KR20060095993A - 기관 기능 평가 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 기관 또는 조직 손상의 분석 방법을 제공한다 :
(a) 염료로 기관 또는 조직을 표지함 ;
(b) 상기 기관 또는 조직의 생체외 대사 및/또는 세포 조건을 포함하여 다수의 지시를 수득함 ; 및
(c) 상기 지시로부터 기관 또는 조직 손상을 분석함.
기관, 조직, 손상
Description
본 발명은 기관 기능 평가 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 미세해부학 기원 혈관계 및/또는 배설 경로로 다수의 반응 지시 (indice) 를 정량적으로 측정하고/하거나 또는 시각적으로 분석하는 방법에 관한 것이다.
위스콘신 대학 용액 (University of Wisconsin solution) 의 사용이 간 이식에 대한 평균 보존 시간을 향상시켰더라도, 원발성 이식 기능부전 및 초기의 불량한 기능의 지시는 여전히 지속된다 (1-3). 그러한 기능장애 및 결과적인 이식 생존의 상실의 임상적인 지시는 저장 시간에 따라 다르다 (1-4). 재관류 손상 (reperfusion injury) 은 장기간 한랭 허혈증 (prolonged cold ischemia) 후에 이식 실패를 초래하는 주요 사건이다 (5-9). 저장 동안에, 간세포는 팽창하고, 수포를 형성한다 (6-8). 그러나, 재관류 시, 실질 세포 내에서의 이러한 변화는 그의 비가역적 손상을 초래하지 않으면서 복구되었다 (6-8). 반면, 간문맥동 내피 세포 (sinusoidal endothelial cell) 는 그의 생존 능력을 상실하고, 쿠퍼 세포 (Kupffer cell) 는 활성화된다 (6-10). UW 용액 내에서 저장된 래트 간 이식체를 사용한 이전의 연구에 따르면, 간문맥 세포에서의 변화가 발생하는 중요한 저장 시간은 16 시간보다 더 길다 (6, 7). 이러한 이식체에서, 세포는 손상 을 받아 혈소판 포착 (10), 섬유소 침착 (11), 및 백혈구 연변추향 (12) 을 야기하였다. 더 짧은 기간 동안 저장된 이식체에서, 간의 ATP 함량은 재관류 후에 잘 회복된다고 보고되었으며, 이는 실질 세포가 생존가능함을 제시한다 (13, 14).
이러한 데이타와는 관계없이, 간세포가 비가역적 손상을 나타내지 않으면서 그의 기능을 상실한 다음, 전체적으로 이식 기능을 방해하는지 주의 깊게 시험해 본 적은 없었다. 담 박출량 (biliary output), 타우로콜산염 및 브로모술포프탈레인의 제거가 이전의 연구에서 측정되었더라도 (13-15), 그것들은 저장 시간이 18 시간으로 신장되는 경우조차 간세포에서 그러한 기능적 변경을 나타내는데 실패하였다 (13). 이러한 연구 외에도, 담즙 구성분을 배설하는 후-한랭 허혈성 이식체의 능력에 있어서의 변경에 관하여 이용가능한 정보가 거의 없었다. 그러한 지시는 담즙 형성을 위한 삼투압 구동력 (osmotic driving force) 을 산출하고 담즙염 또는 유기 음이온을 배설하는 간세포의 능력을 포함하며 ; 따라서, 글루타티온 및 빌리루빈의 배설은 이식체에 있어서 초기 간세포성 변화를 검출하는 마커로서 작용할 수 있었다. 유기 음이온 배설 능력은 생체 이물질을 해독하는 이식체의 효능 및 임상 이식에 있어서 동종이식 기능장애에 대한 위험 요소인 후-한랭 허혈성 과빌리루빈혈증 (hyperbilirubinemia) 의 심각성을 측정할 수 있었다 (2, 16).
발명의 개시
본 발명의 목적은 기관 기능의 평가 방법을 제공하는 것이다. 상기 발견을 기초로, 본 발명자는 추가의 연구를 계속하였다.
후-한랭 허혈성 이식체의 그러한 능력을 측정하기 위해, 우리는 본원에서 저장 시간의 기능으로서 담즙 샘플의 구성분에서의 변화를 시험하고, 간세포 상에서 초기 사건으로서 글루타티온 및 빌리루빈의 손상된 배설을 발견하였다. 이러한 사건은 유기 음이온의 담즙 배설을 위한 ATP-의존성 수송체인 다약물 내성 관련 단백질 2 (multidrug resistance associated protein 2, Mrp2) 의 세포질 재위치화의 결과인 것으로 판명되었다. 우리의 결과는, 이러한 수송체의 기능은 손상되는 반면, 이식체는 임의의 뚜렷한 간세포 손상을 나타내지 않으면서 그의 전체적인 에너지 전하를 확실히 유지한다는 것을 제시한다. 더욱이, 간세포에서의 그러한 변화를 위한 기작은 한랭 허혈증의 보다 짧은 기간 ; 즉 8 시간에 노출된 이식체 내의 쿠퍼 세포에서의 트롬복산 합성을 포함하는 것으로 여겨진다.
본 출원은 하기 발명을 제공한다 :
(1) 하기 단계를 포함하는, 기관 또는 조직 손상의 분석 방법:
(a) 염료로 기관 또는 조직을 표지함 ;
(b) 상기 기관 또는 조직의 생체외 대사 및/또는 세포 조건을 포함하여 다수의 지시를 수득함 ; 및
(c) 상기 지시로부터 기관 또는 조직 손상을 분석함.
(2) 기관 또는 조직은 간, 신장, 폐, 췌장 및 위장관으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 (1) 의 방법.
(3) 단계 (b) 는 혈관계 및/또는 배설 경로의 미세해부학 기원을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 (1) 또는 (2) 의 방법.
(4) 분석은 시각적으로 및/또는 정량적으로 수행되는 (1) 내지 (3) 중의 어느 한 방법.
(5) 세포 조건은 세포 생존 능력, 세포 손상, 분자 수송, 및 미토콘드리아 기능으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 (1) 내지 (4) 중의 어느 한 방법.
(6) 하기 단계를 포함하는, 약물 독성 평가 방법 :
(a) 염료로 기관 또는 조직을 표지함 ;
(b) 상기 기관 또는 조직에 테스트 약물을 적용함 ;
(c) 상기 기관 또는 조직의 생체외 대사 및/또는 세포 조건을 포함하여 다수의 지시를 수득함 ;
(d) 상기 지시로부터 기관 또는 조직 손상을 분석함 ; 및
(e) 약물이 상기 기관 또는 조직에 독성을 가지는지 아닌지 평가함.
(7) 기관 또는 조직은 간, 신장, 폐, 췌장 및 위장관으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 (6) 의 방법.
(8) 단계 (b) 는 혈관계 및/또는 배설 경로의 미세해부학 기원을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 (6) 또는 (7) 의 방법.
(9) 분석은 시각적으로 및/또는 정량적으로 수행되는 (6) 내지 (8) 중의 어느 한 방법.
(10) 세포 조건은 세포 생존 능력, 세포 손상, 세포 내 및 주변에서의 분자 수송, 및 생물학적 활성 화합물의 발생, 혈류, 및 조직 산소화로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 (6) 내지 (9) 중의 어느 한 방법.
도 1 은 한랭 보존 및 이어서, 재관류를 수행한 간 이식체의 담즙 방출의 시간 경과를 나타낸다. 열린 원은 비-허혈성 대조군 간으로부터의 데이타를 나타낸다. 열린, 그림자진, 및 닫힌 사각형은 각각 8, 16, 24 시간-한랭 저장에 노출된 이식체로부터의 데이타를 나타낸다. 닫힌 삼각형은 48-시간 저장 이식체로부터의 데이타를 나타낸다. 값은 5 개의 개별 실험의 평균 ± SE 이다. TC (+) 및 TC (-) : 30 μmol/ℓ 의 나트륨 타우로콜산염의 존재 및 부재 하에 수합된 데이타. R : 재관류의 개시. 담즙염-비의존성 및 -의존성 방출 둘 다 16-시간 보존된 이식체에서 감소되었음을 주목한다. 대조군으로부터의 데이타와 비교해 *P < 0.05. 16-시간 이식체로부터의 데이타와 비교해 †P < 0.05. 24-시간 이식체로부터의 데이타와 비교해 #P < 0.05.
