JP2001305105A - 平板型ゲル電気泳動装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 被分析ＤＮＡサンプルの作成から電気泳動ま
でを一貫して行うことができる平板型ゲル電気泳動装置
を提供する。 【解決手段】 水平に載置された泳動板のゲル電解質層
で蛍光標識ＤＮＡサンプルを分離し、分離された各塩基
から放出される蛍光を蛍光検出用ラインセンサにより受
光することからなる平板型ゲル電気泳動装置において、
前記泳動板は、上部部材と下部部材とからなり、前記上
部部材は、サンプル注入用の貫通孔と、上部バッファ液
注入用の貫通孔と、下部バッファ液注入用の貫通孔と、
前記上部バッファ液注入用貫通孔付近にゲル電解質注入
口と、前記下部バッファ液注入用貫通孔付近にゲル電解
質排出口とを有し、前記下部部材の一方の平面上には、
前記上部部材のサンプル注入用貫通孔に対応する位置に
サンプル生成反応用の凹陥部と、ゲル電解質を収容する
ための所定の長さの溝が刻設されており、前記上部部材
と下部部材とを重ね合わせ一体化させることにより前記
泳動板を構成する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はゲル電気泳動装置に
関する。更に詳細には、本発明はＤＮＡサンプル作成機
能を有し、サンプル作成から電気泳動までを一貫して行
うことができる平板型ゲル電気泳動装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＤＮＡ等の塩基配列を決定する方法とし
て、ゲル電気泳動法が広く実施されている。

【０００３】電気泳動する際に、従来は試料をラジオア
イソトープでラベルし、分析していたが、この方法では
手間と時間がかかる難点があった。更に、放射能管理の
点から常に最大限の安全性と管理が求められ、特別な施
設内でなければ分析を行うことができない。このため、
最近では、試料を蛍光体でラベルする方式が検討されて
いる。

【０００４】光を用いる方法では、蛍光ラベルしたＤＮ
Ａ断片をゲル中を泳動させる。例えば、配列を決定しよ
うとするＤＮＡ鎖を鋳型として酵素反応（ダイデオキシ
法）による操作で末端塩基種がわかった種々の長さのＤ
ＮＡを複製し、これらに蛍光体を標識する。つまり、蛍
光体で標識されたアデニン（Ａ）断片群，シトシン
（Ｃ）断片群，グアニン（Ｇ）断片群およびチミン
（Ｔ）断片群を得る。これらの断片群を混合して電気泳
動用ゲルの別々の泳動レーン溝に注入し、電圧を印加す
る。ＤＮＡは負の電荷を持つ鎖状の重合体高分子のた
め、ゲル中を分子量に反比例した速度で移動する。短い
（分子量の小さい）ＤＮＡ鎖ほど早く、長い（分子量の
大きい）ＤＮＡ鎖ほどゆっくりと移動するので、分子量
によりＤＮＡを分画できる。

【０００５】蛍光ラベルしたＤＮＡ断片をゲル中を電気
泳動させる方式として、図２に示されるような平板型
（又は別名「平床式」とも呼ばれる）ゲル電気泳動装置
が使用されている。例えば、透明なガラス又は石英基板
１００の上面にアガロース又はポリアクリルアミドなど
のゲル電解質層１０２を形成し、このゲル電解質層１０
２の上部に励起光源１０４を配置し、この励起光源１０
４と対峙して、基板１０２の反対側に受光光学系１０６
を配置し、この光学系１０６の下部に、リニアラインセ
ンサなどの蛍光検出器１０８を配置する。蛍光検出器１
０８への蛍光入射領域を画成するための走査開口スリッ
ト１１０を蛍光検出器１０８の直前に配置する。基板の
下部には光学フィルタ１１２も配置されている。このフ
ィルタは均一な光学特性を有し、実際の分析では、光源
１０４からの励起光を最初に受光して、校正のための基
準値を出す。

