CN106701886A - 一种三阴性乳腺癌细胞上皮间质转换过程中对内皮细胞分泌功能影响的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种三阴性乳腺癌细胞上皮间质转换过程中对内皮细胞分泌功能影响的检测方法，选取三阴性乳腺癌细胞株MDA‑MB‑231及人脐静脉内皮细胞HUVEC，设置实验组：MDA‑MB‑231和HUVEC共培养组、对照组：MDA‑MB‑231单独培养组；将实验组和对照组均应用10ng/ml TGF‑β刺激36小时后，应用TMT定量蛋白质组表达谱分析两组中细胞上清中分泌蛋白的差异表达，比较SERPINE(PAI‑1)因子在共培养组和单独培养组的分泌结果。三阴性乳腺癌细胞上皮间质转换的过程中三阴性乳腺癌细胞株能够促进内皮细胞分泌趋化因子CCL5，从而促进三阴性乳腺癌细胞的转移。

Description

一种三阴性乳腺癌细胞上皮间质转换过程中对内皮细胞分泌 功能影响的检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物领域，具体涉及一种三阴性乳腺癌细胞上皮间质转换过程中对内皮细胞分泌功能影响的检测方法。

背景技术

三阴性乳腺癌(TNBC)患者预后差，肿瘤侵袭性强，易发生局部复发及远处转移。上皮间质转换(EMT)是指上皮细胞在形态上发生向间质细胞表型的转变并获得迁移的能力。既往对三阴性乳腺癌细胞在上皮间质转换过程中与内皮细胞之间的关系并无相关研究。故而，本发明涉及了三阴性乳腺癌细胞在上皮间质转换过程中对内皮细胞分泌功能的影响的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种三阴性乳腺癌细胞上皮间质转换过程中对内皮细胞分泌功能影响的检测方法。

为达到上述目的，本发明提供的技术方案是：

一种三阴性乳腺癌细胞上皮间质转换过程中对内皮细胞分泌功能影响的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

选取三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231及人脐静脉内皮细胞HUVEC，设置实验组：MDA-MB-231和HUVEC共培养组、对照组：MDA-MB-231单独培养组；

将实验组和对照组均应用10ng/ml TGF-β刺激36小时后，应用TMT定量蛋白质组表达谱分析两组中细胞上清中分泌蛋白的差异表达，比较SERPINE1(PAI-1)因子在共培养组和单独培养组的分泌结果。

在细胞培养皿中分别单独培养三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231的单独培养组，以及三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231及人脐静脉内皮细胞HUVEC的共培养组，所述的共培养组采用小室上下室共培养。

上室接种HUVEC细胞，下室接种MDA-MB-231细胞。

在单独培养组和共培养组的细胞培养皿添加10ng/ml TGF-β刺激36小时后，收集两组细胞上清，加入缓冲液，漩涡震荡60min，-20度保存。

对单独培养组和共培养组两组细胞上清进行TMT定量蛋白质组表达谱分析，具体步骤为：样品处理；强阳离子交换色谱分离样品；C18反相色谱除盐，进行肽段的纯化；质谱检测。

所述的样品处理包括：

(a)上清加入DTT至终浓度10mM；56度水浴1h；取出后，迅速加入IAM至终浓度55mM，暗室静置1h；

(b)加入4倍于样品溶液体积的预冷丙酮，-20度沉淀3h以上，离心20min，取沉淀；加入300ul的复溶缓冲液，超声3min助溶；

(c)使用bradford法对蛋白进行定量每个样品取100ug蛋白体积，用含0.1％SDS的TEAB补齐所有样品体积；

(d)加入1ug/ul的Trypsin，每100ug蛋白质底物加入3.3ug的酶，37度水浴24h，然后补加Trypsin 1ug，37度12h；

(e)冻干消化液，然后使用TEAB(水：TEAB＝1:1，含0.1％SDS)每管30ul复溶肽段,取1ul消化后肽段，使用MALDI Tof/Tof检测消化效率。

三阴性乳腺癌细胞上皮间质转换的过程中三阴性乳腺癌细胞株能够促进内皮细胞分泌趋化因子CCL5，从而促进三阴性乳腺癌细胞的转移。本发明提供了检测三阴性乳腺癌细胞上皮间质转换的过程中对内皮细胞功能的影响的方法。

附图说明

图1：TMT定量蛋白质组表达谱分析发现与HUVEC共培养后，能够促进PAI-1(SERPINE1)的分泌。

图2：体外细胞株实验验证PAI-1的分泌。

图3：小鼠成瘤实验各组小鼠体积变化。

图4：各组小鼠体重变化。

图5：各组小鼠分泌PAI-1的检测。

图6：相关指标的免疫组化。

图7：三阴性乳腺癌组织芯片总PAI-1、CD31表达情况。

图8：CD31及PAI-1表达的相关性。

图9：PAI-1表达与三阴性乳腺癌患者复发风险的相关性。

图10：PAI-1表达与三阴性乳腺癌患者远处转移的相关性。

图11：PAI-1及PAI-039处理后对内皮细胞增殖的影响。

图12：Transwell迁移实验检测PAI-1对内皮细胞迁移的影响。

图13：划痕实验检测PAI-1对内皮细胞迁移的影响.

