu par culture en laboratoire d’une ou plusieurs cellules précurseurs d’un tissu, telles que des cellules souches (type cellules souches embryonnaires ou pluripotentes induites). Ces cellules peuvent s’auto-organiser en trois dimensions, dans un milieu nutritif adéquat comprenant des facteurs de croissance et de différentiation, pour former le mini-organe. De préférence, les cellules s’auto-organisent dans un environnement tridimensionnel adapté, tel qu’un hydrogel ou une matrice poreuse.
L’organoïde utilisé dans la présente invention peut être n’importe quel organoïde utilisé en testin vitro, par exemple une peau reconstruite, un organoïde cérébral, un organoïde tumoral, un organoïde intestinal ou un organoïde rénal.
Un organoïde est donc distinct des cellules classiques en culture (par exemple en boîtes de Pétri) ; tandis que l’organoïde est forcément en trois dimensions (3D), les cellules en culture ne sont qu’en 2D.
Typiquement, les organoïdes peuvent être utilisés pour tester la toxicité ou l’efficacité de potentiels médicaments, ou bien pour tester l’innocuité de compositions cosmétiques.
Selon l’invention, de préférence, la globine, le protomère de globine ou l’hémoglobine extracellulaire d’Annélides utilisé dans la première étape peut être formulée dans une solution tampon, un milieu de culture cellulaire ou une solution de préservation d’organe ou de greffon.
La solution tampon créée un environnement salin adéquat pour l’hémoglobine, ses protomères et ses globines, et permet ainsi le maintien de la structure quaternaire, et donc de la fonctionnalité de cette molécule. Grâce à la solution tampon, l’hémoglobine, ses protomères et ses globines sont capables d’assurer leur fonction d’oxygénation.
La solution tampon selon l’invention est de préférence une solution aqueuse comprenant des sels, de préférence des ions chlorure, sodium, calcium, magnésium et potassium, et confère à la composition selon l’invention un pH compris entre 5 et 9, de préférence entre 5.5 et 8.5, de préférence entre 6.5 et 7.6 ; sa formulation est similaire à celle d’un liquide physiologiquement injectable. Dans ces conditions, l’hémoglobine extracellulaire d’Annélides, ses protomères de globine et ses globines restent fonctionnels.
Dans la présente description, le pH s’entend à température ambiante (25°C), sauf mention contraire. De préférence, la solution tampon est une solution aqueuse comprenant du chlorure de sodium, du chlorure de calcium, du chlorure de magnésium, du chlorure de potassium, ainsi que du sodium gluconate et du sodium acétate, et a un pH compris entre 6.5 et 7.6, de préférence égal à 7,1 ± 0,5, de préférence d’environ 7.35. Plus préférentiellement, la solution tampon est une solution aqueuse comprenant 90 mM de NaCl, 23 Mm de Na-gluconate, 2,5 mM de CaCl2, 27 mM de Na-acétate, 1,5 mM de MgCl2, 5 mM de KCl, et a un pH de 7,1 ± 0,5, pouvant contenir entre 0 et 100 mM d’antioxydant de type acide ascorbique et/ou glutathion réduit.
De préférence, la globine, le protomère de globine ou l’hémoglobine extracellulaire d’Annélides utilisée dans la première étape peut également être formulée dans une solution de préservation d’organe ou de greffon, ou un milieu de culture cellulaire.
Par exemple, la solution de conservation d’organes peut être une solution aqueuse ayant un pH compris entre 6.5 et 7.5, comprenant des sels, de préférence des ions chlorure, sulfate, sodium, calcium, magnésium et potassium ; des sucres, de préférence le mannitol, le raffinose, le saccharose, le glucose, le fructose, le lactobionate (qui est un imperméant), ou le gluconate ; des antioxydants, de préférence le glutathion ; des agents actifs, de préférence des inhibiteurs de xanthine oxydase tel que l’allopurinol, des lactates, des acides aminés tel que l’histidine, l’acide glutamique (ou glutamate), le tryptophane ; et éventuellement des colloïdes tels que de l'hydroxyéthyl amidon, du polyéthylène glycol ou du dextran.
