JP2009115672A - 微小粒子の光学的測定方法及び分取方法、並びに前記光学的測定方法及び分取方法に用いる流路、光学的測定装置及びフローサイトメータ - Google Patents
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Abstract
【課題】微小粒子を正確に測定及び分取可能な光学的測定方法等を提供すること。
【解決手段】流路を通流する微小粒子を光学的に測定する方法であって、前記流路中の壁面の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む層流を形成する参照用層流形成工程と、 前記流路の所定位置において、前記微小粒子及び前記参照用物質からの光学的情報を検出する光学的情報検出工程と、を少なくとも行う微小粒子の光学的測定方法を提供する。この方法によれば、必要に応じて、前記光学的情報に基づいて、各種測定条件を制御することができるため、微小粒子の分析を行う際の測定精度の向上、及び測定時間の短縮が実現できる。
【選択図】図１
【解決手段】流路を通流する微小粒子を光学的に測定する方法であって、前記流路中の壁面の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む層流を形成する参照用層流形成工程と、 前記流路の所定位置において、前記微小粒子及び前記参照用物質からの光学的情報を検出する光学的情報検出工程と、を少なくとも行う微小粒子の光学的測定方法を提供する。この方法によれば、必要に応じて、前記光学的情報に基づいて、各種測定条件を制御することができるため、微小粒子の分析を行う際の測定精度の向上、及び測定時間の短縮が実現できる。
【選択図】図１
Description
本発明は、微小粒子の光学的測定方法に関する。より詳しくは、測定中等に測定条件の変更が可能な微小粒子の光学的測定方及び分取方法、並びに前記光学的測定方法及び分取方法に用いる流路、光学的測定装置及びフローサイトメータに関する。
近年、分析手法の発展に伴い、細胞や微生物等の生体微小粒子、マイクロビーズなどの微小粒子等を流路中に通流させ、通流させる工程において前記微小粒子を個々に測定したり、測定した微小粒子を解析し、分取したりする手法が開発されつつある。このような流路を用いた微小粒子の解析又は分取の手法の代表的な一例として、フローサイトメトリーと呼ばれる分析手法の技術改良が急速に進んでいる。
フローサイトメトリ−とは、解析の対象となる微小粒子を流体中に流し込み、該微小粒子の列を形成し、整列した該微小粒子にレーザ光等を照射することにより、各微小粒子から発せられた蛍光や散乱光を検出することで微小粒子の解析を行い、更には、解析結果に基づいて、微小粒子の分取を行う分析手法である。
以下、フローサイトメトリ−について図２４を用いて具体的に説明する。図２４は、従来のフローサイトメータの摸式図である。フローサイトメトリ−のプロセスは、（１）水流系、（２）光学系、（３）電気系、（４）分取系、に大別することができる。
（１）水流系
水流系では、分析対象となる微小粒子をフローセル（流路）中で一列に整列させる（図２４中（１）参照）。より具体的には、シース流Ｌ３３を一定の流速でフローセル内に流入させ、その状態で微小粒子を含むサンプル流Ｌ２２をフローセル中央部にゆっくりと注入する。この時、laminar flowの原理によりそれぞれの流れは互いに混合されず、層を成した流れ（層流）が形成される。そして、分析対象となる微小粒子の大きさ等に応じて、シース流Ｌ３３とサンプル流Ｌ２２の流入量を調節し、微小粒子を一つ一つが整列した状態で通流させる。
水流系では、分析対象となる微小粒子をフローセル（流路）中で一列に整列させる（図２４中（１）参照）。より具体的には、シース流Ｌ３３を一定の流速でフローセル内に流入させ、その状態で微小粒子を含むサンプル流Ｌ２２をフローセル中央部にゆっくりと注入する。この時、laminar flowの原理によりそれぞれの流れは互いに混合されず、層を成した流れ（層流）が形成される。そして、分析対象となる微小粒子の大きさ等に応じて、シース流Ｌ３３とサンプル流Ｌ２２の流入量を調節し、微小粒子を一つ一つが整列した状態で通流させる。
この水流系では、プラスチックやガラス等で形成した２次元又は３次元の略１ｍｍ以下の微細な流路を用いる、いわゆるマイクロ流路又はマイクロフルイディクスと呼ばれる技術も開発されている。
（２）光学系
光学系では、分析対象となる微小粒子にレーザ光を照射し、微小粒子から発せられる蛍光や散乱光を検出する（図２４中（２）参照）。微小粒子は、前記水流系（１）において、一つ一つが整列した状態でレーザ照射部を通流させ、一つ一つの微小粒子が通過する毎に、微小粒子から発せられる蛍光や散乱光を、パラメーター毎に光学検出器を用いて検出し、微小粒子一つ一つの特性を分析する。
光学系では、分析対象となる微小粒子にレーザ光を照射し、微小粒子から発せられる蛍光や散乱光を検出する（図２４中（２）参照）。微小粒子は、前記水流系（１）において、一つ一つが整列した状態でレーザ照射部を通流させ、一つ一つの微小粒子が通過する毎に、微小粒子から発せられる蛍光や散乱光を、パラメーター毎に光学検出器を用いて検出し、微小粒子一つ一つの特性を分析する。
（３）電気系
電気系では、光学系において検出した光学的情報を、電気的信号（電圧パルス）に変換する（図２４中（３）参照）。変換された電気的信号は数値化され、数値化されたデータをもとに解析用コンピューターとソフトウェアでヒストグラムを抽出し、解析を行う。
電気系では、光学系において検出した光学的情報を、電気的信号（電圧パルス）に変換する（図２４中（３）参照）。変換された電気的信号は数値化され、数値化されたデータをもとに解析用コンピューターとソフトウェアでヒストグラムを抽出し、解析を行う。
（４）分取系
分取系では、測定を終えた微小粒子を分離し、回収する（図２４中（４）参照）。代表的な分取方法としては、測定を終えた微小粒子にプラス又はマイナスの電荷を加え、フローセルを、電位差を有する２つの偏向板Ｄで挟み込み、帯電された微小粒子はその電荷に応じていずれかの偏向板に引き寄せられることにより、分取する方法がある。
分取系では、測定を終えた微小粒子を分離し、回収する（図２４中（４）参照）。代表的な分取方法としては、測定を終えた微小粒子にプラス又はマイナスの電荷を加え、フローセルを、電位差を有する２つの偏向板Ｄで挟み込み、帯電された微小粒子はその電荷に応じていずれかの偏向板に引き寄せられることにより、分取する方法がある。
このフローサイトメトリ−のような流路中の微小粒子の解析及び分取技術は、医療分野、創薬分野、臨床検査分野、食品分野、農業分野、工学分野、法医学分野、犯罪鑑識分野等、様々な分野で広く利用されている。特に医療分野においては、病理学、腫瘍免疫学、移植学、遺伝学、再生医学、化学療法などで重要な役割を担っている。
このように、非常に広い分野で流路中の微小粒子を解析及び分取する技術が必要とされており、前記（１）から（４）のプロセスに関わる技術も、日々、開発が進められている。例えば、特許文献１では、非安定なフロー（層流）を安定させるための技術として、シース流に水の粘度を与えるために、粘度増加剤を添加したシース流を使用する技術を提案している。
流路中の微小粒子を解析及び分取するには、解析又は分取対象となる微小粒子に合わせて、層流の位置、層流の量、光照射位置、受光位置、光源パワー、印加電圧等の個々の設定が必要である。
これらの設定は、微小粒子の解析又は分取を行う前に、解析又は分取対象となる微小粒子に対応した参照スペクトルビーズや参照直径ビーズ等を予め流路内に通流させ、最適な層流の位置、層流の量、光照射位置、受光位置、光源パワー、印加電圧等を決定する必要がある。
そのため、実際に目的の微小粒子の解析又は分取を行う前段階の準備が必要となり、時間やコストの面で、更なる改良が期待されている。
