CN111607618A - 一种利用突变体使MGP Variant 1对乳腺癌细胞EMT的促进功能丧失的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及利用MGP Variant1构建的慢病毒转染突变体，使原本MGP Variant1对乳腺癌细胞EMT进程的促进功能丧失的方法。包括以下步骤：步骤A、细胞培养；步骤B、细胞转染；步骤C、免疫印迹试验；构建MGP的不同转录本的过表达质粒，通过制备慢病毒并转染进乳腺癌细胞MDA‑MB‑231和T47D里，筛选的到稳定上调Variant1或Variant2表达量的细胞株，并对EMT重要标志物进行Western blot及RT‑qPCR检测，通过免疫荧光发现Variant1对伪足的促进作用，通过MTT发现Variant1对增殖的促进作用，验证了Variant1在乳腺癌E MT进程中的作用。

Description

一种利用突变体使MGP Variant 1对乳腺癌细胞EMT的促进功 能丧失的方法
技术领域
本发明涉及医疗领域，具体的说是一种利用突变体使MGP Variant 1对乳腺癌细胞 EMT的促进功能丧失的方法。
背景技术
女性乳腺是由皮肤、纤维组织、乳腺腺体和脂肪组成的，乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。乳腺癌中99％发生在女性，男性仅占1％。乳腺并不是维持人体生命活动的重要器官，原位乳腺癌并不致命；但由于乳腺癌细胞丧失了正常细胞的特性，细胞之间连接松散，容易脱落。癌细胞一旦脱落，游离的癌细胞可以随血液或淋巴液播散全身，形成转移，危及生命。目前乳腺癌已成为威胁女性身心健康的常见肿瘤。
MGP是一种13～15kd左右的依赖维生素K的基质GLA蛋白，拥有5个γ-羧基谷氨酸残基，在GLA的序列结构域中的谷氨酸(Glu)残基都是潜在的羧基化位点，这类蛋白拥有一个对羧化酶的底物识别很重要的保守的gla-x(3)-gla-x-cys基序。
在乳腺癌中，出现高水平的MGP表达量与预后不良有关。人类细胞内已完全分离出两种MGP转录本编码的蛋白。Variant1，长度387bp，有128个氨基酸残基，拥有5个外显子。Variant2，长度312bp，有103个氨基酸残基，共有4个外显子。研究发现对乳腺癌 EMT来说，MGP Variant 1在促进EMT过程中发挥更重要的作用。因此，针对上述问题提出一种利用可稳定转染的突变体使MGP Variant1促进乳腺癌细胞EMT进程丧失的方法。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明提供了一种利用突变体使MGP Variant 1对乳腺癌细胞EMT的促进功能丧失的方法，本发明提供的突变体，使原本MGP Variant1对乳腺癌细胞EMT进程的促进功能丧失。构建MGP Variant 1可稳定转染的突变体质粒，将MGP Variant1作为对照及构建的突变体转染进乳腺癌细胞里，做Western blot，使MGP Variant1突变体消除MGP Variant 1在乳腺癌EMT进程中的促进作用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种利用突变体使MGP Variant 1对乳腺癌细胞EMT的促进功能丧失的方法，包括以下步骤：
S1、细胞培养；使用DMEM培养液培养细胞；具体的包括以下步骤：
a、将-80℃冰箱或液氮罐里的HEK293FT细胞，最快速度放入37℃的恒温水浴锅中，尽可能在2min内迅速晃动融化；然后将1ml新鲜的DMEM细胞培养液与冻存管中的细胞，用枪头混匀在离心管中；随后放入1000rpm的离心机中3min进行离心；用枪头小心吸净上层的冻存液废液，加入1ml新鲜DMEM细胞培养液，悬浮细胞；向细胞培养皿中加入4ml新鲜DMEM培养液，将悬浮细胞打入细胞培养皿中，置于细胞培养箱中进行培养；