Les milieux de culture cellulaire sont disponibles commercialement et très variés. Par exemple, des milieux disponibles chez Invitrogen, sans être limités à ceux-ci sont les milieux suivants : D-MEM, D-MEM/F-12, MEM, RPMI 1640, milieu 199 ou tout milieu analogue.
Typiquement, l’hémoglobine, ses protomères ou ses globines est utilisée dans une concentration allant de 0,03 g/L à 40 g/L, de préférence de 0,05 g/L à 35 g/L, de préférence de 0,1 g/L à 30 g/L, de préférence de 0,5 g/L à 25 g/L, de préférence de 1 g/L à 20 g/L, de préférence de 1,5 g/L à 20 g/L.
La température de mise en œuvre du procédé peut être comprise entre 0°C et 40°C, de préférence entre 2°C et 39°C. De préférence, cette température est d’environ 4°C ; alternativement de préférence, cette température est d’environ 37°C.
A la fin de la première étape du procédé, on obtient ainsi un mélange d’hémoglobine, de ses protomères ou de ses globines et d’échantillon de cellules ou d’organoïde.
De façon optionnelle, une seconde étape est présente dans le procédé : cette seconde étape comprend la préparation du mélange obtenu à la première étape.
De préférence, cette seconde étape comprend au moins la coloration et/ou l’amincissement et/ou l’inclusion dans la paraffine ou une résine époxy, d’au moins certaines cellules et/ou d’au moins certains organites cellulaires de l’échantillon.
Par « organite cellulaire », on entend un compartiment différencié contenu dans les cellules eucaryotes qui a une fonction donnée. De préférence, l’organite cellulaire est choisi parmi le noyau, les lysosomes, les peroxysomes et les mitochondries.
Selon une première alternative, la seconde étape comprend directement au moins la coloration et/ou l’amincissement et/ou l’inclusion dans la paraffine ou une résine époxy, d’au moins certaines cellules de l’échantillon.
Selon une seconde alternative, la seconde étape comprend l’isolation d’au moins certains organites cellulaires de l’échantillon, puis leur coloration et/ou leur amincissement et/ou leur inclusion dans la paraffine ou une résine époxy. Par exemple, la seconde étape peut comprendre l’isolation des mitochondries de l’échantillon de cellules du patient, puis leur coloration.
Les tissus biologiques présentent en eux-mêmes très peu de contraste en imagerie. Typiquement, la coloration est utilisée aussi bien pour augmenter le contraste que pour mettre en valeur une structure particulière.
La coloration peut être réalisée à l’aide d’un colorant classique, notamment un colorant acide ou basique. Un tel colorant peut être choisi parmi le carmin, l’hématoxyline, l’éosine, l’acide picrique, la fuschine acide, la fuschine basique, l’orange G, l’érythrosine, la safranine, la coloration PAS (Periodic Acid Schiff), le bleu de méthylène et la thionine.
Le colorant peut également être la Rhodamine 123. Ce colorant est notamment utilisé pour la coloration des mitochondries.
L’amincissement de l’échantillon peut être effectué par tranchage, notamment à l’aide d’un microtome, pour réaliser des coupes adaptées.
Cet amincissement est notamment effectué après inclusion d’au moins certaines cellules de l’échantillon dans la paraffine ou une résine époxy.
Typiquement, le mélange obtenu à la première étape est mélangé avec de la paraffine à l’état liquide, ou avec une résine époxy, puis le mélange résultant est séché. La paraffine présente l’avantage d’être liquide à une température supérieure à 56 °C et de se solidifier lorsque la température passe en dessous de cette limite. On obtient finalement des blocs de paraffine solide, ou de résine époxy polymérisée, contenant les cellules de l’échantillon. Ces blocs peuvent alors être débités à l’aide d’un microtome, pour obtenir des coupes fines d’échantillon de quelques micromètres d'épaisseur. Ces coupes peuvent subir ensuite une coloration, de façon à identifier certains éléments de façon plus ou moins spécifique, avant d’être placées sur une lame de microscope pour analyse.