图14：小管形成实验检测PAI-1对内皮细胞血管形成的影响。

图15：CD31流式实验检测PAI-1对内皮细胞血管形成的影响。

图16：全基因表达谱分析PAI-1及PAI-039处理后内皮细胞基因组表达的变化。

图17：qRT-PCR验证PAI-1、PAI-039处理后CCL5、CCR5、MMP9、MMP10表达的变化。

图18：Western blotting验证PAI-1、PAI-039处理后PAI-1、CCL5、CCR5表达的变化。

图19：ELISA检测PAI-1、PAI-039处理后CCL5分泌量的变化。

图20：小鼠成瘤实验各组小鼠体积变化.

图21：各组小鼠体重变化。

图22：各组小鼠分泌PAI-1的检测。

图23：各组小鼠分泌CCL5的检测。

图24：相关指标的免疫组化。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

选取三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231及人脐静脉内皮细胞HUVEC，设置实验组MDA-MB-231和HUVEC共培养组，对照组MDA-MB-231单独培养组。均应用10ng/ml TGF-β刺激36小时后，应用TMT定量蛋白质组表达谱分析两组中细胞上清中分泌蛋白的差异表达。发现SERPINE1(PAI-1)因子在共培养组分泌升高大约3倍。

在细胞培养皿中分别单独培养三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231，或者三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231及人脐静脉内皮细胞HUVEC采用小室上下室共培养(上室接种HUVEC细胞，下室接种MDA-MB-231细胞)，分别换液后添加10ng/ml TGF-β刺激36小时后，收集两组细胞上清，加入60μl Elution Buffer(7M尿素，1％(w/v)CHAPS)。漩涡震荡60min。-20度保存。

接着对两组细胞上清进行TMT定量蛋白质组表达谱分析，具体步骤为：上清加入DTT至终浓度10mM。56度水浴1h。取出后，迅速加入IAM至终浓度55mM，暗室静置1h。

加入4倍于样品溶液体积的预冷丙酮，-20度沉淀3h以上。离心，4度，20000g，20min，取沉淀。

加入300ul的复溶buffer，终浓度为50％TEAB，0.1％SDS。超声3min助溶。

定量，使用bradford法对蛋白进行定量。

定量结果如下：

样品名称	样本1	样本2	样本3	样本4	样本5	样本6
							浓度(ug/ul)	1.81	1.72	1.91	1.92	1.78	1.83

表1. 1蛋白样品定量列表

每个样品取100ug蛋白体积，用含0.1％SDS的TEAB补齐所有样品体积。加入1ug/ul的Trypsin，每100ug蛋白质底物加入3.3ug的酶，37度水浴24h，然后补加Trypsin 1ug。37度12h。

冻干消化液，然后使用TEAB(水：TEAB＝1:1，含0.1％SDS)每管30ul复溶肽段。取1ul消化后肽段，使用MALDI Tof/Tof检测消化效率。

HPLC(强阳离子交换色谱)试剂及样品准备：样品：标记后样品是用A液稀释10倍，磷酸调pH至3.0，15000g离心10min，取上清。A液：25％ACN，10mM KH2PO4，用磷酸调pH值至3.0；B液：25％ACN，2MKCL，10mM KH2PO4，用磷酸调PH值至3.0。AB液配好后，管外超声5-10min，过滤，使用0.22um或0.45um的有机膜。

机器打开后，将阀门打开，此时用MilliQ水作AB泵的排气。排气过后，关上阀门，使用MilliQ水冲洗柱子10min左右，观察压力是否平衡。

清洗过后，A泵放入A液，B泵放入B液，打开阀门，让A泵充满A液，B泵充满B液。

关闭阀门，调Pump B至0％，即用A液平衡系统，10-20min，1ml/min,同时balance。平衡至压力，吸收峰都走平，即可上样。

上样。样品处理后，使用进样针将样品注入定量环中(注意上样体积，过量会损失)。

收集样品,平衡清洗。A液平衡10min后，流速调0，将A，B泵至于MilliQ水中，打开阀门，冲泵。关闭阀门，冲洗至吸收峰走平，压力走平后，冲甲醇。

肽段的纯化(C18反相色谱除盐)：1ml甲醇活化柱料，流速1s 2-3滴；5％ACN平衡，1滴/s；样品用1ml MilliQ水溶解过柱。1ml 5％乙腈洗柱除盐，1滴/s。2*500ul纯乙腈洗脱，1滴/s。低温离心抽干乙腈。0.1％甲酸复溶肽段。

