JP2001305106A - Ｄｎａサンプルローディングツール - Google Patents
ＤｎａサンプルローディングツールInfo
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- JP2001305106A JP2001305106A JP2000127096A JP2000127096A JP2001305106A JP 2001305106 A JP2001305106 A JP 2001305106A JP 2000127096 A JP2000127096 A JP 2000127096A JP 2000127096 A JP2000127096 A JP 2000127096A JP 2001305106 A JP2001305106 A JP 2001305106A
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- Japan
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- dna
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- loading tool
- sample
- dna sample
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44704—Details; Accessories
- G01N27/44743—Introducing samples
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＤＮＡサンプルの調製からサンプルローディ
ングまで一貫して行うことのできる、ゲル電気泳動装置
用のサンプルローディングツールを提供する。 【解決手段】 一方の面に導電性薄膜電極が蒸着された
支持基板と、該支持基板の電極蒸着面側に固着された、
サンプル及び精製反応試薬注入部を複数個有するセル板
とからなることを特徴とするＤＮＡサンプルローディン
グツール。
ングまで一貫して行うことのできる、ゲル電気泳動装置
用のサンプルローディングツールを提供する。 【解決手段】 一方の面に導電性薄膜電極が蒸着された
支持基板と、該支持基板の電極蒸着面側に固着された、
サンプル及び精製反応試薬注入部を複数個有するセル板
とからなることを特徴とするＤＮＡサンプルローディン
グツール。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ゲル電気泳動装置
で使用される泳動板のゲル電解質層の所定の泳動路位置
に被検体サンプルをローディングするためのサンプルロ
ーディングツールに関する。更に詳細には、本発明は、
蛍光標識を用いてＤＮＡの塩基配列を効率的に迅速に決
定することのできるＤＮＡ塩基配列決定装置などのゲル
電気泳動装置で使用される、被検体サンプルの作成から
ローディングまでを一貫して行うことができるサンプル
ローディングツールに関する。
で使用される泳動板のゲル電解質層の所定の泳動路位置
に被検体サンプルをローディングするためのサンプルロ
ーディングツールに関する。更に詳細には、本発明は、
蛍光標識を用いてＤＮＡの塩基配列を効率的に迅速に決
定することのできるＤＮＡ塩基配列決定装置などのゲル
電気泳動装置で使用される、被検体サンプルの作成から
ローディングまでを一貫して行うことができるサンプル
ローディングツールに関する。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡ等の塩基配列を決定する方法とし
て、ゲル電気泳動法が広く実施されている。
て、ゲル電気泳動法が広く実施されている。
【０００３】電気泳動する際に、従来は試料をラジオア