また、流路中は、管壁側での通流抵抗が高くなるため、解析又は分取中に層流の位置や層流の量を変化させたい場合も生じる。しかし、実際に目的の微小粒子の解析又は分取を行う前段階で設定した層流の位置や層流の量は、解析又は分取中に変更することは難しかった。
更に、サンプル液中には、大きさや性質の異なる微小粒子が存在することが多い。そのため、解析又は分取中に、対象の微小粒子に最適な層流の位置、層流の量、光照射位置、受光位置、光源パワー、印加電圧等を変化させたい場合も生じる。しかし、前記と同様、実際に目的の微小粒子の解析又は分取を行う前段階で設定した個々の設定値は、解析又は分取中に変更することは難しかった。
そこで、本発明では、解析又は分取を行う前段階の準備工程を省略でき、また、解析又は分取中に個々の測定条件を変更させることが可能な光学的測定方法を提供することを主目的とする。
本願発明者は、解析又は分析を行う前段階の準備工程と、実際の解析又は分取工程を同時に行う方法について鋭意研究を行った。その結果、解析又は分取を行う前段階の準備工程を省略でき、また、解析又は分取中に個々の測定条件を変更させることが可能な光学的測定方法を新規に見出した。
本発明では、まず、流路を通流する微小粒子を光学的に測定する方法であって、
前記流路中の壁面の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む層流を形成する参照用層流形成工程と、
前記流路の所定位置において、前記微小粒子及び前記参照用物質からの光学的情報を検出する光学的情報検出工程と、
を少なくとも行う微小粒子の光学的測定方法を提供する。
本発明に係る光学的測定方法では、前記光学的情報検出工程にて検出した光学的情報に基づいて、測定条件を制御する測定条件制御工程を更に行うことも可能である。
本発明に係る光学的測定方法における前記参照用層流形成工程では、前記流路中の壁面の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む層流を形成することができればよいが、前記流路を形成する全壁面に沿って、前記層流を形成することができれば、より好適に光学的測定を行うことができる。
本発明に係る光学的測定方法における前記光学的情報検出工程では、前記参照用物質からの光学的情報の検出ができれば光照射方法は特に限定されないが、一例としては、照射スポットを前記流路幅方向に走査させながら光学的情報を検出する方法が挙げられる。
本発明に係る光学的測定方法における前記光学的情報検出工程では、前記微小粒子及び前記参照用物質の様々な光学的情報を得ることができる。例えば、位置情報等を光学的に検出することが可能である。
該位置情報を用いれば、例えば、本発明に係る光学的測定方法における前記測定条件制御工程において、得られた位置情報に基づいて、前記流路内の流体制御を行うことが可能である。
また、得られた前記位置情報に基づいて、測定時の受光位置の制御を行うことも可能である。
更に、本発明に係る光学的測定方法における前記光学的情報検出工程において、前記微小粒子及び前記参照用物質の光学的信号量を検出することも可能である。そして、該光学的信号量を用いれば、例えば、本発明に係る光学的測定方法における前記測定条件制御工程において、得られた光学的信号量に基づいて、測定時の光学的条件を制御することが可能である。
加えて、本発明に係る光学的測定方法における前記光学的情報検出工程において、前記微小粒子及び前記参照用物質の電気的信号量を検出することも可能である。そして、該電気的信号量を用いれば、例えば、本発明に係る光学的測定方法における前記測定条件制御工程において、得られた電気的信号量に基づいて、測定時の電気的条件を制御することが可能である。
本発明では、次に、流路を通流する微小粒子を分取する方法であって、
前記流路中の壁面の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む層流を形成する参照用層流形成工程と、
前記流路の所定位置において、前記微小粒子及び前記参照用物質からの光学的情報を検出する光学的情報検出工程と、
前記光学的情報に基づいて分取条件を制御する分取条件制御工程と、
を少なくとも行う微小粒子の分取方法を提供する。
本発明に係る光学的測定方法における前記参照用層流形成工程では、前記流路中の壁面の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む層流を形成することができればよいが、前記流路を形成する全壁面に沿って、前記層流を形成することができれば、より好適に微小粒子の分取を行うことができる。
本発明に係る分取方法における前記光学的情報検出工程では、前記参照用物質からの光学的情報の検出ができれば光照射方法は特に限定されないが、一例としては、照射スポットを前記流路幅方向に走査させながら光学的情報を検出する方法が挙げられる。
本発明に係る分取方法における前記光学的情報検出工程では、前記微小粒子及び前記参照用物質の様々な光学的情報を得ることができる。例えば、位置情報等を光学的に検出することが可能である。
該位置情報を用いれば、例えば、本発明に係る分取方法における前記分取条件制御工程において、得られた位置情報に基づいて、前記流路内の分取位置の制御を行うことが可能である。
前記分取位置の制御方向は特に限定されないが、例えば、流路中の微小粒子の流路幅方向位置を制御することにより、分取位置の制御をすることができる。
また、前記流路幅方向位置の制御は、流路幅方向位置の制御ができればその方法は特に限定されないが、例えば、流路内の流体制御を行うことにより、前記分取位置を制御することができる。
本発明では、次に、微小粒子の光学的測定に用いる、複数の層流を形成可能な流路であって、
測定用流路と、
前記測定用流路の上流に接続し、前記微小粒子を含むサンプル流の層流を形成させるサンプル流用流路と、
前記測定用流路の上流に接続し、シース流の層流を形成させるシース流用流路と、
前記測定用流路の上流に接続し、前記測定用流路の壁面の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む層流を形成させる参照用層流用流路と、
を少なくとも備える流路を提供する。
本発明に係る流路には、更に、前記測定用流路の下流に接続し、前記微小粒子を分取する分取用流路を備えることも可能である。
本発明では、次に、微小粒子の光学的測定に用いる光学的測定装置であって、
微小粒子に光を照射する光照射部と、
前記光照射部により光照射された微小粒子から発せられる光学的情報を検出する光検出部と、
前記光検出部により検出された光学的情報を電気的情報に変換する電気的信号変換部と、
下記（１）から（４）を少なくとも備える流路と、
を少なくとも備える光学的測定装置を提供する。
（１）測定用流路。
（２）前記測定用流路の上流に接続し、前記微小粒子を含むサンプル流の層流を形成させるサンプル流用流路。
（３）前記測定用流路に接続し、シース流の層流を形成させるシース流用流路。
（４）前記測定用流路の上流に接続し、前記測定用流路の壁面の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む層流を形成させる参照用層流用流路。
更に、本発明では、試料に光を照射する光照射部と、
前記光照射部により光照射された試料から発せられる光学的情報を検出する光検出部と、
前記光検出部により検出された光学的情報を電気的情報に変換する電気的信号変換部と、
下記（１）から（５）を少なくとも備える流路と、
を少なくとも備えるフローサイトメータを提供する。
（１）測定用流路。
（２）前記測定用流路の上流に接続し、前記試料を含むサンプル流の層流を形成させるサンプル流用流路。
（３）前記測定用流路に接続し、シース流の層流を形成させるシース流用流路。
（４）前記測定用流路の上流に接続し、前記測定用流路の壁面の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む層流を形成させる参照用層流用流路。
（５）前記測定用流路の下流に接続し、前記試料を分取する分取用流路。
