WO2021032763A1 - Utilisation d'hémoglobine d'annélides in vitro - Google Patents

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WO2021032763A1
WO2021032763A1 PCT/EP2020/073154 EP2020073154W WO2021032763A1 WO 2021032763 A1 WO2021032763 A1 WO 2021032763A1 EP 2020073154 W EP2020073154 W EP 2020073154W WO 2021032763 A1 WO2021032763 A1 WO 2021032763A1
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WO
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sample
annelid
cells
globin
organoid
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Application number
PCT/EP2020/073154
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English (en)
Inventor
Franck Zal
Original Assignee
Hemarina
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hemarina filed Critical Hemarina
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Priority to CA3147455A priority patent/CA3147455A1/fr
Priority to EP20757336.1A priority patent/EP4017261A1/fr
Publication of WO2021032763A1 publication Critical patent/WO2021032763A1/fr

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients

Definitions

  • the present invention relates to the use of a molecule selected from an Annelid globin, an Annelid globin protomer and an Annelid extracellular hemoglobin, for its in vitro use.
  • the present invention relates to a method for analyzing a sample of cells from a patient or a sample of bacteria or an organoid, comprising: a first step of mixing the sample of cells from the patient , of the bacterial sample or of the organoid with at least one molecule chosen from a globin of Annelids, a protomer of globin of Annelids and an extracellular hemoglobin of Annelids, optionally, a second step of preparation of the mixture obtained at the first step, and a third step of analyzing the mixture obtained in the first or in the second step.
  • a biological test begins with taking a biological sample from a patient. This sample is then analyzed to determine the normal value or the imbalance of a biological parameter, and thus to identify the nature, the cause or the prognosis of a disease.
  • samples comprising cells from a patient are particularly delicate. Indeed, the maintenance in good condition and / or the survival of the cells taken are crucial for the relevance and the sensitivity of the results which result from them.
  • Cells are sensitive biological material; unsuitable culture or storage conditions can induce their death, which can have the consequence of falsifying the results of the analyzes, or even of making their analyzes impossible.
  • organoids in addition, in the field of in vitro tests, it is very common to use organoids as biological material that mimics the anatomy of an organ. Such structures have limited lifespans, and the measurements are not necessarily carried out under good conditions.
  • agar cultures in the case of bacteria, it is very common to use agar cultures to study these microorganisms, for example to determine the level of effectiveness of new antibiotics, or even to identify a bacterial strain.
  • Such agar cultures are typically performed in the presence of blood, for example sheep blood (blood agar or Columbia blood agar), in a relatively large amount (of the order of 50 mL of blood per liter of agar).
  • blood for example sheep blood (blood agar or Columbia blood agar)
  • a relatively large amount of the order of 50 mL of blood per liter of agar.
  • due to the presence of blood such cultures cannot undergo a freezing step.
  • the present invention makes it possible to meet these expectations.
  • It relates in fact to a method for analyzing a sample of cells from a patient, preferably human, a bacterial sample or an organoid, comprising: a first step of mixing the sample of cells of the patient, of the bacterial sample or of the organoid with at least one molecule chosen from a globin of Annelids, a protomer of globin of Annelids and an extracellular hemoglobin of Annelids, optionally, a second step of preparation of the mixture obtained in the first step, and a third step of analysis of the mixture obtained in the first or in the second step.
  • Such a method makes it possible, thanks to the presence of at least one molecule chosen from an Annelid globin, an Annelid globin protomer and an Annelid extracellular hemoglobin, to maintain the sample of cells or bacteria or the organoid alive in good conditions.
  • the sample exhibits a significantly improved lifespan. This lifetime is of course dependent on the size of the sample, and the volume in which it is immersed.
  • the organoid As for the organoid, its lifespan is also improved, and allows reliable and reproducible measurements.
  • the method according to the invention has the advantage of being able to be implemented from the operating room where the sample of a patient, preferably a biopsy, is taken, to the analysis laboratory: in fact, from the sample, the patient sample is mixed with at least one molecule selected from an Annelid globin, an Annelid globin protomer and an Annelid extracellular hemoglobin, then it undergoes the subsequent steps of the process inherently (e.g. example extractor hood in the case of use of volatile organic solvent).
  • a subject of the present invention is also the use of a molecule chosen from an Annelid globin, an Annelid globin protomer and an Annelid extracellular hemoglobin, for the preservation of at least one sample of Annelid cells.
  • a patient preferably human, of a bacterial or organoid sample.
  • the molecule according to the invention is chosen from an Annelid globin, an Annelid globin protomer and an Annelid extracellular hemoglobin.
  • This molecule is an oxygen carrier.
  • oxygen carrier is meant a molecule capable of transporting oxygen, reversibly, from the environment to target cells, tissues or organs.
  • the extracellular hemoglobin of Annelids is present in the three classes of Annelids: the Polychaetes, the Oligochaetes and the Achetes. We speak of extracellular hemoglobin because it is naturally not contained in a cell, and can therefore circulate freely in the blood system without chemical modification to stabilize it or make it functional.
  • Annelid s extracellular hemoglobin is a giant biopolymer with a molecular weight between 2000 and 4000 kDa, made up of approximately 200 polypeptide chains ranging from 4 to 12 different types that are generally grouped into two categories.
  • the first category comprising 144 to 192 elements, groups together the so-called “functional” polypeptide chains which carry an active site of the heme type, and are capable of reversibly binding oxygen; they are globin-like chains (eight types in total for Arenicola marina hemoglobin: a1, a2, b1, b2, b3, c, d1 and d2), whose masses are between 15 and 18 kDa. They are very similar to the type a and b chains of vertebrates.
  • the second category comprising 36 to 42 elements, groups together the so-called “structural” or “linker” polypeptide chains possessing little or no active site but allowing the assembly of subunits called twelfths or protomers.
  • linkers There are two types of linkers, L1 and L2.
  • Each hemoglobin molecule consists of two superimposed hexagons which have been called hexagonal bilayer (hexagonal bilayer) and each hexagon is itself formed by the assembly of six subunits (dodecamer or protomer) in the form of a drop. 'water.
  • the native molecule is made up of twelve of these subunits (dodecamer or protomer).
  • Each subunit has a molecular weight of approximately 250 kDa, and is the functional unit of the native molecule.
  • the extracellular hemoglobin of Annelids is chosen from extracellular hemoglobins of Annelid Polychetes and extracellular hemoglobins of Annelid Oligochaetes.
  • the extracellular hemoglobin of Annelids is chosen from extracellular hemoglobins of the Lumbricidae family, extracellular hemoglobins of the Arenicolidae family and extracellular hemoglobins of the Nereididae family.
  • the extracellular hemoglobin of Annelides is chosen from the extracellular hemoglobin of Lumbricus terrestris, the extracellular hemoglobin of Arenicola sp and the extracellular hemoglobin of Nereis sp, more preferably the extracellular hemoglobin of Arenicola marina or by Nereis virens.
  • the lugworm Arenicola marina is a polychaete annelid worm that lives mainly in sand.
  • the globin protomer of the extracellular hemoglobin of Annelids constitutes the functional unit of native hemoglobin, as indicated above.
  • the globin chain of the extracellular hemoglobin of Annelids can in particular be chosen from the globin chains of type Ax and / or Bx of extracellular hemoglobin of Annelids.
  • the extracellular hemoglobin of Annelids, its globin protomers and / or its globins do not require a cofactor to function, unlike mammalian hemoglobin, especially human.
  • the extracellular hemoglobin of Annelides, its globin protomers and / or its globins not having a blood type, they make it possible to avoid any problem of immunological or allergic reaction.
  • the extracellular hemoglobin of Annelids, its globin protomers and / or globins exhibit intrinsic superoxide dismutase (SOD) activity. Therefore, this intrinsic antioxidant activity does not require any antioxidants to function, unlike the use of mammalian hemoglobin for which the antioxidant molecules are contained inside the red blood cell and are not bound to hemoglobin. .
  • the extracellular hemoglobin of Annelides, its globin protomers and / or its globins can be native or recombinant.
  • the extracellular hemoglobin is that of Arenicola marina.
  • the method according to the invention comprises a first step of mixing the sample of cells from the patient, preferably human, the bacterial sample or the organoid with at least one molecule chosen from an Annelid globin, a protomer globin from Annelids and extracellular hemoglobin from Annelids.
  • the patient sample of cells is any biological sample from said patient comprising cells.
  • the sample of cells may be a set of isolated cells, a fragment of biological tissue, or an organ or an organ fragment.
  • the cells can be eukaryotic or prokaryotic, preferably eukaryotic, preferably mammalian, preferably human.
  • This sample is preferably a set of isolated cells (such as for example a blood sample), a fragment of biological tissue, or even a fragment of an organ.
  • This sample is preferably a blood sample, biopsy, smear or organ resection.
  • a blood sample is preferably a sample comprising at least red blood cells.
  • a biopsy is a removal of a piece of an organ or tissue, usually done with a needle or trocar.
  • a smear is a scrape taken, usually with a swab, small brush, or small spatula.
  • Organ resection also called ablation, is the surgical removal of part of an organ or tissue, usually pathological.
