JP2009109218A - 微小粒子の光学的測定方法及び光学的測定装置 - Google Patents

微小粒子の光学的測定方法及び光学的測定装置 Download PDF

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Abstract

【課題】輝度レベルの差が大きい複数の蛍光又は散乱光を検出する場合でも、蛍光補正及びデータ解析における精度が高く、信頼性が高い測定が可能で、かつレーザ光による微小粒子のダメージ及び変質を低減することができる微小粒子の光学的測定方法及び光学的測定装置を提供する。
【解決手段】流路２内を一列になって通流する微小粒子３に、光照射部４からパルスレーザ光５を、パルス強度を変調しながら照射することにより、１つの微小粒子に対して、同一波長のレーザ光を複数回照射する。そして、レーザ光５によって微小粒子３から発せられた蛍光及び／又は散乱光１０を、検出部１１で検出する。このとき、検出部９に設けられた光検出器１１の感度は固定しておく。
【選択図】図１

Description

本発明は、細胞及びマイクロビーズ等の微小粒子を個別に識別するための微小粒子の光学的測定方法及び光学的測定装置に関する。より詳しくは、特定波長のレーザ光が照射されたときに微小粒子から発せられる蛍光又は散乱光から微小粒子の種類を識別する技術に関する。
一般に、細胞、微生物及びリポソーム等の生体関連微小粒子を識別する場合は、フローサイトメトリー（フローサイトメーター）を用いた光学的測定方法が利用されている（例えば、非特許文献１参照。）。フローサイトメトリーは、流路内を１列になって通流する微小粒子に特定波長のレーザ光を照射し、各微小粒子から発せられた蛍光又は散乱光を検出することで、複数の微小粒子を１個ずつ識別する方法である。
具体的には、フローセル内において、測定対象の微小粒子を含むサンプル液と、その周囲を流れるシース（鞘）液とで層流を形成し、更に、サンプル液とシース液との間にわずかな圧力差を生じさせることで、サンプル液中に含まれる複数の微小粒子を１列に並べる。その状態でフローセルにレーザ光を照射すると、微小粒子がレーザービームを横切るように１個ずつ通過する。このとき、レーザ光により励起されて各微小粒子から発せられた蛍光及び／又は散乱光を、電気光学検出器を用いて測定する。
そして、検出した光を電気的信号に変換して数値化し、統計解析を行うことにより、個々の微小粒子の種類、大きさ及び構造等を判定する。なお、測定対象の微小粒子を複数の蛍光色素で修飾すると、光学フィルタにより波長域別に分離しても、各検出器に目的以外の蛍光色素からの蛍光が漏れ込むことがある。このため、従来の測定方法では、一般に、目的とする蛍光からのデータのみを得るため、蛍光が重なり合った部分を差し引く蛍光補正が行われている。
また、フローサイトメトリーでは、微小粒子の種類、大きさ及び構造等を個別に識別すると共に、複数のパラメータを１度に解析することができるため、サンプル液中に複数種の微小粒子が含まれている場合でも、必要なものだけを迅速にかつ確実に分取することができる。
更に、従来、複数の蛍光色素で修飾された微小粒子から発せられる複数の蛍光を検出可能にするため、互いに異なる波長のレーザ光を同一の入射光路上に導光し、照射するフローサイトメーターも提案されている（特許文献１参照）。図１２は特許文献１に記載の従来のフローサイトメーターの構成を模式的に示す図である。図１２に示すように、特許文献１に記載のフローサイトメーター１０１は、蛍光色素で修飾された細胞をフローセル内で１列に配列するための流体（フロー）系１０２と、各細胞に波長の異なる複数のレーザ光を照射し、散乱光及び蛍光等の検出対象光を検出するための光学系１０３と、光学系１０３から出力された散乱光及び蛍光に関する電気信号を制御・処理する信号処理装置１０４とで構成されている。
この従来のフローサイトメーター１０１では、光源１０６ａ，１０６ｂ，１０６ｃから互いに異なる波長を有する複数のレーザ光を、所定の周期及び互いに異なる位相で照射し、更に、導光部材１０７によりこの複数のレーザ光を同一の入射光路上に導光して、細胞１０５に集光している。これにより、複数の蛍光色素により標識された細胞に対して、複数のレーザ光を照射する場合でも、入射光路を１つにすることができるため、細胞から発せられた複数の蛍光を、遅延時間を設定することなく検出することができる。
更にまた、再生医療・移植等に利用可能な生きた細胞を分取するため、蛍光色素を結合させた抗体等のプローブを用いた蛍光標識を行わずに、目的の細胞を分離・分取する方法も提案されている（特許文献２参照）。この特許文献２に記載の方法では、細胞から発せられた前方散乱光と側方散乱光とを測定し、その測定値を二次元画面上に位置情報として表示することで、細胞の大きさ及び構造を識別している。
