CN103063628A - 一种多荧光染料的激发方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多荧光染料的激发方法，用于激发多个荧光染料，多个荧光染料所需的总激发光强度为W，每个荧光染料各自所需的最佳激发光的波长分别为X、Y等，同时采用两种以上单色激光束共同对多个荧光染料进行激发，两种以上单色激光束的总强度为W，两种以上单色激光束的波长分别为X、Y等。本发明同时使用两种以上单色激光束共同对多个荧光染料进行激发，可大大降低光源成本，从而降低荧光染料的激发成本，有利于荧光染料激发技术的推广应用。

Description

一种多荧光染料的激发方法

技术领域

本发明涉及荧光染料，尤其与多荧光染料的激发有关。

背景技术

DNA测序是现代分子生物学研究中的重要技术，自动高速的进行DNA测序是该技术追求的主要目标之一。1986年，Smith提出了四色荧光标记自动测序法：四种具有不同发射波长的荧光染料标记由聚合酶链反应产生的一系列终止片段，经过聚丙烯酰胺或毛细管电泳分离后，采用激光对分离的DNA片段携带的荧光信号进行激发，检测并记录不同发射波长的荧光信号，经计算机处理，最后得到序列信息。建立在荧光基础上的检测分析技术，由于具有多色分析、快速和使用简单的优点，被广泛使用在法医实验室中。在STR（Short Tandem Repeat，短串联重复序列）遗传标记的DNA分型应用中，荧光染料与一条PCR（PolymeraseChain Reaction，聚合酶链反应）引物相连接，扩增后荧光染料掺入目的DNA的产物。扩增后的STR等位基因在凝胶上以谱带的形式或在电泳图谱中以峰的形式出现。

荧光染料吸收和发射光谱之间的差异被称作斯托克斯位移(Stokes shift)。由于斯托克斯位移的存在，可以使用光学滤光片把激发光和发射光分开。每种荧光染料都有其特定的吸收光谱和发射光谱，有了合适的光学滤光片，就可以仔细地选用那些发射光谱彼此分开的荧光染料。这种特性容许使用多种荧光染料同时检测几种不同的DNA分子，用多色荧光检测要比单色荧光检测快很多。

最佳荧光染料的选择需要考虑荧光染料的发射光谱性质和用于检测的仪器的性能之间的关系，而荧光染料发射光的强度直接取决于激发荧光染料的光强，因此，激发光的光源对荧光染料的使用有着十分重要的影响。激光器是一种有效的发射激发光的光源，目前氩离子(Ar+)激光器被广泛应用于可见光谱内荧光染料的激发。氩离子激光器是气体激光器，产生的光的波长有很多种，主要分布在480～520nm之间。氩离子激光器产生光的这几种波长相互补充，整体提高了多种荧光染料的激发效率和均匀性。但是氩离子激光器的体积大、功耗大，尤其是成本非常高，因此大大提高了荧光染料激发的成本，增加了使用者的经济负担，严重影响该技术的推广使用。固体激光器制作简单、成本低廉，如果能够使用固体激光器来激发荧光染料，将大大降低荧光染料的激发成本。但是目前的一种固体激光器只能发射一种波长的光，固体激光器的单一波长在实现多色荧光光谱激发的时候很难同时兼顾每种染料的激发，因此使得固体激光器很难在荧光染料激发领域推广使用。

发明内容

本方明的目的是提供一种可使用如固体激光器的低廉光源发射的光束来激发荧光染料，从而大大降低荧光染料激发成本，强有力推动荧光染料激发技术的应用普及的多荧光染料的激发方法。

为达成上述目的，本发明提供了以下的技术方案：

一种多荧光染料的激发方法，用于激发多个荧光染料，所述多个荧光染料所需的总激发光强度为W，每个荧光染料各自所需的最佳激发光的波长分别为X、Y等，同时采用两种以上单色激光束共同对所述多个荧光染料进行激发，所述两种以上单色激光束的总强度为W，所述两种以上单色激光束的波长分别为X、Y等。

进一步，使用固体激光器发射所述单色激光束。

进一步，所述多个荧光染料容置于一毛细管中。

进一步，所述多个荧光染料分别为FAM、JOE、TAMRA、ROX和Cy5，所述两种以上单色激光束分别是波长为488纳米的单色激光束和波长为514.5纳米的单色激光束，所述两种以上单色激光束的总强度为25毫瓦，所述波长为488纳米的单色激光束的强度为10±3毫瓦，所述波长为514.5纳米的单色激光束的强度为15±3毫瓦。

进一步，所述波长为488纳米的单色激光束的强度为10毫瓦，所述波长为514.5纳米的单色激光束的强度为15毫瓦。

进一步，所述两种以上单色激光束通过光纤合束的方法进行合束。

本发明与现有技术相比，具有如下显著的进步：

1、本发明同时使用两种以上单色激光束共同对多个荧光染料进行激发，可达到使用氩离子激光器多波长激光组合对多个荧光染料进行激发的相同效果，由于每种单色激光束均可分别通过固体激光器获得，比氩离子激光器的多波长激光的获得成本低，因此使用两种以上单色激光束对多个荧光染料进行激发可大大降低光源成本，从而降低荧光染料的激发成本，有利于荧光染料激发技术的推广应用。

2、本发明使用10毫瓦的488纳米波长的单色激光束与15毫瓦的514.5纳米波长的单色激光束的组合，同时对FAM、JOE、TAMRA、ROX和Cy5五种荧光染料进行激发，实现FAM、JOE、TAMRA、ROX和Cy5同时检测，并平衡单一波长激发荧光染料光谱的不均匀性，提高光谱检测稳定性，还可以调整组合激光束的能量分布，降低荧光光谱检测中对荧光染料浓度的依赖程度。