【０００６】図３は図２に示された装置の平面図であ
る。ゲル電解質層１０２の各泳動路の泳動開始点にスポ
ットされた被分析ＤＮＡサンプル１１４は電圧が印加さ
れると、ゲル電解質層１０２内を分子量に反比例した速
度で移動し、各塩基１１６毎に分離される。各分離塩基
からの蛍光は走査開口スリット１１０を透過し、リニア
ラインセンサ１０８の各画素１０８ａ〜１０８ｎで受光
検出される。

【０００７】しかし、従来の平板型ゲル電気泳動装置で
は、泳動板サイズと被分析ＤＮＡサンプル生成のプロセ
スの問題により、サンプル生成から電気泳動に至る工程
を全自動化したシステムは、その構成が巨大化するた
め、現在まで殆ど実用化されていない。このため、従来
の平板型ゲル電気泳動装置では、被分析ＤＮＡサンプル
を別の場所で作成し、作成されたサンプルをキャピラリ
などの道具を用いて手作業でゲル電解質層にローディン
グしなければならず、分析作業のスループットを向上さ
せることができなかった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、被分析ＤＮＡサンプルの作成から電気泳動までを一
貫して行うことができる平板型ゲル電気泳動装置を提供
することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】前記課題は、サンプル注
入用の貫通孔と、上部バッファ液注入用の貫通孔と、下
部バッファ液注入用の貫通孔と、前記上部バッファ液注
入用貫通孔付近にゲル注入口と、前記下部バッファ液注
入用貫通孔付近にゲル排出口とを有する上部部材と、一
方の平面上に、サンプル作成反応用の凹陥部と、ゲル電
解質を収容するための所定の長さの溝が形成されている
下部部材とからなる泳動板を使用することを特徴とする
平板型ゲル電気泳動装置により解決される。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、図面を参照しながら本発明
の平板型ゲル電気泳動装置について具体的に説明する。
図１は、本発明の平板型ゲル電気泳動装置の構成の一例
を示す概要分解組立斜視図である。本発明の平板型ゲル
電気泳動装置における泳動板は基本的に、上部部材１と
下部部材３とからなる。上部部材１にはサンプル注入用
貫通孔５と、上部バッファ液注入用貫通孔７と、下部バ
ッファ液注入用貫通孔９が配設されている。更に、上部
部材１の上部バッファ液注入用貫通孔７付近にゲル注入
口１１と、下部バッファ液注入用貫通孔９付近にゲル排
出口１３が配設されている。ゲル注入口１１には、ゲル
注入用シリンジ１５が接続されている。ゲルの注入（及
び排出）とバッファ液の注入（及び排出）を切替えるた
めの、切替バルブ１７及び１９が配設されている。ゲル
注入用シリンジ１５を駆動してゲルを注入（及び排出）
する場合、切替バルブ１７及び１９を引き出し、バッフ
ァ液注入口７及び９を閉鎖する。電気泳動を行う場合
は、切替バルブ１７及び１９を押し込み、ゲル注入口１
１とゲル排出口１３を閉鎖し、バッファ液注入口７及び
９を開放する。

【００１１】下部部材３に一方の平面上には、前記上部
部材１のサンプル注入用貫通孔５の位置に対応する位置
に、注入されたサンプルなどを受けるための凹陥部２１
が刻設されている。そしてこの凹陥部２１に連通するサ
ンプル生成反応部２３が刻設されている。凹陥部２１を
設けることなく、サンプル注入用貫通孔５からサンプル
生成反応部２３にサンプル及び試薬類を直接注入するこ
ともできる。サンプル生成反応部２３の容積は２０μｌ
〜１００μｌの範囲内であることが好ましい。２０μｌ
未満ではＰＣＲ法及びシーケンス反応に必要な試薬類を
収容することが困難であるばかりか、生成物の収量も少
なすぎて分析に支障がでる。１００μｌ超では、大き過
ぎて無駄なだけとなる。サンプル生成反応部２３と同じ
軸線上に、サンプル生成反応部２３に隣接して、サンプ
ルローディング部２５が刻設されている。このサンプル
ローディング部２５の位置は前記上部バッファ液注入用
貫通孔７の位置に対応している。サンプルローディング
部２５から電気泳動終了部２７まで電気泳動部２７が延
びている。電気泳動終了部２７の位置は前記下部バッフ
ァ液注入用貫通孔９の位置に対応している。サンプル生
成反応部２３の下部には加熱手段３７が配設されてお
り、サンプル生成反応部２３内に注入されたサンプル及
び反応試薬類を所定温度にまで加熱することができる。