特開２００７−０４６９４７号公報 特開２００３−３０４８６７号公報 中内啓光監修，「細胞工学別冊 実験プロトコルシリーズ フローサイトメトリー自由自在」，第２版，株式会社秀潤社，２００６年８月３１日発行
しかしながら、前述した従来の測定方法及び測定装置には、以下に示す問題点がある。即ち、従来の測定方法における第１の問題点は、各微小粒子から発せられる蛍光又は散乱光の強度にばらつきが生じると、前述した蛍光補正及びその結果に基づき行われるデータ解析の精度が低下することである。
例えば、検出された蛍光又は散乱光の輝度レベルに３桁以上の差がある場合、前述した特許文献１に記載された方法で測定すると、輝度レベルが低いものでは、ノイズレベルに信号が埋もれてしまい、また、輝度レベルが高いものでは、信号が飽和してしまう。特に、複数のアノード（光検出器）に対して、制御電圧が１つしか設定できない場合は、上記問題はより顕著になる。
そこで、従来、蛍光又は散乱光の輝度レベルが高いものを測定する場合は、励起光であるレーザ光の強度、及びＰＭＴ（Photo-Multiplier Tube；光電子増倍管）等の光検出器の感度を、信号レベルが飽和しない値に設定している。これにより、蛍光又は散乱光の輝度レベルが高いものについての解析精度は向上するが、その一方で、輝度レベルが低いものは、出力波形がより小さくなるため、蛍光出力信号の解析自体が困難になる。
また、従来の測定方法における第２の問題点は、レーザ照射によって、微小粒子がダメージをうけたり、温度上昇して変質したりすることである。更に、従来の測定方法における第３の問題点は、微小粒子に修飾されている蛍光色素は、温度が高いと微小粒子の表面から脱落してしまい、また、光強度が強いと退色してしまうということである。これらの問題点は、２種以上のレーザ光を照射する場合、及び測定対象の微小粒子が細胞である場合に特に発生しやすい。
一方、特許文献２に記載された発明は、生きた細胞を分取するための技術であるが、この発明は蛍光色素を結合することによる細胞の変質防止を目的としたものであり、レーザ光による影響については何ら考慮されていない。このため、特許文献２に記載の発明は、細胞に従来と同様の方法でレーザ光を照射していると考えられる。従って、特許文献２に記載された方法では、レーザ光による微小粒子のダメージ及び変質を防止することはできない。
そこで、本発明は、輝度レベルの差が大きい複数の蛍光又は散乱光を検出する場合でも、蛍光補正及びデータ解析における精度が高く、信頼性が高い測定が可能で、かつレーザ光による微小粒子のダメージ及び変質を低減することができる微小粒子の光学的測定方法及び光学的測定装置を提供することを主目的とする。
本発明の微小粒子の光学的測定方法は、流路内を通流する微小粒子にレーザ光を照射し、前記微小粒子から発せられた蛍光及び／又は散乱光を検出する光学的測定方法であって、前記レーザ光をパルス状とし、そのパルス強度を変調させることにより、１つの微小粒子に１又は波長が異なる２以上のレーザ光を、強度を変えて複数回照射する。
これにより、波長毎に出力レベルが異なる複数の検出信号が得られるため、いずれかの回で適正レベルの信号が得られる。このため、測定対象の微小粒子から発せられる蛍光及び散乱光の強度が、微小粒子毎又は蛍光色素毎に大きく異なっていても、レーザ光の照射条件又は検出器の感度を個別に調整しなくても、高精度の測定が可能となる。
この光学的測定方法においては、前記微小粒子の通流速度をｘ（ｍ／秒）、前記レーザ光のスポット径をｙ（ｍ）、前記レーザ光の変調回数をｗ（回）、前記レーザ光の波長の数をｎとしたとき、前記レーザ光のパルス幅ｐ（秒）が下記数式１を満たすようにしてもよい。なお、レーザ光のスポット形状は、円形、楕円形、正方形及び長方形等、任意の形状を適用することが可能であり、スポット形状が円形以外の場合は、下記数式１におけるｙは前記微小粒子が通過する方向における距離とする。
Figure 2009109218
また、この光学的測定方法では、検出された蛍光及び／又は散乱光を、前記レーザ光の強度に基づき規格化してもよい。その場合、前記規格化された値から、前記微小粒子の種類及び／又は状態を識別することができる。
更に、前記微小粒子に波長が異なる２以上のレーザ光を、パルス強度を変調させつつ位相時間をずらして照射し、前記微小粒子から発せられた蛍光及び／又は散乱光を前記レーザ光の波長毎に検出してもよい。これにより、単一の励起レーザ光による光信号のみを検出できるため、複数のレーザ光を同時に照射する場合に比べて蛍光補正が容易となる。
そして、前記微小粒子が２以上の蛍光色素で修飾されている場合には、一のレーザ光を照射したときに検出された蛍光又は散乱光を、この一のレーザ光で励起されない蛍光色素の参照スペクトルを零として、逆行列解析することができる。これにより、蛍光補正のための逆行列解析の数値計算が単純になり、処理時間を短縮することができる。
