CN101983562B - 一种非程序细胞冻存液 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种非程序细胞冻存液，含有细胞膜保护剂1.0～28w/v％、渗透性细胞膜内保护剂1.0～18w/v％、细胞沉降稳定剂3.0～28％，余量为溶剂。本发明的细胞冻存液，对细胞保护效果好，添加冻存液后，可直接将细胞放入-80℃冰箱冻存，无需复杂的程序冻存，大大缩短的细胞冻存时间，提高了冻存效率，极为适用于大量细胞的冻存。冻存后的细胞复苏率高，复苏后细胞的生长和分化正常；细胞冻存液成分稳定，保质期长；使用前无需另行配制或稀释，批次间稳定性好。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞冻存液，特别涉及一种非程序细胞冻存液。
背景技术
细胞，特别是干细胞等高价值的细胞，具有潜在的医用价值等其他价值，细胞保存技术是实现这些价值的基础。
常用的细胞保存方法有培养保存和冻存。培养保存，耗时耗力，程序繁琐，在培养的过程中，特别是长期继代培养时，细胞容易发生变异，细胞特性丧失，失去保存价值。因此，培养保存一般应用于易于培养，不易发生变异的细胞中，如部分瘤细胞。
细胞冻存即将细胞置于低温环境下保存，以使细胞暂时脱离生长状态，保存其细胞特性。这样保存的成本较低，可以在需要时将细胞复苏培养。与些同时，也避免了培养保存中因细胞污染而导致的细胞品种损失。
现有的细胞冻存液，主要由DMSO、血清以及细胞培养液组成，细胞培养液一般作为溶剂。这种冻存液一般为即用型冻存液，需要现配现用，批次差异大，保持期短，保存效果不稳定。
此外，现有冻存液的冻存程序复杂，需要使用昂贵的专用冻存仪器进行程序性降温，整个冻存过程耗时长达3～4小时，以保证冻存细胞的复苏率。这种冻存操作复杂、处理量小，冻存成本较高，不能满足大规模细胞快速冻存的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的细胞冻存液。
本发明所采取的技术方案是：
一种非程序细胞冻存液，含有细胞膜保护剂1.0～28w/v％、渗透性细胞膜内保护剂1.0～18w/v％、细胞沉降稳定剂3.0～28％，余量为溶剂。
优选的，冻存液中还添加有0.1～0.7w/v％的抗氧化剂。
优选的，冻存液中还添加有0.2～1.0w/v％的细胞营养剂。
本发明的细胞冻存液，对细胞保护效果好，添加冻存液后，可直接将细胞放入-80℃冰箱冻存，无需复杂的程序冻存，大大缩短的细胞冻存时间，提高了冻存效率，极为适用于大量细胞的冻存。冻存后的细胞复苏率高，复苏后细胞的生长和分化正常。
本发明的细胞冻存液，成分稳定，保质期长。
本发明的细胞冻存液，无需另行配制或稀释，批次间稳定性好。
附图说明
图1是SD大鼠间充质干细胞MSCs复苏后的生长曲线图；
图2是未诱导的SD大鼠MSCs细胞图；
图3是本发明细胞冻存液冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成骨诱导28d的细胞图；
图4是常规细胞冻存液程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成骨诱导28d的细胞图；
图5是常规细胞冻存液非程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成骨诱导28d的细胞图；
图6是本发明细胞冻存液冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成脂诱导20d的细胞图；
图7是常规细胞冻存液程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成脂诱导20d的细胞图；
图8是常规细胞冻存液非程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成脂诱导20d的细胞图。
具体实施方式
本发明中使用的细胞膜保护剂、渗透性细胞膜内保护剂、细胞沉降稳定剂，既可以单独使用，也有可以根据需要混合使用。
本发明细胞冻存液中使用的溶剂，可为各种适用于细胞培养的溶剂，一般为血清，特别是新生牛血清。
本发明细胞冻存液中使用的渗透性细胞膜内保护剂，包括二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇、丙三醇等。