质谱检测：Thermo-fisher Q-Exactive–Orbitrap高精度液质联用型质谱检测肽段信号并分析蛋白定性定量结果。

蛋白质定性与定量分析。

TMT定量蛋白质组表达谱结果发现SERPINE1(PAI-1)因子在共培养组分泌升高大约3倍。

实施例2

验证表达谱结果：设置HUVEC单独培养组、三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231单独培养组、三阴性乳腺癌细胞株Hs578t单独培养组、三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231和HUVEC共培养组和三阴性乳腺癌细胞株Hs578t和HUVEC共培养组，共五组。分别应用10ng/ml TGF-β刺激36小时，应用ELISA技术检测各组刺激前后PAI-1因子分泌的变化。

在细胞培养皿中分别单独培养三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231，三阴性乳腺癌细胞株Hs578t，人脐静脉内皮细胞HUVEC，或者三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231及人脐静脉内皮细胞HUVEC采用小室上下室共培养(上室接种HUVEC细胞，下室接种MDA-MB-231细胞)，三阴性乳腺癌细胞株Hs578t及人脐静脉内皮细胞HUVEC采用小室上下室共培养(上室接种HUVEC细胞，下室接种Hs578t细胞)共五组。分别换液后添加10ng/ml TGF-β刺激36小时后，收集两组细胞上清。

运用PAI-1因子ELISA试剂盒检测各组分泌蛋白中PAI-1的量。具体步骤如下：

分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。

弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100μl(在使用前一小时内配制)，酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。

温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干。

每孔加检测溶液B工作液(同检测A工作液)100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。

温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干.

依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色.

依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。

用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(od值)。在加终止液后立即进行检测。

实施例3

动物实验验证：分别利用三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231或MDA-MB-231和HUVEC共培养皮下注射至免疫缺陷小鼠皮下中建立移植瘤模型，并分别在小鼠瘤周注射PBS或TGF-β，定期测量移植瘤的大小；小鼠成瘤5周后予以安乐死，并测量各组小鼠体重。小鼠成瘤第3周及第5周抽取其静脉血，并运用ELISA检测其中的PAI-1及TGF-β浓度。并对各组小鼠瘤体组织进行PAI-1、EMT相关指标E-Cadherin、N-Cadherin和增殖指数Ki-67免疫组化。

收集含10％进口胎牛血清、1％100U/ml青霉素-100mg/L链霉素的1640培养基培养的MDA-MB-231细胞，或者MDA-MB-231和HUVEC(1:1)共培养细胞，在细胞培养至对数生长期时，加入适量胰蛋白酶液，胰蛋白酶完全覆盖细胞。倒置显微镜下观察消化细胞的形态，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度；用RPMI-1640制成约2.5×l0⁷个/ml细胞悬液，取0.2ml(5x10⁶个MDA-MB-231乳腺癌细胞或MDA-MB-231及HUVEC共培养细胞/只)选择裸鼠前腿上根部皮下；

接种时用小手指先压住裸鼠尾巴，再把右后肢向尾部反向拉一下，再用无名指压住右后肢，绷紧注射部位的皮肤，用1ml注射器吸取0.2ml细胞悬液(抽吸前注意混悬均匀)，注射至裸鼠后腿上根部皮下；

每1周测量裸鼠皮下移植瘤大小(长：l(mm)；宽：w(mm))，并计算肿瘤体积(＝Π/6×l×w×(l+w)/2)，当皮下移植瘤体积为100mm³左右时(约2周)，选择体重相近、健康状态良好、肿瘤生长良好的裸鼠随机分为4组，每组为4-6只；

用生理盐水配制羧甲基纤维素钠溶液至0.5％浓度，置于高压锅中灭菌备用；

根据不同分组给予不同的药物处理：TGF-β(100ng/ml)；对照组(PBS)，分别给予小鼠瘤周注射，每周注射1次；

用药期间每1周测量肿瘤大小，用药后第3、5周通过尾静脉抽取适量小鼠静脉血，并于用药后第5周处死小鼠并取出移植瘤，及时放入含无血清培养液的平皿中，再在超净工作台内修剪肿瘤组织，去除脂肪、结缔组织及坏死的肿瘤组织，并用无血清培养液洗涤2次，将瘤组织切成约1mm×2mm×2mm的小块备用。