更にまた、この光学的測定方法では、前記レーザ光を櫛形状の超短パルスレーザ光としてもよい。これにより、測定対象の微小粒子に与える光ダメージをより低減できると共に、微小粒子が加熱されにくくなる。
その場合、予め、測定対象の微小粒子が破壊される温度及び／又は光強度を測定しておき、その結果に応じて、前記パルスレーザ光の照射強度、照射時間、照射波形、パルス比率、位相、パルス幅及びパルス形状のうちの少なくとも１種の条件を調整することができる。なお、ここでいう「パルス比率」とは、周期に対するパルス幅の比率である。
本発明に係る微小粒子の光学的測定装置は、流路内を通流する微小粒子にレーザ光を照射する光照射部と、前記レーザ光が照射された微小粒子から発せられる蛍光及び／又は散乱光を検出する光検出部と、を有し、前記光照射部からパルス強度を変調させながらパルスレーザを照射し、１つの微小粒子に１又は波長が異なる２以上のレーザ光を、強度を変えて複数回照射するものである。
この光学的測定装置では、前記微小粒子の通流速度をｘ（ｍ／秒）、前記レーザ光のスポット径をｙ（ｍ）、前記レーザ光の変調回数をｗ（回）、前記レーザ光の波長の数をｎとしたとき、前記レーザ光のパルス幅ｐ（秒）が上記数式１を満たすようにすることができる。
また、本発明の光学的測定装置では、前記光検出部で検出された蛍光及び／又は散乱光を、前記レーザ光の強度に基づき規格化するデータ処理部を有していてもよい。そして、前記規格化された値から、前記微小粒子の種類又は状態を識別することもできる。
一方、本発明の光学的測定装置においては、前記光照射部から前記微小粒子に波長が異なる２以上のレーザ光を、パルス強度を変調させつつ位相時間をずらして照射し、前記光検出部において前記微小粒子から発せられた蛍光及び／又は散乱光を前記レーザ光の波長毎に検出することができる。
その場合、前記微小粒子が２以上の蛍光色素で修飾されているときは、一のレーザ光を照射したときに検出された蛍光又は散乱光を、この一のレーザ光で励起されない蛍光色素の参照スペクトルを零として、逆行列解析してもよい。
また、前記光照射部から櫛形状の超短パルスレーザ光を照射することもできる。これにより、測定対象の微小粒子が受ける光ダメージがより低減すると共に、微小粒子が加熱されにくくなる。
その場合、更に、予め測定された測定対象の微小粒子が破壊される温度及び／又は光強度のデータに基づき、前記パルスレーザ光の照射強度、照射時間、照射波形、パルス比率、位相、パルス幅及びパルス形状のうちの少なくとも１種の条件を調整するレーザ光制御部を有していてもよい。
更に、前述した光学的測定方法及び光学的測定装置において測定対象としている微小粒子としては、例えば、細胞又はマイクロビーズが挙げられる。
本発明によれば、レーザ光をパルス状としているため、レーザ光による微小粒子のダメージ及び変質を低減することができ、更に、パルス強度を変調しながら照射しているため、波長毎に出力レベルが異なる複数の検出信号が得られ、輝度レベルの差が大きい複数の蛍光又は散乱光を検出する場合でも、精度が高く、信頼性に優れた測定を実現することができる。
以下、本発明を実施するための最良の形態について、添付の図面を参照して詳細に説明する。なお、本発明は、以下に示す各実施形態に限定されるものではない。
先ず、本発明の第１の実施形態に係る光学的測定装置について説明する。図１は本実施形態の光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。図１に示すように本実施形態の光学的測定装置１には、流路２内を一列になって通流する微小粒子３に、レーザ光５を照射する光照射部４と、レーザ光３が照射された微小粒子３から発せられた蛍光及び／又は散乱光１０を検出する検出部９が設けられている。
この光学的測定装置１の光照射部４は、例えば、レーザ発振器６、ミラー７及び集光レンズ８等を備え、レーザ発振器６から出射され、ミラー７により流路２の方向に反射されたレーザ光５を、集光レンズ８により集光して１つの微小粒子３に照射する構成とすることができる。
また、本実施形態の光学的測定装置１で使用されるレーザ発振器６としては、例えば、ＹＡＧレーザ等の固体レーザ、半導体レーザ及びフェムト秒レーザ等が挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではなく、パルスレーザ光を、パルス強度を変調させながら出射することができるものであれば、測定内容等に応じて適宜選択することができる。
