CN102803506A - 核酸检测 - Google Patents

Abstract

公开了用于检测样品中的多种分析物的方法，其包括：选择一个或多个引物；用不同的染料标记每一个引物并置于反应容器中；加入待分析的样品；使样品经受倍增过程，根据大小分离扩增子；定量所存在的大小和确定每一种大小的颜色；将所产生的定量和颜色与已知的数据进行比较以确定扩增子的性质。还公开了用于实施所述方法的仪器。

Description

核酸检测

技术领域

本发明涉及核酸的检测和鉴别，特别涉及多元核酸检测系统。

发明背景

核酸(例如病毒的)的多元检测被特别描述于专利说明书WO/2004/085455中，其描述了将样品置于多个孔中，然后平行地使每个样品都经受检测过程。

已显示，有可能通过免疫学技术来对引起疾病的试剂进行多元检测，一个实例是LUMINEX系统，其被描述于专利说明书WO/2002/024959中。另一种技术是将靶分子杂交到阵列上，如专利说明书WO/2008/054830中所描述的。此类方法的劣势是用于生成结果所花费的时间。此外，它们需要大量样品以确保能够成功地检测通常非常稀释的分析物。备选的方法是PCR方法，其被描述于美国专利说明书No.4,683,202中。传统地，核酸是在PCR之后通过大小分级而被检测的，这是一个费时的过程，但是当使所产生的扩增物经受某些下游过程(例如电泳)时，有可能通过其大小而检测多重分析物。近来，大多数核酸检测系统依赖于实时PCR，例如美国专利说明书No.6,814,934中所描述的。实时PCR的明显劣势是对于用于进行测试的设备的物理限制-它们受限于检测最多5种靶分子。这一限制是物理的，是由于其光学系统的设计并且光学设计还导致光学通道之间的串扰。由于来自所需分析物的光被来自存在于反应容器中的其它产物的光投上阴影，这实际上使得很难对所存在的分析物的水平进行定量。

因此，目标仍旧是能够在尽可能短的时间内检测单一样品中的所有病原体。当诱发剂可以是病毒和/或细菌组中的任意一种时，未鉴别的感染的爆发很好地呈现了要满足这种需求的情形。在广泛的领域中也有此目标，例如人类遗传学和用于案发现场分析的DNA指纹分析。另一个重要的目标是准确检测和鉴别短的核酸序列，其在亚75bp、但优选亚60bp扩增子大小的范围内。这些用传统的方法(包括上述那些)不能被可靠地分析。

置于目前可获得的化学作用之上的限制是由测试方法本身的特征所施加的。检测的遗传学方法包括使用嵌合染料(例如SYBR)，其允许检测但是在应用领域具有如下的主要劣势：它们不是核酸序列特异性的。这引起发明了许多要求分子相互作用的检测系统或探针，其要求存在正确的核酸序列以产生信号。这些的一个实例被描述于专利说明书WO97/46707中。此方法的劣势是，额外的分子在此类技术上设置了设计负担，因为有可能被检测到的最小大小的扩增子。此外，由探针提供的分子检测是更高阶的事件，因为必须允许有时间以使信号生成。

自探测引物是本领域已知的，然而，那些(例如LUX系统)不是序列特异性的，并且所产生的任何伪产物都将类似地生成信号。其它已知的化学作用，即Scorpions GB 2338301和‘Angler’方法(Lee，M.A.et al.(2002)，Analytica Clinica Acta 457：61：70；Whitcombe，D.et al.(1999)，Nature Biotechnology 17：804-807)，利用的是它们自身在经扩增的序列内探测的引发序列。这些因而要求发生更高阶的事件，即与所希望的靶杂交并且不迎合短的扩增物，因为必须有足够的空间以允许待探测的序列被包含在扩增物内。

本发明提出了许多克服这些限制的手段，特别是关于检测大小在60个碱基以下的短核酸片段，60个碱基的大小是现存的化学反应所要求的。嵌合染料方法虽然扩增效率高，但将倾向于似乎对于短的产物具有低的特异性，因为高的背景掩盖了短的扩增子所产生的相对低的信号。此外，此类短的扩增子就是不具有足够的可得碱基用于采用传统的探针方法，且60个碱基左右似乎是分界点。