本发明细胞冻存液中使用的细胞沉降稳定剂，包括甲基纤维素、羟乙基淀粉、糊精、可溶性淀粉，用以防止或延缓细胞在冻存过程中的沉降，防止细胞互相挤压，影响细胞冻存效果。
本发明细胞冻存液中使用的抗氧化剂，为常规的抗氧化剂，包括维生素C、谷胱甘肽等，抗氧化剂既可以单独使用，也可以混用。本领域的技术人员可以根据需要选择其他的抗氧化剂。
本发明细胞冻存液中使用的细胞营养剂，为常规的细胞营养剂，包括谷氨酰胺、丙酮酸钠等，用以补充细胞代谢时消耗的部分能量。细胞营养剂既可以单独使用，也可以混用。本领域的技术人员可以根据需要选择其他的细胞营养剂。
一种非程序细胞冻存液，含有细胞膜保护剂1.0～28w/v％、渗透性细胞膜内保护剂1.0～18w/v％、细胞沉降稳定剂3.0～28％，余量为溶剂。
优选的，冻存液中还添加有0.1～0.7w/v％的抗氧化剂。
优选的，冻存液中还添加有0.2～1.0w/v％的细胞营养剂。
细胞膜保护剂包括非还原性双糖、多糖、糖酐。其中，非还原性双糖包括海藻糖、蔗糖；多糖包括棉子糖、木糖、潘糖；糖酐包括低分子糖酐-40、中分子糖酐-70、高分子糖酐-500。
细胞沉降稳定剂包括甲基纤维素、羟乙基淀粉、糊精、可溶性淀粉
渗透性细胞膜内保护剂包括DMSO、丙二醇、丙三醇
抗氧化剂包括维生素C、谷胱甘肽。
下面结合实施例，进一步说明本发明。
以下实施例中，如无特别说明，百分比均指w/v％。
实施例1
细胞冻存液的组成如下：
细胞膜保护剂1％，由0.4％的棉子糖、0.6％的中分子糖酐-70组成，
渗透性细胞膜内保护剂5％，由DMSO组成，
细胞沉降稳定剂15％，由甲基纤维素500CP组成，
抗氧化剂0.2％，由0.03％的维生素C、0.17％的谷胱甘肽组成，
细胞营养剂0.3％，由0.2％的谷氨酰胺、0.1％的丙酮酸钠组成，
新生牛血清，余量。
实施例2
细胞冻存液的组成如下：
细胞膜保护剂7％，由海藻糖组成，
渗透性细胞膜内保护剂9％，由6％的丙二醇、3％的丙三醇组成，
细胞沉降稳定剂28％，由20％的甲基纤维素400CP、8％的糊精组成，
抗氧化剂0.4％，由维生素C组成，
细胞营养剂1.0％，由0.7％的谷氨酰胺、0.3％的丙酮酸钠组成，
新生牛血清，余量。
实施例3
细胞冻存液的组成如下：
细胞膜保护剂28％，由10％的蔗糖、14％的潘糖、4％的低分子糖酐-40组成，
渗透性细胞膜内保护剂1％，由丙二醇组成，
细胞沉降稳定剂9％，由羟乙基淀粉组成，
抗氧化剂0.1％，由谷胱甘肽组成，
细胞营养剂0.2％，由丙酮酸钠组成，
新生牛血清，余量。
实施例4
细胞冻存液的组成如下：
细胞膜保护剂21％，由17％的木糖、4％的高分子糖酐-500组成，
渗透性细胞膜内保护剂12％，由丙二醇、丙三醇各半组成，
细胞沉降稳定剂14％，由5％的甲基纤维素1500CP、9％的可溶性淀粉组成，
抗氧化剂0.7％，由0.2％的维生素C、0.5％的谷胱甘肽组成，
细胞营养剂0.8％，由谷氨酰胺、丙酮酸钠各半组成，
新生牛血清，余量。
实施例5
细胞冻存液的组成如下：
细胞膜保护剂11％，由7％的海藻糖、4％的棉子糖组成，
渗透性细胞膜内保护剂18％，由2％的DMSO、16％的丙二醇组成，
细胞沉降稳定剂14％，由8％的羟乙基淀粉、6％的糊精组成，
抗氧化剂0.7％，由维生素C组成，
细胞营养剂0.5％，由0.4％的谷氨酰胺、0.1％的丙酮酸钠组成，
新生牛血清，余量。
实施例6
细胞冻存液的组成如下：
细胞膜保护剂17％，由5％的棉子糖、12％的木糖组成，
渗透性细胞膜内保护剂15％，由DMSO、丙二醇、丙三醇各5％组成，
细胞沉降稳定剂18％，由12％的甲基纤维素、6％的可溶性淀粉组成，
抗氧化剂0.5％，由维生素C组成，
细胞营养剂0.7％，由丙酮酸钠组成，
新生牛血清，余量。
实施例7
细胞冻存液的组成如下：
细胞膜保护剂23％，由7％海藻糖、12％的低分子糖酐-40、5％的木糖组成，
渗透性细胞膜内保护剂11％，由DMSO组成，
细胞沉降稳定剂3％，由甲基纤维素4000CP组成，
抗氧化剂0.5％，由谷胱甘肽组成，
细胞营养剂0.5％，由0.1％谷氨酰胺、0.4％丙酮酸钠组成，
新生牛血清，余量。
使用不同配比细胞膜保护剂的细胞冻存液，非程序性冻存SD大鼠间充质干细胞MSCs，检测其复苏率，结果如表1所示。
表1、细胞膜保护剂配比-细胞复苏率比较表
表中，细胞膜保护剂为单独使用，从表中的数据可知，不同的用量对细胞的复苏率有一定的影响。细胞膜保护剂的用量在3.0～23％之间时，细胞复苏率在90％以上，综合其他实验数据及冻存液的通用性考虑，细胞膜保护剂的用量优选为1.0～28％。