前記流路中の壁面の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む層流を形成する参照用層流形成工程と、
前記流路の所定位置において、前記微小粒子及び前記参照用物質からの光学的情報を検出する光学的情報検出工程と、
を少なくとも行う微小粒子の光学的測定方法を提供する。
本発明に係る光学的測定方法では、前記光学的情報検出工程にて検出した光学的情報に基づいて、測定条件を制御する測定条件制御工程を更に行うことも可能である。
本発明に係る光学的測定方法における前記参照用層流形成工程では、前記流路中の壁面の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む層流を形成することができればよいが、前記流路を形成する全壁面に沿って、前記層流を形成することができれば、より好適に光学的測定を行うことができる。
本発明に係る光学的測定方法における前記光学的情報検出工程では、前記参照用物質からの光学的情報の検出ができれば光照射方法は特に限定されないが、一例としては、照射スポットを前記流路幅方向に走査させながら光学的情報を検出する方法が挙げられる。
本発明に係る光学的測定方法における前記光学的情報検出工程では、前記微小粒子及び前記参照用物質の様々な光学的情報を得ることができる。例えば、位置情報等を光学的に検出することが可能である。
該位置情報を用いれば、例えば、本発明に係る光学的測定方法における前記測定条件制御工程において、得られた位置情報に基づいて、前記流路内の流体制御を行うことが可能である。
また、得られた前記位置情報に基づいて、測定時の受光位置の制御を行うことも可能である。
更に、本発明に係る光学的測定方法における前記光学的情報検出工程において、前記微小粒子及び前記参照用物質の光学的信号量を検出することも可能である。そして、該光学的信号量を用いれば、例えば、本発明に係る光学的測定方法における前記測定条件制御工程において、得られた光学的信号量に基づいて、測定時の光学的条件を制御することが可能である。
加えて、本発明に係る光学的測定方法における前記光学的情報検出工程において、前記微小粒子及び前記参照用物質の電気的信号量を検出することも可能である。そして、該電気的信号量を用いれば、例えば、本発明に係る光学的測定方法における前記測定条件制御工程において、得られた電気的信号量に基づいて、測定時の電気的条件を制御することが可能である。
本発明では、次に、流路を通流する微小粒子を分取する方法であって、
前記流路中の壁面の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む層流を形成する参照用層流形成工程と、
前記流路の所定位置において、前記微小粒子及び前記参照用物質からの光学的情報を検出する光学的情報検出工程と、
前記光学的情報に基づいて分取条件を制御する分取条件制御工程と、
を少なくとも行う微小粒子の分取方法を提供する。
本発明に係る光学的測定方法における前記参照用層流形成工程では、前記流路中の壁面の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む層流を形成することができればよいが、前記流路を形成する全壁面に沿って、前記層流を形成することができれば、より好適に微小粒子の分取を行うことができる。
本発明に係る分取方法における前記光学的情報検出工程では、前記参照用物質からの光学的情報の検出ができれば光照射方法は特に限定されないが、一例としては、照射スポットを前記流路幅方向に走査させながら光学的情報を検出する方法が挙げられる。
本発明に係る分取方法における前記光学的情報検出工程では、前記微小粒子及び前記参照用物質の様々な光学的情報を得ることができる。例えば、位置情報等を光学的に検出することが可能である。
該位置情報を用いれば、例えば、本発明に係る分取方法における前記分取条件制御工程において、得られた位置情報に基づいて、前記流路内の分取位置の制御を行うことが可能である。
前記分取位置の制御方向は特に限定されないが、例えば、流路中の微小粒子の流路幅方向位置を制御することにより、分取位置の制御をすることができる。
また、前記流路幅方向位置の制御は、流路幅方向位置の制御ができればその方法は特に限定されないが、例えば、流路内の流体制御を行うことにより、前記分取位置を制御することができる。
本発明では、次に、微小粒子の光学的測定に用いる、複数の層流を形成可能な流路であって、
測定用流路と、
前記測定用流路の上流に接続し、前記微小粒子を含むサンプル流の層流を形成させるサンプル流用流路と、
前記測定用流路の上流に接続し、シース流の層流を形成させるシース流用流路と、
前記測定用流路の上流に接続し、前記測定用流路の壁面の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む層流を形成させる参照用層流用流路と、
を少なくとも備える流路を提供する。
本発明に係る流路には、更に、前記測定用流路の下流に接続し、前記微小粒子を分取する分取用流路を備えることも可能である。
本発明では、次に、微小粒子の光学的測定に用いる光学的測定装置であって、
微小粒子に光を照射する光照射部と、
前記光照射部により光照射された微小粒子から発せられる光学的情報を検出する光検出部と、
前記光検出部により検出された光学的情報を電気的情報に変換する電気的信号変換部と、
下記（１）から（４）を少なくとも備える流路と、
を少なくとも備える光学的測定装置を提供する。
（１）測定用流路。
（２）前記測定用流路の上流に接続し、前記微小粒子を含むサンプル流の層流を形成させるサンプル流用流路。
（３）前記測定用流路に接続し、シース流の層流を形成させるシース流用流路。
（４）前記測定用流路の上流に接続し、前記測定用流路の壁面の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む層流を形成させる参照用層流用流路。
更に、本発明では、試料に光を照射する光照射部と、
前記光照射部により光照射された試料から発せられる光学的情報を検出する光検出部と、
前記光検出部により検出された光学的情報を電気的情報に変換する電気的信号変換部と、
下記（１）から（５）を少なくとも備える流路と、
を少なくとも備えるフローサイトメータを提供する。
（１）測定用流路。
（２）前記測定用流路の上流に接続し、前記試料を含むサンプル流の層流を形成させるサンプル流用流路。
（３）前記測定用流路に接続し、シース流の層流を形成させるシース流用流路。
（４）前記測定用流路の上流に接続し、前記測定用流路の壁面の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む層流を形成させる参照用層流用流路。
（５）前記測定用流路の下流に接続し、前記試料を分取する分取用流路。
本発明に係る光学的測定方法では、測定対象となる微小粒子が通流する流路と同一流路内の壁面に、参照用物質を含む層流を形成するため、実際に対象微小粒子の測定を行うと同時に、参照用物質の測定も可能である。そのため、前段階の準備工程を省略でき、また、測定中に個々の測定条件を変更させることが可能である。従って、測定精度の向上や測定時の時間やコストの大幅な削減が期待できる。
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
＜微小粒子の光学的測定方法＞
図１は、本発明に係る光学的測定方法のフロー図である。
本発明に係る光学的測定方法は、流路を通流する微小粒子を光学的に測定する方法であって、参照用層流形成工程（Ｉ）と、光学的情報検出工程（II）と、を少なくとも行う方法であり、必要に応じて測定条件制御工程（III）を行う方法である。以下、それぞれの工程について、詳細に説明する。
図１は、本発明に係る光学的測定方法のフロー図である。
本発明に係る光学的測定方法は、流路を通流する微小粒子を光学的に測定する方法であって、参照用層流形成工程（Ｉ）と、光学的情報検出工程（II）と、を少なくとも行う方法であり、必要に応じて測定条件制御工程（III）を行う方法である。以下、それぞれの工程について、詳細に説明する。