도 2 는 담즙 구성분의 담즙 농도에 대한 한랭 허혈증의 지속 효과를 나타낸다. 담즙 구성분의 데이타를 재관류의 개시 후 20 분째에 수합하였다. A : 담즙염 (패널 A). B : 인지질. C : 담즙 내 환원된 글루타티온 (GSH) 의 농도. D : 재관류 전 및 20 분 후에 측정된 대조군 및 16-시간 저장된 이식체 내 GSH 의 간 농도. E : 담즙 내 빌리루빈 (BR)-Ⅸα 의 농도. F : 재관류 전 및 20 분 후에 측정된 대조군 및 16-시간 저장된 이식체 내 BR-Ⅸα 의 간 농 도. 값은 5 - 7 개의 개별 실험의 평균 ± SE 이다. 대조군 간으로부터의 데이타와 비교된 *P < 0.05. 16-시간 군으로부터의 데이타와 비교된 #P < 0.05. 20-분 재관류에 노출된 대조군 이식체로부터의 데이타와 비교된 †P < 0.05.
도 3 은 한랭 허혈증-재관류된 이식체에서 간세포 카르복시플루오레세인 (CF) 의 미세담관으로의 배출의 역동학에서의 변경을 나타낸다. A : 프로베네시드의 제거 전 (기저 로딩, basal loading), 및 제거 후 10 분 및 25 분째에 포착된 미세관의 CF 배설의 대표 그림. 24-시간 한랭 허혈성-재관류된 이식체 (화살표) 에서 미세담관 네트워크의 벌집무늬 패턴의 분포를 주목한다. 색상 막대기는 CF 의 공지된 농도로 검량된 형광 세기를 나타낸다. 막대기 : 30 ㎛. B : 한랭 허혈증의 다양한 기간 동안 저장된 이식체 내의 CF-채워진 폴리곤 (polygon) 의 밀도에 의해 판단되는 미세담관 네트워크의 재관류-유도된 분열에서의 차이. 대조군 간으로부터의 데이타와 비교된 *P < 0.05. C : 군 중에서 상당한 CF 로딩을 나타내는 초기의 간세포 CF 농도. 값은 5 개의 개별 실험의 평균 ± SE 이다.
도 4 는 카르복시플루오레세인 (CF) 의 미세담관 분비를 시각화함에 의한 Mrp2 기능의 생체 내 정량 분석을 나타낸다. A : 각각의 간세포로부터 염료 배설을 나타내는 그림의 대표 시리즈. 상부 ; 1.5 mM 프로베네시드의 존재 하에 관류된 이식체로부터의 이미지 (PB(+)). 하부 ; 프로베네시드의 제거 후 포착된 이미지 (PB(-)). 세포 내에서 형광의 시간-의존성 감소 및 이어서, 주변의 미세담관에서 염료의 응축 및 제거를 주목한다. 세포에서 염료 유지는 주목할 만하다. B : 간세포 CF 형광의 붕괴. 프로베네시드로 처리된 (닫힌 원) 또는 처리되지 않은 (열린 원) 이식체에서 간세포 CF 의 농도는, 직선이 지수 곡선을 나타내는 시간에 대해 준-대수적으로 (semi-logarithmically) 플롯되었다. 삽입 : CF 농도 및 8-비트 계조도 사이의 관계를 나타내는 검량 곡선 [CFapp] : CF 의 겉보기 농도. CF 농도는 3 μmol/ℓ 미만의 농도에서 계조도와 선형으로 관련되었다 (r2 = 0.996, p < 0.05). C : 간세포로부터 CF 배제의 반감기 (T1 /2) 에서의 차이. 값은 각 군에서 5 개의 개별 실험의 평균 ± SE 이다. 대조군 간으로부터의 데이타와 비교된 *P < 0.05. EHBR : Eisai 과빌리루빈혈증 래트로부터 단리된 이식체. PB : 1.5 mM 프로베네시드로 관류된 이식체.
도 5 는 한랭 허혈증-재관류 시 담즙으로 카르복시플루오레세인 (CF) 를 배설하는 간 이식체의 능력에서의 변경을 나타낸다. A : 다양한 길이의 한랭 허혈증에 노출된 이식체에서 담즙 CF 배설의 시간 경과에서의 차이. 열린 원 : Mrp2 억제제인 1.5 mM 프로베네시드를 제거한 후 즉시 관류된 대조군 이식체. 열리고 그림자진 사각형 : 프로베네시드의 부재 하에 각각 8- 및 24-시간 한랭 저장 및 이어서 재관류를 수행한 이식체. 그림자진 원 : 프로베네시드의 존재 하에 노르모관류된 (normoperfuse) 이식체. 닫힌 원 : Eisai 과빌리루빈혈증 래트로부터 단리된 노르모관류된 이식체. 값은 5 개의 개별 실험의 평균 ± SE 이다. T0 : 프로베네시드가 관류액으로부터 제거된 시간. 삽입 : CF 농도 및 형광 세기 사이의 선형 관계. B : 다양한 기간의 재관류 시 수합된 담즙 내 상대적인 CF 농도에서의 변경, 및 쿠퍼 세포 (KC) 의 제거의 효과 좌측 : 대조군 (0 시간, 파선) 및 8-시간-저장된 간 이식체 (8 시간, 실선) 사이의 담즙 CF 분비의 붕괴에서의 차이. 우측 : 정맥내 리포좀-캡슐화된 디클로로메틸렌 디포스포네이트 (LDD) 에 의한 KC 삭제의 효과. 열린 원 : 대조군 (0 시간, 파선). 열린 사각형 : 8-시간-저장된 이식체 (8 시간, 실선). 데이타는 4 개의 개별 실험의 측정의 평균 ± SE 를 나타낸다. 대조군 간에서 CF 배제의 붕괴와 비교된 *P < 0.05. C : 8-시간 한랭 저장 간에서 T1 /2 값을 신장하는데 있어, LDD 에 의한 KC 삭제 [KC(-)] 및/또는 트롬복산 A2 합성효소의 억제제인 OKY-046 (OKY) 로의 처리의 효과. IM : 인도메타신. 저장 및 헹굼액에서의 OKY 및 IM 의 농도는 각각 240 및 28 μmol/ℓ 이었다. OKY 의 억제 작용은 KC-삭제 이식체에서 사라짐을 주목한다. 값은 5 - 6 개의 개별 실험의 평균 ± SE 이다. 대조군 간으로부터의 데이타와 비교된 *P < 0.05. 8-시간 저장된 이식체에서의 데이타와 비교된 †P < 0.05.
도 6 은 8-시간 한랭 허혈증 및 60-분 재관류 (8 시간/R) 에 노출된 간 이식체에서 Mrp2 의 세포내 분포의 분열, 및 쿠퍼 세포 (KC)-삭제 과정[KC(-)] 또는 OKY-046 (OKY) 으로의 처리의 효과를 나타낸다. A : 항-아크롤레인 단일클론 항체 5F6 에 의한 Mrp2 의 웨스턴 블롯 분석 및 면역침전. M : 분자 마커. B : Mrp2 분포의 면역형광 분석. 좌측 ; 피코에리트린으로 표지된 항-Mrp2 단일클론 항체 (M2Ⅲ-6) 로의 단일 염색. 막대기 : 30 ㎛. 우측 ; FITC-표지된 ZO-1 항체 및 피코에리트린-표지된 M2Ⅲ-6 항체로의 이중 면역염색. 막대기 : 10 ㎛. C. 간세포 Mrp2 위치화의 준정량 분석. %I-Mrp2(cyt/bc) ; Mrp2-관련 면역활성 대 미세담관에서 측정된 것들의 세포질 세기. 값은 4 개의 개별 간으로부터 40 - 60 간세포/간에서의 측정의 평균 ± SE 이다. 대조군 간으로부터의 데이타와 비교된 *P < 0.05. 8 시간/R-KC (+) 군으로부터 수합된 데이타와 비교된 †P < 0.05.