イソトープでラベルし、分析していたが、この方法では
手間と時間がかかる難点があった。更に、放射能管理の
点から常に最大限の安全性と管理が求められ、特別な施
設内でなければ分析を行うことができない。このため、
最近では、試料を蛍光体でラベルする方式が検討されて
いる。
イソトープでラベルし、分析していたが、この方法では
手間と時間がかかる難点があった。更に、放射能管理の
点から常に最大限の安全性と管理が求められ、特別な施
設内でなければ分析を行うことができない。このため、
最近では、試料を蛍光体でラベルする方式が検討されて
いる。
【０００４】光を用いる方法では、蛍光ラベルしたＤＮ
Ａ断片をゲル中を泳動させるが、泳動開始部から、１０
〜７０cm下方に各泳動路毎に光励起部と光検出器を設け
ておき、ここを通過するＤＮＡ断片を順に計測する。例
えば、配列を決定しようとするＤＮＡ鎖を鋳型として酵
素反応（ダイデオキシ法）による操作で末端塩基種がわ
かった種々の長さのＤＮＡを複製し、これらに蛍光体を
標識する。つまり、蛍光体で標識されたアデニン（Ａ）
断片群，シトシン（Ｃ）断片群，グアニン（Ｇ）断片群
およびチミン（Ｔ）断片群を得る。これらの断片群を混
合して電気泳動用ゲルの別々の泳動レーン溝に注入し、
電圧を印加する。ＤＮＡは負の電荷を持つ鎖状の重合体
高分子のため、ゲル中を分子量に反比例した速度で移動
する。短い（分子量の小さい）ＤＮＡ鎖ほど早く、長い
（分子量の大きい）ＤＮＡ鎖ほどゆっくりと移動するの
で、分子量によりＤＮＡを分画できる。
Ａ断片をゲル中を泳動させるが、泳動開始部から、１０
〜７０cm下方に各泳動路毎に光励起部と光検出器を設け
ておき、ここを通過するＤＮＡ断片を順に計測する。例
えば、配列を決定しようとするＤＮＡ鎖を鋳型として酵
素反応（ダイデオキシ法）による操作で末端塩基種がわ
かった種々の長さのＤＮＡを複製し、これらに蛍光体を
標識する。つまり、蛍光体で標識されたアデニン（Ａ）
断片群，シトシン（Ｃ）断片群，グアニン（Ｇ）断片群
およびチミン（Ｔ）断片群を得る。これらの断片群を混
合して電気泳動用ゲルの別々の泳動レーン溝に注入し、
電圧を印加する。ＤＮＡは負の電荷を持つ鎖状の重合体
高分子のため、ゲル中を分子量に反比例した速度で移動
する。短い（分子量の小さい）ＤＮＡ鎖ほど早く、長い
（分子量の大きい）ＤＮＡ鎖ほどゆっくりと移動するの
で、分子量によりＤＮＡを分画できる。
【０００５】特開昭６３−２１５５６号公報には、レー
ザで照射される電気泳動装置のゲル上のラインと光ダイ
オードアレイの配列方向が電気泳動装置内のＤＮＡ断片
の泳動方向と直角となるように構成されたＤＮＡ塩基配
列決定装置が開示されている。
ザで照射される電気泳動装置のゲル上のラインと光ダイ
オードアレイの配列方向が電気泳動装置内のＤＮＡ断片
の泳動方向と直角となるように構成されたＤＮＡ塩基配
列決定装置が開示されている。
【０００６】図４は該装置の構成を説明する模式図であ
る。図４の装置では、光源７０から出たレーザ光はミラ
ー７２で反射され、泳動板７４のゲル中の一定ポイント
に横から水平にレーザ光を照射する。ゲル中を泳動して
きた蛍光ラベルされたＤＮＡ断片７６がこの照射領域を
通過する際、このＤＮＡ断片から蛍光が順次放出され
る。このとき、蛍光放出の水平位置から末端塩基の種類
が、また、泳動スタートからの泳動時間の差から断片の
長さを、更に、発光波長で検体の識別ができる。各泳動
路からの蛍光はレンズ７８によりイメージインテンシフ
ァイヤ８０の受光部８２で結像する。この信号は増幅さ
れて光ダイオードアレイ８４で電気信号に変換されて計
測される。計測結果をコンピュータ処理することによっ
て各ＤＮＡ断片の配列を計算し、目的とするＤＮＡの塩
基配列を決定する。
る。図４の装置では、光源７０から出たレーザ光はミラ