  • the patient can be any vertebrate or invertebrate animal; preferably it is a mammal, preferably a human.
  • the sample of cells from a patient is a sample of part of an organ or pathological tissue, in particular affected by cancer.
  • the sample of cells from a patient is a sample of part of an organ or tumor tissue.
  • the bacterial sample is any sample of bacteria, comprising a single bacterial strain or a mixture of strains.
  • the bacteria may or may not be known.
  • they are Gram + bacteria, preferably bacteria of the Bacilli class, preferably of the genus Streptococcus or Staphylococcus.
  • the method according to the invention can also comprise a first step of mixing the organoid with at least one molecule chosen from an Annelid globin, an Annelid globin protomer and an Annelid extracellular hemoglobin.
  • organoid is meant a three-dimensional structure which reproduces in vitro the micro-anatomy of an organ.
  • An organoid therefore corresponds to an organ model; it is prepared outside of any living organism. It is generally obtained by culture in the laboratory of one or more precursor cells of a tissue, such as stem cells (such as embryonic or induced pluripotent stem cells). These cells can self-organize in three dimensions, in a suitable nutrient medium comprising growth and differentiation factors, to form the mini-organ. Of preferably, cells self-organize in a suitable three-dimensional environment, such as a hydrogel or a porous matrix.
  • the organoid used in the present invention can be any organoid used in in vitro testing, for example reconstructed skin, brain organoid, tumor organoid, intestinal organoid or renal organoid.
  • organoid is therefore distinct from conventional cells in culture (for example in Petri dishes); while the organoid is necessarily three-dimensional (3D), cells in culture are only 2D.
  • organoids can be used to test the toxicity or efficacy of potential drugs, or to test the safety of cosmetic compositions.
  • the globin, the protomer of globin or the extracellular hemoglobin of Annelids used in the first step can be formulated in a buffer solution, a cell culture medium or an organ preservation solution or graft.
  • the buffer solution creates an adequate saline environment for hemoglobin, its protomers and globins, and thus allows the maintenance of the quaternary structure, and therefore the functionality of this molecule. Thanks to the buffer solution, hemoglobin, its protomers and globins are able to perform their oxygenating function.
  • the buffer solution according to the invention is preferably an aqueous solution comprising salts, preferably chloride, sodium, calcium, magnesium and potassium ions, and gives the composition according to the invention a pH of between 5 and 9, preferably between 5.5 and 8.5, preferably between 6.5 and 7.6; its formulation is similar to that of a physiologically injectable liquid. Under these conditions, the extracellular hemoglobin of Annelides, its globin protomers and globins remain functional.
  • the pH is understood to mean at room temperature (25 ° C.), unless otherwise stated.
  • the buffer solution is an aqueous solution comprising sodium chloride, calcium chloride, magnesium chloride, potassium chloride, as well as sodium gluconate and sodium acetate, and has a pH between 6.5 and 7.6 , preferably equal to 7.1 ⁇ 0.5, more preferably about 7.35.
  • the buffer solution is an aqueous solution comprising 90 mM of NaCl, 23 mm of Na-gluconate, 2.5 mM of CaCh, 27 mM of Na-acetate, 1.5 mM of MgCl2, 5 mM of KCl, and has a pH of 7.1 ⁇ 0.5, which may contain between 0 and 100 mM of antioxidant such as ascorbic acid and / or reduced glutathione.
  • the globin, globin protomer or extracellular hemoglobin of Annelids used in the first step can also be formulated in an organ or graft preservation solution, or cell culture medium.
  • the organ preservation solution can be an aqueous solution having a pH between 6.5 and 7.5, comprising salts, preferably chloride, sulfate, sodium, calcium, magnesium and potassium ions; sugars, preferably mannitol, raffinose, sucrose, glucose, fructose, lactobionate (which is a waterproofing agent), or gluconate; antioxidants, preferably glutathione; active agents, preferably xanthine oxidase inhibitors such as allopurinol, lactates, amino acids such as histidine, glutamic acid (or glutamate), tryptophan; and optionally colloids such as hydroxyethyl starch, polyethylene glycol or dextran.
  • salts preferably chloride, sulfate, sodium, calcium, magnesium and potassium ions
  • sugars preferably mannitol, raffinose, sucrose, glucose, fructose, lactobionate (which is a waterproofing agent), or
  • Cell culture media are commercially available and vary widely.
  • media available from Invitrogen are the following: D-MEM, D-MEM / F-12, MEM, RPMI 1640, Medium 199 or any like medium.
  • hemoglobin, its protomers or globins is used in a concentration ranging from 0.03 g / L to 40 g / L, preferably from 0.05 g / L to 35 g / L, preferably from 0, 1 g / L to 30 g / L, preferably 0.5 g / L to 25 g / L, preferably 1 g / L to 20 g / L. It can be used in a concentration ranging from 1.5 g / L to 20 g / L.
  • hemoglobin, its protomers or globins is used in a concentration ranging from 0.03 g / L to 10 g / L, preferably from 0.08 g / L to 10 g / L, preferably from 0 , 1 g / L to 5 g / L.
  • the temperature for carrying out the process can be between 0 ° C and 40 ° C, preferably between 2 ° C and 39 ° C. Preferably, this temperature is about 4 ° C; alternatively preferably, this temperature is about 37 ° C.
  • the first step of the process according to the invention is carried out in a container comprising agar.
  • Agar is a nutrient that promotes or inhibits (depending on its composition) the proliferation and development of bacteria.
  • the agar comprises at least a mixture of peptones, agar-agar and sodium chloride.
  • the agar comprises from 5 to 35 g / L, preferably from 7 to 30 g / L of peptones.
  • the agar comprises from 5 to 30 g / L, preferably from 7 to 25 g / L, preferably from 10 to 20 g / L of agar-agar.
  • Agar-agar provides a solid composition (solid gel).
  • the agar comprises from 3 to 20 g / L, preferably from 4 to 10 g / L of sodium chloride.
  • the agar may include other ingredients, for example salts, starch, or any other conventional ingredient.
  • the agar comprises at least one molecule selected from an Annelid globin, an Annelid globin protomer and an Annelid extracellular hemoglobin.
  • blood agar which comprises about 10 g / L of mammalian hemoglobin, for example sheep hemoglobin.
  • the agar comprises at least one molecule chosen from an Annelid globin, an Annelid globin protomer and an Annelid extracellular hemoglobin
  • said hemoglobin, its protomers or its globins is used in a concentration ranging from 0.03 g / L to 5 g / L, preferably from 0.08 g / L to 3 g / L, preferably from 0.1 g / L to 2 g / L.
  • the first step comprises depositing the sample of cells from the human patient, the bacterial sample or the organoid in a container comprising agar and at least one molecule selected from an Annelid globin, a globin protomer of Annelids and extracellular hemoglobin of Annelids.
  • the sample or organoid is deposited in the agar container comprising at least one molecule chosen from an Annelid globin, an Annelid globin protomer and an Annelid extracellular hemoglobin.
  • the container obtained can be frozen while waiting to undergo other steps of the process, without compromising the reliability of the results obtained.
  • a mixture of hemoglobin, its protomers or its globins and a sample of cells a bacterial or organoid sample is thus obtained.
  • this second step comprises the preparation of the mixture obtained in the first step.
  • this second step comprises at least the coloring and / or the thinning and / or the inclusion in the paraffin or an epoxy resin, of at least some cells and / or at least some cell organelles of the. sample.
  • cellular organelle is meant a differentiated compartment contained in eukaryotic cells which has a given function.
  • the cell organelle is chosen from the nucleus, lysosomes, peroxisomes and mitochondria.
  • the second step directly comprises at least the coloring and / or thinning and / or the inclusion in paraffin or an epoxy resin, of at least certain cells of the patient or bacterial sample.
  • the second step comprises the isolation of at least some cell organelles from the patient sample, then their coloring and / or their thinning and / or their inclusion in paraffin or an epoxy resin.
  • the second step may involve isolating the mitochondria from the patient's cell sample and then staining them.
  • Coloring can be carried out using a conventional dye, in particular an acidic or basic dye.
  • a conventional dye in particular an acidic or basic dye.
  • Such a dye can be chosen from carmine, hematoxylin, eosin, picric acid, fuschin acid, basic fuschin, orange G, erythrosine, safranin, PAS (Periodic Acid Schiff ), methylene blue and thionine.
  • the dye can also be Rhodamine 123. This dye is used in particular for the staining of mitochondria.
  • the thinning of the sample can be carried out by slicing, in particular using a microtome, to make suitable sections.
  • This thinning is carried out in particular after inclusion of at least some cells of the sample in paraffin or an epoxy resin.
  • the mixture obtained in the first step is mixed with paraffin in the liquid state, or with an epoxy resin, then the resulting mixture is dried.
  • Paraffin has the advantage of being liquid at a temperature above 56 ° C and of solidifying when the temperature drops below this limit.
  • blocks of solid paraffin, or polymerized epoxy resin, containing the cells of the sample are obtained. These blocks can then be cut using a microtome, to obtain thin sections of sample a few micrometers thick. These cuts can then undergo staining, so as to identify certain elements more or less specifically, before being placed on a microscope slide for analysis.