运用ELISA实验检测小鼠静脉血中TGF-β及PAI-1的含量。

组织取材、固定与包埋蜡块：将取好的组织块用4％缓冲中性福尔马林(甲醛)液固定24-48h；

固定后取出组织块，用生理盐水冲洗组织块30min；

脱水：从30％乙醇开始，经过50％、70％、80％、95％、100％至完全脱水，各级乙醇中放置45min到1h；

透明：将组织块置于二甲苯中30min；

透蜡：将组织块置于恒温箱中浸蜡30min；

包埋：将包埋框合成模型槽，在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却；打开组织块脱水盒，取出组织块，再将待包埋的组织置于石蜡之中，并排列整齐，把平整的一面朝下，用镊子轻压，保持在一平面上，最后加入少许液体石蜡；每包埋完一块组织块，即将标签附上标记；将蜡块置于-20℃中进行冷冻，使石蜡变成固态，取出蜡块。

切片：将包埋好的组织从模具上取下来，并置于石蜡切片机上，切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致，然后调节切片的厚度，一般为5μm，用毛笔将切割的载玻片向外拉，并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于40℃温水中。

捞组织：当组织载玻片置于40℃温水中之前，要先将水浴中的气泡赶走，以免气泡受热上浮而贴到组织上，组织受热展开，将捞出来的载玻片置于架子上，放入37℃温箱中烘干备用。

脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100％酒精-100％酒精-95％酒精-90％酒精-80％酒精-70％酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯,依据的是相似相溶的原理.一般在每个试剂中放10min；

高温高压抗原修复：高压锅中用含0.001M EDTA(pH＝8.0)去离子水2L加热至沸腾；将含有切片的切片架放入锅内(液面没过切片)；高压锅加热，自第一声喷气起计时2min，然后取出切片后室温下自然冷却，以PBS液(pH＝7.4)洗涤2min、重复3次；

血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，使一些非特异性的位点封闭起来，然后放入37℃温箱中半小时。血清稀释10倍(900μl PBS：100μl血清封闭液)。

加一抗：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加入目的蛋白一抗，4℃冰箱中保存过夜；

加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS液(pH＝7.4)后滴加Envision即用型二抗(丹麦DAKO公司)50μl/片,然后置于37℃温箱中30min；

加SABC：将片子从温箱中取出，用PBS液(pH＝7.4)洗涤3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上SABC,然后置于37℃温箱中半小时；SABC稀释100倍(990μlPBS：10μlSABC)；

DAB显色：将片子从温箱中取出,放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上显色剂，DAB显色5-10min，流水冲洗以终止显色(显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀A：DAB；B：H2O2；C：磷酸缓冲)；

复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色30s；

脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70％酒精→80％酒精→90％酒精→95％酒精→100％酒精(Ⅰ)→100％酒精(Ⅱ)→二甲苯(Ⅰ)→二甲苯(Ⅱ)；每个试剂中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，在通风柜中操作；

封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干；

结果判读：以细胞质或细胞核内出现黄色为阳性信号，随机选取10个高倍镜视野，对免疫组化结果进行评估。

实施例4：

三阴性乳腺癌病人组织验证：利用165例三阴性乳腺癌病人组织芯片，检测PAI-1及血管内皮标志物CD31免疫组化分析其相关性。并于三阴性乳腺癌数据库中分析PAI-1因子与三阴性乳腺癌患者远处转移及复发风险之间的关系。

对165例三阴性乳腺癌病人组织进行PAI-1及CD31免疫组化：

切片脱蜡与水化后，利用高压锅高温高压抗原修复：高压锅中用含0.001mol/LEDTA(pH＝8.0)的去离子水2000ml左右加热至沸腾；将含有切片的切片架放入锅内(液面没过切片)；高压锅加热，自第一声喷气起时起计时2min，然后取出切片后室温下自然冷却，以PBS液(pH＝7.4)洗涤2min、重复3次。

滴加相关一抗(TXNIP、p27抗体)，37℃1h。

PBS液(pH＝7.4)洗涤3次后，滴加Envision即用型二抗(丹麦DAKO公司，50μl/片)，室温下孵育30min。

PBS液(pH＝7.4)洗涤3次后，DAB显色5-10min，流水冲洗以终止显色。

苏木素染色3-5min；浓盐酸与70％乙醇体积比1：100的混合液中褪色2-10s；

流水冲洗蓝化；50％、70％、80％梯度乙醇脱水；二甲苯透明；树脂封片。

结果判断：以细胞质或细胞核内出现棕黄色为阳性信号，随机选择10个高倍视野，对免疫组化结果进行评估：阳性细胞百分率<10％为(-)，10％-25％为(+)，25％-50％为(++)，>50％为(+++)。

三阴性乳腺癌数据库中分析PAI-1因子与三阴性乳腺癌患者远处转移及复发风险之间的关系：

登陆癌症病人预后分析网站http://kmplot.com/analysis/；选取乳腺癌患者，输入SERPINE1，选取无复发生存期(RFS)或无远处转移生存期，选择最佳cut-off，选择三阴性乳腺癌患者，得到相应结果。