De préférence, l’échantillon de cellules du patient obtenu à la première ou la seconde étape est conservé pendant une durée de quelques heures, par exemple au moins 24 heures, de préférence au moins 50 heures, de préférence au moins 100 heures à une température comprise entre 0°C et 10°C, par exemple 4°C ; ou bien à une température comprise entre 15°C et 25°C, telle que la température ambiante.
Lorsqu’on utilise un organoïde, la seconde étape du procédé selon l’invention, optionnelle, comprend la préparation du mélange obtenu à la première étape. Cette préparation peut alors comprendre la mise en contact d’un composé avec le mélange obtenu à la première étape.
Le composé peut être toute molécule potentiellement active, ou bien une composition cosmétique. La molécule peut être chimique ou biologique.
Le procédé vise alors à déterminer les effets éventuels du composé sur l’organoïde.
La seconde étape peut comprendre au moins la coloration d’au moins certaines cellules de l’organoïde.
Enfin, le procédé selon l’invention comprend une troisième étape d’analyse du mélange obtenu à la première ou à la seconde étape.
Notamment, la troisième étape comprend l’analyse par histologie, par microscopie, par détection immunologique ou par biologie moléculaire.
L’histologie est une technique d’analyse biologique comprenant l’identification d’un ensemble de cellules données par des moyens chimiques, enzymatiques, par radiographie ou par immunologie.
De préférence, l’histologie est choisie parmi l’histochimie, l’histochimie enzymatique, l’historadiographie et l’immunohistochimie.
On parle d’histochimie quand au moins certaines cellules ou organites de l’échantillon ou de l’organoïde sont colorées grâce à des réactions chimiques connues entre des réactifs de laboratoire et des composants des cellules étudiées (de type cytoplasme, noyau, ou présence de glucides).
Ainsi, l’analyse par histochimie est effectuée lorsque la seconde étape comprend au moins la coloration de l’échantillon ou de l’organoïde.
L’histochimie enzymatique est une méthode histologique qui permet la détermination de l'activité d'une ou plusieurs enzymes dans un tissu donné. La technique histoenzymologique ne révèle pas les enzymes en tant que telles, mais leur présence par le produit obtenu au cours de leur action sur un substrat spécifique de l’enzyme en question.
L’historadiographie consiste à faire des coupes minces du tissu à observer et à leur inclusion dans de la paraffine (i.e. seconde étape d’amincissement et d’inclusion de l’échantillon), puis à les observer en utilisant des radiations.
Enfin, l’immunohistochimie consiste à utiliser des anticorps pour se fixer à une molécule présente dans au moins certaines cellules de l’échantillon ou de l’organoïde. Ces anticorps sont spécifiques de la molécule à identifier et donc de l’analyse à effectuer. Les complexes anticorps-antigènes (présents dans l’échantillon) sont ensuite révélés en utilisant un composé chimique.
De préférence, on utilise des anticorps ciblant des antigènes tumoraux.
La microscopie peut être une microscopie optique ou une microscopie électronique à balayage.
La détection immunologique repose sur le même principe que l’immunohistochimie, et utilise des anticorps pour se fixer à une molécule présente dans au moins certaines cellules de l’échantillon ou de l’organoïde.
De préférence, la détection immunologique comprend l’utilisation d’au moins un anticorps dirigé contre un antigène cancéreux ou un antigène inflammatoire.
L’analyse par biologie moléculaire peut comprendre notamment l’utilisation de PCR, ou encore la détection d’un ratio d’acides nucléiques tel que le ratio ADN/ARN, notamment par spectrophotométrie. Un ratio ADN/ARN élevé indique une quantité d’ARN faible, donc une vie des cellules faible. Le mélange de l’échantillon de cellules du patient ou de l’organoïde avec au moins une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides selon l’invention, permet notamment de protéger les ARN cellulaires, et d’obtenir ainsi des résultats plus fiables et reproductibles.
Lorsqu’on utilise un organoïde, la troisième étape du procédé selon l’invention peut comprendre l’analyse par histologie, par détection immunologique ou par biologie moléculaire, notamment comme indiqué ci-avant.
La présente invention est illustrée par l’exemple suivant, nullement limitatif.