  • the patient cell sample obtained in the first or second step is stored for a period of a few hours, for example at least 24 hours, preferably at least 50 hours, preferably at least 100 hours at a temperature between 0 ° C and 10 ° C, for example 4 ° C; or else at a temperature between 15 ° C and 25 ° C, such as room temperature.
  • the second optional step of the method according to the invention comprises the preparation of the mixture obtained in the first step. This preparation can then comprise bringing a compound into contact with the mixture obtained in the first step.
  • the compound can be any potentially active molecule, or else a cosmetic composition.
  • the molecule can be chemical or biological.
  • the process then aims to determine the possible effects of the compound on the organoid.
  • the second step can include at least staining at least some cells of the organoid.
  • the method according to the invention comprises a third step of analyzing the mixture obtained in the first or in the second step.
  • the third step includes analysis by histology, microscopy, immunological detection or molecular biology.
  • Histology is a technique of biological analysis involving the identification of a set of donated cells by chemical, enzymatic, radiography or immunology.
  • the histology is selected from among histochemistry, enzymatic histochemistry, historadiography and immunohistochemistry.
  • the histochemical analysis is carried out when the second step comprises at least the staining of the sample or of the organoid.
  • Enzymatic histochemistry is a histological method which allows the determination of the activity of one or more enzymes in a given tissue. The histoenzymological technique does not reveal the enzymes as such, but their presence by the product obtained during their action on a specific substrate of the enzyme in question.
  • Historadiography consists of making thin sections of the tissue to be observed and their inclusion in paraffin (i.e. second step of thinning and inclusion of the sample), then observing them using radiation.
  • immunohistochemistry involves the use of antibodies to bind to a molecule present in at least some cells of the sample or organoid. These antibodies are specific for the molecule to be identified and therefore for the analysis to be performed. The antibody-antigen complexes (present in the sample) are then revealed using a chemical compound.
  • antibodies targeting tumor antigens are used.
  • the microscopy can be light microscopy or scanning electron microscopy.
  • Immunological detection is based on the same principle as immunohistochemistry, and uses antibodies to bind to a molecule present in at least some cells of the sample or organoid.
  • the immunological detection comprises the use of at least one antibody directed against a cancer antigen or an inflammatory antigen.
  • the analysis by molecular biology can comprise in particular the use of PCR, or also the detection of a ratio of nucleic acids such as the ratio DNA / RNA, in particular by spectrophotometry.
  • a high DNA / RNA ratio indicates a low amount of RNA, hence low cell life.
  • the mixture of the sample of cells of the patient or of the organoid with at least one molecule chosen from an Annelid globin, an Annelid globin protomer and an Annelid extracellular hemoglobin according to the invention makes it possible in particular to protect cellular RNAs, and thus obtain more reliable and reproducible results.
  • the third step of the method according to the invention can comprise analysis by histology, by immunological detection or by molecular biology, in particular as indicated above.
  • a subject of the present invention is also a container comprising agar and at least one molecule chosen from an Annelid globin, an Annelid globin protomer and an Annelid extracellular hemoglobin.
  • the agar preferably comprises at least a mixture of peptones, agar-agar and sodium chloride.
  • the agar comprises from 5 to 35 g / L, preferably from 7 to 30 g / L of peptones.
  • the agar comprises 5 to 30 g / L, preferably 7 to 25 g / L, preferably 10 to 20 g / L of agar-agar.
  • the agar comprises from 3 to 20 g / L, preferably from 4 to 10 g / L of sodium chloride.
  • the agar can also include other ingredients, for example salts, starch, or any other conventional ingredient.
  • hemoglobin, its protomers or globins is used in a concentration ranging from 0.03 g / L to 5 g / L, preferably from 0.08 g / L to 3 g / L, preferably from 0 , 1 g / L to 2 g / L.
  • This container can be used for any in vitro test using a biological sample, for example a patient sample or a bacterial sample. It can be frozen without impacting the reliability of the results obtained.
  • Example 1 Study of preservation of different rat organs, by analysis of mitochondria
  • the aim of the study is to identify an optimal condition for organ preservation for the rat liver, heart and brain.
  • Organs were stored at 4 ° C in HEM02Life® solution with modulation of storage period and HEM02Life® concentration. The effectiveness of preservation was assessed by characterizing mitochondrial integrity and functionality.
  • HEM02Life® is a composition comprising the extracellular hemoglobin of Arenicoia marina, with various excipients.
  • the organs used are the liver, heart and brain of 250 g male Wistar rats (reference: Wl (Han), Charles River).
  • Each organ is mixed with HEM02Life® (first step of the process according to the invention).
  • a 24 hour retention period has been set as a benchmark. According to the results obtained at this time, longer or shorter time points were evaluated with a modulation of the concentration of HEM02Life®. In case of good storage at 24 hours (liver), a longer period has been tested. In the event of poor storage at 24 hours (heart and brain), a shorter period was tested.
  • HEM02Life® 49 g / L stock solution was diluted in 20 g / L stabilization buffer. The solution was diluted in stabilization buffer to obtain a final concentration of 15, 10 or 5 g / L in 8 mL (final volume).
  • the containers are 20 ml flat bottom tubes (PP container, Miguel Dutscher).
  • the volume of HEM02Life® represents 40% of the total volume of the tube (8 mL).
  • the containers were placed on a stirring apparatus (IKA HS 260 basic, VWR) at the speed of 90 round trips / minute.
  • a stirring apparatus IKA HS 260 basic, VWR
  • the samples were stored in a cold room at 4 ° C.
  • the mitochondria were isolated from the organs by freezing, grinding, then centrifugation in a density gradient (second step of the process according to the invention), then incubated at 37 ° C. for 45 minutes.
  • the integrity of the mitochondria is evaluated by the absence of spontaneous swelling and by the transmembrane potential, and their functionality is evaluated by the respiratory control index after incubation.
  • the mitochondria were incubated at 37 ° C with Rhodamine 123 in 96-well plates in 200 ⁇ L (final volume) (second step of the process according to the invention, staining step).
  • the isolated mitochondria were incubated in a 1.5 mL cell under magnetic stirring with a Clark type oxygen electrode (Hansatech Instruments Ltd, Norfolk, UK), thermostatted at 37 ° C, in 500 ⁇ L of medium. Consisting of 0.3M mannitol, 10 mM phosphate buffer (pH 7.3), 10 mM KCl, 5 mM MgCl2 and 1 mg / ml BSA (bovine serum albumin). The addition of ADP (1.65 mM) causes a sudden increase in oxygen uptake when ADP is converted to ATP, characterized by a state of active respiration. The inhibitor Oligomycin A (1 mM), which blocks respiration in coupled mitochondria and the mCICCP decoupling agent were added to restore activity.
  • the swelling is calculated as follows (third step of the process according to the invention):
  • Transmembrane potential The transmembrane potential is calculated as follows (third step of the process according to the invention):
  • the respiratory control index is calculated as follows:
  • This index indicates the tightness of oxidative phosphorylation, thus referring to the functionality of the respiratory chain and the quality of the mitochondrial preparation.
  • a preservation condition has been validated for the liver and heart if:
  • RCI> 3 the RCI in mitochondria isolated from fresh liver and heart was 6.34 and 4.85 respectively.
  • a preservation condition has been validated for the brain if:
  • the liver is the organ with the longest storage period (30 h) at 4 ° C in HEM02Life®. Beyond that, the mitochondrial membrane begins to rupture and respiratory activity decreases sharply.
  • the Respiratory Control Index (RCI) is 6.34, spontaneous swelling is 5.40%, and spontaneous DYGTI loss is 1.89%.
  • the RCI value remained above 5, and spontaneous swelling and spontaneous DYGP loss are less than 10%, suggesting that the functionality of the mitochondria is strongly conserved.
  • HEM02Life® at 10 and 15 g / L maintains mitochondrial functionality during 30 h incubation at 4 ° C.
  • the functionality of the cardiac mitochondria was preserved with a 24 h incubation at 4 ° C with 15 g / L of HEM02Life®.
  • the RCI value is 4.85
  • the spontaneous swelling is 6.94%
  • the spontaneous loss of DYGTI is 7.81%.
  • 15 g / L of HEM02Life® allows mitochondrial functionality to be preserved (RCI> 3).
  • the liver is the organ with the longest storage period in HEM02Life® (30 h), followed by the heart (24 h) then the brain (12 h).
  • the required concentration of HEM02Life® is 15 g / L for the heart and the brain, and 10 g / L for the liver.
  • the concentration of 10 g / L is protective for 16 hours for the heart, while it does not protect the brain for 12 hours.
  • the analysis method according to the invention makes it possible to define the optimum conditions for the transport of organs, in particular rat organs, such as liver, heart and brain, without any alteration of the mitochondria.