b、用酒精将所有拿进去的物品消毒后放进生物安全柜；吸去废液，随即用枪头吸取 5mlPBS，沿培养皿壁缓慢加入，摇匀后吸去废液；加入适量胰酶，摇匀后放回培养箱中；根据不同细胞调整胰酶反应的时间，进行消化反应，时间为3-5min，消化不完全的适当增加消化时间；消化完全后，将1ml新鲜的DMEM培养液沿培养皿壁打入，冲洗几遍，胰酶消化反应停止，并将细胞充分冲下，放入1000rpm的离心机中离心3min；吸去上清，向离心管中添加1ml新鲜的DMEM培养液，重新悬浮细胞，换到新的细胞培养皿中培养。
c、移出上清，加入适量的10％DMSO+90％DMEM细胞培养液组成的细胞冻存液，温和地将细胞沉淀吹打均匀；随即将细胞悬浮液进行分装，用枪头吸取1ml细胞悬浮液打入1.5ml冻存管；冻存管放入泡沫盒里，胶带封好放入-80℃冰箱，48h后，再放入液氮罐中进行长期冻存；
S2、细胞转染：包括瞬时转染，制备慢病毒，慢病毒转染；
S3、免疫印迹试验：提取细胞的总蛋白，对提取的总蛋白进行蛋白质浓度测定，然后进行电泳，电泳完成之后进行转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育，最后进行曝光检测，验证构建的突变体使MGPVariant1对乳腺癌细胞EMT上进程的促进功能丧失。
具体的，所述S2中的瞬时转染为：在六孔板中种293T细胞，每孔3×105个细胞，分散均匀后培养，细胞长至约50％；转染试剂阳离子Exfect2000与无血清的DMEM培养液充分混匀，放置5min；目的质粒与无血清的DMEM培养液充分混匀，放置5min；将目的质粒与无血清的DMEM培养液混匀的培养液加入转染试剂阳离子Exfect2000与无血清的 DMEM培养液的培养液中，涡旋震荡10s，简单离心，室温孵育10min；将孵育中的阳离子复合物转圈滴加进六孔板中，6h后吸去培养液换新鲜DMEM细胞培养液；转染2-4天后收集蛋白。
具体的，所述S2中的制备慢病毒为：六孔板中，每孔添加1μl polylysine(多聚赖氨酸)及1ml PBS，进行包板，使HEK293FT细胞更易贴壁。显微镜观察，HEK293FT在对数期生长时。种细胞，大致每孔细胞数为8×105个细胞。添加新鲜的DMEM培养液，六孔板每孔培养液不超过2ml，把六孔板放置于细胞培养箱中过夜培养。12h后，HEK293FT 约75％左右细胞密度至时开始制备慢病毒。将100微升无血清DMEM加入8微升慢病毒转染试剂，轻轻混合。以每孔为例，将无血清DMEM吸于管中，将1μg vsvg、1μg plp1、 1μg plp2,、3μg目的质粒打入其中，振荡混匀，静置5min。以每孔为例，将无血清DMEM 先逐个吸于管中，加入转染试剂Exfect2000，静置5min。将(6)加入(7)中混合，上下颠倒混匀，室温放置10min，用枪头转圈均匀滴加混合液进入六孔板中每个孔中。摇匀放入细胞培养箱中培养。6h后贴六孔板的板壁缓慢地换液，操作时轻拿轻放。换液48h后收一次病毒，先在管子上标记好病毒名称，将上清液吸至灭菌后的EP管中，移至4℃冰箱中存放(长时间放在4℃会降低慢病毒的感染效率)，-80℃冰箱中可长期存储。
具体的，所述S2中的慢病毒转染为：将细胞，按传代方法，将其消化离心收集后重新悬浮细胞。血细胞计数板计数。于-80℃冰箱取出制备好的慢病毒，使用0.45μm的滤膜滤除将细胞碎片，再吸出1ml的慢病毒均匀打入到六孔板中。将1ml病毒和1×105细胞悬液混匀后，添加新鲜的DMEM细胞培养液，补至2ml，再添加2μl polybrene以增强病毒的感染效率。72h换液，再添加2μl的2mg/ml的puromycin，筛选细胞，缓速混匀后。加入puromycin 48h后观察细胞存活率和细胞密度，等六孔板中细胞密度至75％，把细胞扩大培养，留种冻存。
具体的，所述S3中的免疫印迹试验具体的为：