Exemple 1 :
Etude de préservation de différents organes
de rat
, par analyse des mitochondries
Le but de l'étude est d'identifier une condition optimale de conservation des organes pour le foie, le cœur et le cerveau de rat.
Les organes ont été conservés à 4°C dans une solution d’HEMO2Life® avec modulation de la période de conservation et de la concentration en HEMO2Life®. L’efficacité de la conservation a été évaluée par la caractérisation de l’intégrité et de la fonctionnalité mitochondriales.
Le principal challenge de cette étude est d’éviter les préparations extemporanées de mitochondries en optimisant la conservation des échantillons pendant le transport.
HEMO2Life® est une composition comprenant l’hémoglobine extracellulaire d’Arenicola marina,avec différents excipients.
Matériels et Méthodes
Organes
Les organes utilisés sont le foie, le cœur et le cerveau de rats Wistar mâles de 250 g (référence: WI (Han), Charles River).
Conditions de conservation
Durée:
Chaque organe est mélangé avec HEMO2Life® (première étape du procédé selon l’invention).
Une période de conservation de 24 heures a été définie comme point de référence. Selon les résultats obtenus à ce temps, des points temporels plus longs ou plus courts ont été évalués avec une modulation de la concentration en HEMO2Life®. En cas de bonne conservation à 24 heures (foie), un délai plus long a été testé. En cas de mauvaise conservation à 24 heures (cœur et cerveau), une période plus courte a été testée.
Solution HEMO2Life®:
HEMO2Life® (solution-mère à 49 g/L) a été diluée dans du tampon de stabilisation à 20 g/L. La solution a été diluée dans du tampon de stabilisation pour obtenir une concentration finale de 15, 10 ou 5 g/L dans 8 mL (volume final).
Récipient:
Les récipients sont des tubes à fond plat de 20 ml (récipient PP, Dominique Dutscher). Le volume de HEMO2Life® représente 40% du volume total du tube (8 mL).
Agitation:
Les récipients ont été placés sur un appareil d’agitation (IKA HS 260 basic, VWR) à la vitesse de 90 allers-retours/minute.
Température:
Les échantillons ont été conservés dans une chambre froide à 4°C.
Les mitochondries ont été isolées des organes par congélation, broyage, puis centrifugation en gradient de densité (seconde étape du procédé selon l’invention), puis incubées à 37°C pendant 45 minutes. L’intégrité des mitochondries est évaluée par absence de gonflement spontané et par le potentiel transmembranaire, et leur fonctionnalité est évaluée par l’indice de contrôle respiratoire après incubation.
Paramètres
Gonflement et potentiel transmembranaire:
Les mitochondries ont été incubées à 37°C avec de la Rhodamine 123 dans des plaques 96 puits dans 200 µL (volume final) (seconde étape du procédé selon l’invention, étape de coloration).
L’absorbance à 545 nm (gonflement) et la fluorescence de la Rhodamine 123 (perte de ∆Ψm; λExcitation 485 nm; λEmission 535 nm) ont été enregistrées en temps réel pendant 45 minutes à l'aide d'un spectrofluorimètre (Tecan Infinite 200). Des traitements de CaCl2 (50 µM) et mCICCP (carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone) (50 µM) ont été utilisés comme contrôle positif du gonflement et de la perte de ∆Ψm, respectivement.
Respiration:
Les mitochondries isolées ont été incubées dans une cellule de 1,5 mL sous agitation magnétique avec une électrode à oxygène de type Clark (Hansatech Instruments Ltd, Norfolk, Royaume-Uni), thermostatées à 37°C, dans 500 µL d'un milieu constitué de 0,3M de mannitol, du tampon phosphate 10 mM (pH 7,3), KCl 10 mM, MgCl2 5 mM et 1 mg/ml de BSA (sérum albumine bovine). L’addition d’ADP (1,65 mM) provoque une augmentation soudaine de l’absorption d’oxygène lorsque l’ADP est converti en ATP, caractérisée par un état de respiration active. L’inhibiteur Oligomycine A (1 µM), qui bloque la respiration dans les mitochondries couplées et l'agent de découplage mClCCP ont été ajoutés pour rétablir l'activité.