본 발명을 수행하기 위한 최상의 형태
이후, 본 발명은 더욱 상세히 기술될 것이다.
쿠퍼 세포 (KC) 가 후-한랭 허혈성 간세포 손상에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 생각되었더라도, 비-괴사성 이식 기능장애에서의 그의 역할은 알려져 있지 않다. 본 연구는 후-한랭 허혈성 간 이식체에서 KC 의 그러한 역할을 해명하는 것을 목적으로 하였다. KC-삭제 시약인 리포좀-캡슐화된 디클로로메틸렌 디포스포네이트로 처리된 또는 처리되지 않은 래트 간을 4℃ 에서 위스콘신 대학 용액에 8 - 24 시간 동안 저장하고, 담 박출량 및 구성분을 모니터링하면서 재관류시켰다. 담즙을 배설하는 간세포의 능력을 그 자리에서 레이저-콘포칼 마이크로플 루오로그래피를 통해 평가하였다. 한랭 허혈증-재관류된 이식체는 임의의 뚜렷한 세포 손상 없이 8 시간째에 그의 담즙 방출을 현저히 감소시켰다. 이러한 사건은 글루타티온 및 빌리루빈-Ⅸα 의 손상된 배설과 일치하였으며, 이는 상기 유기 음이온의 지연된 수송을 제시한다. 기작은 다약물 내성 단백질-2 (Mrp2) 의 세포내 재-위치화와 관련있었다. 상기 수송체를 통해 배설되는 형광프로브인 카르복시플루오레세인의 담즙 배설에 대한 반응속도법 분석은, 간세포로부터 미세담관으로의 염료 배설이 현저히 지연되었음을 나타내었다. KC-삭제 처리는 세포질로부터 미세관 막으로의 Mrp2 의 재-분포를 통해 8-시간 한랭 허혈성 이식체에서 Mrp2 를 통해 매개되는 담즙 음이온 수송에서의 이러한 감소를 확실히 조장하였다. 더욱이, 기작은 KC 에서 트롬복산 A2 합성효소를 포함하는 것으로 보였는데, 이는 Mrp2 의 CF 분비 및 세포질 내재화에 있어 이러한 효소를 차단하는 효과를 향상시키는 것이 KC-삭제 이식체에서 사라졌기 때문이다. 결론적으로, 이러한 결과는, KC 활성화가 비-괴사성 간세포 기능장애, 해독화 능력의 위태롭게 하는 항상성 및 후-한랭 허혈성 이식체의 유기 음이온 대사의 중요한 결정소라는 것을 제안한다.
본 명세서에서, 일부 약어가 사용된다 : BC, 미세담관 ; BR-Ⅸα, 빌리루빈-Ⅸα ; CF, 5-카르복시플루오레세인 ; CFDA, 5-카르복시플루오레세인 디아세테이트 ; EHBR, Eisai 과빌리루빈혈증 래트 ; GSH, 환원된 글루타티온 ; KC, 쿠퍼 세포 ; LDD, 리포좀-캡슐화된 디클로로메틸렌 디포스포네이트 ; Mrp2, 다약물 내성 단백질 2 ; TXA2, 트롬복산 A2.
본 발명의 한 구현예에서, 기관 또는 조직 기능장애 및/또는 손상의 분석 방법이 제공된다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다 :
(a) 기관 또는 조직을 하나 또는 두 개의 염료로 표지함 ;
(b) 상기 기관 또는 조직의 분자 수송 및 배설, 생체외 대사 및/또는 세포 조건을 포함하여 세포 및/또는 기관 기능을 지시하는 다수의 지시를 수득함 ; 및
(c) 상기 지시로부터 기관 또는 조직 손상을 분석함.
본 발명에서, 기관 또는 조직 손상은 괴사, 세포사멸 또는 세포질 막의 분열을 의미한다.
살아있는 조건 하에 기관 또는 조직을 표지하기 위해, 염료 (예를 들어, 형광 염료, 로다민 또는 플루오레세인염 또는 프로피디움 아이오다이드) 를 사용하는 통상의 방법을 적용할 수 있다. 예를 들어, 이러한 염료는 실험 동물에 정맥내 주사 또는 복강내 주사로, 또는 간, 신장, 췌장, 위장관 또는 폐 내의 단리된 관류된 기관 제조물 내로 그의 조절된 농축물로 혈관내 관류하여 로딩할 수 있다.
다수의 지시는 세포 생존 능력, 미토콘드리아 막 전위, 산소 유리 라디칼, 세포 막을 가로지르는 음이온 또는 양이온의 수송, 세포질 막 전위, 및 세포사멸 또는 괴사를 포함하는 세포 죽음을 의미한다. 다수의 지시의 예는 생체외 대사 및 세포 생존 능력을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
생체외 대사는 신체 내에서 분해되는 임의의 유형의 외생 시약 또는 약물의 대사 및/또는 이화과정을 의미한다.
세포 조건은 분자 수송 (예를 들어, 세포 내 및 주변에서의 분자 수송), 막 전위, 미토콘드리아 기능, 생물학적 활성 화합물의 발생 (생물학적 종의 발생), 혈류 및 조직 산소화, 및 음이온 및 양이온의 취득과 배설, 및 괴사 또는 세포사멸과 같은 그의 생존 능력을 상실시키는 세포의 그러한 것을 포함하여 살아 있는 세포의 임의의 유형의 기능적 상태를 의미한다. 세포 조건의 예는 세포 생존 능력 및 세포 손상을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 한 구현예에서, 용어 "미세해부학적 기원" 은 세포, 및 림프계 및/또는 연결 조직 (예를 들어, 간에서의 미세담관계) 을 포함하는 간질 (interstitial space) 및 미세혈관계와 같은 그의 주변 구조 사이의 기하학적 관계를 의미한다. 따라서, 미세해부학적 기원의 예는 간에서의 미세담관 네트워크를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "혈관계" 는 전도 맥관, 소동맥, 모세혈관 및 소정맥을 포함하는 거대 및 미세순환계를 의미한다.
용어 "분비 경로" 는 세포내 분자가 세포외 공간 내로 배설되도록 하는 경로를 의미한다.
본 발명에서, 전체-기관 기능 변수의 모니터링은 기관 또는 조직 손상을 시각적으로 또는 정량적으로 알아보는데 적용될 수 있다. 용어 "시각적으로" 는 생물학적 활성의 정량적인 정보를 포함하는 생체내 이미지의 포착을 의미한다. 용어 "정량적으로" 는 생물학적 활성을 지시하는 값을 측정하는 것을 의미한다. 전체-기관 기능 변수는 담즙 방출, 담즙산, 인지질, 콜레스테롤 및 비카르보네이트와 같은 담즙 구성분의 측정을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 약물 독성 평가 방법이 제공된다. 본 발명에서, 하기 단계가 포함된다 :
(a) 기관 또는 조직을 염료로 표지함 ;
(b) 상기 기관 또는 조직에 테스트 약물을 적용함 ;
(c) 상기 기관 또는 조직의 생체외 대사 및/또는 세포 조건을 포함하여 다수의 지시를 수득함 ;
(d) 상기 지시로부터 기관 또는 조직 손상을 분석함 ; 및
(e) 약물이 상기 기관 또는 조직에 독성을 갖는지 평가함.