  • Example 2 Study of bacterial growth on an aelose substrate
  • Flask 1 (negative control): addition of 5mL of a dilution solution ("stabilization solution", i.e. Arenicola marina hemoglobin saline buffer) in 250mL, then pouring of 12 cans;
  • stabilization solution i.e. Arenicola marina hemoglobin saline buffer
  • Flask 2 (positive control): addition of sheep hemoglobin at a concentration of 50 ml of blood per liter of agar, then pouring of 12 dishes;
  • Flask 3 (invention): addition of 5ml_ of Arenicola marina hemoglobin (M101) diluted in "stabilization solution” (ie 0.5mL to 50g / L in 4.5mL of "stabilization solution”): final M101 to 0.1 g / L, then pouring of 12 boxes;
  • stabilization solution ie 0.5mL to 50g / L in 4.5mL of "stabilization solution”
  • Flask 4 (invention): addition of 5mL of M101 diluted in "stabilization solution” (ie 2.5mL at 50g / L in 2.5mL of “stabilization solution”): final M101 at 0.5g / L, then pouring of 12 cans ; and
  • Flask 5 (invention): addition of 5mL of M101 at 50g / L (undiluted to have 1 g / L): final M101 at 1 g / L, then pouring of 12 cans.
  • 10 are inoculated with a rake by adding an inoculum of S. aureus diluted if necessary and homogenized, contained in 500 ml of “stabilization solution” (first step of the process of the invention).
  • the target inoculum concentration is 50 cfu / box, or 100 cfu / mL. 2 boxes serve as negative control.
  • the number of colonies per dish is then read on the 10 dishes at 24h, 48h, 72h and 96h (third step of the process of the invention).
  • Controls for each condition are checked at the same times, which should be negative.
  • hemoglobin from Arenicola marina at concentrations of 0.1, 0.5 and 1 g / L makes it possible to grow Staphylococcus aureus as on a Columbia-type agar made from fresh blood.
  • This hemoglobin from Arenicola marina can be used at concentrations well below that of blood. Moreover, it can be frozen, which is not possible for the blood.

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Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé d'analyse d'un échantillon de cellules d'un patient ou d'un organoïde, comprenant : une première étape de mélange de l'échantillon de cellules du patient ou de l'organoïde avec au moins une molécule choisie parmi une globine d'Annélides, un protomère de globine d'Annélides et une hémoglobine extracellulaire d'Annélides, optionnellement, une seconde étape de préparation du mélange obtenu à la première étape, et une troisième étape d'analyse du mélange obtenu à la première ou à la seconde étape.

Description

UTILISATION D'HÉMOGLOBINE D'ANNÉLIDES IN VITRO
La présente invention concerne l’utilisation d’une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides, pour son usage in vitro. En particulier, la présente invention se rapporte à un procédé d’analyse d’un échantillon de cellules d’un patient ou d’échantillon bactérien ou d’un organoïde, comprenant : une première étape de mélange de l’échantillon de cellules du patient, de l’échantillon bactérien ou de l’organoïde avec au moins une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides, optionnellement, une seconde étape de préparation du mélange obtenu à la première étape, et une troisième étape d’analyse du mélange obtenu à la première ou à la seconde étape.
Les examens de biologie médicale sont réalisés pour le dépistage et le suivi des maladies. Un examen biologique commence par le prélèvement d’un échantillon biologique chez un patient. Cet échantillon est ensuite analysé pour déterminer la valeur normale ou le déséquilibre d’un paramètre biologique, et ainsi identifier la nature, la cause ou le pronostic d’une maladie.
Parmi les différents échantillons biologiques utilisables, les échantillons comprenant des cellules d’un patient sont particulièrement délicats. En effet, le maintien en bon état et/ou la survie des cellules prélevées sont cruciaux pour la pertinence et la sensibilité des résultats qui en découlent.
Les cellules constituent un matériel biologique sensible ; des conditions de culture ou de stockage inadaptées peuvent induire leur mort, ce qui peut avoir pour conséquence de fausser les résultats des analyses, voire même de rendre leurs analyses impossibles.
Pourtant, les techniques actuelles de biologie médicale ne sont pas nécessairement appropriées pour maintenir une survie optimale des cellules.
Il est d’une part important d’obtenir des échantillons biologiques de bonne qualité, prélevés et préparés selon des standards de qualité (voir la publication Ziv et al, The Importance of Biopsy in the Era of Molecular Medicine, Cancer J, 2016 ; 22(6) :418-422). D’autre part, l’utilisation de certains solvants, en particulier les solvants organiques volatils, pose des problèmes de santé et de sécurité : par exemple, le formaldéhyde (ou formol) est un composé cancérigène et fortement volatil. Lors de la préparation d’un échantillon biologique en vue de son analyse, ce solvant est à manipuler avec précaution.
Ainsi, il existe un besoin pour une méthode permettant de maintenir les cellules prélevées d’un patient vivantes, le plus longtemps possible. Cela permettrait d’effectuer des analyses de façon fiable, reproductible et sensible. En outre, cela permettrait de lire et/ou interpréter les résultats avec précision et dans des conditions optimales, car proches du contexte in vivo. Enfin, il existe un besoin pour une méthode qui limite ou n’utilise pas de solvant organique volatil, et/ou qui substitue ce dernier, afin d’obtenir un environnement d’expérimentation plus sûr.
Par ailleurs, dans le domaine des tests in vitro, il est très courant d’utiliser des organoïdes comme matériel biologique mimant l’anatomie d’un organe. De telles structures ont des durées de vie limitées, et les mesures ne sont pas forcément effectuées dans de bonnes conditions.
Il existe donc un besoin pour une méthode permettant de préserver ce type de matériel biologique, afin d’assurer des mesures fiables et reproductibles.
Enfin, dans le cas des bactéries, il est très courant d’utiliser des cultures sur gélose pour étudier ces micro-organismes, par exemple pour déterminer le niveau d’efficacité de nouveaux antibiotiques, ou bien encore pour identifier une souche bactérienne. De telles cultures sur gélose sont effectuées typiquement en présence de sang, par exemple de sang de mouton (gélose au sang ou Columbia au sang), en quantité relativement importante (de l’ordre de 50 mL de sang par litre de gélose). En outre, du fait de la présence de sang, de telles cultures ne peuvent pas subir d’étape de congélation.
Il existe donc un besoin pour une méthode d’étude des bactéries, qui soit plus économe en matières premières, et qui permette une congélation des échantillons.
La présente invention permet de répondre à ces attentes.
Elle a en effet pour objet un procédé d’analyse d’un échantillon de cellules d’un patient, de préférence humain, d’un échantillon bactérien ou d’un organoïde, comprenant : une première étape de mélange de l’échantillon de cellules du patient, de l’échantillon bactérien ou de l’organoïde avec au moins une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides, optionnellement, une seconde étape de préparation du mélange obtenu à la première étape, et une troisième étape d’analyse du mélange obtenu à la première ou à la seconde étape.
Un tel procédé permet, grâce à la présence d’au moins une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides, de maintenir l’échantillon de cellules ou bactérien ou l’organoïde en vie dans de bonnes conditions.
En outre, l’échantillon présente une durée de vie significativement améliorée. Cette durée de vie est bien entendu dépendante de la taille de l’échantillon, et du volume dans lequel il est immergé.
En ce qui concerne l’organoïde, sa durée de vie est également améliorée, et permet des mesures fiables et reproductibles.
Le procédé selon l’invention présente l’avantage de pouvoir être mis en oeuvre depuis le bloc opératoire où l’échantillon d’un patient, de préférence une biopsie, est prélevé, jusqu’au laboratoire d’analyses : en effet, dès le prélèvement, l’échantillon du patient est mélangé avec au moins une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides, puis il subit les étapes subséquentes du procédé de manière inhérente (par exemple hotte aspirante dans le cas d’utilisation de solvant organique volatil).
La présente invention a également pour objet l’utilisation d’une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides, pour la conservation d’au moins un échantillon de cellules d’un patient, de préférence humain, d’un échantillon bactérien ou d’un organoïde.
La molécule selon l’invention est choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides.
Cette molécule est un transporteur d’oxygène. Par « transporteur d’oxygène », on entend une molécule capable de transporter l’oxygène, de façon réversible, depuis l’environnement jusqu’aux cellules, tissus ou organes cibles.
L’hémoglobine extracellulaire d’Annélides est présente chez les trois classes d'Annélides: les Polychètes, les Oligochètes et les Achètes. On parle d’hémoglobine extracellulaire car elle est naturellement non contenue dans une cellule, et peut donc circuler librement dans le système sanguin sans modification chimique pour la stabiliser ou la rendre fonctionnelle.
L’hémoglobine extracellulaire d’Annélides est un biopolymère géant de poids moléculaire compris entre 2000 et 4000 kDa, constitué d'environ 200 chaînes polypeptidiques comprises entre 4 et 12 types différents que l'on regroupe généralement en deux catégories.
La première catégorie, comptant 144 à 192 éléments, regroupe les chaînes polypeptidiques dites "fonctionnelles" qui portent un site actif de type hème, et sont capables de lier réversiblement l'oxygène ; ce sont des chaînes de type globine (huit types au total pour l’hémoglobine d ’Arenicola marina : a1 , a2, b1 , b2, b3, c, d1 et d2), dont les masses sont comprises entre 15 et 18 kDa. Elles sont très similaires aux chaînes de type a et b de vertébrés.
La deuxième catégorie, comptant 36 à 42 éléments, regroupe les chaînes polypeptidiques dites de « structure » ou « linkers » possédant peu ou pas de site actif mais permettant l'assemblage des sous-unités appelées douzièmes ou protomères. On compte deux types de linkers, L1 et L2.