【００１２】下部部材３の平面上の、凹陥部２１、サン
プル生成反応部２３、サンプルローディング部２５、電
気泳動部２７及び電気泳動終了部２７は、ホトレジスト
を使用する光リソグラフィーなどの常用のエッチング技
術により刻設することができる。上部部材１及び下部部
材３の材質としては、光透過性のガラス、石英又はプラ
スチックなど任意の材料を使用することができる。

【００１３】平板型のゲル電気泳動においては、ゲル電
解質層の厚さを薄くするほど、バンドの分離能が向上す
る。このため、同じ塩基対長を読む場合、ゲル電解質層
を薄くすれば、従来の泳動板サイズと比較して装置全体
を小型化することができる。また、図示されているよう
に、電気泳動部２７を略Ｓ字状に蛇行させることによ
り、電気泳動部２７を一直線状に刻設した場合に比べ
て、装置全体を大幅に小型化することができる。

【００１４】光学フィルタ３１及び蛍光検出用ラインセ
ンサ３３などが実装された検出基板３５は公知慣用の手
段により電気泳動部２７を走査することができる。図示
されていないが、励起光源としては紫外線源、レーザ光
源など任意の光源を使用することができ、このような光
源は上部部材１に上方に配設することもできるし、ある
いは、検出基板３５と同じ側に配置することもできる。

【００１５】図１には、２本の泳動路が図示されている
が、配設する泳動路の本数は１本でもよいし、あるいは
３本以上であることもできる。配設する泳動路の本数に
応じて、サンプル注入用貫通孔５、上部バッファ液注入
用貫通孔７、下部バッファ液注入用貫通孔９、サンプル
生成反応部２３などをそれぞれ設ければよい。

【００１６】次に、本発明の平板型ゲル電気泳動装置に
よるＤＮＡサンプル調製について説明する。ＤＮＡサン
プルは下部部材３の平面上に刻設されたサンプル生成反
応部２３で生成される。基本的に、ＤＮＡサンプルは公
知のＰＣＲ法及びシーケンス反応により調製される。Ｐ
ＣＲ法は、特定のＤＮＡ領域を挟んだ２種類のプライマ
ーとＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡ合成反応を繰り返すこ
とにより、その特定領域を数十万倍に増幅することから
なるポリメラーゼ連鎖反応法のことであり、１９８５年
に米国のＣｅｔｕｓ社により開発された。この方法は、
その後、耐熱性酵素Ｔａｑポリメラーゼを利用した方法
に改良されたことで、効率の良いＰＣＲ法として確立さ
れ、現在に至っている。ＰＣＲ法の原理は、例えば、実
験医学，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．２，１４頁〜１８頁（１９
８９）に詳細に説明されている。このＰＣＲ法は基本的
に、プライマーが結合された２本鎖ＤＮＡを熱変性に
より１本鎖に変性し、プライマーをアニーリングし、
Ｔａｑポリメラーゼにより伸長させることからなる一
連のサイクルからなり、このサイクルを数十回繰り返す
ことにより所望のＤＮＡ断片を増幅させることからな
る。