본 발명에서, 약물 독성은 효소 또는 수송체 기능의 억제를 포함하여, 살아 있는 세포에 대한 시약 또는 약물의 임의의 유형의 해로운 작용을 의미한다. 약물의 예는 ABC 수송체의 억제제 (예를 들어, mrp2, 시클로스포린, 아드리아마이신, 시스플라티눔, 시메티딘 등의 억제제로서 프로베네시드) 를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
단어 "테스트 약물을 적용함" 은 기관 또는 조직에 이로운 약물을 접촉시키는 것을 의미한다. 약물 독성은 일부 지시로부터 기관 또는 조직 손상을 분석함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 임의의 ABC 수송체의 기능에 대한 지시가 변하는 경우, 약물 (예를 들어, ABC 수송체) 은 기관 또는 조직에 독성을 갖고 있다고 평가된다. 지시가 안정하게 유지되는 경우, 약물 (예를 들어, ABC 수송 체) 은 기관 또는 조직에 독성을 갖고 있지 않다고 평가된다.
본 발명은, 유기 음이온의 Mrp2-의존성 분비를 실행하는 간세포의 손상된 능력이 한랭-허혈증과 같은 기관 또는 세포 손상 및 이어서 단기간의 재관류에 의해 야기되는 이식 기능장애를 지시하는 초기 사건임을 설명하는 증거를 제공한다. 간세포 상의 이러한 변화는 미묘하고 비-괴사성이나, 세포 발생 및 전체 이식체의 레벨에서 글루타티온 및 빌리루빈의 배설 사이의 불균형을 야기하기에 충분한 정도로 결정적이었다. 16 시간까지 한랭 허혈증의 기간을 신장하는 것은 그의 사라짐과 비대를 특징으로 하는 미세담관의 기능장애를 유도하였으며, 한편 그의 다각형 네트워크는 한랭 저장 기간이 8 시간을 초과하지 않는 한 손상되지 않은 채 그대로 유지되었다. 알기로는, 상대적으로 단기간의 한랭 허혈증에 노출된 간세포의 그러한 비-괴사성 기능장애가 KC 를 포함하여 간문맥동 세포의 후-허혈성 반응에 의해 매개될 수 있었는지는 알려져 있지 않다. 여기에 나타낸 바와 같이, Mrp2 를 통한 유기 음이온을 배설하는 능력의 감소는 KC 를 제거함으로써 완전히 복구되었고, 이는 기능장애에 대한 기작에서 이러한 간문맥동 세포의 관련을 제시한다.
8-시간 후 한랭-허혈성 이식체에서 Mrp2-매개된 수송의 손상은 세관 막으로부터 이러한 수송체의 세포질 재-위치화로부터 발생하나, 담 세관 네트워크의 분열로부터 및 수송체 그 자체의 산소화 개질로부터는 발생되지 않으며 ; 이는 8-시간 한랭 허혈증 및 재관류가 간 이식체에서 임의의 뚜렷한 산소화 스트레스를 나타내지 않는다는 우리의 이전의 관찰과 일치한다 (14). Mrp2 의 담 세관 선별을 위 한 결정소 (32, 40, 41) 인 cAMP 에서의 변경은 KC-매개된 기능장애에서 역할을 하지 않는 경향이 있는데, 이는 그의 함량이 KC 의 존재와는 상관없이 다르지 않았기 때문이다. ATP 의 간세포 함량은 수송체 기능을 위한 또다른 결정소이나, 만약 있더라도 기작에서 거의 역할을 하지 않는데, 이는 임의의 차이가 8-시간 한랭 허혈증을 수행한 KC-삭제 및 대조군 이식체 사이에 뚜렷하였기 때문이다. KC 삭제가 정상적인 간에서 유기 음이온을 분비하는 Mrp2 의 능력을 변경하지 않았기 때문에, 이식체에서 수송체 기능의 그러한 변경은, 이식체가 한랭 허혈증-재관류를 수행하지 않는 한 야기될 수 없는 KC 의 반응으로부터 발생하는 것으로 보인다. 상세한 기작이 알려져 있지 않더라도, 본 결과는 KC 로부터 방출되는 프로스타노이드의 주요 부류인 TX 에 관여하는 효소인 TXA2 합성효소의 연루를 제시한다 (37, 38). 효소 억제제의 예방 효과가 KC-삭제된 이식체에서 완전히 취소되었다는 관찰은, 우리로 하여금 KC 가 간세포의 세포질 내로 Mrp2 를 내재화하는 TX 의 주요 공급원을 구성한다는 것을 제안하도록 하였다. TXA2 가 다양한 유형의 세포에 강력한 생물학적 작용을 발휘하는 것으로 생각되었더라도, 이전의 연구는 TXA2 의 상대적으로 안정한 대사물인 TXB2 가 비-리포좀성 단백질분해효소를 활성화시켜서, 일차 배양된 간세포의 수포 형성을 유도할 수 있다는 증거를 제공하였다 (42). 따라서, KC-유도된 TX 가 간세포 기능을 야기하는 추가의 기작이 필요할 것이다.
조절된 양의 CF 로 미리 로딩된 이식체로부터의 신규 개발된 염료 배제 분석 방법은, Mrp2 의 재-위치화가 간세포 레벨에서 발생하며, 전체-이식 기능의 현저한 저하를 초래한다는 것을 밝혔다. 도 3 에서 보는 바와 같이, 8-시간 저장은 만약 있더라도, 조직 함량에서의 임의의 변화를 나타내지 않으면서 담즙의 글루타티온 배설을 현저히 감소시켰다. 이러한 유기 음이온이 담즙산-의존성 담즙 형성을 위한 삼투압 구동력을 산출하는 주요 성분으로서 작용하기 때문에, 담에서의 그의 감소는 방출에서의 감소를 초래할 수 있었다. 이러한 생각은 또한 8-시간 저장된 이식체가 방출의 현저한 감소를 나타내었다는 우리의 관찰과 일치한다.
이러한 정황에서, 이식체에서 BR-Ⅸα 의 내생 발생 및 담즙 배설 사이의 불균형은 현재의 연구에서 크게 흥미롭다. 도 2 에서 나타낸 바와 같이, 대조군 간은 우리의 이전의 연구와 일치하듯이, 내생 BR-Ⅸα 의 약 75% 를 관류의 20 분 내에 담즙 내로 방출할 수 있다 (24). 반면, 담즙 색소의 그러한 재빠른 제거는 16-시간 한랭 허혈성 이식체 내에서 발생하지 않았다. BR-Ⅸα 의 담즙 농도에 의해 판단되는 바와 같이 (도 2E), 색소의 절대량은 상승하였으나, 비-한랭 허혈성 대조군 이식체와 비교해 결코 감소하지는 않았다. 순환 내로 방출되는 BR-Ⅸα 의 양이 무시할만 하였기 때문에 (데이타는 나타내지 않음), 이러한 결과는, 초기의 20-분 동안의 재관류 동안 한랭 허혈성 이식체가 담즙으로 그것을 배설하는 그의 능력으로부터 예상되는 것보다 더 큰 양의 색소를 합성한다고 제시한다. 이러한 생각은, 이식체가 헴 분해를 위한 스트레스-유도성 효소인 헴 옥시게나제-1 을 유도한다는 우리의 관찰과 잘 동의된다 (43). 이러한 사건은 후-한랭 허혈성 이식체의 항-산화성 스트레스 반응의 견해로부터 병리생리학적으로 중요하다. 우리는 최근, 낮은-투여량의 빌리루빈이, 그의 과도한 투여량이 확실히 해롭더라 도, 산화 스트레스를 개선하고 그로 인해 후-한랭 허혈성 간 이식체를 보호할 수 있다는 것을 보고하였다 (31, 43). 한랭 허혈증에 노출된 이식체에서, 재관류는 간의 빌리루빈 대사를 위태롭게 지시하는 2 가지 중요한 사건을 야기할 수 있었다 ; Mrp2 를 통한 증가된 헴 분해 및 BR-Ⅸα 의 유지. 따라서, 이러한 2 가지 사건의 조합된 작용은 간세포를 보호하기에 충분한 상기 항산화제의 축적을 초래할 수 있었으며, 한편 그의 연장된 효과는 재관류의 후기에 간세포 손상 및 과빌리루빈혈증을 초래한다.