(1)将细胞密度达到80％-90％的细胞取出放置在冰上，用冰箱拿出的1×PBS沿皿壁冲洗细胞3次，缓慢地注意不要将细胞冲起；向培养皿中总共加入300μl-500μl冰箱里预冷的NP40裂解液，分两次加入，将细胞放置于冰上1-2min等待裂解，刮刀或者枪头刮下，吸到1.5ml的EP管中；在4℃冷库中剧烈的振荡，振荡时间分别为5min，10min，20min，用旋转混合器进行旋转促进细胞充分裂解，在此过程中通过将基因组DNA打断；20min 时的震荡后，换入新的EP管中，将其放入提前预冷的4℃离心机中，12000rpm，离心30min；留上清到新的EP管中；
(2)将牛血清白蛋白稀释为1μg/μl；配BCA蛋白浓度测定试剂混匀，避光放置；所有蛋白待测液均设定3个重复组，每孔10μl蛋白待测液；在96孔板第一排中滴加10 μl1μg/μl的牛血清白蛋白和100μlAB显色液，第二排添加10μlNP40蛋白裂解液和100 μlAB显色液，做空白对照；96孔板中第三排开始加入蛋白待测液，10μl样品加100μlAB 混合液，37℃放置1个小时；OD570测定蛋白样品的浓度；计算蛋白待测液浓度。随后以 1:4添加5×SDS-PAGELoadingBuffer，在沸水中，插在漂子上煮3min，随后将其保存在-20℃冰箱中；
(3)所用的SDS-PAGE 8％、10％和15％分离胶与浓缩胶的配方见表一和表二，制胶完成后，放入电泳槽，并将电泳液倒进电泳槽，蛋白质样品置于沸水中，插在漂子上煮 2-3min，去梳子，点上蛋白Marker，每个空的上样量及点样体积需要保持一致；恒压80V 至跑入分离胶，转恒压100V电泳，观察marker位置，及时结束电泳；电泳停止之后，剥离胶，把分离胶放入盛有预冷的TransferBuffer(TB)的托盘中；
(4)裁一张和分离胶差不多的NC膜(或PVDF膜)和4张滤纸，膜太大容易形成气泡；把NC膜(用甲醇提前浸泡PVDF膜)、滤纸、海绵垫和分离胶置于盛有预冷 TransferBuffer托盘中充分浸泡，玻璃棒先赶海绵垫里的气泡；按照顺序依次是：转印板红面(阳极)和海绵垫、2层滤纸、膜、凝胶、2层滤纸、海绵垫、转印板黑面(阴极)，此过程应用玻璃棒缓慢赶去气泡；添加预冷的TB缓冲液至转膜槽中，加入转子，放入冰盒，放在磁力搅拌器上，保证不会局部温度高；通电后，在转膜槽周围放入大量碎冰；恒流300mA转膜1-3h；转膜结束后，小心地取出NC膜(或PVDF膜)；
(5)封闭：将NC膜(或PVDF膜)加入封闭液(50mlTBST+5％脱脂牛奶)放置摇床摇摆，常温3h摇晃封闭或者4℃过夜缓慢摇晃封闭；
(6)一抗孵育：1:1000稀释一抗(5％脱脂牛奶+1×TBST)，膜浸泡其中；把NC膜(或PVDF膜)放在4℃冷库，置于摇床上缓慢摇晃，过夜；取出NC膜(或PVDF膜)，用WashingBuffer摇晃清洗3次，以便洗去残留抗体，每次10min。
(7)二抗孵育：用5％脱脂奶粉溶于WashingBuffer来稀释1:10000二抗；摇床常温孵育1h；取出NC膜(或PVDF膜)，用WashingBuffer摇晃清洗3次，以便洗去残留抗体，每次10min；
(8)曝光检测：把NC膜(或PVDF膜)放置干净保鲜膜上，按Tanon说明书配置显色液，A液、B液等比例混合(避光放置)，均匀的滴加在NC膜上(或PVDF膜)静置2min后，曝光检测。
本发明的有益效果：
本发明一种利用突变体使MGP Variant 1对乳腺癌细胞EMT的促进功能丧失的方法，使原本MGP Variant1对乳腺癌细胞EMT进程的促进功能丧失；MGP Variant1，通过瞬时转染或慢病毒转染进入乳腺癌细胞里，收集细胞株并提取总蛋白，对EMT重要标志物进行Western blot检测，发现Variant1对EMT进程有显著的促进作用。本发明构建的可稳定转染的突变体，可以消除MGP Variant1对乳腺癌细胞EMT上进程的促进功能，适合推广使用。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1为本发明提供的一种利用突变体使MGP Variant 1对乳腺癌细胞EMT的促进功能丧失的方法的流程图；
图2为本发明的前期数据支持MGP Variant1对EMT进程有明显促进作用
图3为本发明的前期数据支持MGP Variant1对伪足有明显促进作用；