（Ｉ）参照用層流形成工程
図２は、参照用層流形成工程（Ｉ）の具体的な方法を摸式的に示す図である。図２中符号Ａで示す図は、本発明に係る光学的測定方法で用いる流路を摸式的に示す斜視摸式図であり、図２中符号Ｂで示す図は、図中矢印Ｉ部における断面摸式図である。
図２は、参照用層流形成工程（Ｉ）の具体的な方法を摸式的に示す図である。図２中符号Ａで示す図は、本発明に係る光学的測定方法で用いる流路を摸式的に示す斜視摸式図であり、図２中符号Ｂで示す図は、図中矢印Ｉ部における断面摸式図である。
参照用層流形成工程（Ｉ）は、流路１中の壁面１１の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む参照用層流Ｌ１を形成する工程である。従来、流路を通流する微小粒子Ｃを光学的に測定する場合には、図２中符号Ｌ２に示すように流路１の中央部を測定対象となる微小粒子Ｃを通流させ、微小粒子Ｃに向かって光照射等を行い、光学的測定を行っていた。しかし、この方法では、測定中は、微小粒子Ｃからの情報のみしか得ることができないため、流路１における微小粒子Ｃの位置、光照射スポットの位置、測定に最適な光学的条件および電気的条件等を、測定中に制御することが困難であった。そのため、予め、微小粒子Ｃに対応した参照スペクトルビーズや参照直径ビーズ等を流通させ、流路１中の微小粒子Ｃの位置、光照射スポットの位置、測定に最適な光学的条件および電気的条件等を特定した後に、実際の測定を行うという、前準備工程が必要であった。
しかし、本発明に係る光学的測定方法では、流路１中の壁面１１の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む参照用層流Ｌ１を形成させるため、測定中に、微小粒子Ｃ以外の参照用層流Ｌ１からの情報も同時に検出することが可能である。従って、流路１中の微小粒子Ｃの位置、光照射スポットの位置、測定に最適な光学的条件および電気的条件等の制御を、測定中であっても簡便に行うことが可能となる。
本発明に係る光学的測定方法は、図３に示すような基板Ｔ上に形成したマイクロ流路１中で行うことも可能である。図３中符号Ａで示す図は、基板Ｔ上に形成したマイクロ流路１の上方視平面図であり、符号Ｂで示す図は、基板Ｔ上に形成したマイクロ流路１の側方視断面図である。前記マイクロ流路の流路幅は特に限定されないが、本発明に係る光学的測定方法では、流路幅１ｍｍ以下のマイクロ流路でも行うことが可能である。特に、流路幅１０μｍ以上１ｍｍ以下程度のマイクロ流路を用いれば、本発明に係る光学的測定方法をより好適に行うことができる。
本発明に係る光学的測定方法における参照用層流形成工程（Ｉ）では、流路１中の壁面１１の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む参照用層流Ｌ１を形成することができればよい。従って、図２及び図３に示すように、流路１の壁面１１の１箇所のみに参照用層流Ｌ１を形成させてもよいが、図４及び図５に示すように、流路１の壁面１１の２箇所に参照用層流Ｌ１を形成させてもよい。更に、図示しないが、２箇所に留まらず、流路１の壁面１１の複数個所に参照用層流Ｌ１を形成させることも自由である。
また、図６及び図７に示すように、流路１を形成する全壁面１１に沿って、参照用層流Ｌ１を形成することができれば、より好適に光学的測定を行うことができる。例えば、流路１を形成する全壁面１１に沿って参照用層流Ｌ１を形成すれば、後述する光学的情報検出工程（II）における光照射がいかなる方向からなされても参照用層流Ｌ１を検出することが可能である。また、いかなる方向からの照射においても、流路１の流路幅を検出することが可能である。
更に、流路１を形成する全壁面１１に沿って参照用層流Ｌ１を形成することにより、以下の効果も生じる。図８中符号Ａで示す図は、従来の光学的測定方法に用いる流路１の断面を摸式的に示す断面摸式図であり、図８中符号Ｂで示す図は、本発明に係る光学的測定方法に用いる流路１の断面を摸式的に示す断面摸式図である。
従来の光学的測定方法では、流路１の壁面１１における表面張力の影響で、測定対象となる微小粒子Ｃを整然と通流させることが困難であった。例えば、図８Ａ中符号Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３で示すように、流路１の壁面１１における表面張力で微小粒子Ｃが壁面１１側へ引っ張られたり、ひいては微小粒子Ｃの順番が入れ替わってしまったりすることもあった。また、層流が乱れてしまうことで、微小粒子Ｃの流れも乱れてしまうという問題もあった。
しかし、本発明に係る光学的測定方法における参照用層流形成工程（Ｉ）において、流路１を形成する全壁面１１に沿って参照用層流Ｌ１を形成すれば、流路１の壁面１１における表面張力の影響を減少させることができ、図８Ｂで示すように、微小粒子Ｃを整然と通流させることが可能となる。
以上説明した参照用層流形成工程（Ｉ）において用いる参照用物質は、後述する光学的情報検出工程（II）において光学的情報を検出し得る物質であれば特に限定されない。例えば、蛍光物質、マイクロビーズなどが挙げられる。
（II）光学的情報検出工程
光学的情報検出工程（II）は、流路１の所定位置において、微小粒子Ｃ及び参照用層流Ｌ１に含まれる参照用物質からの光学的情報を検出する工程である。具体的には、参照用物質を含む参照用層流Ｌ１を形成し、微小粒子Ｃを通流させた流路１の所定箇所に、光照射を行い、該光照射によって参照用物質及び微小粒子Ｃから発生される蛍光や散乱光の検出を行う。
光学的情報検出工程（II）は、流路１の所定位置において、微小粒子Ｃ及び参照用層流Ｌ１に含まれる参照用物質からの光学的情報を検出する工程である。具体的には、参照用物質を含む参照用層流Ｌ１を形成し、微小粒子Ｃを通流させた流路１の所定箇所に、光照射を行い、該光照射によって参照用物質及び微小粒子Ｃから発生される蛍光や散乱光の検出を行う。
光学的情報検出工程（II）における光照射の種類は特に限定されないが、参照用物質や微小粒子Ｃから蛍光や散乱光を確実に発生させるためには、光方向、波長、光強度が一定の光が望ましい。一例としては、レーザやＬＥＤ（Light Emission Diode：発光ダイオード）を挙げることができる。
光学的情報検出工程（II）では、参照用物質及び微小粒子Ｃからの光学的情報の検出ができれば光照射方法は特に限定されない。例えば、図９中符号Ｗで示すように、照射スポットを流路幅方向に走査させながら光学的情報を検出する方法が挙げられる。この方法で光学的情報を検出した場合、例えば、図１０のような検出結果を得ることができる。図１０中Ｘ軸は光照射（走査）方向を、Ｙ軸は検出信号量をそれぞれ示す。また、図１０中符号Ｆ１で示す検出値は参照用物質から発せられた検出信号を、符号Ｆ２で示す検出値は微小粒子Ｃから発せられた検出信号をそれぞれ示す。
（III）測定条件制御工程
測定条件制御工程（III）は、光学的情報検出工程（II）で検出した情報に基づいて、測定条件の制御を行う工程である。制御を行う測定条件は特に限定されないが、例えば、流路１中の微小粒子Ｃの位置、光照射スポットの位置、測定に最適な光学的条件および電気的条件等が挙げられる。具体的に、前記光学的条件とは、照射スポットの形状、光照射強度、パルス幅、パルス比率、焦点位置等を示し、前記電気的条件とは、光検出器の増幅率、光照射器の増幅率等を示す。
測定条件制御工程（III）は、光学的情報検出工程（II）で検出した情報に基づいて、測定条件の制御を行う工程である。制御を行う測定条件は特に限定されないが、例えば、流路１中の微小粒子Ｃの位置、光照射スポットの位置、測定に最適な光学的条件および電気的条件等が挙げられる。具体的に、前記光学的条件とは、照射スポットの形状、光照射強度、パルス幅、パルス比率、焦点位置等を示し、前記電気的条件とは、光検出器の増幅率、光照射器の増幅率等を示す。