此类短的扩增子在其中靶DNA可能被剪断的测试中是有利的，例如当试图检测经宿主免疫系统处理的病原体核酸时就是这种情形。备选地，小的干扰RNA(siRNA)研究的焦点在于大小在20至超过30个碱基范围中的双链RNA分子，而使用现有的探针技术不可能检测这些分子。可能的情况是，区分致病型的DNA序列可由核苷酸的短的重复组成，而能够准确地确定仅仅是重复的数目却不受来自相同的基因组区域的干扰可以是有利的。此种方法对于所有测定类型的其它益处是此类短扩增子所固有的增加的反应速度和PCR效率。

在本专利说明书中，用语容器是指能够盛载待处理的物质或样品的任何设备，并且因此可包括下列或由下列组成：孔、管(开放或闭合的)、玻片(可能是以硅片的形式)或盘。本发明特别涉及孔形式的微量滴定容器。

在本专利说明书中，术语热循环用于指循环地加热样品至多个温度。典型的热循环过程是聚合酶链式反应(PCR)，其中采用三种温度(较高的变性温度，中等的延伸温度和较低的重组温度)。理想地，在热循环的过程中，尽可能准确和快速地达到所需的温度并维持，从而使得所述过程所花费的时间最小化。

存在进行实时分析的系统。专利说明书WO2004045772描述了一种此类系统。然而，这些系统局限于多元分析方法，例如熔点测定和上文中提及的实时PCR方法。类似地，存在用于大小分离的脱机系统，例如美国专利说明书5552322中所描述的DNA测序仪。

因此，本发明的重要目的是提供用于对核酸分析物进行高效多元分析的系统。

发明简述

根据本发明的第一个方面，检测样品中多种分析物的方法包括：

·根据所预期的分析物的性质选择一个或多个引物，用不同的染料标记每一个引物并且将其置于反应容器中；

·将待分析的样品置于所述反应容器中；

·使所述样品经受倍增过程；

·根据大小分离经倍增的样品的组分，此后称作扩增物；

·量化所存在的大小并且确定每种大小的颜色；以及

·将所产生的量化和颜色与已知的数据进行比较，以确定所存在的靶扩增物或每种所存在的靶扩增物的性质或其部分的性质。

将领会到，本发明的这一方面的倍增过程可在单一的反应容器中实现，尽管样品中可能存在多种核酸。

可通过使扩增物经受电压从而进行电泳来分离扩增物组分。备选地，可采用离心。

典型的分离介质包括琼脂糖，聚丙烯酰胺和其它本领域中所熟知的。

过程可包括将经倍增的样品从反应容器转移至光学检测仪器，后者可能包括毛细管，在其中进行大小的定量和颜色的确定。可使用微流体系统来实现所述转移。然而，将领会，整个过程可在试剂盒中进行，所述试剂盒在一个实施方式中可以是手持尺寸，在另一个实施方式中可以是小的桌上型尺寸，而在另一个实施方式中可以是实验室设备比例，并且在每种情形中都可以是自动化的。

尽管倍增仪器可能与光学检测仪器相分离，本发明的特征是容易地可能提供用于实现上述过程的仪器，其是手工地便携的并且因而容许现场使用，例如由去探访爆发了某些疾病的农场的兽医使用或者其它。来自所涉及的动物或兽群的疾病迹象将就起因病原体的性质提供一些指征并且可据此选择引物和染料。

设备可以是能够检测至少两种分析物的，虽然在单一的闭合管测定中应当能够实现检测超过十种，甚至超过二十种。

根据本发明的第二个方面，提供了用于检测样品中的多种分析物的仪器，其包括：

·反应容器；

·使反应容器中的样品经受倍增过程的工具；

·可操作以根据大小分离扩增物组分的分离台；

·用于定量所存在的大小和确定每种大小的颜色的光学检测工具；以及

·用于将所产生的定量和颜色与已知的数据进行比较以确定所存在的靶扩增物或每种所存在的靶扩增物的性质或其部分的性质的工具。

优选地，所述反应容器是微量滴定孔，所述样品倍增工具包括PCR仪，所述分离台包括用于向扩增物应用电压的工具，且用于使扩增物经受分离电压的工具包括电泳仪，所述光学检测工具包括光谱检测仪。