图4为本发明的前期数据支持MGP Variant1对细胞增殖促进作用；
图5为本发明的MGP Variant1突变体使MGP Variant1对乳腺癌EMT的促进作用丧失。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
如图1所示，本发明的一种利用突变体使MGP Variant 1对乳腺癌细胞EMT的促进功能丧失的方法，包括以下步骤：
S1、细胞培养；使用DMEM培养液培养细胞；具体的包括以下步骤：
a、将-80℃冰箱或液氮罐里的HEK293FT细胞，最快速度放入37℃的恒温水浴锅中，尽可能在2min内迅速晃动融化；然后将1ml新鲜的DMEM细胞培养液与冻存管中的细胞，用枪头混匀在离心管中；随后放入1000rpm的离心机中3min进行离心；用枪头小心吸净上层的冻存液废液，加入1ml新鲜DMEM细胞培养液，悬浮细胞；向细胞培养皿中加入4ml新鲜DMEM培养液，将悬浮细胞打入细胞培养皿中，置于细胞培养箱中进行培养；
b、用酒精将所有拿进去的物品消毒后放进生物安全柜；吸去废液，随即用枪头吸取 5mlPBS，沿培养皿壁缓慢加入，摇匀后吸去废液；加入适量胰酶，摇匀后放回培养箱中；根据不同细胞调整胰酶反应的时间，进行消化反应，时间为3-5min，消化不完全的适当增加消化时间；消化完全后，将1ml新鲜的DMEM培养液沿培养皿壁打入，冲洗几遍，胰酶消化反应停止，并将细胞充分冲下，放入1000rpm的离心机中离心3min；吸去上清，向离心管中添加1ml新鲜的DMEM培养液，重新悬浮细胞，换到新的细胞培养皿中培养。
c、移出上清，加入适量的10％DMSO+90％DMEM细胞培养液组成的细胞冻存液，温和地将细胞沉淀吹打均匀；随即将细胞悬浮液进行分装，用枪头吸取1ml细胞悬浮液打入1.5ml冻存管；冻存管放入泡沫盒里，胶带封好放入-80℃冰箱，48h后，再放入液氮罐中进行长期冻存；
S2、细胞瞬时转染；
S3、免疫印迹试验：提取细胞的总蛋白，对提取的总蛋白进行蛋白质浓度测定，然后进行电泳，电泳完成之后进行转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育，最后进行曝光检测，使构建的突变体，消除MGPVariant1对乳腺癌细胞EMT上进程的促进功能。
具体的，所述S2中的瞬时转染为：在六孔板中种293T细胞，每孔3×105个细胞，分散均匀后培养，细胞长至约50％；转染试剂阳离子Exfect2000与无血清的DMEM培养液充分混匀，放置5min；目的质粒与无血清的DMEM培养液充分混匀，放置5min；将目的质粒与无血清的DMEM培养液混匀的培养液加入转染试剂阳离子Exfect2000与无血清的 DMEM培养液的培养液中，涡旋震荡10s，简单离心，室温孵育10min；将孵育中的阳离子复合物转圈滴加进六孔板中，6h后吸去培养液换新鲜DMEM细胞培养液；转染2-4天后收集细胞。
具体的，所述S2中的制备慢病毒为：六孔板中，每孔添加1μl polylysine(多聚赖氨酸)及1ml PBS，进行包板，使HEK293FT细胞更易贴壁。显微镜观察，HEK293FT在对数期生长时。种细胞，大致每孔细胞数为8×105个细胞。添加新鲜的DMEM培养液，六孔板每孔培养液不超过2ml，把六孔板放置于细胞培养箱中过夜培养。12h后，HEK293FT 约75％左右细胞密度至时开始制备慢病毒。将100微升无血清DMEM加入8微升慢病毒转染试剂，轻轻混合。以每孔为例，将无血清DMEM吸于管中，将1μg vsvg、1μg plp1、 1μg plp2,、3μg目的质粒打入其中，振荡混匀，静置5min。以每孔为例，将无血清DMEM 先逐个吸于管中，加入转染试剂Exfect2000，静置5min。将(6)加入(7)中混合，上下颠倒混匀，室温放置10min，用枪头转圈均匀滴加混合液进入六孔板中每个孔中。摇匀放入细胞培养箱中培养。6h后贴六孔板的板壁缓慢地换液，操作时轻拿轻放。换液48h后收一次病毒，先在管子上标记好病毒名称，将上清液吸至灭菌后的EP管中，移至4℃冰箱中存放(长时间放在4℃会降低慢病毒的感染效率)，-80℃冰箱中可长期存储。