Calculs
Gonflement:
Le gonflement est calculé comme suit (troisième étape du procédé selon l’invention) :
Potentiel transmembranaire:
Le potentiel transmembranaire est calculé comme suit (troisième étape du procédé selon l’invention) :
Indice de contrôle respiratoire (RCI):
L’indice de contrôle respiratoire est calculé comme suit :
Cet indice indique l'étanchéité de la phosphorylation oxydative, se référant ainsi à la fonctionnalité de la chaîne respiratoire et à la qualité de la préparation mitochondriale.
Critères d’acceptation
Une condition de préservation a été validée pour le foie et le cœur si:
Gonflement spontané <20%
Perte de ∆Ψm spontanée <20%
RCI > 3 (le RCI chez les mitochondries isolées à partir de foie et de cœur frais était de 6,34 et 4,85 respectivement).
Une condition de préservation a été validée pour le cerveau si:
Gonflement spontané <20%
Perte de ∆Ψm spontanée <20%
RCI > 2 (le RCI des mitochondries isolées à partir de cerveau frais était de 3,23).
Résultats
Les résultats sont résumés ci-dessous.
Le foie est l'organe présentant la plus longue période (30 h) de conservation à 4°C dans HEMO2Life®. Au-delà, la membrane mitochondriale commence à se rompre et l’activité respiratoire diminue fortement. Pour le foie frais, l'indice de contrôle respiratoire (RCI) est de 6,34, le gonflement spontané est de 5,40% et la perte de ∆Ψm spontanée est de 1,89%. Après 24 h, la valeur de RCI est restée supérieure à 5, et le gonflement spontané et la perte de ∆Ψm spontanée sont inférieurs à 10%, ce qui suggère que la fonctionnalité des mitochondries est fortement conservée. HEMO2Life® à 10 et 15 g/L maintient la fonctionnalité mitochondriale pendant 30 h d’incubation à 4°C. Il est intéressant de noter que la concentration de 10 g/L semble mieux préserver l'activité respiratoire (RCI = 4,55 pour 10 g/L et 3,59 pour 15 g/L), tandis que la concentration de 15 g/L semble mieux conserver l’intégrité de la membrane (gonflement spontané = 17,86 pour 10 g/L et 9,25 pour 15 g/L). En revanche, HEMO2Life® à 5 g/L semble trop faible pour assurer l’intégrité mitochondriale après 30 h à 4°C, comme le montre un gonflement spontané élevé (> 20%) révélant une perméabilisation de la membrane mitochondriale. Une plus forte concentration (20 g/L) de HEMO2Life® semble être délétère pour la fonction mitochondriale, perturbant l'activité de la chaîne respiratoire.
Quelle que soit la concentration de HEMO2Life®, la fonctionnalité mitochondriale n’est pas préservée au-delà d’une incubation de 30 h à 4°C.
La fonctionnalité des mitochondries cardiaques a été préservée avec une incubation de 24 h à 4°C avec 15 g/L de HEMO2Life®.
En effet, avec un cœur frais, la valeur de RCI est de 4,85, le gonflement spontané est de 6,94% et la perte de ∆Ψm spontanée est de 7,81%. Au bout de 16 h d’incubation, 5 g/L d’HEMO2Life® ne sont pas suffisants pour préserver l’activité respiratoire (RCI = 2,71). Cependant, les concentrations de 10 g/L (RCI = 3,78) et 15 g/L (RCI = 3,44) permettent le maintien de la fonctionnalité mitochondriale à ce moment précis. À 24 heures d’incubation, seulement 15 g/L de HEMO2Life® permettent de préserver la fonctionnalité mitochondriale (RCI> 3). En revanche, HEMO2Life® à 10 g/L n'est pas suffisant (RCI = 2,63) et la concentration de 20 g/L semble trop élevée pour assurer une bonne conservation (RCI = 2,83). Au-delà de 24 h, la fonctionnalité mitochondriale et l'intégrité du cœur ne sont pas préservées.