本发明因此提供了用于同时检测多种核酸的设备，其通过倍增它们以产生预期核酸的扩增物(例如通过PCR)，然后根据物理大小分离所产生的扩增物。有效地，此手段能够同时根据大小和颜色鉴别经扩增的靶标。此设备大大增加了一次操作中可检测的分析物的数目，在此情形中是病原体。此外，可在60分钟内、有可能甚至在30分钟内完成操作。

根据本发明的特征，样品中的寡核苷酸在设备内被荧光标记。这样，可检测到很短的寡核苷酸引物序列。合适的染料包括，特别是荧光标记例如荧光素、TET、HEX。这是系统的所谓化学作用部分。

这一化学作用部分相对于现有技术的系统所具有的优势是：去除了对于以前产生序列特异性信号所必需的额外分子的需要。这相对于现存的方法带来了重要的双重优势：其一，对于序列检测可以考虑更小的区域；其二，更小的扩增子和缺少更高阶的事件使得能够更快地检测目的病原体。

因此，所述设备可被用于鉴别大小相差1bp的PCR产物，且使用上文所述的经荧光标记的引物同时鉴别15种或更多种。

然后使用上述分离系统来分离产物。然后，当经分离的片段经受分光镜分析仪的光学审查时，可基于在预期的波长和大小条带中是否存在光而采用合适的软件来自动化地为终端用户解释结果。

因此，本发明是这样的系统：其能够进行快速的多元实时PCR并且随后根据大小分离所产生的扩增子，其特性可通过特定编写的软件被自动化地分辨。此外，所述系统可被用于区分对于本领域操作者而言显然的各种靶标的任何短的(亚60bp)扩增物。

在操作中，料想可以如此构建测试从而使给定组的所有靶标都将被相同的染料标记并且进行实时分析以鉴别所述组。然后可通过随后的大小分离而立即提供组内的亚分型。这是依赖于测定的，并且所述系统然后可区分单一容器中的最少一种至最多一百种分析物(这是十种不同的颜色和十种不同的扩增子大小)。本发明的这一系统组成部分有三个阶段，下面将概述其实例。

第一阶段有利地包含快速和准确的热循环系统，如在专利说明书WO 2008107683中所概述的。此阶段可在30分钟以内完成。

多元检测系统可具有一个或多个发光源的特征，包括单一的或多个发光源。这些将优选地是二极管泵浦固态激光，但可以是下列的任一种：LED、气体泵浦激光、灯等。在另一个所料想的实施方式中，可使用一系列此类发光源，从而进一步增加所述系统可利用的染料的范围。

本发明有利地利用具有最少6nm(但优选1nm)分辨率的光谱检测仪。这允许区分十二种染料并且如此就允许比现存的技术检测显著更多的扩增物，现存的技术目前受限于五种试剂。待分析的波长将最小为500-700nm，但优选300-1000nm。这样的系统能够(介由染料去卷积(deconvolution)软件)区分峰值荧光发射仅相差3nM的染料。去卷积软件可准确地分离来自所存在的每一种分析物各自的光谱。

各个所料想的探针系统可以利用在使用经修饰的碱基方面的最近进展，例如LNA分子或任何本领域已知的经修饰的碱基。此类分子的优势是：使用所述探针系统有可能检测长度如20个碱基短的扩增物。

本发明的其它所预料的实施方式依赖于将两种分别放置的染料置于正向和反向引物上。仅仅在正确扩增的产物上，这些荧光分子才将在空间上足够近以发生FRET并因此产生信号。

将所产生的定量和颜色与已知数据进行比较以确定所存在的靶扩增物或每种所存在的靶扩增物的性质或其部分的性质的步骤可使用合适的所述去卷积软件完成。所述软件将基于所期待的波长带内是否存在光而自动化地为终端用户解释结果。