ー７２で反射され、泳動板７４のゲル中の一定ポイント
に横から水平にレーザ光を照射する。ゲル中を泳動して
きた蛍光ラベルされたＤＮＡ断片７６がこの照射領域を
通過する際、このＤＮＡ断片から蛍光が順次放出され
る。このとき、蛍光放出の水平位置から末端塩基の種類
が、また、泳動スタートからの泳動時間の差から断片の
長さを、更に、発光波長で検体の識別ができる。各泳動
路からの蛍光はレンズ７８によりイメージインテンシフ
ァイヤ８０の受光部８２で結像する。この信号は増幅さ
れて光ダイオードアレイ８４で電気信号に変換されて計
測される。計測結果をコンピュータ処理することによっ
て各ＤＮＡ断片の配列を計算し、目的とするＤＮＡの塩
基配列を決定する。
【０００７】図５に示されるように、泳動板７４は、ガ
ラス板８６と８８の間に、電気泳動用ゲル（例えば、ポ
リアクリルアミド）からなるゲル電解質層９０が挟装さ
れている。２枚のガラス板の長手方向両端部にはゲル電
解質層９０の厚さを規制するためのスペーサ９２が間挿
されている。ガラス板８８の上端部は、両端から幅方向
の中心に向けて若干の部分を除いて、所定の深さで幅方
向に切り欠かれている。この切り欠き部分９４はゲル電
解質層９０の上端をバッファ液と接触させるために設け
られている。泳動板全体の厚さは約１０ｍｍ程度である
が、ゲル電解質層９０自体の厚さは約０．３ｍｍ程度で
ある。ガラス板８８の切り欠き部９４の下端面９６と大
体同じ位置に、凹凸の櫛歯状のゲル電解質層上端が存在
する。この櫛歯の凹陥部７５内に蛍光物質で標識された
ＤＮＡ断片を注入する。
ラス板８６と８８の間に、電気泳動用ゲル（例えば、ポ
リアクリルアミド）からなるゲル電解質層９０が挟装さ
れている。２枚のガラス板の長手方向両端部にはゲル電
解質層９０の厚さを規制するためのスペーサ９２が間挿
されている。ガラス板８８の上端部は、両端から幅方向
の中心に向けて若干の部分を除いて、所定の深さで幅方
向に切り欠かれている。この切り欠き部分９４はゲル電
解質層９０の上端をバッファ液と接触させるために設け
られている。泳動板全体の厚さは約１０ｍｍ程度である
が、ゲル電解質層９０自体の厚さは約０．３ｍｍ程度で
ある。ガラス板８８の切り欠き部９４の下端面９６と大
体同じ位置に、凹凸の櫛歯状のゲル電解質層上端が存在
する。この櫛歯の凹陥部７５内に蛍光物質で標識された
ＤＮＡ断片を注入する。
【０００８】このゲル電解質層上端の凹陥部７５に被分
析検体であるＤＮＡ断片が注入される。しかし、この凹
陥部７５の幅は約１．５ｍｍであり、深さは約５ｍｍ程
度しかない。凹陥部の間隔は２ｍｍ程度である。このた
め、検体はキャピラリのような微小なガラス管を用いて
凹陥部７５内に注入しなければならない。しかし、泳動
板のガラス板およびゲル電解質は何れも透明なため、凹
陥部７５の位置確認または判別が極めて困難であり、検
体の注入に失敗することが度々あった。
析検体であるＤＮＡ断片が注入される。しかし、この凹
陥部７５の幅は約１．５ｍｍであり、深さは約５ｍｍ程
度しかない。凹陥部の間隔は２ｍｍ程度である。このた
め、検体はキャピラリのような微小なガラス管を用いて
凹陥部７５内に注入しなければならない。しかし、泳動
板のガラス板およびゲル電解質は何れも透明なため、凹
陥部７５の位置確認または判別が極めて困難であり、検
体の注入に失敗することが度々あった。
【０００９】このＤＮＡ断片のサンプル注入を支援する
ために、図６に示されるようシャークコーム１１０が開
発され、使用されてきた。このようなシャークコームは
例えば、特開平８−３２７５９６号公報に記載されてい
る。このシャークコーム１１０は一方の長手辺縁に複数
個の櫛歯１１３を有する。このシャークコーム１１０は
例えば、水膨潤性の素材（例えば、紙）から形成され、
図７に示されるように、シャークコーム１１０は２枚の