図１１は、流路１中の微小粒子Ｃの位置及び光照射スポットの位置を制御する方法の一例を示す概念図である。図１１中符号Ａで示す図は、本発明に係る光学的測定方法に用いる流路１の断面を摸式的に示す断面摸式図であり、符号Ｂで示す図は、光学的情報の検出値を示す図面代用グラフである。
図１１Ａ中符号Ｗで示すように、照射スポットを流路幅方向に走査させながら光学的情報を検出したときに、図１１Ｂに示すようなＷ１＞Ｗ２というデータが検出された場合、測定対象の微小粒子Ｃを含むサンプル流Ｌ２が、流路１の中央部より、図面向かって右方向にずれていることが確認できる。
一般に、微小粒子Ｃを含むサンプル流Ｌ２の層流を形成するためには、図１１Ａ中符号Ｌ３１、Ｌ３２で示すように流体媒体（以下「シース流Ｌ３１、Ｌ３２」と称する。）で微小粒子Ｃを挟み込みながら搬送させる方法がとられる。そのため、例えば、図１１中符号Ｌ３２側のシース流Ｌ３２の流量を多くすることにより、図１２で示すように、サンプル流Ｌ２を流路１の中央部に流体制御することができる。
また、微小粒子Ｃを含むサンプル流Ｌ２の流路１中でのずれを確認できれば、前記のように流体制御を行わなくとも、照射スポットを目的の微小粒子Ｃに確実に照射できるように受光位置を制御することも可能である。
従来の方法では、流路１の壁面の位置情報を得る手段がなかったため、微小粒子Ｃの情報を検出できない場合には、微小粒子Ｃが存在しないのか、或いは微小粒子Ｃに照射スポットが確実に照射されていないのかを判断することが難しかった。しかし、本発明に係る光学的測定方法では、流路１の壁面の位置情報を得ることができるため、微小粒子Ｃに確実に照射スポットを位置決めすることができ、測定の精度を向上させることができる。
また、従来の方法では、測定中にサンプル流Ｌ２の流路１内でのずれを確認する手段がなかったため、測定中にサンプル流Ｌ２やシース流Ｌ３１、Ｌ３２等の流体制御を行うことが困難であり、流体制御を行うには、測定の前準備段階において、予め、微小粒子Ｃに対応した参照スペクトルビーズや参照直径ビーズ等を流通させ、最適な流量等の設定を行う必要があった。しかし、本発明に係る光学的測定方法では、測定中に同時にサンプル流Ｌ２の流路１内でのずれを確認することができるため、測定中にサンプル流Ｌ２やシース流Ｌ３１、Ｌ３２等の流体制御を行うことが可能となる。そのため、測定時間の短縮や測定精度の向上が実現できる。
図１３は、本発明に係る光学的測定方法の光学的測定条件及び電気的測定条件を制御する方法の一例を示す概念図である。図１３中符号Ａで示す図は、本発明に係る光学的測定方法に用いる流路１の断面を摸式的に示す断面摸式図であり、符号Ｂで示す図は、光学的情報の検出値を示す図面代用グラフである。
図１３Ａ中符号Ｗで示すように、照射スポットを流路幅方向に走査させながら光学的情報を検出したときに、図１３Ｂに示すようなＦ１＞Ｆ２というデータが検出された場合、光照射パワー又は光検出時の印加電圧等が最適値より低いと判断できる。そして、測定時の光照射パワーや光検出時の印加電圧等の校正や最適化を行うための制御が可能となる。
従来の方法では、測定時の光学的条件や電気的条件は、測定前の準備段階において、予め、微小粒子Ｃに対応した参照スペクトルビーズや参照直径ビーズ等を流通させ、光学的条件や電気的条件の最適値等を見つけ設定する方法であった。しかし、本発明に係る光学的測定方法では、流路１の壁面に沿って、参照用物質を含む参照用層流Ｌ１を形成するため、前記の流体制御のみならず、測定時の光学的条件や電気的条件を、測定中に制御することが可能となる。そのため、測定時間の短縮や測定精度の向上が実現できる。
以上説明した光学的情報検出工程（II）と測定条件制御工程（III）は、本発明に係る光学的測定方法においては、何度も繰り返し行うことが可能である。何度も繰り返すことにより、測定精度の向上を実現することができる。また、光学的情報検出工程（II）と測定条件制御工程（III）を何度も繰り返すことができれば、測定対象となる微小粒子Ｃが複数種存在する場合にも、測定中に、通流する微小粒子Ｃの種類に合わせて、微小粒子Ｃの種類毎に測定条件を制御することが可能である。
（ａ）試料流入工程
本発明に係る光学的測定方法では、参照用層流形成工程（Ｉ）の前、若しくは光学的情報検出工程（II）の前に試料流入工程（ａ）を行う。試料流入工程（ａ）は、測定対象となる微小粒子Ｃを流路１中に流入する工程である。
本発明に係る光学的測定方法では、参照用層流形成工程（Ｉ）の前、若しくは光学的情報検出工程（II）の前に試料流入工程（ａ）を行う。試料流入工程（ａ）は、測定対象となる微小粒子Ｃを流路１中に流入する工程である。
微小粒子Ｃの流路１中への流入方法は特に限定されないが、例えば、整流を促す流体媒体（シース流）で微小粒子Ｃを挟み込みながら搬送する方法が挙げられる。このように搬送すれば、微小粒子Ｃを含むサンプル流Ｌ２の層流を形成することができ、より好適である。前記流体媒体は微小粒子Ｃを含むサンプル流Ｌ２の整流を促す機能を有すれば、その種類は特に限定されないが、例えば、微小粒子Ｃが細胞である場合には、生理食塩水等を用いることができる。
試料流入工程（ａ）では、２次元又は３次元のプラスチックやガラス等の基板上に形成した流路幅１ｍｍ以下のマイクロ流路においても、微小粒子Ｃをシース流で挟み込みながら搬送することにより、微小粒子Ｃを含むサンプル流Ｌ２の層流を形成することができる。
（ｂ）分取工程
本発明に係る光学的測定方法では、必須の工程ではないが、光学的測定を終えた微小粒子Ｃを分取する分取工程（ｂ）を行うことも可能である。例えば、光学的測定により得た微小粒子Ｃの大きさ、形態、内部構造等の情報に基づいて、微小粒子Ｃを分取することができる。
本発明に係る光学的測定方法では、必須の工程ではないが、光学的測定を終えた微小粒子Ｃを分取する分取工程（ｂ）を行うことも可能である。例えば、光学的測定により得た微小粒子Ｃの大きさ、形態、内部構造等の情報に基づいて、微小粒子Ｃを分取することができる。
＜微小粒子の分取方法＞
図１４は、本発明に係る微小粒子の分取方法のフロー図である。
本発明に係る分取方法は、流路を通流する微小粒子を分取する方法であって、参照用層流形成工程（Ｉ）と、光学的情報検出工程（II）と、分取条件制御工程（III）と、を少なくとも行う方法である。以下、それぞれの工程について、詳細に説明する。
図１４は、本発明に係る微小粒子の分取方法のフロー図である。
本発明に係る分取方法は、流路を通流する微小粒子を分取する方法であって、参照用層流形成工程（Ｉ）と、光学的情報検出工程（II）と、分取条件制御工程（III）と、を少なくとも行う方法である。以下、それぞれの工程について、詳細に説明する。
（Ｉ）参照用層流形成工程
図１５は、参照用層流形成工程（Ｉ）の具体的な方法を摸式的に示す図である。図１５中符号Ａで示す図は、本発明に係る分取方法で用いる流路を摸式的に示す斜視摸式図であり、図１５中符号Ｂで示す図は、図中矢印Ｉ部における断面摸式図である。
図１５は、参照用層流形成工程（Ｉ）の具体的な方法を摸式的に示す図である。図１５中符号Ａで示す図は、本発明に係る分取方法で用いる流路を摸式的に示す斜視摸式図であり、図１５中符号Ｂで示す図は、図中矢印Ｉ部における断面摸式図である。
参照用層流形成工程（Ｉ）は、前記光学的測定方法における参照用層流形成工程と同様、流路１中の壁面１１の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む参照用層流Ｌ１を形成する工程である。
本発明に係る分取方法における参照用層流形成工程（Ｉ）では、流路１中の壁面１１の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む参照用層流Ｌ１を形成することができればよい。従って、図１５に示すように、流路１の壁面１１の１箇所のみに参照用層流Ｌ１を形成させてもよいが、前記光学的測定方法における参照用層流形成工程と同様、流路１の壁面１１の２箇所に参照用層流Ｌ１を形成させてもよい（図４及び図５参照）。更に、２箇所に留まらず、流路１の壁面１１の複数個所に参照用層流Ｌ１を形成させることも自由である。