Chaque molécule d'hémoglobine est constituée de deux hexagones superposés que l'on a nommés bicouche hexagonale (hexagonal bilayer) et chaque hexagone est lui-même formé par l'assemblage de six sous-unités (dodécamère ou protomère) en forme de goutte d'eau. La molécule native est formée de douze de ces sous-unités (dodécamère ou protomère). Chaque sous-unité a une masse moléculaire d’environ 250 kDa, et constitue l'unité fonctionnelle de la molécule native.
De préférence, l'hémoglobine extracellulaire d’Annélides est choisie parmi les hémoglobines extracellulaires d’Annélides Polychètes et les hémoglobines extracellulaires d’Annélides Oligochètes. De préférence, l'hémoglobine extracellulaire d’Annélides est choisie parmi les hémoglobines extracellulaires de la famille des Lumbricidae, les hémoglobines extracellulaires de la famille des Arenicolidae et les hémoglobines extracellulaires de la famille des Nereididae. Encore plus préférentiellement, l'hémoglobine extracellulaire d’Annélides est choisie parmi l’hémoglobine extracellulaire de Lumbricus terrestris, l’hémoglobine extracellulaire d ’Arenicola sp et l’hémoglobine extracellulaire de Nereis sp, plus préférentiellement l’hémoglobine extracellulaire d’Arenicola marina ou de Nereis virens. L’arénicole Arenicola marina est un ver annélide polychète vivant essentiellement dans le sable. Selon l’invention, le protomère de globine de l’hémoglobine extracellulaire d’Annélides constitue l’unité fonctionnelle de l’hémoglobine native, comme indiqué ci-dessus.
Enfin, la chaîne de globine de l’hémoglobine extracellulaire d’Annélides peut notamment être choisie parmi les chaînes de globine de type Ax et/ou Bx d’hémoglobine extracellulaire d’Annélides.
L’hémoglobine extracellulaire d’Annélides, ses protomères de globine et/ou ses globines ne nécessitent pas de cofacteur pour fonctionner, contrairement à l'hémoglobine de mammifère, notamment humaine. Enfin, l’hémoglobine extracellulaire d’Annélides, ses protomères de globine et/ou ses globines ne possédant pas de typage sanguin, ils permettent d'éviter tout problème de réaction immunologique ou allergique. L’hémoglobine extracellulaire d’Annélides, ses protomères de globine et/ou ses globines présentent une activité superoxide dismutase (SOD) intrinsèque. Par conséquent, cette activité anti-oxydante intrinsèque ne nécessite aucun antioxydant pour fonctionner, contrairement à l'utilisation d'une hémoglobine de mammifères pour laquelle les molécules antioxydantes sont contenues à l'intérieur du globule rouge et ne sont pas liées à l'hémoglobine.
L’hémoglobine extracellulaire d’Annélides, ses protomères de globine et/ou ses globines peuvent être natifs ou recombinants.
De préférence, l’hémoglobine extracellulaire est celle d ’Arenicola marina.
Le procédé selon l’invention comprend une première étape de mélange de l’échantillon de cellules du patient, de préférence humain, de l’échantillon bactérien ou de l’organoïde avec au moins une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides.
L’échantillon de cellules du patient est tout échantillon biologique dudit patient comprenant des cellules. L’échantillon de cellules peut être un ensemble de cellules isolées, un fragment de tissu biologique, ou bien encore un organe ou un fragment d’organe. Les cellules peuvent être eucaryotes ou procaryotes, de préférence eucaryotes, de préférence de mammifère, de préférence humaines.
Cet échantillon est de préférence un ensemble de cellules isolées (tel que par exemple un échantillon sanguin), un fragment de tissu biologique, ou bien encore un fragment d’organe. Cet échantillon est de préférence un échantillon sanguin, une biopsie, un frottis ou une résection d’organe.
Un échantillon sanguin est de préférence un échantillon comprenant au moins des hématies.
Une biopsie est un prélèvement d’un fragment d’un organe ou d’un tissu, généralement effectué au moyen d’une aiguille ou d’un trocart.
Un frottis est un prélèvement effectué par grattage, généralement au moyen d’un écouvillon, d’une petite brosse ou d’une petite spatule.
Une résection d’organe, appelée également ablation, est un retrait par chirurgie d’une partie d’organe ou d’un tissu, généralement pathologique.
Le patient peut être tout animal vertébré ou invertébré ; de préférence il s’agit d’un mammifère, de préférence d’un humain.
De préférence, l’échantillon de cellules d’un patient, de préférence humain, est un échantillon d’une partie d’organe ou de tissu pathologique, notamment affecté par un cancer. Ainsi, de préférence, l’échantillon de cellules d’un patient est un échantillon d’une partie d’organe ou de tissu tumoral.
L’échantillon bactérien est tout échantillon de bactéries, comprenant une seule souche bactérienne ou un mélange de souches. Les bactéries peuvent être connues ou non. De préférence, il s’agit de bactéries Gram+, de préférence de bactéries de la classe Bacilli, de préférence du genre Streptococcus ou Staphylococcus.
Selon une alternative, le procédé selon l’invention peut également comprendre une première étape de mélange de l’organoïde avec au moins une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides.
Par « organoïde », on entend une structure tridimensionnelle qui reproduit in vitro la micro-anatomie d’un organe. Un organoïde correspond donc à un modèle d’organe ; il est préparé hors de tout organisme vivant. Il est généralement obtenu par culture en laboratoire d’une ou plusieurs cellules précurseurs d’un tissu, telles que des cellules souches (type cellules souches embryonnaires ou pluripotentes induites). Ces cellules peuvent s’auto-organiser en trois dimensions, dans un milieu nutritif adéquat comprenant des facteurs de croissance et de différentiation, pour former le mini-organe. De préférence, les cellules s’auto-organisent dans un environnement tridimensionnel adapté, tel qu’un hydrogel ou une matrice poreuse.
L’organoïde utilisé dans la présente invention peut être n’importe quel organoïde utilisé en test in vitro, par exemple une peau reconstruite, un organoïde cérébral, un organoïde tumoral, un organoïde intestinal ou un organoïde rénal.
Un organoïde est donc distinct des cellules classiques en culture (par exemple en boîtes de Pétri) ; tandis que l’organoïde est forcément en trois dimensions (3D), les cellules en culture ne sont qu’en 2D.
Typiquement, les organoïdes peuvent être utilisés pour tester la toxicité ou l’efficacité de potentiels médicaments, ou bien pour tester l’innocuité de compositions cosmétiques.
Selon l’invention, de préférence, la globine, le protomère de globine ou l’hémoglobine extracellulaire d’Annélides utilisé dans la première étape peut être formulée dans une solution tampon, un milieu de culture cellulaire ou une solution de préservation d’organe ou de greffon.
La solution tampon créée un environnement salin adéquat pour l’hémoglobine, ses protomères et ses globines, et permet ainsi le maintien de la structure quaternaire, et donc de la fonctionnalité de cette molécule. Grâce à la solution tampon, l’hémoglobine, ses protomères et ses globines sont capables d’assurer leur fonction d’oxygénation.
La solution tampon selon l’invention est de préférence une solution aqueuse comprenant des sels, de préférence des ions chlorure, sodium, calcium, magnésium et potassium, et confère à la composition selon l’invention un pH compris entre 5 et 9, de préférence entre 5.5 et 8.5, de préférence entre 6.5 et 7.6 ; sa formulation est similaire à celle d’un liquide physiologiquement injectable. Dans ces conditions, l’hémoglobine extracellulaire d’Annélides, ses protomères de globine et ses globines restent fonctionnels.
Dans la présente description, le pH s’entend à température ambiante (25°C), sauf mention contraire. De préférence, la solution tampon est une solution aqueuse comprenant du chlorure de sodium, du chlorure de calcium, du chlorure de magnésium, du chlorure de potassium, ainsi que du sodium gluconate et du sodium acétate, et a un pH compris entre 6.5 et 7.6, de préférence égal à 7,1 ± 0,5, de préférence d’environ 7.35. Plus préférentiellement, la solution tampon est une solution aqueuse comprenant 90 mM de NaCI, 23 Mm de Na-gluconate, 2,5 mM de CaCh, 27 mM de Na-acétate, 1 ,5 mM de MgCl2, 5 mM de KCI, et a un pH de 7,1 ± 0,5, pouvant contenir entre 0 et 100 mM d’antioxydant de type acide ascorbique et/ou glutathion réduit. De préférence, la globine, le protomère de globine ou l’hémoglobine extracellulaire d’Annélides utilisée dans la première étape peut également être formulée dans une solution de préservation d’organe ou de greffon, ou un milieu de culture cellulaire.