使用不同配比渗透性细胞膜内保护剂的细胞冻存液，非程序性冻存SD大鼠间充质干细胞MSCs，检测其复苏率，结果如表2所示。
表2、渗透性细胞膜内保护剂配比-细胞复苏率比较表
从表中数据可知，渗透性细胞膜内保护剂的用量在1～16％之间，细胞复苏率都较为理想，综合考虑，渗透性细胞膜内保护剂的用量优选为1～18％。
使用不同配比细胞沉降稳定剂的细胞冻存液，非程序性冻存SD大鼠间充质干细胞MSCs，检测其复苏率，结果如表3所示。
表3、细胞沉降稳定剂配比-细胞复苏率比较表
表中，甲基纤维素4000CP、羟乙基淀粉为单独使用。
从表中数据可知，细胞沉降稳定剂的用量在3.0～23％之间时，细胞的复苏率都较为理想。综合考虑，细胞沉降稳定剂的用量优选为3.0～28％。
实验数据
复苏率比较
使用本发明的细胞冻存液常规冻存液按程序/非程序冻存间质干细胞(MSCs)、皮层神经元细胞(CNCs)及胚胎干细胞(ESCs)，之后测试其细胞复苏率，结果如表4所示。
表4、不同冻存液/冻存方法-细胞复苏率比较表
从表中数据可知，使用常规冻存液程序冻存细胞，其冻存效果明显好于非程序冻存，而采用本发明的细胞冻存液非程序冻存，细胞复苏率明显高于常规冻存液程序冻存，可见，本发明的细胞冻存液，优势明显。
细胞增殖力比较
分别使用本发明细胞冻存液非程序冻存、常规冻存液程序冻存和常规冻存液非程序冻存SD大鼠间充质干细胞MSCs，复苏后均接种1×105个细胞培养，培养7天，每天计算细胞数量，绘制其生长曲线，其生长曲线如图1所示。从图中可知，常规冻存液非程序冻存的细胞增殖速度差，常规冻存液程序冻存的细胞增殖速度较快，本发明细胞冻存液非程序冻存的细胞增殖速度最快，本发明细胞冻存液的效果最好。
不同细胞冻存液对细胞分化能力的影响
分别使用本发明细胞冻存液非程序冻存、常规冻存液程序冻存和常规冻存液非程序冻存SD大鼠间充质干细胞MSCs，复苏后传一代使用诱导液进行成骨诱导及成脂肪细胞诱导，诱导后对细胞进行染色观察。成骨诱导28d后的细胞使用茜素红染色；成脂诱导20d后的细胞使用油红O染色，细胞诱导结果如图3～8所示。图2是未诱导的SD大鼠MSCs细胞图；图3是本发明细胞冻存液非程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成骨诱导28d的细胞图；图4是常规细胞冻存液程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成骨诱导28d的细胞图；图5是常规细胞冻存液非程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成骨诱导28d的细胞图。
图6是本发明细胞冻存液非程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成脂诱导20d的细胞图；图7是常规细胞冻存液程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成脂诱导20d的细胞图；图8是常规细胞冻存液非程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成脂诱导20d的细胞图。
从图中可以看出，本发明的细胞冻存液对细胞的分化能力没有影响，效果明显好于常规细胞冻存液程序冻存。
Claims (4)
1.一种非程序细胞冻存液，含有细胞膜保护剂1.0～28 w/v%、渗透性细胞膜内保护剂1.0～18 w/v%、细胞沉降稳定剂3.0～28 w/v %，余量为溶剂；其中细胞膜保护剂选自非还原性双糖、多糖、糖酐，非还原性双糖选自海藻糖、蔗糖，多糖选自棉子糖、木糖、潘糖，糖酐选自低分子糖酐-40、中分子糖酐-70、高分子糖酐-500；细胞沉降稳定剂选自甲基纤维素、羟乙基淀粉、糊精、可溶性淀粉；渗透性细胞膜内保护剂选自二甲基亚砜（DMSO）、丙二醇、丙三醇。
2.根据权利要求1所述的一种非程序细胞冻存液，其特征在于：所述冻存液中还添加有0.1～0.7 w/v%的抗氧化剂。
3.根据权利要求1所述的一种非程序细胞冻存液，其特征在于：所述冻存液中还添加有细胞营养剂0.2～1.0 w/v%。
4.根据权利要求2所述的一种非程序细胞冻存液，其特征在于：抗氧化剂选自维生素C、谷胱甘肽。
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