具体的，所述S2中的慢病毒转染为：将细胞，按传代方法，将其消化离心收集后重新悬浮细胞。血细胞计数板计数。于-80℃冰箱取出制备好的慢病毒，使用0.45μm的滤膜滤除将细胞碎片，再吸出1ml的慢病毒均匀打入到六孔板中。将1ml病毒和1×105细胞悬液混匀后，添加新鲜的DMEM细胞培养液，补至2ml，再添加2μl polybrene以增强病毒的感染效率。72h换液，再添加2μl的2mg/ml的puromycin，筛选细胞，缓速混匀后。加入puromycin 48h后观察细胞存活率和细胞密度，等六孔板中细胞密度至75％，把细胞扩大培养，留种冻存。
具体的，所述S3中的免疫印迹试验具体的为：
(1)将细胞密度达到80％-90％的细胞取出放置在冰上，用冰箱拿出的1×PBS沿皿壁冲洗细胞3次，缓慢地注意不要将细胞冲起；向培养皿中总共加入300μl-500μl冰箱里预冷的NP40裂解液，分两次加入，将细胞放置于冰上1-2min等待裂解，刮刀或者枪头刮下，吸到1.5ml的EP管中；在4℃冷库中剧烈的振荡，振荡时间分别为5min，10min，20min，用旋转混合器进行旋转促进细胞充分裂解，在此过程中通过将基因组DNA打断；20min 时的震荡后，换入新的EP管中，将其放入提前预冷的4℃离心机中，12000rpm，离心30min；留上清到新的EP管中；
(2)将牛血清白蛋白稀释为1μg/μl；配BCA蛋白浓度测定试剂混匀，避光放置；所有蛋白待测液均设定3个重复组，每孔10μl蛋白待测液；在96孔板第一排中滴加10μl1μg/μl的牛血清白蛋白和100μlAB显色液，第二排添加10μlNP40蛋白裂解液和100μlAB显色液，做空白对照；96孔板中第三排开始加入蛋白待测液，10μl样品加100μlAB混合液，37℃放置1个小时；OD570测定蛋白样品的浓度；计算蛋白待测液浓度。随后以1:4添加 5×SDS-PAGELoadingBuffer，在沸水中，插在漂子上煮3min，随后将其保存在-20℃冰箱中；
(3)所用的SDS-PAGE 8％、10％和15％分离胶与浓缩胶的配方见表一和表二，制胶完成后，放入电泳槽，并将电泳液倒进电泳槽，蛋白质样品置于沸水中，插在漂子上煮2-3min，去梳子，点上蛋白Marker，每个空的上样量及点样体积需要保持一致；恒压80V 至跑入分离胶，转恒压100V电泳，观察marker位置，及时结束电泳；电泳停止之后，剥离胶，把分离胶放入盛有预冷的TransferBuffer(TB)的托盘中；
(4)裁一张和分离胶差不多的NC膜(或PVDF膜)和4张滤纸，膜太大容易形成气泡；把NC膜(用甲醇提前浸泡PVDF膜)、滤纸、海绵垫和分离胶置于盛有预冷 TransferBuffer托盘中充分浸泡，玻璃棒先赶海绵垫里的气泡；按照顺序依次是：转印板红面(阳极)和海绵垫、2层滤纸、膜、凝胶、2层滤纸、海绵垫、转印板黑面(阴极)，此过程应用玻璃棒缓慢赶去气泡；添加预冷的TB缓冲液至转膜槽中，加入转子，放入冰盒，放在磁力搅拌器上，保证不会局部温度高；通电后，在转膜槽周围放入大量碎冰；恒流300mA转膜1-3h；转膜结束后，小心地取出NC膜(或PVDF膜)；
(5)封闭：将NC膜(或PVDF膜)加入封闭液(50mlTBST+5％脱脂牛奶)放置摇床摇摆，常温3h摇晃封闭或者4℃过夜缓慢摇晃封闭；
(6)一抗孵育：1:1000稀释一抗(5％脱脂牛奶+1×TBST)，膜浸泡其中；把NC膜 (或PVDF膜)放在4℃冷库，置于摇床上缓慢摇晃，过夜；取出NC膜(或PVDF膜)，用WashingBuffer摇晃清洗3次，以便洗去残留抗体，每次10min。
(7)二抗孵育：用5％脱脂奶粉溶于WashingBuffer来稀释1:10000二抗；摇床常温孵育1h；取出NC膜(或PVDF膜)，用WashingBuffer摇晃清洗3次，以便洗去残留抗体，每次10min；
(8)曝光检测：把NC膜(或PVDF膜)放置干净保鲜膜上，按Tanon说明书配置显色液，A液、B液等比例混合(避光放置)，均匀的滴加在NC膜上(或PVDF膜)静置2min后，曝光检测。