KC 는 에이코사노이드의 강력한 발생제로서 작용하며, 한편 간세포 및 그의 막 상에 발현된 ATP 결합 카세트 수송체는 각각 그의 분해 및 배설을 돕는다 (38, 39). 반면, 글루타티온 및 빌리루빈과 같은 항-산화 유기 음이온은 후-한랭 허혈성 이식체 내에서 담으로의 그의 분비를 위해 Mrp 를 분배한다. 따라서, 에이코사노이드의 KC-매개된 합성 및 간세포로부터의 그의 제거 사이의 균형은 항-산화 음이온의 간세포 내 및 주변에의 재분포를 결정하고, 그리하여 간 이식의 기능적 방출을 지시할 수 있었다. Mrp-매개된 유기 음이온 수송의 KC-매개된 리모델링은, 글루타티온의 세포내- 및 세포간 반응속도에 대한 정량 정보, 및 BR-Ⅸα 가, KC-산출된 트롬복산이 이식체 상의 연이은 산화 스트레스에 대해 초기의 재빠른 기작으로서 작용할 수 있는지를 평가하는데 유용하게 되는 한, 추가의 연구를 할 만하게 한다.
이후, 본 발명은 하기 실시예를 참조로 더욱 상세히 기술될 것이다. 본 발명의 기술 영역은 이러한 실시예에 의해 제한되지 않음을 주목한다.
재료 및 방법
동물 제조
본원에 기술된 실험 프로토콜은 Keio 의과 대학교의 Animal Care Committee 에 의해 제공된 우리 기관의 가이드라인에 의해 인정되었다. 실험실 먹이 및 흐르는 물에 자유롭게 접근하도록 놔두어졌던 수컷 Wistar 래트 (220 - 260g, CLEA Japan, Tokyo) 및 Eisai 과빌리루빈혈증 래트 (EHBR) (220 - 260g, Sankyo Inc., Tokyo) 를 실험 전 24 시간 동안 단식시켰다. 상기 래트의 간을 기준-선 관류액으로서 산소화된 Krebs-Henseleit 완충액으로 생체 외에서 관류시키고 (17, 18), 요구된 시간 동안 4℃ 에서 위스콘신 대학교의 용액에 저장하였다 (14). 필요한 경우, 래트를 우리의 이전 연구에 따라 한랭 저장을 위해 생체 외 간 관류의 제조 전 24 시간째에 리포좀-캡슐화된 디클로로메틸렌 디포스포네이트 (LDD) 를 정맥내 주사하여 예비처리하였다 (14, 19). 이전에 기술된 바와 같이, 이러한 과정은 면역조직화학법에 의해 판단되는 바와 같이, 쿠퍼 세포를 거의 완전히 제거하였다 (20). 한랭 저장 후, 이식체를 유산링거액 40 ㎖ 을 수송 주사하여 유연하게 헹구고, 단일-통과 모드로 일정 유속 (32 ㎖/분) 에서 30 μmol/ℓ 에서 나트륨 타우로콜산염의 존재 또는 부재 하에 산소화된 완충액으로 관류시켰다 (14, 21). 일부 실험을 위해, 트롬복산 A2 (TXA2) 합성효소의 억제제인 OKY-046, 또는 시클로옥시게나제의 억제제인 인도메타신 (IM) 을 목적하는 농도에서 헹굼액 내에 뿐만 아니라, UW 용액에도 첨가하였다 (22).
담즙 및 조직 구성분의 측정
담즙 샘플을 전체 담즙염, 인지질, 환원된 글루타티온 (GSH) 및 빌리루빈-Ⅸα (BR-Ⅸα) 의 농도를 측정하기 위해 사용하였다 (23, 24). BR-Ⅸα 를 24G7 를 사용하는 효소-결합 면역흡착 분석법에 의해 측정하였다 (24). 이러한 단일클론 항체는 이전에 기술된 바와 같이 HO 반응을 통해 특이적으로 발생된 최종 헴-분해 생성물인 BR-Ⅸα 를 인지할 수 있다 (24, 25). 락트산 탈수소효소 (LDH) 의 활성을 이전에 기술된 바와 같이 측정하였다 (17). 간 이식체 내의 아데노신 삼인산염 (ATP) 을 어디에서나 기술된 바와 같이 루시페린/루시퍼라제 방법에 의해 측정하였다 (14, 21). 이식체 내의 환형 AMP 를 효소-결합 면역흡착 분석법 (BiotrakTM system, Amersham Biosciences, Buckinghamshire) 에 의해 측정하였다.
카르복시플루오레세인의
담즙 배설률의 분석
카르복시플루오레세인 (CF) 은 Mrp2 를 통해 다양한 세포로부터 배설되는 유기 음이온이다 (26, 27). 이 염료의 에스테르 전구체인 CF 디아세테이트 (CFDA) 를 Mrp2 의 강력한 억제제인 프로베네시드 1.5 mmol/ℓ 의 존재 하에 50 nmol/ℓ 로 10 분 동안 간으로 수송하면서 로딩하였다 (26, 28). 이 시약은 간세포로 들어갈 수 있고, 에스테라제에 의해 CF 내로 가수분해되어, 담즙 내로 배설된다 (14, 17, 29). 10-분 CFDA 로딩 후, 간을 프로베네시드-없는 완충액으로 관류시켜, CF 가 담즙 내로 배설되게 하였다. 한랭 허혈성 군에서, 저장된 이식체를 프로베네시드의 존재 하에 10 분 동안 CFDA 함유 완충액으로 로딩하고, 이어서 프로베네시드를 제거하고, 50 분 동안 연속해서 재관류시켰다. 상기 제조물로부터 수합된 담즙 샘플을 96-웰 다중-채널 형광 흡광기를 사용하여 형광 측정을 수행할 때까지 급속 냉동시켰다. 샘플의 pH 값을 방해하지 않으면서 510 nm 에서 형광을 산출하는 염료의 등광회전 파장인 440 nm 에서 외-조명 (epi-illumination) 하에 측정을 수행하였다 (26). 샘플 내의 CF 의 농도를 인산염 완충 식염수 중에 용해된 알려진 농도의 CF 로 검량하였다. 후에 결과에서 보는 바와 같이, CF 농도는 시간에 따라 지수적으로 감소하는 것으로 보였다. 이런 가정으로, 담즙 CF 수명은 지수형 붕괴의 T1 / 2 로서 결정되었다. 따라서, 이러한 방법은 관류된 간 내로 로딩된 CF 의 초기량에 영향을 받지 않는다.
간세포
CF
배설의 그 자리에서의 시각화.
전술한 프로토콜을 사용하여 CF 로 로딩된 간 이식체를 이전에 기술된 바와 같이 생체내 레이저 콘포칼 마이크로플루오로그래피를 통해 관찰하였다 (14, 20, 30). 후에 결과에서 나타낸 바와 같이, CF 를 프로베네시드의 존재 하에 간세포 내로 명백히 로딩하였다. 시약의 제거 시, 염료는 간세포로부터 즉시 배제되고, 미세담관 (BC) 내로 배설되어, 벌집모양 네트워크를 나타내고, 마침내 실질 (parenchyma) 로부터 사라졌다. 염료 배설이 Mrp2 의 기능에 의존하는지 알아보기 위해, 일부 이식체를 1.5mmol/ℓ 프로베네시드를 함유하는 완충액으로 재관류 시켰다. 레이저 콘포칼 마이크로플루오로그래프가, 보력된 CCD 카메라 (C5810, Hamamatsu Photonics) 및 다-침공 레이저 콘포칼 프로세서 (CSU-10, Yokogawa Electric Co.) 가 장착된 도립형 현미경 (Diaphot 300, Nikon/Sankei) 에 의해 포착되었다. 모든 마이크로플루오로그래프는 8-비트 계조도 이미지로 디지탈적으로 처리되었다. 형광 세기를 검량하기 위해, 알려진 농도의 CF 를 시험관 내에서 제조하고, 이미지를 카메라의 동일한 광학 변수 하에 포착하였다. 간세포 내의 계조도를 디지탈 이미지 프로세서를 사용해 가변 사각형 창 (2 x 2 ㎛2) 에 의해 측정하였다 (18, 31). 흥미로운 현미경 분야에서 10 개 이상의 상이한 간세포를 단일 실험에서 분석하였다. 간 표면에서 측정된 형광 세기가 용액 내에서 측정된 것들과 동일하다고 한다면, 계조도를 검량선을 사용하여 겉보기 CF 농도로 전환시키고, 이를 CFapp 로서 지정하였다.