一方、光学的測定装置１の検出部９は、例えば、ＣＣＤ（Charge Coupled Device；電荷結合素子）及びＰＭＴ（Photo-Multiplier Tube；光電子増倍管）等の光検出装置１１、分光素子１４、ミラー１２及び集光レンズ１３を備えており、微小粒子３から発せられた蛍光及び／又は散乱光１０が、集光レンズ１３で集光された後、ミラー１２によって光検出装置１１の方向に反射され、分光素子１４を介して光検出装置１１に入射する構成とすることができる。そして、例えば蛍光を検出する場合であれば、この検出部９において、入射した蛍光が回折格子等により分光され、蛍光スペクトルが測定される。
本実施形態の光学的測定装置１は、例えば、フローサイトメトリー装置及びビーズアッセイ装置等として使用することができる。
次に、上述の如く構成された本実施形態の光学的測定装置１の動作、即ち、この光学的測定装置１を使用して、細胞又はマイクロビーズ等の微小粒子３を光学的に測定する方法について説明する。なお、本実施形態の測定方法において測定対象とする微小粒子３は、１又は複数の蛍光色素で修飾されていてもよい。
図２は微小粒子３の通流過程を模式的に示す図である。本実施形態の測定方法では、流路２内を１列になって通流する微小粒子３に対して、光照射部４からレーザ光５を照射する。このように、微小粒子３を１列に並べる方法としては、例えば、図２に示すように、測定対象の微小粒子３を含むサンプル液２１と、その周囲を流れるシース（鞘）液２２とで層流を形成し、更に、サンプル液２１とシース液２２との間にわずかな圧力差を生じさせることで、サンプル液２１中に含まれる複数の微小粒子３を１列に並べる方法がある。この場合、層流部分２３にレーザ光５を照射することにより、サンプル液２１に複数の微小粒子３が含まれている場合でも、１個ずつレーザ光５を照射することができる。
そして、本実施形態の測定方法では、光照射部４から出射されるレーザ光５をパルス状とし、そのパルス強度を変調させることにより、１つの微小粒子３に１又は波長が異なる２以上のレーザ光を、強度を変えて複数回照射する。
このレーザ強度を変調させたパルスレーザ光５の照射は、微小粒子３がレーザスポット２４を通過している最中に完了する必要がある。このため、ｎ（ｎは１以上の自然数）種の波長のレーザ光を照射する場合における各レーザ光５のパルス幅ｐ（秒）は、下記数式２を満たすようにすることが望ましい。なお、下記数式２におけるｘは微小粒子３が流路２内を通流する速度（ｍ／秒）、ｙはレーザ光５のスポット径（ｍ）、ｗ（ｗは１以上の自然数）はレーザ光５の変調回数（回）である。
Figure 2009109218
このように、レーザ光５のパルス幅ｐ（秒）を上記数式２の範囲にすることにより、測定対象の微小粒子３に、強度を変調させたパルスレーザ光を、確実に各強度につき１回以上照射することができる。
そして、本実施形態の測定方法においては、レーザ光５によって微小粒子３から発せられた蛍光及び／又は散乱光１０を、検出部１１で検出する。このとき、検出部９に設けられた光検出器１１の感度は固定しておく。
一方、特許文献１に記載の測定方法では、レーザ光の強度は一定とし、ＰＭＴ電圧、即ち、光検出器であるＰＭＴの感度を調節することにより、検出値のばらつきを補正しているが、その場合、高速でＰＭＴの印加電圧を変化させなければならず、技術的に困難であるという問題点がある。これに対して、本実施形態の測定方法では、光検出器１１の感度は固定し、パルス強度を変化させているため、高速でレーザ光の注入電流を変化させることにより、容易にパルス強度変調を行うことができる。特に、レーザ発振器６として半導体レーザを使用した場合は、数ＭＨｚから数百ＭＨｚの範囲で、極めて高速にレーザ光５のパルス幅、パルス強度及びパルス形状を変化させることが可能となる。
図３は横軸に時間、縦軸に強度をとって、レーザ光５の照射パターンの一例を示す図である。また、図４（ａ）〜（ｄ）は、横軸に波長をとり、縦軸に出力をとって、図３に示すパターンでレーザ光を照射したときに得られる測定スペクトルを示す図であり、図４（ａ）はレーザ強度がＰｗ１のとき、図４（ｂ）はレーザ強度がＰｗ２のとき、図４（ｃ）はレーザ強度がＰｗ３のとき、図４（ｄ）はレーザ強度がＰｗ４のときの測定スペクトルを示す。
図３に示すようにパルス強度を段階的に大きくしながらレーザ光を照射した場合、例えば３種類の蛍光色素で修飾された微小粒子であれば、図４（ａ）〜（ｄ）に示す４つのスペクトルが得られる。これらの測定スペクトルのうち、図４（ａ）に示す測定スペクトルＡ（レーザ強度：Ｐｗ１）は、出力レベルがノイズレベルと同程度であり、図４（ｂ）に示す測定スペクトルＢ（レーザ強度：Ｐｗ２）は、最も出力レベルが小さいチャンネルの出力がノイズレベルと同程度であり、図４（ｄ）に示す測定スペクトルＤ（レーザ強度：Ｐｗ４）は、最も出力レベルが大きいチャンネルの出力が飽和レベルに達している。一方、図４（ｃ）に示す測定スペクトルＣ（レーザ強度：Ｐｗ３）は、全てのチャンネル出力で信号レベルが十分に大きく、得られた４つの測定スペクトルの中で、最もデータ解析、及びその前に必要に応じて行う蛍光補正に適しているといえる。
