CN102578077B - 一种无血清低温保护剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种无血清低温保护剂，包含细胞内渗透保护剂和细胞外保护剂，所述细胞外保护剂由NaCL、KCL、Na2HPO4.12H2O、KH2PO4、PEG(400-2000)、D-海藻糖和胶原IV组成，所述细胞内渗透保护剂为DMSO。本发明还公开了一种制备无血清低温保护剂的方法。本发明不含有任何来源的血清成分，在低温储存细胞时不会有血清成分残留，本发明成分明确、简单，易于配制，可用于间充质干细胞的低温储存。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种无血清低温保护剂。
背景技术
目前体外制备的动物细胞低温储存保护剂主要采用含血清的DMSO溶液，但经过这种低温保护剂储存的细胞制剂血清残留很难清除，而且血清成分复杂，限制了细胞制剂的用途。
间充质干细胞与其它成体二倍体细胞不同，是一种具有自我更新和多向分化能力的细胞，具有广泛的医疗用途，其低温储存对配方有更高的要求，为了满足临床需要，低温保护剂最好不含有血清成分。
无血清低温保护剂是间充质干细胞低温保护剂的发展方向，现有技术已经公开采用了PEG或海藻糖作为低温保护剂，也披露了IV型胶原蛋白在人胚胎干细胞低温储存中的作用。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种无血清低温保护剂，在于解决现有技术中含血清的低温保护剂血清成份复杂、血清残留难清除的问题及无血清低温储存试剂成分不明确的问题。
为达到上述目的，本发明采取了如下技术方案：
一种无血清低温保护剂，包括细胞内渗透保护剂和细胞外保护剂，其特征在于：所述细胞外保护剂由NaCl、KCl、Na2HPO4.12H2O、KH2PO4、PEG(400～2000)、D-海藻糖和胶原IV(IV型胶原蛋白)组成，所述细胞内渗透保护剂为DMSO(二甲基亚砜)，所述PEG(400～2000)是聚乙二醇的分子量在400～2000之间。
进一步的技术方案是，每100mL无血清低温保护剂中，所述细胞外保护剂组成成份的重量为：NaCl为800mg、KCL为20mg、Na2HPO4.12H2O为290mg、KH2PO4为24mg、PEG(400～2000)为5～15g、D-海藻糖为3.423g～6.846g、胶原IV为100ug～1000ug，所述细胞内渗透保护剂DMSO为5mL～15mL。
一种制备无血清低温保护剂的方法，
步骤一：将NaCl、KCl、Na2HPO4.12H2O、KH2PO4、PEG(400～2000)和D-海藻糖全溶于注射用水中，溶液40℃保温；
步骤二：步骤一所述溶液降温至20℃后，加入胶原IV，溶液20℃保温；
步骤三：在无菌环境中将步骤二所述加入胶原IV后的20℃保温溶液过滤除菌；
步骤四：将无菌DMSO溶入到步骤三经过滤除菌的溶液中，得到无血清低温保护剂。
进一步的技术方案是，每100mL的无血清低温保护剂中，所述步骤一的NaCl为800mg、KCl为20mg、Na2HPO4.12H2O为290mg、KH2PO4为24mg、PEG(400～2000)为5～15g、D-海藻糖为3.423g～6.846g，所述的注射用水为60mL。
进一步的技术方案是，每100mL的无血清低温保护剂中，所述步骤二胶原IV为100ug～1000ug，加入胶原IV100ug～1000ug后的溶液定容至85mL～95mL。
进一步的技术方案是，所述步骤三的过滤除菌，使用孔径为0.22um的无菌亲水滤膜。
进一步的技术方案是，每100mL的无血清低温保护剂中，所述步骤四的无菌DMSO为5mL～15mL。
更进一步的技术方案是，所述的一种无血清低温保护剂，用于冻存间充质干细胞，所述间充质干细胞包括人和动物的骨髓、肌肉、皮肤、肝脏、肾脏、心脏、骨骼、脑、肺脏、消化道、胎盘、羊膜、羊水、脐带、脐带血、外周血。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明不含有任何来源的血清成分，在低温储存细胞时不会有血清成分残留。
(2)本发明成分明确、简单，易于配制。
(3)本发明可用于间充质干细胞的低温储存。