实施例5：

PAI-1因子对内皮细胞功能的影响：分别对内皮细胞转染PAI-1过表达或siPAI-1质粒，或者予以10ng/ml的人重组PAI-1因子或PAI-1抑制剂PAI-039处理后，分别利用细胞计数、Transwell迁移实验、划痕实验、小管形成实验及CD31流式实验，检测内皮细胞细胞增殖、迁移及血管形成等特性的改变。

细胞计数法测定细胞增殖：

取对数生长期HUVEC细胞按每孔20000个细胞接种于24孔板。细胞计数后稀释为合适倍数，每孔体积为1mL，每个样本设6个复孔。细胞均匀接种于24孔板后，在37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养至贴壁；

小心弃去培养液，转染PAI-1过表达或siPAI-1质粒，或者予以10ng/ml的人重组PAI-1因子或PAI-1抑制剂PAI-039处理；

小心弃去培养液，用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞悬液于离心管中；以离心半径15cm、2000r/min离心5min，弃上清，加入200μl培养液重悬；

计数：将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上，将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间；静置约1分钟；镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。

按下式计算：细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×10000×稀释倍数。

划痕实验检测细胞迁移：

取对数生长期HUVEC细胞按每孔200000个细胞接种于6孔板。细胞计数后稀释为合适倍数，每孔体积为1mL，每个样本设3个复孔。细胞均匀接种于6孔板后，在37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养至贴壁；

小心弃去培养液，转染PAI-1过表达或siPAI-1质粒，或者予以10ng/ml的人重组PAI-1因子或PAI-1抑制剂PAI-039处理48小时；

使用200μl枪头于6孔板底部采用“井”字形划线；用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。放入37度5％CO2培养箱，培养。按0，48小时取样，拍照

Transwell迁移实验检测细胞迁移：

取对数生长期HUVEC细胞按每孔200000个细胞接种于6孔板。细胞计数后稀释为合适倍数，每孔体积为1mL，每个样本设3个复孔。细胞均匀接种于6孔板后，在37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养至贴壁；

小心弃去培养液，转染PAI-1过表达或siPAI-1质粒，或者予以10ng/ml的人重组PAI-1因子或PAI-1抑制剂PAI-039处理48小时；

消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至2×10⁵；

取细胞悬液200μl加入24孔Transwell小室；24孔板下室加入800μl含FBS的培养基；放入37度5％CO2培养箱，培养12小时。用棉签擦去基质胶和上室内的细胞；采用结晶紫染色，拍照。

小管形成实验检测血管形成：

取对数生长期HUVEC细胞按每孔200000个细胞接种于6孔板。细胞计数后稀释为合适倍数，每孔体积为1mL，每个样本设3个复孔。细胞均匀接种于6孔板后，在37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养至贴壁；

小心弃去培养液，转染PAI-1过表达或siPAI-1质粒，或者予以10ng/ml的人重组PAI-1因子或PAI-1抑制剂PAI-039处理48小时；

Matrigel基质胶4℃过夜溶解，枪头盒、EP管、96孔板均4℃过夜预冷

次日在冰盒上进行铺胶，先用无血清及生长因子补充物的培养基1:1稀释Matrigel基质胶，混匀后，50ul/孔加入96孔板，37℃孵箱放置30min；

每孔接种10000-15000细胞，然后放入孵箱中培养6h后开始观察，拍照。

CD31流式实验：取对数生长期HUVEC细胞按每孔200000个细胞接种于6孔板。细胞计数后稀释为合适倍数，每孔体积为1mL，每个样本设3个复孔。细胞均匀接种于6孔板后，在37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养至贴壁；小心弃去培养液，转染PAI-1过表达或siPAI-1质粒，或者予以10ng/ml的人重组PAI-1因子或PAI-1抑制剂PAI-039处理48小时；用PBS洗涤细胞(离心2000rpm，5min)收集细胞；加入80μL的PBS重悬浮细胞；加入20μL CD31/IgG，混匀；室温、避光、反应10～15min；流式细胞仪检测。

实施例6

PAI-1因子对内皮细胞功能影响机制的探讨：分别予以10ng/ml的人重组PAI-1及PAI-1抑制剂PAI-039处理内皮细胞及未处理组进行全基因组测序，检测PAI-1对内皮细胞基因组表达的影响，发现趋化因子CCL5及其受体CCR5、金属蛋白酶MMP9、MMP10表达随着PAI-1处理而升高，PAI-1抑制剂处理后下调。并进行qRT-PCR验证，发现CCL5、CCR5、MMP9与表达谱结果抑制，接着进行Western blotting验证。并分析PAI-1及PAI-039处理前后内皮细胞分泌CCL5的差异，发现PAI-1处理后能够促进内皮细胞分泌趋化因子CCL5。