そこで、本実施形態の測定方法では、得られた測定スペクトル等から、最適なもの選択してデータ解析を行い、得られたヒストグラム等から微小粒子の種類又は状態を識別する。具体的には、微小粒子が細胞又はビーズである場合は、それらの大きさ、形状、内部状態、表面状態及び表面抗体反応等を識別することができる。
なお、各測定スペクトルの比較は、出力値による方法に限定されるものではなく、例えば、各出力値のシグナル対ノイズレベルの比（ＳＮＲ）により各測定スペクトルを比較して、最適な測定スペクトルを選択することもできる。
図５は横軸に時間、縦軸に強度をとって、波長が異なる２種のレーザ光を照射する場合の照射パターンの一例を示す図である。本実施形態の測定方法においては、微小粒子３に波長が異なる２以上のレーザ光を照射することも可能であり、例えば、図５に示すように、波長がλ１であるパルスレーザ光をそのパルス強度を変調させながら照射した後、引き続き波長がλ２のパルスレーザ光をそのパルス強度を変調させながら照射することもできる。
また、データ解析を行うにあたっては、蛍光及び／又は散乱光１０の検出値を、レーザ光５の強度で規格化することが望ましい。具体的には、光学的測定装置１にデータ処置部（図示せず）を設け、例えば、検出部９で検出した蛍光及び／又は散乱光１０を、レーザ光５の強度に基づいて規格化する処理を行う。
このように、蛍光及び／又は散乱光１０の検出値を、測定時のレーザ強度で規格化することにより、最適レーザ強度が異なっている複数の微小粒子について、蛍光強度の絶対値比較が可能となる。その結果、蛍光強度を比較することで、例えば、細胞の抗体反応の比較、ビーズの表面反応の絶対値比較等を行うことができる。
上述の如く、本実施形態の微小粒子の光学的測定方法では、１つの微小粒子に、同一波長のレーザ光を、強度を変えて複数回照射しているため、出力が異なる複数の測定スペクトル得られる。このため、それらの中から適性レベルスペクトルを選択してデータ解析を行うことで、測定対象の微小粒子から発せられる蛍光及び／又は散乱光の輝度レベルの差が大きい場合でも、測定精度を向上させることができる。
また、本実施形態の測定方法では、パルスレーザ光を微小粒子に照射しているため、微量粒子に常時レーザ光を照射している従来の測定方法に比べて、微小粒子に与えるダメージを低減できると共に、微小粒子の発熱を抑制することができる。
次に、本発明の第２の実施形態として、２以上の蛍光色素で修飾されている微小粒子を光学的に測定する方法について説明する。例えば、励起波長が異なる２以上の蛍光色素で微小粒子が修飾されている場合は、微小粒子に対して波長が異なる２以上のレーザ光を照射する必要がある。そこで、本実施形態の測定方法においては、光学的測定装置１の光照射部４から、波長λが異なる２以上のパルスレーザ光を、そのパルス強度を変調させつつ位相時間をずらして微小粒子に照射する。
図６は横軸に時間、縦軸に強度をとって、本実施形態の光学的測定方法におけるレーザ光の照射パターンの一例を示す図である。図６に示すように、本実施形態の測定方法においては、微小粒子に対して、波長が異なる複数のレーザ光を、波長毎にパルス強度を変調させつつ時分割照射する。そして、検出部において、各微小粒子から照射された蛍光及び／又は散乱光を、レーザ光の波長毎に検出する。
従来の測定方法では、複数のレーザ光を同時に照射していたため、検出した蛍光信号を補正しなければならなかったが、本実施形態の微小粒子の光学的測定方法においては、波長が異なる２以上のレーザ光を、位相時間をずらして照射すると共に、微小粒子から発せられた蛍光及び／又は散乱光の強度を、レーザ光の波長毎に検出しているため、単一レーザ光に対応する光検出信号が得られる。その結果、後述する蛍光補正処理が容易になり、高精度に光強度を分離することができる。
本実施形態の光学的測定方法においては、微小粒子が２以上の蛍光色素で修飾されており、更に、それらの蛍光色素のうち一の波長で励起される蛍光色素が２以上ある場合は、得られた測定スペクトルを蛍光色素毎に分離する蛍光補正を行う必要がある。なお、微小粒子を１種類の蛍光色素でしか修飾していない場合、及び一の波長で励起される蛍光色素が１つしかない場合は、蛍光の漏れ込みは生じないため、以下に示す蛍光補正処理は不要である。
図７（ａ）〜（ｃ）は、横軸に波長をとり、縦軸に出力をとって、測定スペクトルの蛍光補正処理をその工程順に示すグラフ図である。測定スペクトルの蛍光補正を行う際は、先ず、図７（ａ）に示すように、レーザ強度が異なる複数の測定スペクトルの中から蛍光補正に最適な測定スペクトルを選択する。例えば、測定スペクトルが図４（ａ）〜（ｄ）であった場合は、図４（ｃ）に示す測定スペクトルＣを選択する。