また、前記光学的測定方法における参照用層流形成工程と同様、流路１を形成する全壁面１１に沿って、参照用層流Ｌ１を形成することができれば、より好適に目的の微小粒子Ｃの分取を行うことができる（図６及び図７参照）。例えば、流路１を形成する全壁面１１に沿って参照用層流Ｌ１を形成すれば、後述する光学的情報検出工程（II）における光照射がいかなる方向からなされても参照用層流Ｌ１を検出することが可能である。また、いかなる方向からの照射においても、流路１の流路幅を検出することが可能である。
更に、流路１を形成する全壁面１１に沿って参照用層流Ｌ１を形成することにより、前記光学的測定方法における参照用層流形成工程と同様、流路１の壁面１１における表面張力の影響を減少させることができ、微小粒子Ｃを整然と通流させることが可能となる（図８参照）。
本発明に係る分取方法は、図３、図５、図７に示すような基板Ｔ上に形成したマイクロ流路１中で行うことも可能である。前記マイクロ流路の流路幅は特に限定されないが、本発明に係る分取方法では、流路幅１ｍｍ以下のマイクロ流路でも行うことが可能である。特に、流路幅１０μｍ以上１ｍｍ以下程度のマイクロ流路を用いれば、本発明に係る分取方法をより好適に行うことができる。
以上説明した参照用層流形成工程（Ｉ）において用いる参照用物質は、後述する光学的情報検出工程（II）において光学的情報を検出し得る物質であれば特に限定されない。例えば、蛍光物質、マイクロビーズなどが挙げられる。
（II）光学的情報検出工程
光学的情報検出工程（II）は、流路１の所定位置において、微小粒子Ｃ及び参照用層流Ｌ１に含まれる参照用物質からの光学的情報を検出する工程である。具体的には、参照用物質を含む参照用層流Ｌ１を形成し、微小粒子Ｃを通流させた流路１の所定箇所に、光照射を行い、該光照射によって参照用物質及び微小粒子Ｃから発生される蛍光や散乱光の検出を行う。
光学的情報検出工程（II）は、流路１の所定位置において、微小粒子Ｃ及び参照用層流Ｌ１に含まれる参照用物質からの光学的情報を検出する工程である。具体的には、参照用物質を含む参照用層流Ｌ１を形成し、微小粒子Ｃを通流させた流路１の所定箇所に、光照射を行い、該光照射によって参照用物質及び微小粒子Ｃから発生される蛍光や散乱光の検出を行う。
光学的情報検出工程（II）における光照射の種類は特に限定されないが、参照用物質や微小粒子Ｃから蛍光や散乱光を確実に発生させるためには、光方向、波長、光強度が一定の光が望ましい。一例としては、レーザやＬＥＤ（Light Emission Diode：発光ダイオード）を挙げることができる。
光学的情報検出工程（II）では、参照用物質及び微小粒子Ｃからの光学的情報の検出ができれば光照射方法は特に限定されない。例えば、前記光学的測定方法における参照用層流形成工程と同様、照射スポットを流路幅方向に走査させながら光学的情報を検出する方法が挙げられる（図９参照）。
本発明に係る分取方法では、前記参照用層流形成工程（Ｉ）において、流路１中の壁面１１の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む参照用層流Ｌ１を形成させるため、測定中に、流路１の壁面１１に沿って形成された参照用層流Ｌ１からの情報も同時に検出することが可能である。そのため、流路１における微小粒子Ｃの正確な位置を簡単に把握することができる。
（III）分取条件制御工程
分取条件制御工程（III）は、光学的情報検出工程（II）で検出した情報に基づいて、分取条件の制御を行う工程である。制御を行う分取条件は特に限定されないが、例えば、分取位置条件等が挙げられる。
分取条件制御工程（III）は、光学的情報検出工程（II）で検出した情報に基づいて、分取条件の制御を行う工程である。制御を行う分取条件は特に限定されないが、例えば、分取位置条件等が挙げられる。
分取位置の制御方法は、流路１中の所定の位置で分取できる方法であれば特に限定されない。一例を、図１６を用いて説明する。図１６は、本発明に係る分取方法に用いる流路１の断面を摸式的に示す断面摸式図である。
流路１中を通流し各種測定等を終えた微小粒子Ｃに、分取目的に応じてプラス又はマイナスの電荷を加える（図１６中符号Ｅ参照）。そして、流路１中の分取したい位置毎に偏向板Ｄを備えておけば、帯電された微小粒子Ｃはその電荷に応じていずれかの偏向板に引き寄せられ、分取することができる。
流路１中の分取位置の制御方向は特に限定されない。図１６に示すように、目的の微小粒子Ｃが分取できれば、流路１の通流方向位置の制御を行うことも、幅方向位置の制御を行うことも自由である。
図１７は、本発明に係る分取方法における流路幅方向の分取位置の制御方法の一例を示す図であり、本発明に係る分取方法に用いる流路１の断面を摸式的に示す断面摸式図である。
流路１中を通流し各種測定等を終えた微小粒子Ｃに、分取目的に応じて図１７中符号Ｐ１又はＰ２方向から正圧若しくは負圧をかけることにより、分取することが可能である。このように、流路１の所定位置において正圧若しくは負圧をかけることにより、分取する方法では、以下に示す従来の分取方法での問題点を簡単に解決することができる。
図１８は、従来の分取方法と本発明に係る分取方法とを比較する概念図である。図１８中符号Ａで示す図は、従来の光学的測定方法に用いる流路１の断面を摸式的に示す断面摸式図であり、図１８中符号Ｂで示す図は、本発明に係る分取方法に用いる流路１の断面を摸式的に示す断面摸式図である。
従来、流路を通流する微小粒子を光学的に測定する場合には、微小粒子Ｃからの情報のみしか得ることができないため、微小粒子Ｃの流路１における現実の位置情報を得ることができなかった。そのため、理論的には、図１８中符号Ｃ’で示すように、流路１の中央部を微小粒子Ｃ’が通流する場合であっても、現実には、図１８中符号Ｃで示すように、中央のラインからのずれが生じることがある。この場合、従来の方法では、図１８Ａに示すように、図面向かって左側の流路に分取したい場合であっても、符号Ｃ’の位置に基づいて分取条件を設定してしまうと、図１８Ａで示すように、確実に分取できないという問題があった。
しかし、本発明に係る分取方法では、流路１中の壁面１１の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む参照用層流Ｌ１を形成させるため、測定中に、流路１の壁面１１に沿って形成された参照用層流Ｌ１からの情報も同時に検出することが可能である。そのため、流路１中の微小粒子Ｃの正確な位置を簡単に把握することができ、目的の微小粒子Ｃの流路１内での現実の位置に基づいて、例えば、Ｐ２方向からの加圧力を増加させるなどの手段を取ることが可能である。このように、本発明に係る分取方法では、分取を行う過程において、分取条件を個々に補正することができるため、目的の微小粒子Ｃを確実に分取することが可能となる。
同様の効果は、以下の方法でも実現することができる。図１９は、本発明に係る分取方法における流路幅方向の分取位置の制御方法の一例を示す図であり、本発明に係る分取方法に用いる流路１の断面を摸式的に示す断面摸式図である。
一般に、微小粒子Ｃを含むサンプル流Ｌ２の層流を形成するためには、図１９Ａ中符号Ｌ３１、Ｌ３２で示すように流体媒体（以下「シース流」と称する。）で微小粒子Ｃを挟み込みながら搬送させる方法がとられる。そのため、図１９Ａのようにサンプル流Ｌ２が流路１の中央部からずれていることを確認した場合には、例えば、図１９中符号Ｌ３２側のシース流Ｌ３２の流量を多くすることにより、図１９Ｂに示すように、サンプル流Ｌ２を流路１の中央部に流体制御することができる。
そして、サンプル流Ｌ２を、一旦、流路１の中央部へ流体制御した後、通常の分取を行えば、微小粒子Ｃを確実に分取することができる。
（ａ）試料流入工程
本発明に係る分取方法では、参照用層流形成工程（Ｉ）の前、若しくは光学的情報検出工程（II）の前に資料流入工程（ａ）を行う。試料流入工程（ａ）は、測定対象となる微小粒子Ｃを流路１中に流入する工程である。