Par exemple, la solution de conservation d’organes peut être une solution aqueuse ayant un pH compris entre 6.5 et 7.5, comprenant des sels, de préférence des ions chlorure, sulfate, sodium, calcium, magnésium et potassium ; des sucres, de préférence le mannitol, le raffinose, le saccharose, le glucose, le fructose, le lactobionate (qui est un imperméant), ou le gluconate ; des antioxydants, de préférence le glutathion ; des agents actifs, de préférence des inhibiteurs de xanthine oxydase tel que l’allopurinol, des lactates, des acides aminés tel que l’histidine, l’acide glutamique (ou glutamate), le tryptophane ; et éventuellement des colloïdes tels que de l'hydroxyéthyl amidon, du polyéthylène glycol ou du dextran.
Les milieux de culture cellulaire sont disponibles commercialement et très variés. Par exemple, des milieux disponibles chez Invitrogen, sans être limités à ceux-ci sont les milieux suivants : D-MEM, D-MEM/F-12, MEM, RPMI 1640, milieu 199 ou tout milieu analogue.
Typiquement, l’hémoglobine, ses protomères ou ses globines est utilisée dans une concentration allant de 0,03 g/L à 40 g/L, de préférence de 0,05 g/L à 35 g/L, de préférence de 0,1 g/L à 30 g/L, de préférence de 0,5 g/L à 25 g/L, de préférence de 1 g/L à 20 g/L. Elle peut être utilisée dans une concentration allant de 1 ,5 g/L à 20 g/L.
De préférence, l’hémoglobine, ses protomères ou ses globines est utilisée dans une concentration allant de 0,03 g/L à 10 g/L, de préférence de 0,08 g/L à 10 g/L, de préférence de 0,1 g/L à 5 g/L.
La température de mise en oeuvre du procédé peut être comprise entre 0°C et 40°C, de préférence entre 2°C et 39°C. De préférence, cette température est d’environ 4°C ; alternativement de préférence, cette température est d’environ 37°C.
De préférence, la première étape du procédé selon l’invention est effectuée dans un récipient comprenant de la gélose. La gélose est une substance nutritive favorisant ou inhibant (selon sa composition) la prolifération et le développement des bactéries. Typiquement, la gélose comprend au moins un mélange de peptones, de l’agar-agar et du chlorure de sodium. De préférence, la gélose comprend de 5 à 35 g/L, de préférence de 7 à 30 g/L de peptones. De préférence, la gélose comprend de 5 à 30 g/L, de préférence de 7 à 25 g/L, de préférence de 10 à 20g/L d’agar-agar. L’agar-agar permet d’obtenir une composition solide (gel solide). De préférence, la gélose comprend de 3 à 20 g/L, de préférence de 4 à 10 g/L de chlorure de sodium.
Selon les indications, la gélose peut comprendre d’autres ingrédients, par exemple des sels, de l’amidon, ou tout autre ingrédient classique.
De préférence, la gélose comprend au moins une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides.
Classiquement, on utilise une gélose au sang, qui comprend environ 10g/L d’hémoglobine de mammifère, par exemple d’hémoglobine de mouton.
Dans la présente invention, de préférence, lorsque la gélose comprend au moins une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides, ladite hémoglobine, ses protomères ou ses globines est utilisée dans une concentration allant de 0,03 g/L à 5 g/L, de préférence de 0,08 g/L à 3 g/L, de préférence de 0,1 g/L à 2 g/L.
De préférence, la première étape comprend le dépôt de l’échantillon de cellules du patient humain, de l’échantillon bactérien ou de l’organoïde dans un récipient comprenant de la gélose et au moins une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides.
Ainsi, selon cette première étape, l’échantillon ou l’organoïde est déposé dans le récipient de gélose comprenant au moins une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides. Le récipient obtenu peut être congelé en attendant de subir des autres étapes du procédé, sans entacher la fiabilité des résultats obtenus.
A la fin de la première étape du procédé, on obtient ainsi un mélange d’hémoglobine, de ses protomères ou de ses globines et d’échantillon de cellules, d’échantillon bactérien ou d’organoïde.
De façon optionnelle, une seconde étape est présente dans le procédé : cette seconde étape comprend la préparation du mélange obtenu à la première étape.
De préférence, cette seconde étape comprend au moins la coloration et/ou l’amincissement et/ou l’inclusion dans la paraffine ou une résine époxy, d’au moins certaines cellules et/ou d’au moins certains organites cellulaires de l’échantillon. Par « organite cellulaire », on entend un compartiment différencié contenu dans les cellules eucaryotes qui a une fonction donnée. De préférence, l’organite cellulaire est choisi parmi le noyau, les lysosomes, les peroxysomes et les mitochondries.
Selon une première alternative, la seconde étape comprend directement au moins la coloration et/ou l’amincissement et/ou l’inclusion dans la paraffine ou une résine époxy, d’au moins certaines cellules de l’échantillon de patient ou bactérien.
Selon une seconde alternative, la seconde étape comprend l’isolation d’au moins certains organites cellulaires de l’échantillon de patient, puis leur coloration et/ou leur amincissement et/ou leur inclusion dans la paraffine ou une résine époxy. Par exemple, la seconde étape peut comprendre l’isolation des mitochondries de l’échantillon de cellules du patient, puis leur coloration.
Les tissus biologiques présentent en eux-mêmes très peu de contraste en imagerie. Typiquement, la coloration est utilisée aussi bien pour augmenter le contraste que pour mettre en valeur une structure particulière.
La coloration peut être réalisée à l’aide d’un colorant classique, notamment un colorant acide ou basique. Un tel colorant peut être choisi parmi le carmin, l’hématoxyline, l’éosine, l’acide picrique, la fuschine acide, la fuschine basique, l’orange G, l’érythrosine, la safranine, la coloration PAS (Periodic Acid Schiff), le bleu de méthylène et la thionine.
Le colorant peut également être la Rhodamine 123. Ce colorant est notamment utilisé pour la coloration des mitochondries.
L’amincissement de l’échantillon peut être effectué par tranchage, notamment à l’aide d’un microtome, pour réaliser des coupes adaptées.
Cet amincissement est notamment effectué après inclusion d’au moins certaines cellules de l’échantillon dans la paraffine ou une résine époxy.
Typiquement, le mélange obtenu à la première étape est mélangé avec de la paraffine à l’état liquide, ou avec une résine époxy, puis le mélange résultant est séché. La paraffine présente l’avantage d’être liquide à une température supérieure à 56 °C et de se solidifier lorsque la température passe en dessous de cette limite. On obtient finalement des blocs de paraffine solide, ou de résine époxy polymérisée, contenant les cellules de l’échantillon. Ces blocs peuvent alors être débités à l’aide d’un microtome, pour obtenir des coupes fines d’échantillon de quelques micromètres d'épaisseur. Ces coupes peuvent subir ensuite une coloration, de façon à identifier certains éléments de façon plus ou moins spécifique, avant d’être placées sur une lame de microscope pour analyse.
De préférence, l’échantillon de cellules du patient obtenu à la première ou la seconde étape est conservé pendant une durée de quelques heures, par exemple au moins 24 heures, de préférence au moins 50 heures, de préférence au moins 100 heures à une température comprise entre 0°C et 10°C, par exemple 4°C ; ou bien à une température comprise entre 15°C et 25°C, telle que la température ambiante.
Lorsqu’on utilise un organoïde, la seconde étape du procédé selon l’invention, optionnelle, comprend la préparation du mélange obtenu à la première étape. Cette préparation peut alors comprendre la mise en contact d’un composé avec le mélange obtenu à la première étape.
Le composé peut être toute molécule potentiellement active, ou bien une composition cosmétique. La molécule peut être chimique ou biologique.
Le procédé vise alors à déterminer les effets éventuels du composé sur l’organoïde.
La seconde étape peut comprendre au moins la coloration d’au moins certaines cellules de l’organoïde.
Enfin, le procédé selon l’invention comprend une troisième étape d’analyse du mélange obtenu à la première ou à la seconde étape.
Notamment, la troisième étape comprend l’analyse par histologie, par microscopie, par détection immunologique ou par biologie moléculaire.
L’histologie est une technique d’analyse biologique comprenant l’identification d’un ensemble de cellules données par des moyens chimiques, enzymatiques, par radiographie ou par immunologie.
De préférence, l’histologie est choisie parmi l’histochimie, l’histochimie enzymatique, l’historadiographie et l’immunohistochimie.
On parle d’histochimie quand au moins certaines cellules ou organites de l’échantillon ou de l’organoïde sont colorées grâce à des réactions chimiques connues entre des réactifs de laboratoire et des composants des cellules étudiées (de type cytoplasme, noyau, ou présence de glucides).
Ainsi, l’analyse par histochimie est effectuée lorsque la seconde étape comprend au moins la coloration de l’échantillon ou de l’organoïde. L’histochimie enzymatique est une méthode histologique qui permet la détermination de l'activité d'une ou plusieurs enzymes dans un tissu donné. La technique histoenzymologique ne révèle pas les enzymes en tant que telles, mais leur présence par le produit obtenu au cours de leur action sur un substrat spécifique de l’enzyme en question.
L’historadiographie consiste à faire des coupes minces du tissu à observer et à leur inclusion dans de la paraffine (i.e. seconde étape d’amincissement et d’inclusion de l’échantillon), puis à les observer en utilisant des radiations.