次に、図７（ｂ）に示すように、微小粒子３に修飾されている各蛍光色素の参照スペクトルに基づいて、測定スペクトルＣを波長分布解析し、更に、下記数式３に示すような逆行列法を利用した演算処理（逆行列解析）を行って、各蛍光の量（比率）を算出する。なお、下記数式３におけるＦＬｎは各蛍光色素の量（比率）、ａｎ、ｂｎ、ｃｎ…ｚｎは各蛍光色素の波長毎の比率、ＰＭＴｎは測定された各波長における出力値である。
Figure 2009109218
次に、図７（ｃ）に示すように、前述した逆行列解析の結果に基づいて、測定スペクトルＣを蛍光色素毎の強度に分解する。なお、図７（ｃ）は微小粒子が３種類の蛍光色素で修飾されていた場合の測定スペクトルを、色素毎に分解した図である。
そして、この蛍光補正により色素毎に分離したスペクトルを使用してデータ解析を行い、得られたヒストグラム等から微小粒子の種類又は状態を識別する。その際、逆行列解析により得た値を、レーザ光５の強度で規格化することが望ましい。具体的には、光学的測定装置１にデータ処置部（図示せず）を設け、例えば、検出部９で検出した蛍光及び／又は散乱光１０の値を逆行列解析により蛍光色素毎に分離した後、レーザ光５の強度に基づいて規格化する処理を行う。下記表１にレーザ強度による規格化の例を示す。
Figure 2009109218
このように、蛍光強度レベルの逆行列解析による値を、測定時のレーザ強度で規格化することにより、最適レーザ強度が異なっている粒子同士についても、蛍光強度の絶対値比較が可能となる。
なお、前述した蛍光補正処理においては、一のレーザ光を照射したときに検出された蛍光を逆行列解析する際、この一のレーザ光で励起されない蛍光色素の参照スペクトルを零にして計算してもよい。具体的には、微小粒子の修飾に、レーザ光αで励起する蛍光色素ａ，ｄと、レーザ光βで励起する蛍光色素ｂと、レーザ光γで励起する蛍光色素ｃの４種類の蛍光色素を使用した場合は、波長が異なる３種のレーザ光α，β，γを時分割照射すると共に、各微小粒子から照射された蛍光及び／又は散乱光を、レーザ光の波長毎に検出し、蛍光補正処理を行う。
図８は横軸に波長をとり、縦軸に励起効率をとって、蛍光色素ａ及び蛍光色素ｄの励起波長を示す図である。図８に示すように、レーザ光αを照射すると、蛍光色素ａ及び蛍光色素ｄの２種類の蛍光色素が励起される。このため、レーザ光αを照射した際の光検出信号は蛍光補正処理する必要があるが、その際、下記数式４に示すように、蛍光色素ａ及び蛍光色素ｄの参照スペクトルを使用し、蛍光色素ｂ及び蛍光色素ｃに関する参照スペクトルの行列項目は０として逆行列解析を行ってもよい。なお、下記数式４におけるｙ１〜ｙｎはレーザ光αを照射したときの各波長に対する光検出信号、ａ１１〜ａ１ｎは蛍光色素ａの各波長における参照スペクトル、ｄ１１〜ｄ１ｎは蛍光色素ｃの各波長における参照スペクトル、ｘ１〜ｘｎは各蛍光色素の量（比率）である。
Figure 2009109218
このように、蛍光補正処理する際に、各レーザ光で励起される蛍光色素の参照スペクトルのみ使用し、その他の蛍光色素の参照スペクトルは０として逆行列解析を行うことにより、計算時間を大幅に短縮することができる。その結果、微小粒子を多重染色した場合でも、短時間での測定・解析を実現することができる。
なお、本実施形態の光学的測定方法における上記以外の構成及び効果は、前述した第１の実施形態の測定方法と同様である。
次に、本発明の第３の実施形態に係る光学的測定方法について説明する。本実施形態の測定方法は、光照射部から照射されるレーザ光を櫛形状の超短パルスレーザ光（以下、櫛形状パルスという。）とする以外は、前述した第１及び第２の実施形態の測定方法と同様である。
図９（ａ）及び（ｂ）は、それぞれダメージ強度が異なる細胞Ａ及び細胞Ｂに櫛形状パルスレーザ光を照射するときの照射パターンを示す図であり、図１０（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ退色レベル強度が異なる蛍光色素Ａ及び蛍光色素Ｂが修飾された微小粒子に櫛形状パルスレーザ光を照射するときの照射パターンを示す図である。また、図１１は従来のレーザ光照射パターンを示す図である。図９及び図１０に示すように、本実施形態の測定方法では、微小粒子に照射するレーザ光を櫛形状パルスにしているため、図１１に示すように常時レーザ光を照射する測定方法に比べて、蛍光及び散乱光を検出するために照射されるレーザ光の総光量を少なくすることができる。
これにより、微小粒子から発せられる蛍光又は散乱光の発光強度を低下させずに、微小粒子が受ける光ダメージ及び微小粒子の温度上昇を低減することができるため、微小粒子を変質させずに、そのままの状態で分取することが可能となる。
また、本実施形態の測定方法においては、予め、検出対象の微小粒子が破壊される温度及び／又は光強度を測定しておき、その結果に応じて、櫛形状パルスレーザ光の照射強度、照射時間、照射波形、パルス比率、位相、パルス幅及びパルス形状等の条件を調整してもよい。