附图说明

图1为使用两种单色激光束同时激发荧光染料的结构示意图。

附图标记说明如下：

1 组合激光束；

2 荧光染料；

3 毛细管；

4 荧光染料的发射光谱；

5 线阵CCD（Charge-Coupled Device，电荷耦合元件）；

6 固体激光器；

7 计算机；

8 光纤合束器。

具体实施方式

下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。

在生物识别技术中需要用到荧光染料作为标记物质，目前发现和使用的荧光染料的光谱带宽都在20nm以上，在荧光染料选择与组合设计中，为了提高检测通量，通常采用多荧光染料组合进行物质特征分析。由于不同荧光染料的吸收光谱的波长各不相同，对应的受激发射的发射光谱的波长也不相同，为了改善不同荧光染料发射光谱强度分布的不均匀性，本发明提出一种使用两种以上单色激光束组合激发多荧光染料的方法。在该方法中，在已知多个荧光染料所需的总激发光强度为W，每个荧光染料各自所需的最佳激发光的波长分别为X、Y等的条件下，同时采用两种以上单色激光束共同对上述多个荧光染料进行激发，该两种以上单色激光束的总强度为W，该两种以上单色激光束的波长分别为X、Y等。本方法适用医疗、化学化工、生物制药、法医分析等涉及到毛细管阵列分析的高通量微量分析技术的领域。

如图1所示，本发明采用两个固体激光器6分别发射出两种单色激光束，该两种单色激光束经过光纤合束器的合束作用后组合为用于激发的组合激光束1，多个荧光染料2容置于一毛细管3中，组合激光束1穿过毛细管3，并激发毛细管3中的荧光染料2，荧光染料2受激发后发射光谱4被线阵CCD5采集，线阵CCD5将光信号转换为电信号后，发送到计算机7，计算机7对该信号进行分析，并得出检测结论。目前，激光器一般包括气体激光器、液体激光器、固体激光器、半导体激光器、自由电子激光器等几种。本发明中，固体激光器6的制作成本低廉，可大大降低本发明多荧光染料激发方法的成本，便于多荧光染料激发技术的推广应用。

下面通过一个具体的实施例对本发明的多荧光染料激发方法作进一步详细说明。由于荧光染料吸收光谱和发射光谱的依赖关系，要想找到同时激发多种荧光染料的激光器就要首先获得该多种荧光染料的吸收光谱。下面以FAM、JOE、TAMRA、ROX和Cy5五种染料为例进行说明。

在单独采用488纳米单一波长激光器激发上述五种荧光染料时，FAM染料激发强度变化不大，而其他四种染料的激发强度都降低了。在单独采用514.5纳米单一波长激光器单独激发上述五种荧光染料时，FAM激发强度减弱非常厉害，Cy5激发强度也有所减弱，而其他三种荧光染料的激发强度都增强了。在采用488纳米波长和514.5纳米波长激光束组合后对上述五种荧光染料进行激发时，该两单色激光束可以采用光纤合束或其他方式进行合束，已达到组合效果。该两单色激光束合束后的激光总强度还是25毫瓦（该强度为上述五种荧光染料激发光的最佳激发强度），但是488纳米波长单色激光束的强度为10毫瓦，514.5纳米波长单色激光束的强度为15毫瓦，此时对上述五种荧光染料的激发可以得到最优的效果。用两个固体激光器以上述的强度比例组合发射激发光束，即可实现对多荧光染料的激发，将本发明的方法应用到STR检测中，将很大程度上解决目前用气体激光器发射激光带来的体积大、价格高的问题，同时也可以解决用单一固体激光器发射激光带来的多荧光染料激发不均匀的问题。

本发明使用10毫瓦的488纳米波长的单色激光束与15毫瓦的514.5纳米波长的单色激光束的组合，同时对FAM、JOE、TAMRA、ROX和Cy5五种荧光染料进行激发，实现FAM、JOE、TAMRA、ROX和Cy5同时检测，并平衡单一波长激发荧光染料光谱的不均匀性，提高光谱检测稳定性，还可以调整组合激光束的能量分布，降低荧光光谱检测中对荧光染料浓度的依赖程度。

本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

Claims (6)

1.一种多荧光染料的激发方法，用于激发多个荧光染料，所述多个荧光染料所需的总激发光强度为W，每个荧光染料各自所需的最佳激发光的波长分别为X、Y等，其特征在于，同时采用两种以上单色激光束共同对所述多个荧光染料进行激发，所述两种以上单色激光束的总强度为W，所述两种以上单色激光束的波长分别为X、Y等。

2.根据权利要求1所述的多荧光染料的激发方法，其特征在于，使用固体激光器发射所述单色激光束。

3.根据权利要求1所述的多荧光染料的激发方法，其特征在于，所述多个荧光染料容置于一毛细管中。

4.根据权利要求1所述的多荧光染料的激发方法，其特征在于，所述多个荧光染料分别为FAM、JOE、TAMRA、ROX和Cy5，所述两种以上单色激光束分别是波长为488纳米的单色激光束和波长为514.5纳米的单色激光束，所述两种以上单色激光束的总强度为25毫瓦，所述波长为488纳米的单色激光束的强度为10±3毫瓦，所述波长为514.5纳米的单色激光束的强度为15±3毫瓦。

5.根据权利要求4所述的多荧光染料的激发方法，其特征在于，所述波长为488纳米的单色激光束的强度为10毫瓦，所述波长为514.5纳米的单色激光束的强度为15毫瓦。

6.根据权利要求1-5任一所述的多荧光染料的激发方法，其特征在于，所述两种以上单色激光束通过光纤合束的方法进行合束。

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