Enfin, l’immunohistochimie consiste à utiliser des anticorps pour se fixer à une molécule présente dans au moins certaines cellules de l’échantillon ou de l’organoïde. Ces anticorps sont spécifiques de la molécule à identifier et donc de l’analyse à effectuer. Les complexes anticorps-antigènes (présents dans l’échantillon) sont ensuite révélés en utilisant un composé chimique.
De préférence, on utilise des anticorps ciblant des antigènes tumoraux.
La microscopie peut être une microscopie optique ou une microscopie électronique à balayage.
La détection immunologique repose sur le même principe que l’immunohistochimie, et utilise des anticorps pour se fixer à une molécule présente dans au moins certaines cellules de l’échantillon ou de l’organoïde.
De préférence, la détection immunologique comprend l’utilisation d’au moins un anticorps dirigé contre un antigène cancéreux ou un antigène inflammatoire.
L’analyse par biologie moléculaire peut comprendre notamment l’utilisation de PCR, ou encore la détection d’un ratio d’acides nucléiques tel que le ratio ADN/ARN, notamment par spectrophotométrie. Un ratio ADN/ARN élevé indique une quantité d’ARN faible, donc une vie des cellules faible. Le mélange de l’échantillon de cellules du patient ou de l’organoïde avec au moins une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides selon l’invention, permet notamment de protéger les ARN cellulaires, et d’obtenir ainsi des résultats plus fiables et reproductibles. Lorsqu’on utilise un organoïde, la troisième étape du procédé selon l’invention peut comprendre l’analyse par histologie, par détection immunologique ou par biologie moléculaire, notamment comme indiqué ci-avant.
La présente invention a également pour objet un récipient comprenant de la gélose et au moins une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides.
La gélose comprend de préférence au moins un mélange de peptones, de l’agar-agar et du chlorure de sodium. De préférence, la gélose comprend de 5 à 35 g/L, de préférence de 7 à 30 g/L de peptones. De préférence, la gélose comprend de 5 à 30 g/L, de préférence de 7 à 25 g/L, de préférence de 10 à 20g/L d’agar-agar. De préférence, la gélose comprend de 3 à 20 g/L, de préférence de 4 à 10 g/L de chlorure de sodium.
La gélose peut également comprendre d’autres ingrédients, par exemple des sels, de l’amidon, ou tout autre ingrédient classique.
De préférence, l’hémoglobine, ses protomères ou ses globines est utilisée dans une concentration allant de 0,03 g/L à 5 g/L, de préférence de 0,08 g/L à 3 g/L, de préférence de 0,1 g/L à 2 g/L.
Ce récipient peut être utilisé pour tout test in vitro utilisant un échantillon biologique, par exemple un échantillon de patient ou un échantillon bactérien. Il peut être congelé sans impacter la fiabilité des résultats obtenus.
La présente invention est illustrée par les exemples suivants, nullement limitatifs.
Exemple 1 : Etude de préservation de différents organes de rat, par analyse des mitochondries
Le but de l'étude est d'identifier une condition optimale de conservation des organes pour le foie, le cœur et le cerveau de rat.
Les organes ont été conservés à 4°C dans une solution d’HEM02Life® avec modulation de la période de conservation et de la concentration en HEM02Life®. L’efficacité de la conservation a été évaluée par la caractérisation de l’intégrité et de la fonctionnalité mitochondriales.
Le principal challenge de cette étude est d’éviter les préparations extemporanées de mitochondries en optimisant la conservation des échantillons pendant le transport. HEM02Life® est une composition comprenant l’hémoglobine extracellulaire d ’Arenicoia marina, avec différents excipients.
Matériels et Méthodes
Organes
Les organes utilisés sont le foie, le cœur et le cerveau de rats Wistar mâles de 250 g (référence: Wl (Han), Charles River).
Conditions de conservation Durée:
Chaque organe est mélangé avec HEM02Life® (première étape du procédé selon l’invention).
Une période de conservation de 24 heures a été définie comme point de référence. Selon les résultats obtenus à ce temps, des points temporels plus longs ou plus courts ont été évalués avec une modulation de la concentration en HEM02Life®. En cas de bonne conservation à 24 heures (foie), un délai plus long a été testé. En cas de mauvaise conservation à 24 heures (cœur et cerveau), une période plus courte a été testée.
Solution HEM02Life@:
HEM02Life® (solution-mère à 49 g/L) a été diluée dans du tampon de stabilisation à 20 g/L. La solution a été diluée dans du tampon de stabilisation pour obtenir une concentration finale de 15, 10 ou 5 g/L dans 8 mL (volume final).
Récipient:
Les récipients sont des tubes à fond plat de 20 ml (récipient PP, Dominique Dutscher). Le volume de HEM02Life® représente 40% du volume total du tube (8 mL).
Agitation:
Les récipients ont été placés sur un appareil d’agitation (IKA HS 260 basic, VWR) à la vitesse de 90 allers-retours/minute.
Température:
Les échantillons ont été conservés dans une chambre froide à 4°C. Les mitochondries ont été isolées des organes par congélation, broyage, puis centrifugation en gradient de densité (seconde étape du procédé selon l’invention), puis incubées à 37°C pendant 45 minutes. L’intégrité des mitochondries est évaluée par absence de gonflement spontané et par le potentiel transmembranaire, et leur fonctionnalité est évaluée par l’indice de contrôle respiratoire après incubation.
Paramètres
Gonflement et potentiel transmembranaire:
Les mitochondries ont été incubées à 37°C avec de la Rhodamine 123 dans des plaques 96 puits dans 200 pL (volume final) (seconde étape du procédé selon l’invention, étape de coloration).
L’absorbance à 545 nm (gonflement) et la fluorescence de la Rhodamine 123 (perte de DYGTI; AExcitation 485 nm; AEmission 535 nm) ont été enregistrées en temps réel pendant 45 minutes à l'aide d'un spectrofluorimètre (Tecan Infinité 200). Des traitements de CaCI2 (50 pM) et mCICCP (carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone) (50 pM) ont été utilisés comme contrôle positif du gonflement et de la perte de DYGTI, respectivement.
Respiration:
Les mitochondries isolées ont été incubées dans une cellule de 1 ,5 mL sous agitation magnétique avec une électrode à oxygène de type Clark (Hansatech Instruments Ltd, Norfolk, Royaume-Uni), thermostatées à 37°C, dans 500 pL d'un milieu constitué de 0,3M de mannitol, du tampon phosphate 10 mM (pH 7,3), KCI 10 mM, MgCI2 5 mM et 1 mg/ml de BSA (sérum albumine bovine). L’addition d’ADP (1 ,65 mM) provoque une augmentation soudaine de l’absorption d’oxygène lorsque l’ADP est converti en ATP, caractérisée par un état de respiration active. L’inhibiteur Oligomycine A (1 mM), qui bloque la respiration dans les mitochondries couplées et l'agent de découplage mCICCP ont été ajoutés pour rétablir l'activité.
Calculs
Gonflement:
Le gonflement est calculé comme suit (troisième étape du procédé selon l’invention) :
[Math 1]
DOcontrôle négatif T30min\
% de gonflement spontané = 100 — [100 x DOcontrôle négatifTO min r
Potentiel transmembranaire: Le potentiel transmembranaire est calculé comme suit (troisième étape du procédé selon l’invention) :
[Math 2]
RFUcontrôle négatif T30min
% de perte de DYGP = 100 x - 100 RFUcontrôle négatifTO min
Figure imgf000017_0001
Indice de contrôle respiratoire (RCI):
L’indice de contrôle respiratoire est calculé comme suit :
[Math 3]
PenteCICCP
Figure imgf000017_0002
Pente (oligomycine)
Cet indice indique l'étanchéité de la phosphorylation oxydative, se référant ainsi à la fonctionnalité de la chaîne respiratoire et à la qualité de la préparation mitochondriale.
Critères d’acceptation
Une condition de préservation a été validée pour le foie et le cœur si:
Gonflement spontané <20%
Perte de DYGTI spontanée <20%
RCI > 3 (le RCI chez les mitochondries isolées à partir de foie et de cœur frais était de 6,34 et 4,85 respectivement).
Une condition de préservation a été validée pour le cerveau si:
Gonflement spontané <20%
Perte de DYGTI spontanée <20%
RCI > 2 (le RCI des mitochondries isolées à partir de cerveau frais était de 3,23).
Résultats
Les résultats sont résumés ci-dessous.
Le foie est l'organe présentant la plus longue période (30 h) de conservation à 4°C dans HEM02Life®. Au-delà, la membrane mitochondriale commence à se rompre et l’activité respiratoire diminue fortement. Pour le foie frais, l'indice de contrôle respiratoire (RCI) est de 6,34, le gonflement spontané est de 5,40% et la perte de DYGTI spontanée est de 1 ,89%. Après 24 h, la valeur de RCI est restée supérieure à 5, et le gonflement spontané et la perte de DYGP spontanée sont inférieurs à 10%, ce qui suggère que la fonctionnalité des mitochondries est fortement conservée. HEM02Life® à 10 et 15 g/L maintient la fonctionnalité mitochondriale pendant 30 h d’incubation à 4°C. Il est intéressant de noter que la concentration de 10 g/L semble mieux préserver l'activité respiratoire (RCI = 4,55 pour 10 g/L et 3,59 pour 15 g/L), tandis que la concentration de 15 g/L semble mieux conserver l’intégrité de la membrane (gonflement spontané = 17,86 pour 10 g/L et 9,25 pour 15 g/L). En revanche, HEM02Life® à 5 g/L semble trop faible pour assurer l’intégrité mitochondriale après 30 h à 4°C, comme le montre un gonflement spontané élevé (> 20%) révélant une perméabilisation de la membrane mitochondriale. Une plus forte concentration (20 g/L) de HEM02Life® semble être délétère pour la fonction mitochondriale, perturbant l'activité de la chaîne respiratoire.