【００１７】ＰＣＲ増幅は米国のパーキン・エルマー社
から市販のキットを用いて行うことができる。この反応
混合物キットは、テンプレートＤＮＡ３μｌ（例えば、
ヒトゲノム約２００ｎｇ）、１０倍ＰＣＲバッファ３μ
ｌ、ｄＮＴＰ（２．５ミリモル）３μｌ、プライマ１
（１０マイクロモル）３μｌ、プライマ２（１０マイク
ロモル）３μｌ、Ｅｘ Ｔａｑ０．２μｌ及びＨ₂Ｏ１
５μｌからなる全量３０μｌの溶液である。その他の反
応混合物キットも使用できる。これをサンプル注入用貫
通孔５からサンプル生成反応部２３に注入し、加熱手段
３７を駆動して、注入された試薬類を９６℃で３分間加
熱し、次いで、９６℃で３０秒間と６８℃で３分間の加
熱を１サイクルとして、２５〜３０サイクル反復する。
得られたＰＣＲ増幅産物を１μｌ採取し、ミューピッド
により増幅状態をチェックする。増幅が不十分であれ
ば、前記加熱サイクルを更に繰り返す。十分に増幅され
ていれば、ＰＣＲ増幅産物内の未反応物を分解するため
に酵素を添加する。酵素としては、未反応ｄＮＴＰを除
去するためのAlkaline Phosphatase Shrimp(APS)と未反
応プライマを除去するためのExonuklease I(Exol)を使
用する。各酵素をＴＥで２０倍に希釈し、２μｌづつ添
加する。その後、３７℃で１５分間加熱し、更に８０℃
で１５分間加熱し、未反応物質を分解する。その後、得
られた精製物をシーケンス反応に付す。

【００１８】シーケンス反応としては、サイクルシーケ
ンス反応を使用することができる。この反応は、ダイデ
オキシ法によるシーケンス反応方法の一つであり、ＰＣ
Ｒ法を利用し、４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸
（ｄＮＴＰ，ＮはＡ，Ｃ，Ｇ，Ｔ）に各１種類のダイデ
オキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ，ＮはＡ，
Ｃ，Ｇ，Ｔ）が混合された試薬を用い、１種類のプライ
マを加え、熱サイクル反応を行うことからなる。例え
ば、サンプル生成反応部２３に、４．５μｌの５ｘベン
ト酵素バッファ、ＰＣＲ法により増幅したい解析ＤＮＡ
サンプル、１．８ピコモルのプライマ、ベント酵素２単
位及びＨ₂Ｏを加え、全量１８μｌとする。これに、ｄ
／ｄｄＡＴＰ、ｄ／ｄｄＣＴＰ、ｄ／ｄｄＧＴＰ又はｄ
／ｄｄＴＴＰ１．０μｌを加え、ＰＣＲ法により反応を
行う。１５秒間／９５℃−４５秒間／６４℃−６０秒間
／７０℃の熱サイクルを３０回繰り返し、その後、２μ
ｌのホルムアルデヒド色素を添加する。アニーリング時
の温度はプライマの塩基種数や長さにより異なるので、
そのつど最適値に合わせることが好ましい。

【００１９】シーケンス反応により得られた蛍光標識Ｄ
ＮＡサンプルを、キャピラリ又はマイクロピペットなど
の公知慣用の手段でサンプル生成反応部２３から取り出
し、上部バッファ液注入用貫通孔７を介してサンプルロ
ーディング部２５にローディングする。その後、上部バ
ッファ液注入用貫通孔７及び下部バッファ液注入用貫通
孔９内にそれぞれバッファ液を注ぎ込み、サンプルロー
ディング部２５と電気泳動終了部２７との間に電圧を印
加し、電気泳動を起こさせる。電圧は、上部バッファ液
注入用貫通孔７及び下部バッファ液注入用貫通孔９内に
電源端子（図示されていない）を挿入することにより印
加することができる。電気泳動により分離された各塩基
から発せられる蛍光は、従来の平板型ゲル電気泳動装置
と同様に、蛍光検出用ラインセンサ３３により検出され
る。