取对数生长期HUVEC细胞按每孔200000个细胞接种于6孔板。细胞计数后稀释为合适倍数，每孔体积为1mL，每个样本设3个复孔。细胞均匀接种于6孔板后，在37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养至贴壁；小心弃去培养液，予以10ng/ml的人重组PAI-1因子或PAI-1抑制剂PAI-039，及对照组PBS处理48小时；去上清，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置5min，转移到一DEPC处理过的1.5ml EP管。送至公司进行全基因组测序。

qRT-PCR验证相关因子表达：

匀浆处理：培养瓶或细胞培养板中细胞弃去上清，PBS洗涤2次，加入1ml Trizo充分匀浆，室温静置5min，转移到一DEPC处理过的1.5ml EP管。

分层：加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，静置3min。4℃离心，12000rpm×10min，取上清。

RNA沉淀：取上层无色水相(约400-500μl)到新的DEPC处理过的1.5mlEP管，加入0.5ml异丙醇，混匀，冰上静置20-30min。4℃离心，12000rpm×10min，弃上清。

RNA洗脱：加入1ml 75％乙醇，洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。

室温放置晾干或超净台中吹干5min左右，加入适量的Rnase-free H₂O溶解。

使用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，测量前先用DEPC水调零。接着分别测量波长为260nm、280nm处RNA的OD值，其比值范围在1.8-2.0之间表示RNA纯度较好，可用于下游实验。

逆转录反应：相关逆转录引物参照以往文献报道原则设计。按BBI第一链cDNA合成试剂盒(AMV First Strand cDNA Synthesis Kit)说明书进行cDNA第一链合成。

在0.2ml PCR管中加入以下试剂：5μl total RNA；1μl特异性引物；5μl Rnase-free ddH₂O；70℃温浴5min。冰浴10s，离心加入下列试剂：4μl 5×Reaction Buffer；2μldNTP Mix(10mmol/L)；1μl Rnase inhibitor(20U/l)；2μl AMV Reverse Transcriptase(10U/l)；20μl Total volume；37℃温浴5min。42℃温浴60min。70℃温浴10min。终止反应。将上述溶液-20℃保存。

qRT-PCR反应：PCR上、下游引物具体序列如下：

将cDNA样品稀释8倍作为模板上机检测。按ABI SYBR Green PCR Master Mix(2×)说明书，在ABI Stepone plus型荧光定量PCR仪上进行。

反应完成后，确认熔解曲线为单峰。

读取Ct值，采用△△Ct法进行数据分析。具体算法如下

△Ct sample1＝Ct sample1-Ct GAPDH

△Ct sample2＝Ct sample2-Ct GAPDH

△△Ct＝△Ct sample1-△Ct sample2

因此，sample1含量/sample2含量＝2-average△△CT

Western blotting验证：

小心弃去细胞常规培养的培养液，用预冷的PBS或生理盐水洗涤2次，吸去洗涤液；冰上操作，配制细胞裂解液，按RIPA:25×coktail：PMSF＝100:4:1的比例配置，混匀后冰上保存数分钟待用；

将6孔培养板置于冰上，每个孔加入50μl已混合好的蛋白裂解液；

细胞裂解液完全覆盖培养孔，用细胞刮刀刮碎细胞，吸取细胞蛋白裂解液混合物转移至干净的离心管中，并将载有细胞离心管的冰盒置于摇床上震荡冰上充分裂解20min，使细胞与裂解液充分接触；

待充分裂解后，置于4℃、12000rmp离心15min，上清即为细胞全蛋白提取物，取上清移入另一离心管中；

按1:4体积比例加入SDS-PAGE蛋白质上样缓冲液(Loading Buffer)(5×)混匀；100℃变性10min，-80℃保存备用；

蛋白质浓度测定：根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀；完全溶解蛋白标准品，取10μl稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml；将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品的溶液补足到20μl；加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液到20μl；各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30分钟；酶标仪上测定562nm处吸光度，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

配胶及灌胶：a.梳子和玻璃板用去离子水清洗干净：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用去离子水冲洗干净后，置电热恒温鼓风干燥箱烘干后组装玻璃板；b.玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶。配制10％分离胶约8ml，混匀后立即灌胶约4-6cm高，然后缓慢加入去离子水封闭，尽量保持胶平面水平；室温静置约20min，当水和胶之间有一条折射线时即胶已凝固，随后弃去胶上液体，轻轻倾斜玻璃板，用纱布吸干残余的液体；c.配制4％浓缩胶约4ml，混匀凝胶，将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中，插梳子时要使梳子保持水平，尽量避免气泡产生，由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶，室温静置约20min后待浓缩胶凝固；d.待浓缩胶聚合完全后，拆下玻璃板，立即用去离子水洗涤加样槽，以除去未聚合的丙烯酰胺及残留的凝胶。