Quelle que soit la concentration de HEM02Life®, la fonctionnalité mitochondriale n’est pas préservée au-delà d’une incubation de 30 h à 4°C.
La fonctionnalité des mitochondries cardiaques a été préservée avec une incubation de 24 h à 4°C avec 15 g/L de HEM02Life®.
En effet, avec un cœur frais, la valeur de RCI est de 4,85, le gonflement spontané est de 6,94% et la perte de DYGTI spontanée est de 7,81%. Au bout de 16 h d’incubation, 5 g/L d’HEM02Life® ne sont pas suffisants pour préserver l’activité respiratoire (RCI = 2,71). Cependant, les concentrations de 10 g/L (RCI = 3,78) et 15 g/L (RCI = 3,44) permettent le maintien de la fonctionnalité mitochondriale à ce moment précis. À 24 heures d’incubation, seulement 15 g/L de HEM02Life® permettent de préserver la fonctionnalité mitochondriale (RCI> 3). En revanche, HEM02Life® à 10 g/L n'est pas suffisant (RCI = 2,63) et la concentration de 20 g/L semble trop élevée pour assurer une bonne conservation (RCI = 2,83). Au-delà de 24 h, la fonctionnalité mitochondriale et l'intégrité du cœur ne sont pas préservées.
Les mitochondries isolées à partir de cerveau frais sont moins fonctionnelles que les mitochondries du foie et du cœur, comme indiqué par la valeur de RCI (RCI = 3,23), tandis que l'intégrité de ces mitochondries est similaire (gonflement spontané = 5,12% et perte spontanée en DYGTI = 5,39%). La fonctionnalité et l’intégrité mitochondriales du cerveau pourraient être préservées avec 12h à 4°C et 15 g/L de HEM02Life® (RCI > 2, gonflement <12% et perte spontanée en DYGTI <10%), tandis qu'une dose de 10 g/L n’est pas suffisante (RCI = 1 ,79). Au-delà de cette période, la fonctionnalité et l’intégrité mitochondriales ne sont pas conservées. Ensuite, parmi les conditions testées pour le cerveau, HEM02Life® à 15 g/L pendant 12 h est la condition la plus appropriée sans dommage sur la membrane mitochondriale mais un RCI limite.
Pour conclure, le foie est l’organe présentant la plus longue période de conservation dans HEM02Life® (30 h), suivi du cœur (24 h) puis du cerveau (12 h). Pour ces périodes, la concentration requise en HEM02Life® est de 15 g/L pour le cœur et le cerveau, et de 10 g/L pour le foie. La concentration de 10 g/L est protectrice pendant 16 h pour le cœur, alors qu’elle ne préserve pas le cerveau pendant 12 h.
Une augmentation de la concentration d'HEM02Life® jusqu'à 20 g/L n'est pas protectrice, quel que soit l'organe évalué.
Le procédé d’analyse selon l’invention permet de définir les conditions optimales pour le transport des organes notamment de rat, tels que foie, cœur et cerveau, sans aucune altération des mitochondries.
Exemple 2: Etude de la croissance bactérienne sur un substrat de aélose
Protocole:
Autoclavage de la gélose reconstituée en équivalent 1250 L (5x 250mL en flacons schott 500mL)
Refroidissement post autoclavage en étuve à 52°C
Flacon 1 (témoin négatif): ajout de 5mL d'une solution de dilution ("solution de stabilisation", i.e. tampon salin de l'hémoglobine d ’Arenicola marina) dans 250mL, puis coulage de 12 boites;
Flacon 2 (témoin positif): ajout d'hémoglobine de mouton à une concentration de 50mL de sang par litre de gélose, puis coulage de 12 boites;
Flacon 3 (invention): ajout de 5ml_ d'hémoglobine d ’Arenicola marina (M101) diluée dans "solution de stabilisation" (soit 0.5mL à 50g/L dans 4.5mL de "solution de stabilisation"): M101 final à 0.1 g/L, puis coulage de 12 boites;
Flacon 4 (invention): ajout de 5mL de M101 diluée dans "solution de stabilisation" (soit 2.5mL à 50g/L dans 2.5mL de "solution de stabilisation"): M101 final à 0.5g/L, puis coulage de 12 boites; et
Flacon 5 (invention): ajout de 5mL de M101 à 50g/L (non diluée pour avoir 1 g/L) : M101 final à 1 g/L, puis coulage de 12 boites. Sur les 12 boites, 10 sont inoculées au râteau par ajout d'un inoculum de S.aureus dilué si nécessaire et homogénéisé, contenu dans 500mI_ de "solution de stabilisation" (première étape du procédé de l'invention).
La concentration d'inoculum visée est de 50 cfu/boite, soit 100 cfu/mL. 2 boites servent de témoin négatif.
On incube à 35°C-37°C.
Puis on lit le nombre de colonies par boite sur les 10 boites à 24h, 48h, 72h et 96h (troisième étape du procédé de l'invention).
On vérifie les témoins de chaque condition aux mêmes temps, qui doivent être négatifs.
Résultats:
Aucune différence de temps de croissance n'a été observée à 12h, 24h et 48h.
Conclusion :
L'utilisation d'hémoglobine d ’Arenicola marina à des concentrations de 0.1 , 0.5 et 1 g/L permet de faire pousser des Staphylococcus aureus comme sur une gélose type Columbia à base de sang frais. Cette hémoglobine d ’Arenicola marina peut être utilisée à des concentrations bien inférieures à celle du sang. Par ailleurs, elle peut être congelée, ce qui n'est pas possible pour le sang.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d’analyse d’un échantillon de cellules d’un patient humain, d’un échantillon bactérien ou d’un organoïde, comprenant : une première étape de mélange de l’échantillon de cellules du patient humain, de l’échantillon bactérien ou de l’organoïde avec au moins une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides, optionnellement, une seconde étape de préparation du mélange obtenu à la première étape, et une troisième étape d’analyse du mélange obtenu à la première ou à la seconde étape.
2. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l'hémoglobine extracellulaire d’Annélides est choisie parmi les hémoglobines extracellulaires d’Annélides Polychètes, de préférence parmi les hémoglobines extracellulaires de la famille des Arenicolidae et les hémoglobines extracellulaires de la famille des Nereididae.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'hémoglobine extracellulaire d’Annélides est choisie parmi l’hémoglobine extracellulaire d’Arenicola marina et l’hémoglobine extracellulaire de Nereis, plus préférentiellement l’hémoglobine extracellulaire d’Arenicola marina.
4. Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel l’échantillon de cellules du patient humain est un échantillon sanguin, une biopsie, un frottis ou une résection d’organe.
5. Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel la première étape est effectuée dans un récipient comprenant de la gélose.
6. Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel la première étape comprend le dépôt de l’échantillon de cellules du patient humain, de l’échantillon bactérien ou de l’organoïde dans un récipient comprenant de la gélose et au moins une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides.
7. Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel la troisième étape comprend l’analyse par histologie, par microscopie, par détection immunologique ou par biologie moléculaire.
8. Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel la seconde étape comprend au moins la coloration et/ou l’amincissement et/ou l’inclusion dans la paraffine ou une résine époxy, d’au moins certaines cellules et/ou d’au moins certains organites cellulaires de l’échantillon de patient ou bactérien, ou bien la coloration d’au moins certaines cellules de l’organoïde.
9. Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel la seconde étape comprend : soit directement au moins la coloration et/ou l’amincissement et/ou l’inclusion dans la paraffine ou une résine époxy, d’au moins certaines cellules de l’échantillon de patient ou bactérien ; soit l’isolation d’au moins certains organites cellulaires de l’échantillon de patient, puis leur coloration et/ou leur amincissement et/ou leur inclusion dans la paraffine ou une résine époxy ; soit, dans le cas d’un organoïde, la mise en contact d’un composé avec le mélange obtenu à la première étape.
10. Procédé selon l’une des revendications 7 à 9, dans lequel l’histologie est choisie parmi l’histochimie, l’histochimie enzymatique, l’historadiographie et l’immunohistochimie.
11. Procédé selon l’une des revendications 7 à 9, dans lequel la détection immunologique comprend l’utilisation d’au moins un anticorps dirigé contre un antigène cancéreux ou un antigène inflammatoire.
12. Utilisation d’une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides, pour la conservation d’au moins un échantillon de cellules d’un patient humain, d’un échantillon bactérien ou d’un organoïde.
13. Récipient comprenant de la gélose et au moins une molécule choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides, de préférence ladite molécule est présente dans une concentration allant de 0,03 g/L à 5 g/L, de préférence de 0,1 g/L à 2 g/L.
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