検出対象の微小粒子が破壊される温度及び光強度は、それぞれ恒温槽及び光照射装置等を使用して測定することができる。あるいは、本発明の装置を利用して、上述したパルス照射条件を変えたときの細胞の生存率や蛍光ビーズの退色具合を測定してもよい。例えば、細胞の場合は、摂氏４０度程度以上になると、熱ダメージが加わり、測定後の生存率が低下してしまう。
そして、例えば、検出対象の微小粒子が細胞である場合は、例えば、照射強度を数ｍＷ〜数百ｍＷ、照射時間を数ｎｓ〜数ｍｓ、照射波形を櫛形状パルス、パルス比率を数％〜数十％、とすることが望ましい。
このように、検出対象の微小粒子が破壊される温度・光強度に応じて、櫛形状パルスレーザ光の照射強度、照射時間、照射波形、パルス比率、位相、パルス幅及びパルス形状等の条件を調整することにより、従来問題となっていた微小粒子に修飾されている蛍光色素の脱落及び退色を防止することができる。なお、これらの照射条件は全て調整する必要はなく、少なくとも１種を調整するだけで、上述した効果は得られる。
また、本実施形態の測定方法は、例えば、図１に示す光学的測定装置１の光照射部４から、図９及び図１０に示す１種又は波長の異なる２種以上の櫛形状パルスレーザ光を照射することにより、実現することができる。
また、その場合、光学的測定装置１には、更に、各種微小粒子３が破壊される温度及び／又は光強度の測定結果が保存されたデータベース（図示せず）と、このデータベースに保存されている測定結果に基づいて、櫛形状パルスレーザ光の照射強度、照射時間、照射波形、パルス比率、位相、パルス幅及びパルス形状のうち少なくとも１種の条件を調整するレーザ光制御部（図示せず）とを備えていることが好ましい。これにより、微小粒子に修飾されている蛍光色素の脱落及び退色を防止することができる。なお、データベース及びレーザ光制御部は、測定装置１内に設けられている必要はない。
上述の如く、本実施形態の微小粒子の光学的測定方法は、検出対象の微小粒子に照射するレーザ光を櫛形状パルスにしているため、微小粒子の受光量及び温度上昇を少なくして、微小粒子が受けるダメージ及微小粒子の変質を低減することができる。本実施形態の測定方法は、細胞等の変質しやすい微小粒子を測定する場合に特に有効である。
なお、本実施形態の光学的測定方法における上記以外の構成及び効果は、前述した第１及び第２の実施形態と同様である。
本発明の第１の実施形態に係る光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。 微小粒子３の通流過程を模式的に示す図である。 横軸に時間、縦軸に強度をとって、レーザ光の照射パターンの一例を示す図である。 （ａ）〜（ｄ）は、横軸に波長をとり、縦軸に出力をとって、図３に示すパターンでレーザ光を照射したときに得られる測定スペクトルを示す図であり、（ａ）はレーザ強度がＰｗ１のとき、（ｂ）はレーザ強度がＰｗ２のとき、（ｃ）はレーザ強度がＰｗ３のとき、（ｄ）はレーザ強度がＰｗ４のときの測定スペクトルを示す。 横軸に時間、縦軸に強度をとって、波長が異なる２種のレーザ光を照射する場合の照射パターンの一例を示す図である。 横軸に時間、縦軸に強度をとって、本発明の第２の実施形態に係る光学的測定方法におけるレーザ光の照射パターンの一例を示す図である。 （ａ）〜（ｃ）は、横軸に波長をとり、縦軸に出力をとって、測定スペクトルの蛍光補正処理をその工程順に示すグラフ図である。 横軸に波長をとり、縦軸に励起効率をとって、蛍光色素ａ及び蛍光色素ｄの励起波長を示す図である。 （ａ）及び（ｂ）は、それぞれダメージ強度が異なる細胞Ａ及び細胞Ｂに櫛形状パルスレーザ光を照射するときの照射パターンを示す図である。 （ａ）及び（ｂ）は、それぞれ退色レベル強度が異なる蛍光色素Ａ及び蛍光色素Ｂが修飾された微小粒子に櫛形状パルスレーザ光を照射するときの照射パターンを示す図である。 従来のレーザ光照射パターンを示す図である。 特許文献１に記載の従来のフローサイトメーターの構成を模式的に示す図である。
符号の説明
１ 光学的測定装置
２ 流路
３ 微小粒子
４ 光照射部
５ レーザ光
６ レーザ装置
７、１２ ミラー
８、１３ レンズ
９ 検出部
１０ 蛍光及び／又は散乱光
１１ 光検出装置
１４ 分光素子
２１ サンプル液
２２ シース液
２３ 層流部分
２４ レーザスポット
１０１ フローサイトメーター
１０２ 流体（フロー）系
１０３ 光学系
１０４ 信号処理装置
１０５ 細胞
１０６ａ，１０６ｂ，１０６ｃ 光源
１０７ 導光部材

Claims (18)

  1. 流路内を通流する微小粒子にレーザ光を照射し、前記微小粒子から発せられた蛍光及び／又は散乱光を検出する光学的測定方法であって、
    前記レーザ光をパルス状とし、そのパルス強度を変調させることにより、１つの微小粒子に１又は波長が異なる２以上のレーザ光を、強度を変えて複数回照射する微小粒子の光学的測定方法。
