JP2012103159A - 蛍光スペクトル補正方法及び蛍光スペクトル測定装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】蛍光スペクトル測定装置1の検出部2において測定された複数の蛍光色素で標識された微小粒子の蛍光スペクトルを、解析部3において、参照スペクトルと比較して、色素毎の蛍光スペクトルに分離する際、参照スペクトルとして、記憶部3に記憶されているスペクトルデータのうち、単染色サンプルのスペクトルとの誤差が8%以下のスペクトルデータを使用する。
【選択図】図1
Description
この補正方法では、前記参照スペクトルとして、単染色サンプルとの誤差が8%以下のスペクトルデータを使用することができる。
また、前記参照スペクトルには、測定日、検出器の電位、結合している抗体の種類及び前記微小粒子が細胞である場合は細胞の種類のうちいずれかが異なる蛍光スペクトルデータを使用すればよい。
更に、前記微小粒子が細胞である場合、参照スペクトルには、細胞を使用して測定された蛍光スペクトルデータを使用することが望ましい。
この装置では、前記検出部に多チャンネル光電子倍増管が設けられていてもよい。
1.第1の実施の形態
(単染色サンプルを使用せずに蛍光スペクトルを補正する方法の例)
2.第2の実施の形態
(単染色サンプルを使用しない蛍光スペクトル測定装置の例)
[補正方法]
先ず、本発明の第1の実施形態に係る蛍光スペクトル補正方法(以下、単に補正方法ともいう。)について説明する。本実施形態の補正方法では、複数の蛍光色素で標識された微小粒子から得られた蛍光スペクトルを、色素毎に分離する際の参照スペクトルとして、先に測定した蛍光スペクトルを使用する。
[装置の全体構成]
次に、本発明の第2の実施形態に係る蛍光スペクトル測定装置について説明する。図1は本実施形態の蛍光スペクトル測定装置の構成を示すブロック図である。図1に示すように、本実施形態の蛍光スペクトル測定装置1は、少なくとも、検出部2と、記憶部3と、解析部4とを備え、前述した第1の実施形態の補正方法を行う。なお、図1に示す蛍光スペクトル測定装置1には、更に、送液部が設けられていてもよい。
検出部2は、分析対象の微小粒子から発せられた蛍光を、任意の波長領域で同時に検出可能な構成であればよい。具体的には、波長領域毎にその波長領域を検出可能な独立したセンサを複数配置した構成や、多チャンネル光電子倍増管(Photo-Multiplier Tube:PMT)などのように複数の光を同時に検出可能な1又は複数の検出器を備えた構成とすることができる。この検出部2で検出する波長領域の数、即ち、検出部2に配設される検出器のチャンネル数又はセンサ数などは、使用する色素の数以上であればよい。
解析部3では、電子計算機などを用いて、検出部2で検出した各波長領域の光を、定量化し、波長領域毎の総蛍光量(強度)を求める。また、必要に応じて、参照スペクトルを使用した蛍光スペクトル補正を行う。そして、その結果(蛍光スペクトルデータ)は、記憶部4に保存される。
記憶部4は、解析部3で処理された蛍光スペクトルデータを記憶するものである。この記憶部4には、例えば、過去に測定した蛍光スペクトルデータだけでなく、単染色サンプルの蛍光スペクトルデータを保存することもできる。
次に、本実施形態の蛍光スペクトル測定装置1の動作について説明する。本実施形態の蛍光スペクトル測定装置1で分析とする微小粒子は、特に限定されるものではないが、例えば細胞やマイクロビーズなどが挙げられる。また、これら微小粒子を修飾する蛍光色素の種類及び数も、特に限定されるものではなくFITC(fluorescein isothiocyanete:C21H11NO5S)、PE(phycoerythrin)、PerCP(periidinin chlorophyll protein)、PE−Cy5及びPE−Cy7などの公知の色素を、必要に応じて適宜選択して使用することができる。更に、各微小粒子が複数の蛍光色素で修飾されていてもよい。