附图说明
图1为实施例2的不同低温保护剂低温冻存人骨髓间充质干细胞后F-CFU和存活率的检测结果示意图。
具体实施方式
实施例一
一种无血清低温保护剂，包括细胞内渗透保护剂和细胞外保护剂，每100mL的无血清低温保护剂中，所述细胞外保护剂的组成成份重量：NaCl为800mg、KCL为20mg、Na2HPO4.12H2O为290mg、KH2PO4为24mg、PEG(400)为5g、D-海藻糖为3.423g、胶原IV为1000ug，所述细胞内渗透保护剂为DMSO为5mL。
一种制备无血清低温保护剂的方法，
步骤一：将NaCl 800mg、KCL 20mg、Na2HPO4.12H2O 290mg、KH2PO424mg、PEG(400)5g、D-海藻糖3.423g溶于60mL注射用水中，搅拌，直至全溶，溶液40℃保温；
步骤二：将步骤一所述溶液降温至20℃，加入胶原IV1000ug，搅拌，直至全溶，定容至95mL，溶液20℃保温；
步骤三：在无菌环境中将步骤二所述加入胶原IV后的20℃保温溶液经0.22um无菌亲水滤膜过滤除菌；
步骤四：在使用前，将5mL无菌DMSO加入到步骤三经过滤除菌的溶液中，混匀，得到100mL的无血清低温保护剂。
实施例二
一种无血清低温保护剂，包括细胞内渗透保护剂和细胞外保护剂，每100mL的无血清低温保护剂中，所述细胞外保护剂的组成成份重量：NaCl为800mg、KCL为20mg、Na2HPO4.12H2O为290mg、KH2PO4为24mg、PEG(2000)为15g、D-海藻糖为6.846g、胶原IV为100ug，所述细胞内渗透保护剂为DMSO为15mL。
一种制备无血清低温保护剂的方法，
步骤一：将NaCl 800mg、KCL 20mg、Na2HPO4.12H2O 290mg、KH2PO424mg、PEG(2000)15g、D-海藻糖6.846g溶于60mL注射用水中，搅拌，直至全溶，溶液40℃保温；
步骤二：将步骤一所述溶液降温至20℃，加入胶原IV1000ug，搅拌，直至全溶，定容至85mL，溶液20℃保温；
步骤三：在无菌环境中将步骤二所述加入胶原IV后的20℃保温溶液经0.22um无菌亲水滤膜过滤除菌；
步骤四：在使用前，将15mL无菌DMSO加入到步骤三经过滤除菌的溶液中，混匀，得到100mL的无血清低温保护剂。
更进一步的技术方案是，所述的一种无血清低温保护剂，冻存人骨髓间充质干细胞。
人骨髓间充质干细胞的低温冻存：将1mL的1X107个/mL人骨髓间充质干细胞，与1mL上述无血清低温保护剂混匀，转移到冻存管中，再将所述冻存管以程控降温仪降温，1℃/分钟，直至-90℃，转移到液氮中冻存。
取低温冻存前的人骨髓间充质干细胞，血清组、PEG组、D-海藻糖组和PEG+D-海藻糖组的低温冻存剂分别冻存后的人骨髓间充质干细胞，各10组，共50组，每组100个细胞，进行人骨髓间充质干细胞存活率和F-CFU(克隆形成单位)检测，检测结果见表1和表2。
上述PEG+D-海藻糖组是通过本实施例的无血清低温保护剂配方和制备方法制成，上述血清组、PEG组、D-海藻糖组的低温冻存剂配方仅是分别用血清、PEG、D-海藻糖等量替换了上述PEG+D海藻糖组配方中的PEG和D-海藻糖，其它成份和用量相同，制备方法与上述PEG+D-海藻糖组的制备方法相同。
表1不同低温保护剂低温冻存人骨髓间充质干细胞后F-CFU的检测
表2不同低温保护剂低温冻存人骨髓间充质干细胞后存活率的检测
由表1和表2可知，人骨髓间充质干细胞以不同低温保护剂重悬后，以程控降温仪降温法低温储存72小时后复苏，检测存活率和F-CFU。结果显示：低温冻存后，PEG+D-海藻糖组、血清组和冻存前的100个人骨髓间充质干细胞的F-CFU之间不存在显著性差异，说明这两种低温保护剂均能有效保持人骨髓间充质干细胞低温储存后的自我更新能力；低温冻存后人骨髓间充质干细胞的存活率都有显著下降，但血清组和PEG+D-海藻糖组的存活率远高于其它组，并且这两个实验组的存活率之间没有显著性差异，说明PEG+D-海藻糖组的配方对人骨髓间充质干细胞低温冻存的保护作用与血清组配方相同。
实施例三
