JP2012052985A - 蛍光強度補正方法及び蛍光強度算出装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】蛍光波長帯域の重複する複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に光を照射し、励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる光検出器で受光する測定手順と、各光検出器の検出値を補正演算して各蛍光色素からの蛍光強度を算出する際に、算出される蛍光強度値に所定の制約条件を設けて補正演算を行う算出手順と、を含む蛍光強度補正方法を提供する。
【選択図】なし
Description
前記算出手順は、各光検出器の検出値を収集して得られる測定スペクトルを、各蛍光色素を個別に標識した微小粒子で得られる単染色スペクトル及び蛍光色素を標識していない微小粒子で得られる自家蛍光スペクトルの線形和により近似することによって各蛍光色素からの蛍光強度及び自家蛍光強度を算出する手順とできる。微小粒子の自家蛍光成分を含めて演算を行うことにより、サブポピュレーション毎に異なる自家蛍光成分を厳密に演算して、サブポピュレーション間の自家蛍光強度のばらつきに起因する測定誤差を解消できる。
前記制約条件としては、算出される各蛍光色素からの蛍光強度及び自家蛍光強度が所定の最小値、例えば0、以上であるという条件を設定する。この制約条件を設けて補正演算を行うことにより、蛍光色素からの蛍光強度が負値として算出されることに起因する測定誤差や二次元相関図(サイトグラム)上のポピュレーション減少の問題を解決できる。前記制約条件としては、さらに必要に応じて、算出される蛍光強度及び自家蛍光強度が所定の最大値以下であるという条件を加えてもよい。
単染色スペクトル及び自家蛍光スペクトルの線形和による測定スペクトルの近似は最小二乗法を用いて行うことができ、具体的には、下記式で示される評価関数が最小値となるパラメータak(k=1〜M)を求めることにより、各蛍光色素からの蛍光強度及び自家蛍光強度を算出できる。
生体関連微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リポソーム、ミトコンドリア、オルガネラ(細胞小器官)などが含まれる。細胞には、動物細胞(血球系細胞など)および植物細胞が含まれる。微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類などが含まれる。さらに、生体関連微小粒子には、核酸やタンパク質、これらの複合体などの生体関連高分子も包含され得るものとする。また、工業用粒子は、例えば有機もしくは無機高分子材料、金属などであってもよい。有機高分子材料には、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレートなどが含まれる。無機高分子材料には、ガラス、シリカ、磁性体材料などが含まれる。金属には、金コロイド、アルミなどが含まれる。これら微小粒子の形状は、一般には球形であるのが普通であるが、非球形であってもよく、また大きさや質量なども特に限定されない。
1.蛍光強度補正方法
(1)測定手順
(2)算出手順
(2−1)フィッティング演算
(2−1−1)近似曲線
(2−1−2)制約条件
(2−1−3)自家蛍光
(2−2)akの算出方法
(2−2−1)線形最小二乗法
(2−2−2)正規方程式
(2−2−3)特異値分解
2.蛍光強度算出装置
本発明に係る蛍光強度補正方法は、以下の2つの手順を含む。
測定手順:蛍光波長帯域の重複する複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に光を照射し、励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる光検出器で受光する手順。
算出手順:各光検出器の検出値を補正演算して各蛍光色素からの蛍光強度を算出する際に、算出される蛍光強度値に所定の制約条件を設けて補正演算を行う手順。
まず、測定対象とする微小粒子を複数の蛍光色素を用いて多重標識する。微小粒子の蛍光色素標識は従来公知の手法によって行うことができる。例えば測定対象を細胞とする場合には、細胞表面分子に対する蛍光標識抗体と細胞とを混合し、細胞表面分子に抗体を結合させる。蛍光標識抗体は、抗体に直接蛍光色素を結合させたものであってよく、ビオチン標識した抗体にアビジンを結合した蛍光色素をアビジン・ビオチン反応によって結合させたものであってもよい。また、抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってよい。
算出手順においては、測定手順で取得された各光検出器の検出値を補正演算して各蛍光色素からの蛍光強度を算出する。この際、本発明に係る蛍光強度補正方法では、算出される蛍光強度が所定の最小値以上であるという制約条件下で補正演算を行う。
(2−1−1)近似曲線