上样：安装电泳槽，倒入适量电泳缓冲液并没过上样槽，待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出，用微量进样器贴壁吸取样品，将加样器针头插至加样孔中缓慢加样：蛋白maker约5μl，样本蛋白约10-20μl。

电泳(恒压)：接通电源，控制电压，浓缩胶电压约80V，分离胶电压约120V：设置电泳仪电压80V，电泳至蛋白maker完全分开后，将电泳电压设置为120V继续电泳。

转膜(恒流湿转)：电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去(浓缩胶影响操作)，要避免把分离胶刮破。根据目的蛋白分子量大小，对照maker，选择目的蛋白出现在胶上的范围，连同maker一起切胶，切胶时尽量保持胶切缘整齐、条带完整，小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡，将膜盖于胶上，要盖满整个胶，并除气泡；

将准备好的滤纸、凝胶、膜浸泡放置湿转缓冲液中(其中PVDF膜根据条带长宽裁切好，约1×8cm)预先在甲醇溶液中浸泡激活5min，再浸泡于湿转缓冲液中静置5min)；

在转膜仪上依次铺滤纸、膜、胶与滤纸，注意膜应放置白面(靠正极),胶靠黑面(靠负极)，在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。

恒流转膜(湿转法)：将转膜仪放置于转膜槽中(白面靠正极，黑面靠负极)，300mA，冰浴(由于电转移时会产热，在槽的一边放冰袋来降温)，转膜时间根据目的蛋白分子量选择，一般为分子量大小+10min，转膜过程中注意适当更换冰袋以保持冰浴温度。

转完后将膜用1×丽春红染液染5min(于脱色摇床上摇)，然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白，将膜晾干备用。

洗膜：待转膜结束后，取出转膜槽中转膜夹，随后用1×TBST冲洗PVDF膜一次；

封闭：用1×TBST配制5％脱脂牛奶封闭，37℃于摇床上封闭1h；

一抗孵育：用一抗稀释液稀释目的蛋白一抗，4℃摇床上摇动过夜；

洗膜：弃一抗，取出PVDF膜，用1×TBST缓冲液于摇床上洗膜，5min×3次；

二抗孵育：用1×TBST配制5％脱脂牛奶稀释二抗(根据一抗属性选择鼠抗或兔抗，稀释浓度1:5000)，37℃摇床上摇动孵育1h；

洗膜：弃二抗，取出PVDF膜，用1×TBST缓冲液洗膜，10min×3次。

ECL检测：将PVDF膜加入塑封膜中，避光取A、B显影液试剂按1：1比例混匀，将混匀后的试剂均匀滴加在膜上，确保显影液完全覆盖于膜上，1min后迅速送入暗室中；在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中，暗室中观察条带荧光强度，荧光出现后立即于暗室压片曝光：在红灯下取出X-片，用切纸刀剪裁适当大小，打开X-光片夹，把X-光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min。

取出X光胶片，于显影液中显影15-30s，待出现明显条带后，即刻终止显影，于定影液中定影10s，以胶片透明为止，自来水冲洗残余的定影液后自然晾干X光胶片。

图片扫描和定量分析：将X光胶片扫描为图片，使用Image-J软件，定量分析扫描图片中的电泳条带灰度值。

运用ELISA实验检测PAI-1及PAI-039处理前后内皮细胞分泌CCL5的差异，发现PAI-1处理后能够促进内皮细胞分泌趋化因子CCL5。

实施例7

动物实验验证CCL5的分泌：分别利用三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231和HUVEC共培养皮下注射至PAI-1基因敲除小鼠及PAI-1野生型小鼠皮下中建立移植瘤模型，并分别在小鼠瘤周注射PBS、PAI-1或PAI-039，定期测量移植瘤的大小；小鼠成瘤5周后予以安乐死，并测量各组小鼠体重。小鼠成瘤第3周及第5周抽取其静脉血，并运用ELISA检测其中的PAI-1及CCL5浓度。并对各组小鼠瘤体组织进行PAI-1、CCL5、CCR5、内皮细胞标志物CD31免疫组化。

收集含10％进口胎牛血清、1％100U/ml青霉素-100mg/L链霉素的1640培养基培养的MDA-MB-231和HUVEC(1:1)共培养细胞，在细胞培养至对数生长期时，加入适量胰蛋白酶液，胰蛋白酶完全覆盖细胞。倒置显微镜下观察消化细胞的形态，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度；用RPMI-1640制成约2.5×l0⁷个/ml细胞悬液，取0.2ml(5x10⁶个MDA-MB-231及HUVEC共培养细胞/只)选择PAI-1基因敲除小鼠及PAI-1野生型小鼠前腿上根部皮下；