Figure RE-GDA0002596882440000091
表一
Figure RE-GDA0002596882440000092
表二
免疫荧光实验为：
(1)在实验前两天，在6孔板中放入灭过菌的24mm×24mm的盖玻片，随即加入 1ml灭过菌的1×PBS，再加入1μl polybrene，包板，使细胞贴壁更牢固。
(2)将所需要的的细胞进行传代，每孔加入2×10 4个细胞，待到细胞贴壁且形态良好时，处理细胞。
(3)弃培养基，快速的用提前放在37℃的预温1×PBS洗两遍。
(4)每孔使用1ml的37℃的4％的多聚甲醛，30min常温固定，低速摇晃。
(5)吸走多聚甲醛，用PBS低速摇晃洗3乘10min。
(6)弃PBS，每孔加1ml 0.5％的Triton X-100，覆盖细胞，常温20min，低速摇晃。
(7)弃Triton X-100，PBS洗2遍，每次10min，
(8)弃PBS，每孔加1ml 100mM的甘氨酸，室温15min。
(9)PBS洗2次，每次5min。
(10)3％BSA封闭1h，常温静置。
(11)在载玻片上滴加200μl的罗丹明标记的鬼笔环肽(终浓度为200nM)，防止滴落，常温避光静置30min。
(12)PBS洗3次，每次5min。
(13)加入200μl的DAPI溶液(终浓度100nM)，染细胞核，常温避光静置1 h。
(14)PBS洗3次，每次5min。
(15)将一滴透明的抗荧光猝灭剂添加至载玻片，并将盖玻片相继扣在载玻片上。
指甲油永久封片，并避光保持在摄氏4度。
(16)激光共聚焦观察。
MTT试验为：
(1)准备实验所用的70-90％细胞密度的MDA-MB-231和T47D，移去培养液并洗涤，废液打入废液缸。
(2)按分细胞的步骤消化收集细胞。
(3)弃尽废液，添加5ml培养液用枪头缓缓地吹打匀细胞使其混匀。
(4)细胞计数。
(5)计算MDA-MB-231和T47D相关细胞浓度。
(6)调整细胞浓度使24孔板中每孔含5×10 3个细胞，设置3个同样实验组，再添加新鲜的DMEM使得24孔板总体系为600μl，重复铺种5个板，摇匀后置于细胞培养箱中培养。
(7)种板后，连续5天每天取出一个24孔板，添加2mg/ml的MTT 100μl溶液后，黑暗培养箱培养4h。取出后，避光换液并添加200μl的DMSO，常温避光摇床孵育30min，用酶标仪检测OD 490值。
(8)重板时应多加一个96孔板，6h后，贴壁后立即加MTT，后加DMSO，测 OD 490值作为标准。
由Western blotting结果可知，MGP Variant1对乳腺癌细胞EMT的促进作用更明显。
由免疫荧光结果观察可知：在转染了pCDH-MGP-V1-HA、pCDH-MGP-V2-HA的 MDA-MB-231、T47D之后，细胞的骨架发生了不一样的改变。过表达Variant1的细胞中伪足的数量、宽度及亮度均有更明显的促进作用。
由MTT分析对乳腺癌细胞增殖能力的影响：通过MTT实验，Variant1转录本在增殖中发挥着主要作用。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施方式和说明书中的描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入本发明要求保护的范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (5)

1.一种利用突变体使MGP Variant 1对乳腺癌细胞EMT的促进功能丧失的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、细胞培养；使用DMEM培养液培养细胞；具体的包括以下步骤：