우리는 또한 간세포 손상의 지표로서 BC 네트워크 내의 구조적 변화를 알아보기 위해 형태계측술을 수행하였다. 후에 결과에서 나타낸 바와 같이, 정상적으로 기능하는 간세포는 주변 BC 에서 다각형 CF 충전을 특징으로 하며, 한편 손상입은 것들은 주변 BC 네트워크의 부분적 사라짐에 의해 판단되었다. CF 에 의한 완전한 BC 충전에 의해 둘러싸인 그러한 손상되지 않은 간세포의 수를 흥미로운 구역에서 세었다. 간 표면의 약 0.05 ㎜2 가 상기 평가를 위한 단일 실험에 서 분석되었다.
세포간
Mrp2
분포의 면역조직화학 분석.
이식체의 간세포 내의 Mrp2 를 평가하기 위해, 이전 연구에 따라 간 샘플을 고정하고, 썰고, 단일클론 항체 M2Ⅲ-6 로 염색하였다 (32). 섹션 상의 항원을 어디에서나 기술된 바와 같이 피코에리트린-공액된 항-마우스 IgG 에 의해 시각화하고, 488 nm 에서 레이저 콘포칼 마이크로플루오로그래피를 통해 관찰하였다 (20, 30). Mrp2 의 간세포 내재화 및 BC 위치화를 알아보기 위해, 섹션을 간세포 접합부에서 발현되는 또다른 마커인 ZO-1 에 대한 단일클론 항체로 이중 면역염색하였다 (33). 준-정량 방식에서 단백질 분포에서의 변화를 측정하기 위해, Mrp2 의 단일-염색된 마이크로플루오로그래프를 모노크롬 8-비트 이미지로서 전환하였다 (14). 계조도 (1-256) 를 단일 간세포 내의 세포질 및 세관 영역 둘 다에서 측정하였다. 각각의 영역에 대한 5 개 이상의 상이한 위치를 단일 세포에서 선택하여, 세포질 세기 대 상응하는 세관 세기의 상대값을 계산하였다. 그러한 측정은 4 개의 상이한 이식체 내의 40 - 60 개의 간세포에서 수행되어, %I-Mrp2(cyt/bc) 로서 정의된 Mrp2-관련 면역반응성의 세포질 세기 % 의 히스토그램을 구축하였다. 상기 지표의 상승은 Mrp2 내재화에서의 증가를 나타내었다. 히스토그램은 TXA2 합성효소 억제제의 존재 또는 부재 하에 KC-삭제 과정이 있게 및 없이 대조군 이식체 및 한랭 허혈증에 노출된 것들 사이에 비교되었다.
군 중에서 전체 간 이식체 내의 Mrp2 발현에서의 차이를 알아보기 위해, 동 일한 단일클론 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 우리는 또한 항체 M2III-6 에 의해 단백질을 면역침전시키고, 이어서 항-아크롤레인 단일클론 항체 (5F6) 에 의해 웨스턴 분석을 하여 Mrp2 의 산화 개질에서의 변경을 알아보았다 (34, 35).
통계적 분석
상이한 실험군 사이의 데이타의 통계적 유의성을 단-방향 ANOVA 및 Fischer's 다중 비교 테스트에 의해 측정하였다. P < 0.05 는 유의한 것으로 생각되었다.
결과
간
이식체
내의 담즙 방출의 저장 시간-의존성 감소.
간 이식체의 생존 능력을 테스트하기 위해, 정맥의 관류액 내에서의 락트산 탈수소효소의 방출을 세포 파쇄의 지표로서 측정하였다. 표 1 에서 나타낸 바와 같이, 24 시간 미만 동안 한랭 허혈증에 노출된 이식체는 락트산 탈수소효소의 임의의 지각할 수 있는 상승을 나타내지 않았다.
| 이식체의 정맥 관류액에서의 LDH 방출 시 한랭 보존 지속 효과 | ||
| 한랭 저장의 길이 (시간) | 5 분 - R | 60 분 - R |
| 대조군 | 20 ± 6 | 35 ± 11 |
| 8 | 31 ± 7 | 25 ± 9 |
| 16 | 21 ± 8 | 34 ± 6 |
| 24 | 45 ± 8 | 43 ± 22 |
| 48 | 878 ± 377* | 1206 ± 719* |
| 데이타는 재관류 (0 - 24 시간 ; n = 5, 48 시간 ; n= 3) 의 개시 (0 분) 및 60 분째에 이식체로부터의 측정 (mIU/분/g 간) 의 평균 ± SE 를 나타낸다. 다른 군에서의 값과 비교해 *P < 0.05. | ||
48 시간째에, 락트산 탈수소효소 방출은 60 분 재관류가 되고 끝나는 증거가 되었고, 이는 괴사 세포 죽음은 현재 실험 조건 하에 24 시간 미만에 노출된 한랭 허혈성 이식체에서는 검출되지 않았음을 보여준다. 도 1 은 다양화된 길이의 한랭 허혈증을 갖는 이식체에서의 재관류 시간의 함수로서 담즙 방출의 시간 경과를 나타낸다. 나트륨 타우로콜산염이 첨가된 패널 A 에서 나타낸 바와 같이, 8-시간 허혈증에 노출된 이식체는 초기의 재관류 후 30 분째에 대조군 내의 것과 비교가능할 만한 수준으로 그의 방출을 증가시켰으나, 50 - 60 분째에 감소시켰다. 16 - 48 시간 동안의 장기간의 한랭 허혈증에 노출된 이식체에서, 그러한 방출의 감소는 추가로 증명되었다. 도 1 의 패널 B 는 관류액 내의 나트륨 타우로콜산염의 부재 하에 모니터링된 담즙 복구의 시간 경과를 나타내었다. 보는 바와 같이, 16 시간 초과 동안 한랭 허혈증으로 처리된 군은 방출에서 현저한 감소를 나타내었다.
후-한랭 허혈성 간에서 글루타티온 및 빌리루빈의 담즙 배설에서의 변경.
16- 및 24-시간 한랭 허혈증을 갖는 이식체 내에서 담즙 유동의 현저한 감소의 관찰은, 우리로 하여금 담즙정체성 변화에 관여하는 담즙 구성분을 측정하도록 하였다. 도 2 는 한랭 허혈증에 대한 저장 시간의 기능으로서 플롯화된 재관류의 개시 후 20 분째에 측정된 담즙 구성분의 데이타를 예시하였다. 보는 바와 같이, 담즙염의 농도는 임의의 길이의 저장 시간에서의 임의의 현저한 감소를 나타내지 않았으며, 한편 인지질의 것들은 8- 내지 24-시간 한랭 허혈증에 노출된 군에서 농도 및 유동 둘 다에서 뚜렷한 감소를 나타내었다 (도 2A 및 2B). 인지질이 간세포로부터 담즙 부분으로 일차적으로 배설된다는 것을 고려한다면, 상기 데이타는 8 시간 초과 동안 저장된 이식체에서 간세포 기능장애의 존재를 제시한다.