由于可排布光学系统以允许来自反应室的核酸测定的通量，因此可同时在许多热循环仪中进行测试，然后将所产生的扩增物转移至单一的读数器，因而快速地确定诊断结果。

至于可采用的PCR的形式，任何目前被接受的实时PCR检测化学作用都是可能的。探针系统可采取ResonSense^TM探针的形式，如专利说明书WO/1999/028500中所描述的。然而，本申请中所描述的化学作用是优选的。

具体实施方式

现在将参考附图特别描述本发明，其中：

图1(1a，1b，1c)描述了本发明的检测原理；

图2，3和4描述了本发明的化学作用阶段的实施方式；

图5显示了荧光峰之间的相互作用；

图6描述了随时间分离扩增物组分；以及

图7至10是根据本发明的仪器的示意图。

本发明的第一个实施方式采用在5’端用荧光染料标记的序列特异性引物，所述荧光染料优选较长波长的染料例如CY5。探测系统结合到其预期的靶标上，然后可用于引发所需序列的扩增。在含有嵌合染料的反应混合物中扩增经标记的引物，以SYBR为优选的，虽然其它合适的染料(例如SYTO 9和EVA GREEN)是本领域已知的。理想地，此染料比标记至引物分子5’端的染料在更短的波长处。当用光源(在优选的实施方式中是蓝色激光)照明时，SYBR染料将发荧光并将通过FRET原理将它的光能转移至CY5，激光本身不能激发CY5染料。然后检测CY5信号并用其来测量生物学反应的进展并允许在分子水平检测潜在的病原体。在图2-4中概述了此方法。

第二个优选的实施方式采取了扫描仪的形式，因此不需要热循环系统。此类扫描仪可允许增加核酸测定的通量，因为可同时在许多热循环仪中进行测试，然后转移至单一的读数器，以快速地确定诊断结果。此方法将适于仅根据颜色来分离并且如此将在单一的容器中检测最少一种但容易地直至12种不同的靶标。

第三个实施方式是将尾序列掺入引物自身中。尾分子的存在允许序列特异性探针化学作用，例如将用于此类短扩增子的Taqman，这在没有进行这种修饰时将是在物理上不可能的。

第四个实施方式可以是在扩增产物之中使用荧光染料终止剂。如果引物是以CY5标记的并且以重叠的构造被构建，仅需要一个碱基延伸，以完成生物学反应并产生荧光信号。

如在图5中可见的，虽然三个单独的光学“峰”可存在于来自样品的回归谱中，每一个“峰”都被混合为谱。这产生了“峰”之间的“串扰”，其必须被解释并由去卷积软件重新分离，其了解染料被激发时如何响应并且单独地了解峰的形状以及一个“峰”的存在将如何在相同的“样品”中提供对染料的继发性激发。作为示例，染料1被激光激发，这产生了荧光信号，其与激光源一起激发染料2，与如果仅用激光进行激发相比，这产生了来自染料2的不同的光学信号。

优选的实施方式还增加了可被区分的分子的数目，这是通过首先实施能够进行多元检测的实时PCR反应，然后使用电泳根据大小分离经扩增的分子。

图7和8显示了一次性反应容器，其包括热循环室和含有分级物质(例如琼脂糖，聚丙烯酰胺或适于进行电泳分离的任何其它本领域已知的物质)的其它通道。使容器经受热循环反应，并由此在正确的分析物的存在下产生预期的PCR产物，因而产生由系统检测的荧光信号。反应完成后，微流体系统将一部分样品转移至共同定位的分离介质，并且通过电泳过程根据大小进行排序。

优选的实施方式通过用不同的染料标记每一个变异而能够分辨单核苷酸多态性(SNPs)。这样，可通过经过光学检测仪所花费的时间或通过发射的光的波长来检测SNP。可调节电泳介质中电极的电压，使得当“搜寻”样品时(即没有检测到荧光)应用高电压，然后降低电压以在预期扩增子将落入的大小范围内增加检测和SNP分析的分辨率，因而减少检测的时间却保持准确性和分辨率。

图3显示了检测四个单独的多态性的四种颜色。可见，分别标记为红色和蓝色的SNP将不能通过常规的大小分离技术被准确地分辨。结合至扩增物的染料使得这些共迁移种类的分辨简单得多。这一因素增加了可被分辨的产物的量，因为所提出的系统可通过大小和发射的光的波长二者来进行分离。