本発明に係る分取方法では、参照用層流形成工程（Ｉ）の前、若しくは光学的情報検出工程（II）の前に資料流入工程（ａ）を行う。試料流入工程（ａ）は、測定対象となる微小粒子Ｃを流路１中に流入する工程である。
微小粒子Ｃの流路１中への流入方法は特に限定されないが、例えば、整流を促す流体媒体（シース流）で微小粒子Ｃを挟み込みながら搬送する方法が挙げられる。このように搬送すれば、微小粒子Ｃを含む層流（以下「サンプル流Ｌ２」と称する。）を形成することができ、より好適である。前記流体媒体は微小粒子Ｃを含むサンプル流Ｌ２の整流を促す機能を有すれば、その種類は特に限定されないが、例えば、微小粒子Ｃが細胞である場合には、生理食塩水等を用いることができる。
試料流入工程（ａ）では、２次元又は３次元のプラスチックやガラス等の基板上に形成した流路幅１ｍｍ以下のマイクロ流路においても、微小粒子Ｃをシース流で挟み込みながら搬送することにより、微小粒子Ｃを含むサンプル流Ｌ２の層流を形成することができる。
（ｂ）分取工程
本発明に係る分取方法では、最後の工程として、光学的測定を終えた微小粒子Ｃを分取する分取工程（ii）を行う。例えば、光学的測定により得た微小粒子Ｃの大きさ、形態、内部構造等の情報に基づいて、分取条件を制御し、目的の微小粒子Ｃを分取することができる。
本発明に係る分取方法では、最後の工程として、光学的測定を終えた微小粒子Ｃを分取する分取工程（ii）を行う。例えば、光学的測定により得た微小粒子Ｃの大きさ、形態、内部構造等の情報に基づいて、分取条件を制御し、目的の微小粒子Ｃを分取することができる。
＜流路＞
図２０中符号Ａで示す図は、本発明に係る流路１の一実施形態を示す摸式図であり、符号Ｂで示す図は、基板Ｔ上に形成したマイクロ流路１の上方視平面図である。
本発明に係る流路１は、複数の層流を形成可能な流路であって、微小粒子Ｃの光学的測定に用いることができる流路である。より具体的には、測定用流路１２と、サンプル流用流路１３と、シース流用流路１４と、参照用層流用流路１５と、を少なくとも備える流路１である。
図２０中符号Ａで示す図は、本発明に係る流路１の一実施形態を示す摸式図であり、符号Ｂで示す図は、基板Ｔ上に形成したマイクロ流路１の上方視平面図である。
本発明に係る流路１は、複数の層流を形成可能な流路であって、微小粒子Ｃの光学的測定に用いることができる流路である。より具体的には、測定用流路１２と、サンプル流用流路１３と、シース流用流路１４と、参照用層流用流路１５と、を少なくとも備える流路１である。
測定用流路１２では、微小粒子Ｃの光学的測定を行う。光学的測定方法は特に限定されないが、例えば、微小粒子Ｃを通流させた測定用流路１２の所定箇所に、光照射を行い、該光照射によって微小粒子Ｃから発生される蛍光や散乱光の検出を行うことにより、微小粒子の大きさ、形態、内部構造等の情報等を測定する。
前記測定用流路１２の流路幅は特に限定されないが、図２０Ｂで示すように、例えば２次元又は３次元のプラスチックやガラス等の基板上に流路幅１ｍｍ以下のマイクロ流路として形成することも可能である。特に、流路幅１０μｍ以上１ｍｍ以下程度のマイクロ流路を用いれば、本発明に係る光学的測定方法をより好適に行うことができる。
サンプル流用流路１３は、測定用流路１２の上流に接続し、微小粒子Ｃを含むサンプル流の層流を形成させる流路である。サンプル流用流路１３の形状、測定用流路への接続方法などは、微小粒子Ｃを含むサンプル流の層流を形成し得る構造であれば特に限定されず、自由に設計することが可能である。
シース流用流路１４は、測定用流路１２の上流に接続し、シース流の層流を形成させる流路である。シース流とは、微小粒子Ｃを流路１中で一列に整列させながら通流させるための流体媒体をいう。シース流用流路１４の形状、測定用流路への接続方法などは、シース流の層流を形成し得る構造であれば特に限定されず、自由に設計することが可能である。
参照用層流用流路１５は、測定用流路１２の上流に接続し、測定用流路１２の壁面１１の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む層流を形成させる流路である。前記参照用物質は、測定用流路１２において光学的情報を検出し得る物質であれば特に限定されない。例えば、蛍光物質、マイクロビーズなどが挙げられる。
参照用層流用流路１５の形状、測定用流路への接続方法などは、測定用流路１２の壁面１１の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む層流を形成し得る構造であれば特に限定されず、自由に設計することが可能である。
図２１中符号Ａで示す図は、本発明に係る流路１の図２０とは異なる実施形態を示す摸式図であり、符号Ｂで示す図は、基板Ｔ上に形成したマイクロ流路１の上方視平面図である。
本発明に係る流路１は、図２１に示すように、測定用流路１２、サンプル流用流路１３、シース流用流路１４、参照用層流用流路１５以外に、分取用流路１６を更に備えていてもよい。
本発明に係る流路１は、図２１に示すように、測定用流路１２、サンプル流用流路１３、シース流用流路１４、参照用層流用流路１５以外に、分取用流路１６を更に備えていてもよい。
分取用流路１６は、測定用流路１２の下流に接続し、微小粒子Ｃを分取するための流路である。分取用流路１６の形状、測定用流路への接続方法などは、微小粒子Ｃが分取できる構造であれば特に限定されず、自由に設計することが可能である。
以上説明した本発明に係る流路１は、前述の微小粒子の光学的測定方法及び分取方法に好適に用いることが可能である。
また、例えば、図２２に示すように、２次元又は３次元のプラスチックやガラス等の基板Ｔ上に形成した複数の流路１を用いて同時に光学的測定を行う場合には特に有効である。図２２は、基板Ｔ上に複数形成した流路１の上方視平面図である。
本発明に係る流路１は、測定用流路１２の壁面１１の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む層流を形成させるための参照用層流用流路１５を備えているため、流路１の位置を正確に把握することが可能である。そのため、例えば、図２２中符号Ｗで示すように、照射スポットを流路幅方向に走査させながら光学的情報を検出する場合、それぞれの流路１の位置を確実に把握することができ、流路内の微小粒子Ｃへの光照射等を確実に行うことが可能である。従って、測定や分取の前準備段階において、予め、微小粒子Ｃに対応した参照スペクトルビーズや参照直径ビーズ等を流通させ、各流路１の位置を確認する必要がなく、測定時間の短縮や測定精度の向上が実現できる。
また、本発明に係る流路１を用いれば、測定対象となる微小粒子Ｃの測定と同時に参照物質からの情報も得ることができる。そのため、測定時や分取時に、測定条件や分取条件の補正等を行うことができる。従って、測定や分取の前準備段階において、予め、微小粒子Ｃに対応した参照スペクトルビーズや参照直径ビーズ等を流通させ、光学的条件や電気的条件の最適値を設定する必要がなく、測定時間の短縮や測定精度の向上が実現できる。
＜光学的測定装置・フローサイトメータ＞
本発明に係る流路１は、光学的測定装置やフローサイトメータに好適に用いることができる。図２３は、本発明に係る光学的測定装置（フローサイトメータ）２の一実施形態を示す摸式図である。
本発明に係る流路１は、光学的測定装置やフローサイトメータに好適に用いることができる。図２３は、本発明に係る光学的測定装置（フローサイトメータ）２の一実施形態を示す摸式図である。
本発明に係る光学的測定装置（フローサイトメータ）２は、大別すると、光照射部２１と、光検出部２２と、電気的信号変換部２３と、流路１と、を備えており、微小粒子Ｃの光学的測定に用いる装置である。
光照射部２１では、流路１中の微小粒子Ｃや参照物質に光照射を行う。光照射の種類は特に限定されないが、参照用物質や微小粒子Ｃから蛍光や散乱光を確実に発生させるためには、光方向、波長、光強度が一定の光が望ましい。一例としては、レーザやＬＥＤ（Light Emission Diode：発光ダイオード）を挙げることができる。