  2. 前記微小粒子の通流速度をｘ（ｍ／秒）、前記レーザ光のスポット径をｙ（ｍ）、前記レーザ光の変調回数をｗ（回）、前記レーザ光の波長の数をｎとしたとき、
    前記レーザ光のパルス幅ｐ（秒）が下記数式（Ａ）を満たすことを特徴とする請求項１に記載の微小粒子の光学的測定方法。
    Figure 2009109218
  3. 検出された蛍光及び／又は散乱光を、前記レーザ光の強度に基づき規格化することを特徴とする請求項１又は２に記載の微小粒子の光学的測定方法。
  4. 前記規格化された値から、前記微小粒子の種類又は状態を識別することを特徴とする請求項３に記載の微小粒子の光学的測定方法。
  5. 前記微小粒子に波長が異なる２以上のレーザ光を、パルス強度を変調させつつ位相時間をずらして照射し、
    前記微小粒子から発せられた蛍光及び／又は散乱光を前記レーザ光の波長毎に検出することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の微小粒子の光学的測定方法。
  6. 前記微小粒子が２以上の蛍光色素で修飾されており、一のレーザ光を照射したときに検出された蛍光又は散乱光を、この一のレーザ光で励起されない蛍光色素の参照スペクトルを零として、逆行列解析することを特徴とする請求項５に記載の微小粒子の光学的測定方法。
  7. 前記レーザ光を櫛形状の超短パルスレーザ光とすることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の微小粒子の光学的測定方法。
  8. 予め、測定対象の微小粒子が破壊される温度及び／又は光強度を測定しておき、その結果に応じて、前記パルスレーザ光の照射強度、照射時間、照射波形、パルス比率、位相、パルス幅及びパルス形状のうちの少なくとも１種の条件を調整することを特徴とする請求項７に記載の微小粒子の光学的測定方法。
  9. 前記微小粒子が細胞又はマイクロビーズであることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項に記載の微小粒子の光学的測定方法。
  10. 流路内を通流する微小粒子にレーザ光を照射する光照射部と、
    前記レーザ光が照射された微小粒子から発せられる蛍光及び／又は散乱光を検出する光検出部と、を有し、
    前記光照射部からパルス強度を変調させながらパルスレーザを照射し、１つの微小粒子に１又は波長が異なる２以上のレーザ光を、強度を変えて複数回照射する微小粒子の光学的測定装置。
  11. 前記微小粒子の通流速度をｘ（ｍ／秒）、前記レーザ光のスポット径をｙ（ｍ）、前記レーザ光の変調回数をｗ（回）、前記レーザ光の波長の数をｎとしたとき、
    前記レーザ光のパルス幅ｐ（秒）が下記数式（Ａ）を満たすことを特徴とする請求項１０に記載の微小粒子の光学的測定装置。
    Figure 2009109218
  12. 更に、前記光検出部で検出された蛍光及び／又は散乱光を、前記レーザ光の強度に基づき規格化するデータ処理部を有することを特徴とする請求項１０又は１１に記載の微小粒子の光学的測定装置。
  13. 前記規格化された値から、前記微小粒子の種類又は状態を識別することを特徴とする請求項１２に記載の微小粒子の光学的測定装置。
  14. 前記光照射部から前記微小粒子に波長が異なる２以上のレーザ光を、パルス強度を変調させつつ位相時間をずらして照射し、
    前記光検出部において前記微小粒子から発せられた蛍光及び／又は散乱光を前記レーザ光の波長毎に検出することを特徴とする請求項１０乃至１３のいずれか１項に記載の微小粒子の光学的測定装置。
  15. 前記微小粒子が２以上の蛍光色素で修飾されている場合、一のレーザ光を照射したときに検出された蛍光又は散乱光を、前記一のレーザ光で励起されない蛍光色素の参照スペクトルを零として、逆行列解析することを特徴とする請求項１４に記載の微小粒子の光学的測定装置。
  16. 前記レーザ光が、櫛形状の超短パルスレーザ光であることを特徴とする請求項１０乃至１５のいずれか１項に記載の微小粒子の光学的測定装置。
  17. 更に、予め測定された測定対象の微小粒子が破壊される温度及び／又は光強度のデータに基づき、前記パルスレーザ光の照射強度、照射時間、照射波形、パルス比率、位相、パルス幅及びパルス形状のうちの少なくとも１種の条件を調整するレーザ光制御部を有することを特徴とする請求項１６に記載の微小粒子の光学的測定装置。
  18. 前記微小粒子が、細胞又はマイクロビーズであることを特徴とする請求項１０乃至１７のいずれか１項に記載の微小粒子の光学的測定装置。
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