図2(a)、図3(a)、図4(a)、図5(a)は横軸に検出器のチャンネル番号(波長依存番号)をとり、縦軸に蛍光強度をとって、測定日と蛍光スペクトルの関係を示すグラフ図であり、図2(b)、図3(b)、図4(b)、図5(b)は各波長における誤差を示すグラフ図である。なお、図2(a),(b)に示す蛍光スペクトルは、蛍光色素にFITC、抗体にCD14を使用して測定したデータであり、図3(a),(b)に示す蛍光スペクトルは、蛍光色素にPE、抗体にCD3を使用して測定したデータである。いずれの日も同一ロットを用いた。
図6(a)は横軸に検出器のチャンネル番号(波長依存番号)をとり、縦軸に蛍光強度をとって、検出器の電位と蛍光スペクトルの関係を示すグラフ図であり、図6(b)は各波長における誤差を示すグラフ図である。なお、図6(a),(b)に示す蛍光スペクトルは、蛍光色素にPE、抗体にCD3、検出器にPMTを使用して、測定したデータである。なお、印加電圧は、PMTV150が525V、PMTV160が560V、PMTV170が595V、PMTV180が630V、PMTV190が665V、PMTV200が700Vである。
図7(a)、図8(a)は横軸に検出器のチャンネル番号(波長依存番号)をとり、縦軸に蛍光強度をとって、結合している抗体と蛍光スペクトルの関係を示すグラフ図であり、図7(b)、図8(b)は各波長における誤差を示すグラフ図である。なお、図7(a),(b)に示す蛍光スペクトルは、A:蛍光色素にFITC、抗体にCD45、B:蛍光色素にFITC、抗体にCD45RAを使用して測定したデータである。また、図8(a),(b)に示す蛍光スペクトルは、A:蛍光色素にPE、抗体にCD8、B:蛍光色素にPE、抗体にCD3を使用して測定したデータである。なお、検出器はPMTを使用し、印加電圧はいずれも525Vとした。
図11(a)及び図12(a)は横軸に検出器のチャンネル番号(波長依存番号)をとり、縦軸に蛍光強度をとって、微小粒子の種類と蛍光スペクトルの関係を示すグラフ図であり、図11(b)及び図12(b)は各波長における誤差を示すグラフ図である。ここで、図11(a),(b)は、A:色素にFITC、抗体にCD45を使用したときの蛍光スペクトル、B:BD 7−Color Setup Beads中の蛍光色素FITCを含有しているポリスチレンビーズを用いたときの蛍光スペクトルである。また、図12(a),(b)は、A:蛍光色素にPE、抗体にCD8を使用したときの蛍光スペクトル、B:BD 7−Color Setup Beads中の蛍光色素PEを含有しているポリスチレンビーズを使用したときの蛍光スペクトルである。なお、印加電圧はいずれも630Vとした。
2 検出部
3 解析部
4 記憶部
Claims (6)
- 複数の蛍光色素で標識された微小粒子から得られた蛍光スペクトルを、参照スペクトルと比較して、色素毎の蛍光スペクトルに分離する工程を有し、
前記参照スペクトルとして、先に測定したスペクトルデータを使用する蛍光スペクトルの補正方法。 - 前記参照スペクトルは、単染色サンプルとの誤差が8%以下である請求項1に記載の蛍光スペクトルの補正方法。
- 前記参照スペクトルとして、測定日、検出器の電位、結合している抗体の種類及び前記微小粒子が細胞である場合は細胞の種類のいずれかが異なる蛍光スペクトルデータを使用する請求項2に記載の蛍光スペクトルの補正方法。
- 前記微小粒子が細胞である場合、参照スペクトルには、細胞を使用して測定された蛍光スペクトルデータを使用する請求項3に記載の蛍光スペクトルの補正方法。
- 微小粒子から発せられた蛍光を、任意の波長領域で同時に検出する検出部と、
該検出部で検出されたデータを、色素毎の蛍光スペクトルに分離する解析部と、
該解析部で分離された蛍光スペクトルデータを記憶する記憶部と、を有し、
前記解析部は、前記記憶部に記憶されている先に測定した蛍光スペクトルデータを参照スペクトルとして使用して、蛍光スペクトルの分離を行う蛍光スペクトル測定装置。 - 前記検出部には多チャンネル光電子倍増管が設けられている請求項5に記載の微小粒子分析装置。
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