다음, 우리는 조직 함량을 모니터링하면서 GSH 의 담즙 배설을 알아보았다 (도 2C). GSH 에서의 담즙 농도는 8 시간째에 현저히 감소하였고, 한랭 저장 시간의 기능으로서 감소하였다. 다음, 우리는 GSH 의 간 함량을 알아보았고 : 도 2D 에서 보는 바와 같이, 간의 GSH 함량은 재관류 전 및 20-분 후에 변하지 않았다. 16 시간 동안 저장된 이식체에서, 함량은 GSH 를 함유하는 위스콘신 대학교의 용액을 사용한 결과, 뚜렷히 증가하였다. 그러나, 20-분 재관류 시, GSH 가 순환으로부터 제거되었기 때문에 함량은 대조군 수준으로 재빨리 억제되었고, 이는 16-시간 한랭 허혈증에 이은 20-분 재관류는 이식체에서 기본적인 GSH 함량을 변화시키지 않음을 나타내었다. 이러한 결과는, 저장 시간이 16 시간 미만인 한, 후-한랭 허혈성 간에서 담즙 GSH 배설에서의 감소가 이식체에서의 그의 감소보다는 담즙으로의 그의 수송의 손상으로 인한 것임을 제시한다. GSH 가 Mrp2 를 통해 배설되기 때문에, 우리는 동일한 수송체를 통해 배설되는 담즙 색소인 BR-Ⅸα 의 담즙 농도에서의 변경을 알아보았다. 도 2E 에서 나타낸 바와 같이, 초기의 20-분 재관류에서의 BR-Ⅸα 의 담즙 농도는 8-시간 허혈성 군에서 현저히 상승하였고, 16-시간 저장군에서 최대가 되었다. 마침내, 24-시간 한랭 허혈증을 갖는 이식체에서, BR-Ⅸα 의 초기의 농도가 갑자기 감소되었다. 도 2F 는 내생 BR-Ⅸα 를 담즙 내로 제거하는 이식체의 능력을 예시한다. 대조군 이식체에서 나타낸 바와 같이, 이러한 담즙 색소의 간의 함량은 초기의 20-분 관류 내에 현저히 감소하였다. 반면, 동일한 기간의 재관류는 16-시간 처리된 이식체에서 그러한 감소를 야기하지 않았다. 이러한 결과는, 처음부터 BR-Ⅸα 를 발생시키는 16-시간 이식체의 능력이 색소를 담즙 내로 방출시키는 그의 능력을 억제시킨다는 것을 제시한다.
카르복시플루오레세인
배설에 의한
Mrp2
기능의 전체적이고 국지적인 평가.
GSH 및 BR-Ⅸα 의 담즙 배설에서의 변경은, 간세포로부터 이러한 유기 음이온을 제거하는 Mrp2 의 능력이 장기간의 한랭 허혈성에 노출된 이식체에서 손상될 수 있었다는 가능성을 제기하였다. 그러나, 글루타티온 및 BR-Ⅸα 의 초기량이 군 사이에 상이하였기 때문에, 이러한 내생 음이온의 담즙 배설을 측정하는 것은, 우리가 이식체의 유기 음이온-배설 능력을 정당하게 비교하게 할 수는 없었다. 상기 어려움을 극복하기 위해, 이식체를 외생 유기 음이온인 CF 로 로딩하고, 간세포로부터 담즙으로의 그의 제거를 알아보았다. 도 3A 의 좌측 패널에 나타낸 바와 같이, 간세포 CF 로딩은 상이한 길이 (0 - 24 시간) 의 한랭 허혈증에 노출된 이식체 사이에 비교가능한 것으로 보였다. 이를 도 3C 에서의 형광 세기측정법 (fluorescence intensitometry) 에 의해 확인하였고, 이는 간세포가 살아있음을 지시하였다. 이는 또한 지각할 수 있는 LDH 방출을 나타내지 않는 결과와 일치하였다 (표 1). 프로베네시드를 제거한 후 즉시, Mrp2 의 억제제인, 간세포에서 로딩된 CF 를 미세담관 내로 재빨리 배설하고, 10 분 내에 소엽에 걸쳐 벌집모양 네트워크를 형성하였다 (도 3A 에서 중간 칼럼). 25 분째에 (우측 칼럼), 세포질 내의 형광은, 있더라도 거의 검출되지 않았다. 한랭-허혈증 재관류를 수행한 이식체에서, 담즙 CF 배설에서 2 가지 주요 변화가 발생하였다 : 25 분째에 기저의 형광의 상승에 의해 판단되는 바와 같은 간세포 염료 배제의 유지, 및 10 분째에 수합된 마이크로그래프에서 지시된 바와 같은 담즙 세관 (network) 의 사라짐 및 변형. 이러한 변화는 24 시간 동안 신장된 한랭 허혈증에 노출된 이식체에서 증거가 되었다 (도 3A 에서 바닥 열).
10 분째에 포착된 이러한 마이크로플루오로그래프에서 미세담관의 위치에서 조심스럽게 스캐닝을 하면, 세관 네트워크의 구조에서 최소의 그러나 지각할 수 있는 변화를 나타내었다. 도 3B 에 나타낸 바와 같이, CF-충전된 BC 에 의해 완전히 둘러싸인 간세포의 수는 한랭 허혈증의 기간이 증가할수록 감소하였다. 폴리곤 (polygon) 의 그러한 감소는 16 시간 동안 저장된 이식체에서 쉽게 뚜렷해졌다. 간세포에서 초기의 CF 로딩은 0 내지 24 시간의 허혈성 기간의 범위 내에서 비교가능하였기 때문에, BC 에서의 형태적 변화는 16-시간 한랭 허혈증에서 초기에 발생한 것으로 보였다. 즉, 8-시간 한랭 허혈증에 노출된 이식체는 BC 네트워크의 형태에서 임의의 현저한 변화를 나타내지 않았다.
이식체의 간세포 내의 형광에서의 일시적인 변경을 모니터링함으로써 정량 분석에서 CF 배제의 지연을 추가로 알아보았다 (도 4A). 보는 바와 같이, 프로베네시드가 계속해서 관류될 때, 염료는 세포 내에 머물렀고, 이는 세관 배설을 나타내지 않으면서 약간의 감소를 나타내었다. 도 4B 에 플롯화된 바와 같이, 간세포에서 측정된 계조도는 간세포로부터 CF 배제의 T1 / 2 를 측정할 수 있게 하였다. 도 4C 는 군 중에서 T1 /2 값을 예시한다. 프로베네시드의 부재 하에, T1 /2 는 약 6 분이었고, 한편 프로베네시드의 존재 하에 분열은 실제로 느려졌으며, 이는 Mrp2 수송의 거의 완전한 억제를 제시한다. 보는 바와 같이, CF 를 배설하는 8-시간 한랭 허혈성 이식체의 T1 /2 는 현저히 더 커졌으며, 대조군 값 및 EHBR 의 간에서 측정된 값 사이에서 중간 정도의 범위였다. 프로베네시드-처리된 군과 비교해서 이러한 돌연변이 종에서 T1 /2 값이 더 작은 것은 Mrp3 를 통해 간문맥동 공간 내로 염료가 보상적으로 배설되기 때문인 것으로 추정될 수 있었다 (36).
8-시간 한랭 허혈성
이식체에서
담즙
CF
배설에 대한
KC
삭제의 효과.
다음, 우리는 전체적으로 CF 를 배설하는 8-시간 한랭 허혈성 이식체의 능력을 평가하기 위해 시도하였다. 이를 위해, 염료 배제에 대한 T1 /2 값을 측정하였다 (도 5). 프로베네시드의 제거 후 (도 5A 에서 T0), 담즙 내의 CF 농도는 일시적으로 증가하였고, 점차적으로 바닥 수준으로 되돌아갔다. 그러한 일시적 증가는 프로베네시드의 존재 하에 (그림자진 원), 또는 EHBR 로부터 단리된 이식체 내에서는 (닫힌 원) 관찰되지 않았으며, 이는 Mrp2 가 담즙 CF 배설에 관여함을 제시하였다. CF 배제가 8 및 16 시간 동안 저장된 전체 간 이식체에서 분석되었을 때, 분열은 대조군에서의 것보다 더 느리게 나타났다. 8-시간 허혈성 이식체로부터 수합된 데이타를 사용하여, 담즙 샘플에서 CF 농도의 대수값 대 피크 (10 분) 에서의 그것들을 재관류 시간의 함수로서 재-플롯화하였다 (도 5B). 다음, KC 삭제가 있게 및 없이 처리된 이식체 사이에 염료 배제의 T1 /2 값을 비교하였다. 보는 바와 같이, LDD [KC(+)] 로 처리되지 않은 간에서, 8-시간 한랭 허혈증은 대조군보다 증가된 T1 /2 값을 나타내었다. 2 군 사이의 T1 /2 값에서의 그러한 차이는 KC-삭제 이식체에서 완전히 사라졌다. 비-한랭 허혈성 대조군 간에서, KC-삭제 과정 그 자체는, 이식체가 한랭 허혈증-재관류를 겪을 때만 KC 삭제의 개선 효과가 증거가 되었음을 지시하는 T1 /2 값을 변경하지 않았음을 주목하였다.