フィッティング演算では、測定スペクトルを単染色スペクトルの線形和により近似することにより、各蛍光色素からの真の蛍光強度を算出する。この際、単染色スペクトルに自家蛍光スペクトルも加えて、これらの線形和による近似を行ってもよい。「測定スペクトル」とは、蛍光波長帯域の重複する複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に光を照射することによって励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる光検出器で受光し、各光検出器から検出値を収集して得られるものである。また、「単染色スペクトル」とは、各蛍光色素の蛍光波長分布であり、各蛍光色素を個別に標識した微小粒子に光を照射することによって励起された蛍光色素から発生する蛍光を光検出器で受光し、検出値を収集して得られるものである。さらに、「自家蛍光スペクトル」とは、微小粒子そのものが発する蛍光の波長分布であり、蛍光色素を標識していない微小粒子に光を照射することによって微小粒子から発生する蛍光を光検出器で受光し、検出値を収集して得られるものである。上記の測定スペクトルのスペクトル成分には、自家蛍光スペクトルが含まれ得る。
測定スペクトルのスペクトル成分には、自家蛍光スペクトルが含まれ得る。従って、測定スペクトルの線形和による近似は、単染色スペクトルに加えて自家蛍光スペクトルも加えて行ってもよい。自家蛍光スペクトルは、測定の都度に蛍光色素を標識していないサンプルを調製して取得してもよく、あるいは予め記憶された標準スペクトルを利用してもよい。微小粒子の自家蛍光に起因した検出値を含めて演算を行う場合、上記式(1)において、基底関数XM(x1)の定義に、蛍光色素の単染色スペクトルを表す曲線に加えて、自家蛍光スペクトルを表す曲線を含める。自家蛍光スペクトルは、微小粒子のサブポピュレーション毎に異なる可能性があるため、サンプルに複数のサブポピュレーションが含まれる場合には、サブポピュレーション毎に設定した複数の基底関数XM(x)を用いる。
この式(1)で示される近似曲線は、後述する線形最小二乗法を用いてakを求めることにより得られる。このakは、各蛍光色素の真の蛍光強度あるいは微小粒子の自家蛍光強度に同等であり、物理的に負値にはなり得ない値である。そこで、本発明に係る蛍光強度補正方法では、このakについて、所定の最小値以上であるという制約条件(下限値条件)を設けて補正演算を行う。制約条件の最小値は、具体的には、各蛍光色素の蛍光強度あるいは微小粒子の自家蛍光強度は負値になり得ないことから、0を用いることができる。さらに、最小値には、0よりも大きい値を用いてもよい。加えて、akについて、所定の最大値よりも小さいという第二の制約条件(上限値条件)をさらに設けて補正演算を行うこともできる。
(2−2−1)線形最小二乗法
以下に、akを求めるための具体的な手順を説明する。ここでは、測定スペクトルを単染色スペクトルのみの線形和により近似する場合を説明するが、この手順は、自家蛍光スペクトルも加えて近似する場合にも適用が可能である。まず、下記式(2)で示される評価関数(カイ二乗)を定義する。そして、この式(2)が最小値となるようなパラメータak(k=1〜M)を求める。
次に、下記式(3)の要素から構成されるN×M行例A(図2参照)と、長さNのベクトルb(下記式(4))を定義し、当てはめにより得たM個のパラメータa1〜aMを並べたベクトルをaとおく。
上記の正規方程式を用いた方法に替えて特異値分解により、M個のパラメータa1〜aMを並べたベクトルaを求めても良い。
本発明に係る蛍光強度算出装置は、従来のフローサイトメータ等と同様に流体系と光学系、分取系、データ処理系などから構成される。
Claims (7)
- 蛍光波長帯域の重複する複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に光を照射し、励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる光検出器で受光する測定手順と、
各光検出器の検出値を補正演算して各蛍光色素からの蛍光強度を算出する際に、算出される蛍光強度値に所定の制約条件を設けて補正演算を行う算出手順と、を含む蛍光強度補正方法。 - 前記算出手順において、各光検出器の検出値を収集して得られる測定スペクトルを、各蛍光色素を個別に標識した微小粒子で得られる単染色スペクトル及び蛍光色素を標識していない微小粒子で得られる自家蛍光スペクトルの線形和により近似することによって各蛍光色素からの蛍光強度及び自家蛍光強度を算出する請求項1記載の蛍光強度補正方法。
- 前記制約条件として、算出される各蛍光色素からの蛍光強度及び自家蛍光強度が所定の最小値以上であるという条件を設定する請求項1又は2記載の蛍光強度補正方法。
- 前記制約条件として、さらに、算出される各蛍光色素からの蛍光強度及び自家蛍光強度が所定の最大値以下であるという条件を設定する請求項3記載の蛍光強度補正方法。
- 前記算出手順において、単染色スペクトル及び自家蛍光スペクトルの線形和による測定スペクトルの近似を、最小二乗法を用いて行う請求項4記載の蛍光強度補正方法。
- 蛍光波長帯域の重複する複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に光を照射し、励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる光検出器で受光する測定手段と、
各光検出器の検出値を補正演算して各蛍光色素からの蛍光強度を算出する際に、算出される蛍光強度値に所定の制約条件を設けて補正演算を行う算出手段と、を含む蛍光強度算出装置。
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