Les mitochondries isolées à partir de cerveau frais sont moins fonctionnelles que les mitochondries du foie et du cœur, comme indiqué par la valeur de RCI (RCI = 3,23), tandis que l'intégrité de ces mitochondries est similaire (gonflement spontané = 5,12% et perte spontanée en ∆Ψm = 5,39%). La fonctionnalité et l’intégrité mitochondriales du cerveau pourraient être préservées avec 12h à 4°C et 15 g/L de HEMO2Life® (RCI ≥ 2, gonflement <12% et perte spontanée en ∆Ψm <10%), tandis qu'une dose de 10 g/L n’est pas suffisante (RCI = 1,79). Au-delà de cette période, la fonctionnalité et l’intégrité mitochondriales ne sont pas conservées. Ensuite, parmi les conditions testées pour le cerveau, HEMO2Life® à 15 g/L pendant 12 h est la condition la plus appropriée sans dommage sur la membrane mitochondriale mais un RCI limite.
Pour conclure, le foie est l’organe présentant la plus longue période de conservation dans HEMO2Life® (30 h), suivi du cœur (24 h) puis du cerveau (12 h). Pour ces périodes, la concentration requise en HEMO2Life® est de 15 g/L pour le cœur et le cerveau, et de 10 g/L pour le foie. La concentration de 10 g/L est protectrice pendant 16 h pour le cœur, alors qu’elle ne préserve pas le cerveau pendant 12 h.
Une augmentation de la concentration d'HEMO2Life® jusqu'à 20 g/L n'est pas protectrice, quel que soit l'organe évalué.
Le procédé d’analyse selon l’invention permet de définir les conditions optimales pour le transport des organes notamment de rat, tels que foie, cœur et cerveau, sans aucune altération des mitochondries.
Claims (10)
- Procédé d’analyse d’un échantillon de cellules d’un patient ou d’un organoïde, comprenant :
une première étape de mélange de l’échantillon de cellules du patient ou de l’organoïde avec au moins une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides,
optionnellement, une seconde étape de préparation du mélange obtenu à la première étape, et
une troisième étape d’analyse du mélange obtenu à la première ou à la seconde étape. - Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'hémoglobine extracellulaire d’Annélides est choisie parmi les hémoglobines extracellulaires d’Annélides Polychètes, de préférence parmi les hémoglobines extracellulaires de la famille desArenicolidaeet les hémoglobines extracellulaires de la famille desNereididae.
- Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'hémoglobine extracellulaire d’Annélides est choisie parmi l’hémoglobine extracellulaire d’Arenicola marinaet l’hémoglobine extracellulaire deNereis, plus préférentiellement l’hémoglobine extracellulaire d’Arenicola marina.
- Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel l’échantillon de cellules du patient est un échantillon sanguin, une biopsie, un frottis ou une résection d’organe.
- Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel la troisième étape comprend l’analyse par histologie, par microscopie, par détection immunologique ou par biologie moléculaire.
- Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel la seconde étape comprend au moins la coloration et/ou l’amincissement et/ou l’inclusion dans la paraffine ou une résine époxy, d’au moins certaines cellules et/ou d’au moins certains organites cellulaires de l’échantillon, ou bien la coloration d’au moins certaines cellules de l’organoïde.
- Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel la seconde étape comprend :
soit directement au moins la coloration et/ou l’amincissement et/ou l’inclusion dans la paraffine ou une résine époxy, d’au moins certaines cellules de l’échantillon ;
soit l’isolation d’au moins certains organites cellulaires de l’échantillon, puis leur coloration et/ou leur amincissement et/ou leur inclusion dans la paraffine ou une résine époxy ;
soit, dans le cas d’un organoïde, la mise en contact d’un composé avec le mélange obtenu à la première étape. - Procédé selon l’une des revendications 5 à 7, dans lequel l’histologie est choisie parmi l’histochimie, l’histochimie enzymatique, l’historadiographie et l’immunohistochimie.
- Procédé selon l’une des revendications 5 à 7, dans lequel la détection immunologique comprend l’utilisation d’au moins un anticorps dirigé contre un antigène cancéreux ou un antigène inflammatoire.
- Utilisation d’une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides, pour la conservation d’au moins un échantillon de cellules d’un patient ou d’un organoïde.
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