然后，使经大小分级的样品经受上述分光镜分析仪的光谱评价。此系统允许在单一测定中检测最少两种但实际上大大超过二十种试剂。

如图7所示，反应容器(1)具有其中发生PCR的反应部分。通过与热源/槽6相联合的帕尔帖效应模块(4)以及使之经受电压极性逆转而实现所需的加热和冷却。通过热传导性反应容器座(3)将热能转移至反应容器。在此反应室之下是含有电泳凝胶的毛细管11。显示在毛细管上的是一对电触点(2)，可通过电触点(5)在其上供以偏压电压，以促进经标记的DNA朝向所选择的电极而横穿所述凝胶。

使激光激发(7)通过电泳凝胶，从而当经标记的核酸从所述激光前面经过时产生荧光标志(8)。

此荧光标志(8)被指引经过衍射光栅(9)，产生穿过检测仪(10)的光谱。

毛细管通过热源/槽6，所述热源/槽6被保持在40-60℃数量级的恒定温度的移除模块(HRM)处，这允许在更高的电压下进行电泳，所述更高的电压高于由于所述更高的电压所产生的热而通常将允许的电压。

为了完成这些测定，需要适于扩增和检测这些短的核酸靶标的化学作用。第一个所料想的本发明的实施方式是以荧光染料在5’端标记的序列特异性引物，所述荧光染料优选较长波长的染料(例如CY5)，但不受限制并且包括所有本领域已知的染料。探测系统将结合至其所预期的靶标并可用于引发所需序列的扩增。在含有嵌合染料的反应混合物中扩增经标记的引物，所述染料的优选实施方式是SYBR，虽然其它合适的染料(例如SYTO 9和EVA GREEN)是本领域已知的。关键地，此染料将比标记至引物分子5’端的染料在更短的波长处。当用光源(在优选的实施方式中是蓝色激光)照明时，SYBR染料将发荧光并将通过FRET原理将它的光能转移至CY5，激光本身不能激发CY5染料。然后检测CY5信号并将其用于测量生物学反应的进展和允许在分子水平检测潜在的病原体。在图4中概述了此方法。

各个所料想的探针系统都可以利用在使用经修饰的碱基方面的最近进展，例如LNA分子或任何本领域已知的经修饰的碱基。此类分子的优势是：使用所述探针系统有可能检测长度如20个碱基短的扩增物。

本发明的其它所预料的实施方式依赖于将两种分别放置的染料置于正向和反向引物上。仅仅在正确扩增的产物中，这些荧光分子才将在空间上足够近而发生FRET并因此产生信号，如在图4b中所示。

第三个实施方式是将尾序列掺入引物自身中。尾分子的存在允许序列特异性探针化学作用，例如将用于此类短扩增子的Taqman，这在没有进行这种修饰时将是在物理上不可能的。这突出显示于图4c中，此方法以前被用于提供用于产生发夹结构的互补序列或用于提供随后将在自探测扩增子设置(例如钓鱼者(angler)化学作用)中使用的结合位点。关于下述是新颖的：使用5’序列尾部来在短扩增子中提供用于探针杂交的靶标，其中的候选靶标否则不能被选择。

最后潜在的实施方式是在扩增产物之中使用荧光染料终止剂。引物是以CY5标记的并且以重叠的构造被设计，使得仅需要一个碱基延伸来完成生物学反应并产生荧光信号，如图4d中所示。

将领会，在上述试剂盒能够实施本申请中所要求保护和所描述的整个过程的同时，其也能够实施检测过程，其中已知存在最多例如四或五种不同的核酸，而完全省略所述过程的化学作用阶段。

图8表示本发明的另一个实施方式。在那个实施方式中，如此设置现存的实时PCR，使得可收集完成的扩增物用于随后的大小分离。向反应容器供应可刺穿的盖子，并且在完成实时PCR倍增过程之后，随后根据大小分离现在经荧光标记的产物。此仪器结合了能够刺穿容器盖并向毛细管系统递送扩增物的流体系统，所述毛细管系统被设置为用于应用电泳来根据大小分离经荧光标记的产物。