一种无血清低温保护剂，包括细胞内渗透保护剂和细胞外保护剂，每100mL的无血清低温保护剂中，所述细胞外保护剂的组成成份重量：NaCl为800mg、KCL为20mg、Na2HPO4.12H2O为290mg、KH2PO4为24mg、PEG(2000)为12g、D-海藻糖为5.256g、胶原IV为700ug，所述细胞内渗透保护剂为DMSO为15mL。
一种制备无血清低温保护剂的方法，
步骤一：将NaCl 800mg、KCL 20mg、Na2HPO4.12H2O 290mg、KH2PO424mg、PEG(2000)12g、D-海藻糖5.256g溶于60mL注射用水中，搅拌，直至全溶，溶液40℃保温；
步骤二：将步骤一所述溶液降温至20℃，加入胶原IV700ug，搅拌，直至全溶，定容至85mL，溶液20℃保温；
步骤三：在无菌环境中将步骤二所述加入胶原IV后的20℃保温溶液经0.22um无菌亲水滤膜过滤除菌，所述过滤除菌后的溶液在4℃保存三个月；
步骤四：在使用前，将15mL无菌DMSO加入到步骤三经过滤除菌的溶液中，混匀，得到100mL的无血清低温保护剂。
实施例四
一种无血清低温保护剂，包括细胞内渗透保护剂和细胞外保护剂，每100mL的无血清低温保护剂中，所述细胞外保护剂的组成成份重量：NaCl为800mg、KCL为20mg、Na2HPO4.12H2O为290mg、KH2PO4为24mg、PEG(2000)为12g、D-海藻糖为5.256g、胶原IV为700ug，所述细胞内渗透保护剂为DMSO为15mL。
一种制备无血清低温保护剂的方法，
步骤一：将NaCl 800mg、KCL 20mg、Na2HPO4.12H2O 290mg、KH2PO424mg、PEG(2000)12g、D-海藻糖5.256g溶于60mL注射用水中，搅拌，直至全溶，溶液40℃保温；
步骤二：将步骤一所述溶液降温至20℃，加入胶原IV700ug，搅拌，直至全溶，定容至85mL，溶液20℃保温；
步骤三：在无菌环境中将步骤二所述加入胶原IV后的20℃保温溶液经0.22um无菌亲水滤膜过滤除菌，所述过滤除菌后的溶液在在-70℃以下低温保存两年；
步骤四：在使用前，将15mL无菌DMSO加入到步骤三经过滤除菌的溶液中，混匀，得到100mL的无血清低温保护剂。
Claims (7)
1.一种无血清低温保护剂，包括细胞内渗透保护剂和细胞外保护剂，其特征在于：每100mL无血清低温保护剂中，所述细胞外保护剂组成成份的重量为：NaCl为800mg、KCL为20mg、Na2HPO4.12H2O为290mg、KH2PO4为24mg、PEG为5～15g、D-海藻糖为3.423g～6.846g、胶原IV为100ug～1000ug，所述细胞内渗透保护剂DMSO为5mL～15mL。
2.根据权利要求1所述的一种无血清低温保护剂，其特征在于：所述的PEG的分子量在400～2000之间。
3.一种制备权利要求1或2所述的无血清低温保护剂的方法，其特征在于：
步骤一：将NaCl、KCl、Na2HPO4.12H2O、KH2PO4、PEG和D-海藻糖全溶于注射用水中，溶液40℃保温；
步骤二：步骤一所述溶液降温至20℃后，加入胶原IV，溶液20℃保温；
步骤三：在无菌环境中将步骤二所述加入胶原IV后的20℃保温溶液过滤除菌；
步骤四：将无菌DMSO溶入到步骤三经过滤除菌的溶液中，得到无血清低温保护剂。
4.根据权利要求3所述一种制备无血清低温保护剂的方法，其特征在于：每100mL的无血清低温保护剂中，所述步骤一的NaCl为800mg、KCl为20mg、Na2HPO4.12H2O为290mg、KH2PO4为24mg、PEG为5～15g、D-海藻糖为3.423g～6.846g，所述的注射用水为60mL。
5.根据权利要求3所述一种制备无血清低温保护剂的方法，其特征在于：每100mL的无血清低温保护剂中，所述步骤二胶原IV为100ug～1000ug，加入胶原IV100ug～1000ug后的溶液定容至85mL～95mL。
6.根据权利要求3所述一种制备无血清低温保护剂的方法，其特征在于：所述步骤三的过滤除菌，使用孔径为0.22um的无菌亲水滤膜。
7.根据权利要求3所述一种制备无血清低温保护剂的方法，其特征在于：每100mL的无血清低温保护剂中，所述步骤四的无菌DMSO为5mL～15mL。
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