a、将-80℃冰箱或液氮罐里的HEK293FT细胞，最快速度放入37℃的恒温水浴锅中，尽可能在2min内迅速晃动融化；然后将1ml新鲜的DMEM细胞培养液与冻存管中的细胞，用枪头混匀在离心管中；随后放入1000rpm的离心机中3min进行离心；用枪头小心吸净上层的冻存液废液，加入1ml新鲜DMEM细胞培养液，悬浮细胞；向细胞培养皿中加入4ml新鲜DMEM培养液，将悬浮细胞打入细胞培养皿中，置于细胞培养箱中进行培养；
b、用酒精将所有拿进去的物品消毒后放进生物安全柜；吸去废液，随即用枪头吸取5mlPBS，沿培养皿壁缓慢加入，摇匀后吸去废液；加入适量胰酶，摇匀后放回培养箱中；根据不同细胞调整胰酶反应的时间，进行消化反应，时间为3-5min，消化不完全的适当增加消化时间；消化完全后，将1ml新鲜的DMEM培养液沿培养皿壁打入，冲洗几遍，胰酶消化反应停止，并将细胞充分冲下，放入1000rpm的离心机中离心3min；吸去上清，向离心管中添加1ml新鲜的DMEM培养液，重新悬浮细胞，换到新的细胞培养皿中培养；
c、移出上清，加入适量的10％DMSO+90％DMEM细胞培养液组成的细胞冻存液，温和地将细胞沉淀吹打均匀；随即将细胞悬浮液进行分装，用枪头吸取1ml细胞悬浮液打入1.5ml冻存管；冻存管放入泡沫盒里，胶带封好放入-80℃冰箱，48h后，再放入液氮罐中进行长期冻存；
S2、细胞瞬时转染，制备慢病毒，慢病毒转染；
S3、免疫印迹试验：提取细胞的总蛋白，对提取的总蛋白进行蛋白质浓度测定，然后进行电泳，电泳完成之后进行转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育，最后进行曝光检测，以MGPVariant 1为对照，确认构建的突变体可以消除MGP Variant1对乳腺癌细胞EMT进程的促进功能。
2.根据权利要求1所述的一种利用突变体使MGP Variant 1对乳腺癌细胞EMT的促进功能丧失的方法，其特征在于：所述S2中的瞬时转染为：在六孔板中种293T细胞，每孔3×105个细胞，分散均匀后培养，细胞长至约50％；转染试剂阳离子Exfect2000与无血清的DMEM培养液充分混匀，放置5min；目的质粒与无血清的DMEM培养液充分混匀，放置5min；将目的质粒与无血清的DMEM培养液混匀的培养液加入转染试剂阳离子Exfect2000与无血清的DMEM培养液的培养液中，涡旋震荡10s，简单离心，室温孵育10min；将孵育中的阳离子复合物转圈滴加进六孔板中，6h后吸去培养液换新鲜DMEM细胞培养液；转染2-4天后收集细胞。
3.根据权利要求1所述的一种利用突变体使MGP Variant 1对乳腺癌细胞EMT的促进功能丧失的方法，其特征在于：所述S2中的制备慢病毒为：六孔板中，每孔添加1μlpolylysine(多聚赖氨酸)及1ml PBS，进行包板，使HEK293FT细胞更易贴壁；显微镜观察，HEK293FT在对数期生长时；种细胞，大致每孔细胞数为8×105个细胞；添加新鲜的DMEM培养液，六孔板每孔培养液不超过2ml，把六孔板放置于细胞培养箱中过夜培养；12h后，HEK293FT约75％左右细胞密度至时开始制备慢病毒；将100微升无血清DMEM加入8微升慢病毒转染试剂，轻轻混合；以每孔为例，将无血清DMEM吸于管中，将1μg vsvg、1μg plp1、1μgplp2,、3μg目的质粒打入其中，振荡混匀，静置5min；以每孔为例，将无血清DMEM先逐个吸于管中，加入转染试剂Exfect2000，静置5min；将加入质粒的无血清DMEM与加入转染试剂Exfect2000的无血清DMEM混合，上下颠倒混匀，室温放置10min，用枪头转圈均匀滴加混合液进入六孔板中每个孔中；摇匀放入细胞培养箱中培养；6h后贴六孔板的板壁缓慢地换液，操作时轻拿轻放；换液48h后收一次病毒，先在管子上标记好病毒名称，将上清液吸至灭菌后的EP管中，移至4℃冰箱中存放，-80℃冰箱中可长期存储。