1含有扩增产物的反应容器

2流体转移毛细管道

3用于移动流体的真空泵

4电泳毛细管

5光学检测仪

还将领会，虽然可采用例如各含有一些相同的样品的96孔阵列，并使整个阵列进行PCR过程，本发明允许使用单个的孔，这可观地减少了为了成功地分析其组分核酸所需的样品量以及进行所述方法所需的试剂盒的尺寸。

Claims (30)

1.用于检测样品中的多种分析物的方法，其包括：

·根据分析物的预期性质选择一个或多个引物，用不同的染料标记每一个引物并将其置于反应容器中；

·将待分析的样品置于所述反应容器中；

·使所述样品经受倍增过程；

·根据大小分离经倍增的样品的组分，此后称作扩增物；

·定量所存在的大小并确定每一种大小的颜色；以及

·将所产生的定量和颜色与已知的数据进行比较，以确定所存在的靶扩增物或每种所存在的靶扩增物的性质或其部分的性质。

2.权利要求1的方法，其中所述倍增过程在单一的反应容器中完成。

3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述分离是通过应用电压完成的。

4.权利要求3的方法，其中分离手段采用电泳。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述引物包含琼脂糖或聚丙烯酰胺。

6.前述权利要求中任一项的方法，其包括将经倍增的样品从反应容器转移至光学检测仪器。

7.权利要求6的方法，其中所述转移是用微流体系统完成的。

8.权利要求6的方法，其中所述光学检测仪器包括毛细管。

9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述反应容器为微量滴定孔。

10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述倍增过程包括PCR。

11.权利要求10的方法，其中所述PCR过程是如专利说明书WO2008107683中所概述的。

12.前述权利要求中任一项的方法，其中定量所存在的大小和确定每一种大小的颜色包括多元光学检测系统，其具有一个或多个发光源的特征。

13.权利要求12的方法，其中所述发光源包括二极管泵浦固态激光。

14.权利要求12或13的方法，其中所述光学系统采用具有最少6nm分辨率的光谱检测仪。

15.权利要求12或13的方法，其中所述光学系统采用具有1nm分辨率的光谱检测仪。

16.权利要求12-15中任一项所述的方法，其中待分析的波长为500-700nm。

17.权利要求12-15中任一项所述的方法，其中待分析的波长为300-1000nm。

18.前述权利要求中任一项的方法，其中将所产生的定量和颜色与已知的数据进行比较以确定所存在的靶扩增物或每种所存在的靶扩增物的性质或其部分的性质的步骤包括应用去卷积软件，其是基于在所预期的波长带内是否存在光。

19.前述权利要求中任一项的方法，其中标记引物包括用荧光染料标记短的寡核苷酸引物序列。

20.权利要求19的方法，其中所述染料包括一种或多种荧光素、TET、HEX。

21.用于实施前述权利要求中任一项的方法的仪器，其包括：

·反应容器；

·使反应容器中的样品经受倍增过程的工具；

·可操作以根据大小分离扩增物组分的分离台；

·用于定量所存在的大小和确定每种大小的颜色的光学检测工具；以及

·用于将所产生的定量和颜色与已知的数据进行比较以确定所存在的靶扩增物或每种所存在的靶扩增物的性质或其部分的性质的工具。

22.权利要求21的仪器，其中所述反应容器是微量滴定孔。

23.权利要求21或权利要求22的仪器，其中所述样品倍增工具包括PCR仪。

24.权利要求21-23中任一项的仪器，其中用于使扩增物经受分离电压的工具包括电泳仪。

25.权利要求21-24中任一项的仪器，其中所述光学检测工具包括光谱检测仪。

26.权利要求21-25中任一项的仪器，其中所述分离台包括用于向扩增物应用电压的工具。

27.权利要求21-26中任一项的仪器，其包括便携的可手持试剂盒。

28.在核酸扩增过程中分离扩增物的方法，其采用电泳。

29.权利要求1-20和27中任一项的方法，其基本上如上文中所描述的。

30.权利要求21-27中任一项所述的仪器，其基本上如上文中所描述的。

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