8-시간 한랭 허혈성 이식체 내의 KC 가 mrp2 를 통해 연장된 CF 배설을 야기한 기작을 알아보기 위해, 우리는 후-한랭-허혈성 조건 하에 활성화된 KC 로부터 방출되는 주요 프로스타노이드인 트롬복산의 연류를 알아보았다 (37,38). 이러한 목적을 위해, TXA2 합성효소의 억제제인 OKY-046 의 효과를 알아보았다. 도 5C 에서 나타낸 바와 같이, 240 μmol/ℓ 에서 상기 시약을 저장 및 헹굼 용액에 적용하는 것은 CF 배제의 T1 /2 값에서의 증가를 거의 완전히 없앴다. TXA2 합성효소 억제제는 기타 프로스타노이드 (예를 들어, PGE2 및 PGF2α) 를 합성하는 아라키돈산의 이용가능성을 증가시킬 것이기 때문에, 우리는 TX 를 포함하여 시클로옥시게나제 경로를 통해 생성된 모든 프로스타노이드를 억제하는 억제제인 인도메타신 (IM) 이 T1 /2 값을 조장하거나 또는 악화시킬 수 있는지 알아보았다. 나타낸 바와 같이, 상기 억제제는 또한 연장된 T1 /2 값을 거의 완전히 조장하였다. 더욱이, 8-시간 한랭 허혈성 이식체에 대한 OKY-046 의 효과는 KC 가 삭제되었을 때 사라졌으며, 이는 TX 의 연류가 KC-의존적임을 제시하였다.
8-시간 한랭 허혈증에 의한
Mrp2 의
세포내
재-
위치화
및
KC
삭제에 의한 그의 조장.
KC 가 내독소-처리된 간에서 Mrp2 를 하향-조절하는 것으로 알려져 있기 때문에 (39), 우리는 그러한 변화가 수송체의 기능장애에 대한 기작과 연관될 수 있었는지 알아보았다. 웨스턴 블롯 분석에 의해 나타낸 바와 같이, Mrp2 단백질의 양은 24-시간 허혈성 이식체 (데이타는 나타내지 않음) 에서 뿐만 아니라, 8-시간 한랭 허혈성 이식체 (도 6A) 에서도 변하지 않았다. 우리는 또한 단백질 그 자체가 후-허혈성 산소화적 가해의 결과로서 산소화적으로 개질되었는지 알아보았다. 그러나, 항-아크롤레인 항체를 사용하는 면역침전법에 의해 판단되는 바와 같이 뚜렷한 변화는 발견되지 않았다. 다음, 단백질의 간세포 위치화가 8-시간 한랭 허혈성 이식체에서 개질되는지 알아보았다. 도 6B 에서 나타낸 바와 같이, BC 에서 그의 위치화가 눈에 띄게 감소하였으며, 한편 간세포의 세포질에서 배경 형광은 8-시간 허혈증-재관류된 이식체에서 상승되었다. 하부 패널에서 보는 바와 같이, ZO-1 (녹색) 으로의 이중 면역염색은, BC 에서 Mrp2 (적색) 의 공-위치화가 눈에 띄게 방해받았고, 한편 세포질에서의 그의 세기는 상승되었으며, 이는 단백질의 내재화를 제시하는 것임을 밝혔다. 그러한 변화는 KC 삭제 또는 OXY-046 로 처리된 이식체에서 조장되었다. %I-Mrp2 (cyt/bc) 값으로서, 내재화의 지표는, 8-시간 한랭 허혈증-재관류가 Mrp2 내재화를 현저히 증대시키고, KC 삭제 또는 TXA2 합성효소의 차단으로의 처리는 수송체의 담즙 세관 재-위치화를 향상시켰음을 지시하였다.
우리는 8-시간 한랭 허혈증-재관류 후에 KC(+) 및 KC(-) 이식체에서의 ATP 및 cAMP 의 간 함량에서의 차이를 측정하였으나, 2 군 사이에서 임의의 지각할 수 있는 중요성은 없었다 (각각 ATP 함량에서 3.4 ± 0.9 대 2.9 ± 1.1 μmol/g 간, 및 cAMP 함량에서 8.9 ± 1.0 대 9.2 ± 0.5 pmol/g 간) . 상기 결과는, KC 삭제에 의해 상기 ATP-결합 단백질의 세포내 복구의 개선이 ATP 및 cAMP 의 조직 함량에서의 변경으로부터 생기지 않았음을 제시한다.
본 발명은 그의 기관 독성에 대해 이전에 쇠약해진 예비임상 시약의 재생에 유용하다. 전체적으로, 일상적인 임상 화학에 대한 간독성을 지시하는 화합물의 독성에 대한 상세한 기작은 광범위하게 알려져 있지 않다. 상기 화합물이 본 발명을 통해 상세히 시험되고 세포 생존 능력에 영향을 미치지 않으면서 단지 수송체 기능만을 차단하는 것으로 판명된다면, 화학 구조의 최소한의 개질이 임상적 사용을 위해 적용되기에 효과적일 것이다. (2) 인간 암세포로 이식된 면역결핍 마우스에 본 발명의 방법을 적용하면, 생체 내에서 종양 세포 응집물 또는 손상되지 않은 조직으로의 임의의 유형의 약물 전달 및 축적의 특이성을 알아볼 수 있게 한다. 그러한 적용은 생체 내에서 이식된 암에 항암 시약의 전달 및 제거를 알아보는데 매우 유용한데, 이는 mrp2 와 같은 수송체의 기능이 종양의 약물 내 성의 중요한 결정소이기 때문이다. 항암 및 항-혈액응고 시약의 가능성을 스크리닝하기 위한 예비임상 실험의 적용.
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Claims (10)
- 하기 단계를 포함하는, 기관 또는 조직 손상의 분석 방법 :(a) 염료로 기관 또는 조직을 표지함 ;(b) 상기 기관 또는 조직의 생체외 대사 및/또는 세포 조건을 포함하여 다수의 지시를 수득함 ; 및(c) 상기 지시로부터 기관 또는 조직 손상을 분석함.
- 제 1 항에 있어서, 기관 또는 조직은 간, 신장, 폐, 췌장 및 위장관으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 단계 (b) 는 혈관계 및/또는 배설 경로의 미세해부학적 기원을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 분석은 시각적으로 및/또는 정량적으로 수행되는 방법.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 조건은 세포 생존 능력, 세포 손상, 분자 수송, 및 미토콘드리아 기능으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 방법.
- 하기 단계를 포함하는, 약물 독성 평가 방법 :(a) 염료로 기관 또는 조직을 표지함 ;(b) 상기 기관 또는 조직에 테스트 약물을 적용함 ;(c) 상기 기관 또는 조직의 생체외 대사 및/또는 세포 조건을 포함하여 다수의 지시를 수득함 ;(d) 상기 지시로부터 기관 또는 조직 손상을 분석함 ; 및(e) 약물이 상기 기관 또는 조직에 독성을 가지는지 또는 아닌지 평가함.
- 제 6 항에 있어서, 기관 또는 조직은 간, 신장, 폐, 췌장 및 위장관으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 방법.
- 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 단계 (b) 는 혈관계 및/또는 배설 경로의 미세해부학적 기원을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 분석은 시각적으로 및/또는 정량적으로 수행되는 방법.
- 제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 조건은 세포 생존 능력, 세포 손상, 세포 내 및 주변에서의 분자 수송, 및 생물학적 활성 화합물의 발 생, 혈류, 및 조직 산소화로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 방법.
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2006
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