【００２０】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
被分析ＤＮＡサンプルの作成から電気泳動までを一貫し
て行うことができる小型化した平板型ゲル電気泳動装置
が得られる。特に、サンプル生成工程において、従来Ｐ
ＣＲ増幅後の精製処理を遠心分離器で行わずに、酵素を
用いて行うことにより、サンプル生成の全工程が同一の
反応容器で行えるようになり、サンプル生成作業に必要
な時間が大幅に短縮される。しかも、サンプル生成後、
直ちに電気泳動してＤＮＡ塩基配列決定分析を開始する
ことができるので、サンプル生成から配列決定までの全
作業時間も飛躍的に短縮される。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の平板型ゲル電気泳動装置の構成の一例
を示す概要分解組立斜視図である。

【図２】従来の平板型ゲル電気泳動装置の構成の一例を
示す概要図である。

【図３】図２に示された平板型ゲル電気泳動装置におけ
る泳動状態を示す概要平面図である。

【符号の説明】

１ 上部部材 ３ 下部部材 ５ サンプル注入用貫通孔 ７ 上部バッファ液注入用貫通孔 ９ 下部バッファ液注入用貫通孔 １１ ゲル電解質注入口 １３ ゲル電解質排出口 １５ ゲル電解質注入用シリンジ １７，１９ 切替バルブ ２１ 凹陥部 ２３ サンプル生成反応部 ２５ サンプルローディング部 ２７ 電気泳動終了部 ２９ 電気泳動部 ３１ 光学フィルタ ３３ 蛍光検出用ラインセンサ ３５ 基板

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 高木 新一 東京都渋谷区東３丁目16番３号 日立電子 エンジニアリング株式会社内 Ｆターム(参考） 2G043 AA04 BA16 CA03 DA05 EA01 EA19 FA01 GA04 GB01 JA03 KA03 KA09 LA03

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 水平に載置された泳動板のゲル電解質層
   で蛍光標識ＤＮＡサンプルを分離し、分離された各塩基
   から放出される蛍光を蛍光検出用ラインセンサにより受
   光することからなる平板型ゲル電気泳動装置において、 前記泳動板は、上部部材と下部部材とからなり、 前記上部部材は、サンプル注入用の貫通孔と、上部バッ
   ファ液注入用の貫通孔と、下部バッファ液注入用の貫通
   孔と、前記上部バッファ液注入用貫通孔付近にゲル電解
   質注入口と、前記下部バッファ液注入用貫通孔付近にゲ
   ル電解質排出口とを有し、 前記下部部材の一方の平面上には、前記上部部材のサン
   プル注入用貫通孔に対応する位置にサンプル生成反応用
   の凹陥部と、ゲル電解質を収容するための所定の長さの
   溝が刻設されており、 前記上部部材と下部部材とを重ね合わせ一体化させるこ
   とにより前記泳動板が構成されることを特徴とする平板
   型ゲル電気泳動装置。
2. 【請求項２】 前記ゲル電解質を収容するための所定の
   長さの溝は、前記上部部材の上部バッファ液注入用貫通
   孔の位置に対応するサンプルローディング部と、電気泳
   動部と、前記上部部材の下部バッファ液注入用貫通孔の
   位置に対応する電気泳動終了部とからなる連続的な溝で
   あり、前記電気泳動部は略Ｓ字状に形成されていること
   を特徴とする請求項１に記載の平板型ゲル電気泳動装
   置。
3. 【請求項３】 前記上部部材には、前記上部バッファ液
   注入用貫通孔とゲル電解質注入口とを切替えるための切
   替バルブと、前記下部バッファ液注入用貫通孔とゲル電
   解質排出口とを切替えるための切替バルブを更に有する
   ことを特徴とする請求項１に記載の平板型ゲル電気泳動
   装置。
4. 【請求項４】 前記下部部材のサンプル生成反応用凹陥
   部の下面には加熱手段が更に配設されていることを特徴
   とする請求項１に記載の平板型ゲル電気泳動装置。