光検出部２２では、前記光照射部２１からの光照射によって参照用物質及び微小粒子Ｃから発生される蛍光や散乱光の検出を行う。光検出の方法は、特に限定されないが、例えば、蛍光や散乱光を集光レンズ等で集め、ダイクロイックミラー等で振り分けて検出する方法が挙げられる。
電気的信号変換部２３では、前記光検出部２２により検出された光学的情報を電気的情報に変換する。電気的信号に変換された情報は、更に数値化され、該数値データを基に各種の解析を行うことができる。
本発明に係る光学的測定装置及びフローサイトメータは、前述の流路１を備えているため、流路１中の微小粒子Ｃの位置、光照射スポットの位置、測定に最適な光学的条件および電気的条件等を、測定中に制御することが可能となる。そのため、測定時間の短縮や測定精度の向上が実現できる。
また、分取を行う過程においても、分取条件を個々に補正することができるため、目的の微小粒子Ｃに応じて確実に分取することが可能となる。
１ 流路
１１ 流路壁面
１２ 測定用流路
１３ サンプル流用流路
１４ シース流用流路
１５ 参照用層流用流路
１６ 分取用流路
２ 光学的測定装置、フローサイトメータ
２１ 光照射部
２２ 光検出部
２３ 電気的信号変換部
Ｃ 微小粒子
Ｔ 基板
Ｌ１ 参照用層流
Ｌ２、Ｌ２２ サンプル流
Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３３ シース流
１１ 流路壁面
１２ 測定用流路
１３ サンプル流用流路
１４ シース流用流路
１５ 参照用層流用流路
１６ 分取用流路
２ 光学的測定装置、フローサイトメータ
２１ 光照射部
２２ 光検出部
２３ 電気的信号変換部
Ｃ 微小粒子
Ｔ 基板
Ｌ１ 参照用層流
Ｌ２、Ｌ２２ サンプル流
Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３３ シース流
Claims (18)
- 流路を通流する微小粒子を光学的に測定する方法であって、
前記流路中の壁面の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む層流を形成する参照用層流形成工程と、
前記流路の所定位置において、前記微小粒子及び前記参照用物質からの光学的情報を検出する光学的情報検出工程と、
を少なくとも行う微小粒子の光学的測定方法。 - 前記光学的情報に基づいて測定条件を制御する測定条件制御工程を更に行うことを特徴とする請求項１記載の光学的測定。
- 前記参照用層流形成工程では、前記流路を形成する全壁面に沿って、参照用物質を含む層流を形成することを特徴とする請求項１又は２記載の微小粒子の光学的測定方法。
- 前記光学的情報検出工程では、照射スポットを前記流路幅方向に走査させながら光学的情報を検出することを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の微小粒子の光学的測定方法。
- 前記光学的情報検出工程では、前記微小粒子及び前記参照用物質の位置情報を光学的に検出し、
前記測定条件制御工程では、得られた前記位置情報に基づいて、前記流路内の流体制御を行うことを特徴とする請求項２から４のいずれか一項に記載の微小粒子の光学的測定方法。 - 前記光学的情報検出工程では、前記微小粒子及び前記参照用物質の位置情報を光学的に検出し、
前記測定条件制御工程では、得られた前記位置情報に基づいて、測定時の受光位置の制御を行うことを特徴とする請求項２から５のいずれか一項に記載の微小粒子の光学的測定方法。 - 前記光学的情報検出工程では、前記微小粒子及び前記参照用物質の光学的信号量を検出し、
前記測定条件制御工程では、得られた光学的信号量に基づいて、測定時の光学的条件を制御することを特徴とする請求項２から６のいずれか一項に記載の微小粒子の光学的測定方法。 - 前記光学的情報検出工程では、前記微小粒子及び前記参照用物質の電気的信号量を検出し、
前記測定条件制御工程では、得られた電気的信号量に基づいて、測定時の電気的条件を制御することを特徴とする請求項２から７のいずれか一項に記載の微小粒子の光学的測定方法。 - 流路を通流する微小粒子を分取する方法であって、
前記流路中の壁面の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む層流を形成する参照用層流形成工程と、
前記流路の所定位置において、前記微小粒子及び前記参照用物質からの光学的情報を検出する光学的情報検出工程と、
前記光学的情報に基づいて分取条件を制御する分取条件制御工程と、
を少なくとも行う微小粒子の分取方法。 - 前記参照用層流形成工程では、前記流路を形成する全壁面に沿って、参照用物質を含む層流を形成することを特徴とする請求項９記載の微小粒子の分取方法。
- 前記光学的情報検出工程では、照射スポットを前記流路幅方向に走査させながら光学的情報を検出することを特徴とする請求項９又は１０に記載の微小粒子の分取方法。
- 前記光学的情報検出工程では、前記微小粒子及び前記参照用物質の位置情報を光学的に検出し、
前記分取条件制御工程では、得られた前記位置情報に基づいて、前記流路内の分取位置の制御を行うことを特徴とする請求項９から１１のいずれか一項に記載の微小粒子の分取方法。 - 前記分取位置の制御では、前記流路における微小粒子の流路幅方向位置を制御することを特徴とする請求項１２記載の微小粒子の分取方法。
- 流体制御を行うことにより前記流路における微小粒子の流路幅方向位置を制御することを特徴とする請求項１３記載の微粒子の分取方法。
- 微小粒子の光学的測定に用いる、複数の層流を形成可能な流路であって、
測定用流路と、
前記測定用流路の上流に接続し、前記微小粒子を含むサンプル流の層流を形成させるサンプル流用流路と、
前記測定用流路の上流に接続し、シース流の層流を形成させるシース流用流路と、
前記測定用流路の上流に接続し、前記測定用流路の壁面の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む層流を形成させる参照用層流用流路と、
を少なくとも備える流路。 - 前記測定用流路の下流に接続し、前記微小粒子を分取する分取用流路を更に備える請求項１５記載の流路。
- 微小粒子の光学的測定に用いる光学的測定装置であって、
微小粒子に光を照射する光照射部と、
前記光照射部により光照射された微小粒子から発せられる光学的情報を検出する光検出部と、
前記光検出部により検出された光学的情報を電気的情報に変換する電気的信号変換部と、
下記（１）から（４）を少なくとも備える流路と、
を少なくとも備える光学的測定装置。
（１）測定用流路。
（２）前記測定用流路の上流に接続し、前記微小粒子を含むサンプル流の層流を形成させるサンプル流用流路。
（３）前記測定用流路に接続し、シース流の層流を形成させるシース流用流路。
（４）前記測定用流路の上流に接続し、前記測定用流路の壁面の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む層流を形成させる参照用層流用流路。 - 試料に光を照射する光照射部と、
前記光照射部により光照射された試料から発せられる光学的情報を検出する光検出部と、
前記光検出部により検出された光学的情報を電気的情報に変換する電気的信号変換部と、
下記（１）から（５）を少なくとも備える流路と、
を少なくとも備えるフローサイトメータ。
（１）測定用流路。
（２）前記測定用流路の上流に接続し、前記試料を含むサンプル流の層流を形成させるサンプル流用流路。
（３）前記測定用流路に接続し、シース流の層流を形成させるシース流用流路。
（４）前記測定用流路の上流に接続し、前記測定用流路の壁面の少なくとも一部に沿って参照用物質を含む層流を形成させる参照用層流用流路。
（５）前記測定用流路の下流に接続し、前記試料を分取する分取用流路。
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