4.根据权利要求1所述的一种利用突变体使MGP Variant 1对乳腺癌细胞EMT的促进功能丧失的方法，其特征在于：所述S2中的慢病毒转染为：将细胞，按传代方法，将其消化离心收集后重新悬浮细胞；血细胞计数板计数；于-80℃冰箱取出制备好的慢病毒，使用0.45μm的滤膜滤除将细胞碎片，再吸出1ml的慢病毒均匀打入到六孔板中；将1ml病毒和1×105细胞悬液混匀后，添加新鲜的DMEM细胞培养液，补至2ml，再添加2μl polybrene以增强病毒的感染效率；72h换液，再添加2μl的2mg/ml的puromycin，筛选细胞，缓速混匀后；加入puromycin 48h后观察细胞存活率和细胞密度，等六孔板中细胞密度至75％，把细胞扩大培养，留种冻存。
5.根据权利要求1所述的一种利用突变体使MGP Variant 1对乳腺癌细胞EMT的促进功能丧失的方法，其特征在于：所述S3中的免疫印迹试验具体的为：
(1)将细胞密度达到80％-90％的细胞取出放置在冰上，用冰箱拿出的1×PBS沿皿壁冲洗细胞3次，缓慢地注意不要将细胞冲起；向培养皿中总共加入300μl-500μl冰箱里预冷的NP40裂解液，分两次加入，将细胞放置于冰上1-2min等待裂解，刮刀或者枪头刮下，吸到1.5ml的EP管中；在4℃冷库中剧烈的振荡，振荡时间分别为5min，10min，20min，用旋转混合器进行旋转促进细胞充分裂解，在此过程中通过将基因组DNA打断；20min时的震荡后，换入新的EP管中，将其放入提前预冷的4℃离心机中，12000rpm，离心30min；留上清到新的EP管中；
(2)将牛血清白蛋白稀释为1μg/μl；配BCA蛋白浓度测定试剂混匀，避光放置；所有蛋白待测液均设定3个重复组，每孔10μl蛋白待测液；在96孔板第一排中滴加10μl1μg/μl的牛血清白蛋白和100μlAB显色液，第二排添加10μlNP40蛋白裂解液和100μlAB显色液，做空白对照；96孔板中第三排开始加入蛋白待测液，10μl样品加100μlAB混合液，37℃放置1个小时；OD570测定蛋白样品的浓度；计算蛋白待测液浓度；随后以1:4添加5×SDS-PAGELoadingBuffer，在沸水中，插在漂子上煮3min，随后将其保存在-20℃冰箱中；
(3)所用的SDS-PAGE 8％、10％和15％分离胶与浓缩胶的配方见表一和表二，制胶完成后，放入电泳槽，并将电泳液倒进电泳槽，蛋白质样品置于沸水中，插在漂子上煮2-3min，去梳子，点上蛋白Marker，每个空的上样量及点样体积需要保持一致；恒压80V至跑入分离胶，转恒压100V电泳，观察marker位置，及时结束电泳；电泳停止之后，剥离胶，把分离胶放入盛有预冷的TransferBuffer(TB)的托盘中；
(4)裁一张和分离胶差不多的NC膜(或PVDF膜)和4张滤纸，膜太大容易形成气泡；把NC膜(用甲醇提前浸泡PVDF膜)、滤纸、海绵垫和分离胶置于盛有预冷TransferBuffer托盘中充分浸泡，玻璃棒先赶海绵垫里的气泡；按照顺序依次是：转印板红面(阳极)和海绵垫、2层滤纸、膜、凝胶、2层滤纸、海绵垫、转印板黑面(阴极)，此过程应用玻璃棒缓慢赶去气泡；添加预冷的TB缓冲液至转膜槽中，加入转子，放入冰盒，放在磁力搅拌器上，保证不会局部温度高；通电后，在转膜槽周围放入大量碎冰；恒流300mA转膜1-3h；转膜结束后，小心地取出NC膜(或PVDF膜)；
(5)封闭：将NC膜(或PVDF膜)加入封闭液(50mlTBST+5％脱脂牛奶)放置摇床摇摆，常温3h摇晃封闭或者4℃过夜缓慢摇晃封闭；
(6)一抗孵育：1:1000稀释一抗(5％脱脂牛奶+1×TBST)，膜浸泡其中；把NC膜(或PVDF膜)放在4℃冷库，置于摇床上缓慢摇晃，过夜；取出NC膜(或PVDF膜)，用WashingBuffer摇晃清洗3次，以便洗去残留抗体，每次10min；
(7)二抗孵育：用5％脱脂奶粉溶于WashingBuffer来稀释1:10000二抗；摇床常温孵育1h；取出NC膜(或PVDF膜)，用WashingBuffer摇晃清洗3次，以便洗去残留抗体，每次10min；
(8)曝光检测：把NC膜(或PVDF膜)放置干净保鲜膜上，按Tanon说明书配置显色液，A液、B液等比例混合(避光放置)，均匀的滴加在NC膜上(或PVDF膜)静置2min后，曝光检测。
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