接种时用小手指先压住裸鼠尾巴，再把右后肢向尾部反向拉一下，再用无名指压住右后肢，绷紧注射部位的皮肤，用1ml注射器吸取0.2ml细胞悬液(抽吸前注意混悬均匀)，注射至PAI-1基因敲除小鼠及PAI-1野生型小鼠后腿上根部皮下；

每1周测量裸鼠皮下移植瘤大小(长：l(mm)；宽：w(mm))，并计算肿瘤体积(＝Π/6×l×w×(l+w)/2)，当皮下移植瘤体积为100mm³左右时(约2周)，选择体重相近、健康状态良好、肿瘤生长良好的裸鼠随机分为4组，每组为4-6只；

用生理盐水配制羧甲基纤维素钠溶液至0.5％浓度，置于高压锅中灭菌备用；

根据不同分组给予不同的药物处理：PAI-1(100ng/ml)；PAI-039(100ng/ml)对照组(PBS)，分别给予小鼠瘤周注射，每周注射1次；

用药期间每1周测量肿瘤大小，用药后第3、5周通过尾静脉抽取适量小鼠静脉血，并于用药后第5周处死小鼠并取出移植瘤，及时放入含无血清培养液的平皿中，再在超净工作台内修剪肿瘤组织，去除脂肪、结缔组织及坏死的肿瘤组织，并用无血清培养液洗涤2次，将瘤组织切成约1mm×2mm×2mm的小块备用。

运用ELISA实验检测小鼠静脉血中PAI-1及CCL5的含量。

运用免疫组化实验检测小鼠瘤体中PAI-1、CCL5、CCR5、内皮细胞标志物CD31的表达。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种三阴性乳腺癌细胞上皮间质转换过程中对内皮细胞分泌功能影响的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

选取三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231及人脐静脉内皮细胞HUVEC，设置实验组：MDA-MB-231和HUVEC共培养组、对照组：MDA-MB-231单独培养组；

将实验组和对照组均应用10ng/ml TGF-β刺激36小时后，应用TMT定量蛋白质组表达谱分析两组中细胞上清中分泌蛋白的差异表达，比较SERPINE1(PAI-1)因子在共培养组和单独培养组的分泌结果。

2.根据权利要求1所述的三阴性乳腺癌细胞上皮间质转换过程中对内皮细胞分泌功能影响的检测方法，其特征在于：在细胞培养皿中分别单独培养三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231的单独培养组，以及三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231及人脐静脉内皮细胞HUVEC的共培养组，所述的共培养组采用小室上下室共培养。

3.根据权利要求2所述的三阴性乳腺癌细胞上皮间质转换过程中对内皮细胞分泌功能影响的检测方法，其特征在于：上室接种HUVEC细胞，下室接种MDA-MB-231细胞。

4.根据权利要求1所述的三阴性乳腺癌细胞上皮间质转换过程中对内皮细胞分泌功能影响的检测方法，其特征在于：在单独培养组和共培养组的细胞培养皿添加10ng/ml TGF-β刺激36小时后，收集两组细胞上清，加入缓冲液，漩涡震荡60min，-20度保存。

5.根据权利要求1所述的三阴性乳腺癌细胞上皮间质转换过程中对内皮细胞分泌功能影响的检测方法，其特征在于：对单独培养组和共培养组两组细胞上清进行TMT定量蛋白质组表达谱分析，具体步骤为：样品处理；强阳离子交换色谱分离样品；C18反相色谱除盐，进行肽段的纯化；质谱检测。

6.根据权利要求5所述的三阴性乳腺癌细胞上皮间质转换过程中对内皮细胞分泌功能影响的检测方法，其特征在于：所述的样品处理包括：

(a)上清加入DTT至终浓度10mM；56度水浴1h；取出后，迅速加入IAM至终浓度55mM，暗室静置1h；

(b)加入4倍于样品溶液体积的预冷丙酮，-20度沉淀3h以上，离心20min，取沉淀；加入300ul的复溶缓冲液，超声3min助溶；

(c)使用bradford法对蛋白进行定量每个样品取100ug蛋白体积，用含0.1％SDS的TEAB补齐所有样品体积；

(d)加入1ug/ul的Trypsin，每100ug蛋白质底物加入3.3ug的酶，37度水浴24h，然后补加Trypsin 1ug，37度12h；

(e)冻干消化液，然后使用TEAB(水：TEAB＝1:1，含0.1％SDS)每管30ul复溶肽段,取1ul消化后肽段，使用MALDI Tof/Tof检测消化效率。