ガラス板の間の隙間に、例えば、この泳動板７４の上端
側から挿入される。シャークコーム１１０の櫛歯１１３
の先端部を若干ゲル電解質層内に進入させる。シャーク
コーム１１０がバッファ液に浸漬されると、櫛歯１１３
が膨潤し、２枚の泳動板の隙間を完全に閉塞する。その
結果、隣接する櫛歯１１３同士が壁となり、空間１１５
により画成されるサンプル充填区画を隣接の区画から隔
離させることができる。
ために、図６に示されるようシャークコーム１１０が開
発され、使用されてきた。このようなシャークコームは
例えば、特開平８−３２７５９６号公報に記載されてい
る。このシャークコーム１１０は一方の長手辺縁に複数
個の櫛歯１１３を有する。このシャークコーム１１０は
例えば、水膨潤性の素材（例えば、紙）から形成され、
図７に示されるように、シャークコーム１１０は２枚の
ガラス板の間の隙間に、例えば、この泳動板７４の上端
側から挿入される。シャークコーム１１０の櫛歯１１３
の先端部を若干ゲル電解質層内に進入させる。シャーク
コーム１１０がバッファ液に浸漬されると、櫛歯１１３
が膨潤し、２枚の泳動板の隙間を完全に閉塞する。その
結果、隣接する櫛歯１１３同士が壁となり、空間１１５
により画成されるサンプル充填区画を隣接の区画から隔
離させることができる。
【００１０】図８は図７におけるVIII−VIII線に沿った
断面図である。図示されているように、泳動板を構成す
る一方のガラス板８８の上端が長手方向に沿って一部切
り欠かれており、櫛歯１１３が所定の長さを有するの
で、ガラス板８８の切り欠き部９４の下端面９６との間
に開口１１７が形成される。実際にサンプルを注入する
場合、作業者１３は泳動板ガラス越しに注入部位を確認
しながら、この開口１１７から、キャピラリ（毛細管）
又は平板チップなどの注入手段１１９の先端をサンプル
充填空間１１５内に差込み、液体状サンプル１２１を注
入する。このため、注入部位をガラス越しに確認するこ
とが極めて困難であるばかりか、キャピラリなどの極微
量注入手段１１９の液詰まりが起こるなどの問題があっ
た。マイクロピペットなどの注入手段が使用できれば液
詰まりの問題は起きないが、開口１１７の視認性が非常
に悪いことと、開口１１７が物理的に小さ過ぎるため
に、マイクロピペットを使用することはできなかった。
断面図である。図示されているように、泳動板を構成す
る一方のガラス板８８の上端が長手方向に沿って一部切
り欠かれており、櫛歯１１３が所定の長さを有するの
で、ガラス板８８の切り欠き部９４の下端面９６との間
に開口１１７が形成される。実際にサンプルを注入する
場合、作業者１３は泳動板ガラス越しに注入部位を確認
しながら、この開口１１７から、キャピラリ（毛細管）
又は平板チップなどの注入手段１１９の先端をサンプル
充填空間１１５内に差込み、液体状サンプル１２１を注
入する。このため、注入部位をガラス越しに確認するこ
とが極めて困難であるばかりか、キャピラリなどの極微
量注入手段１１９の液詰まりが起こるなどの問題があっ
た。マイクロピペットなどの注入手段が使用できれば液
詰まりの問題は起きないが、開口１１７の視認性が非常
に悪いことと、開口１１７が物理的に小さ過ぎるため
に、マイクロピペットを使用することはできなかった。
【００１１】ＤＮＡの塩基配列の決定には、ＤＮＡを構
成するアデニン（Ａ），グアニン（Ｇ），シトシン
（Ｃ）およびチミン（Ｔ）を規則正しく検出する必要が
あるので、検体の注入失敗はとりもなおさず、分析結果
のエラーにつながりやすい。このため、検体の注入は細
心の注意を払いながら行わなければならず、作業能率を
大幅に低下させる原因にもなっていた。特に、泳動路の
うちの一つの泳動路へのサンプル注入の失敗は泳動板全
体について注入作業をやり直す羽目になるので、サンプ
ル注入を行う作業者の精神的及び肉体的疲労は無視でき
ないものがある。
成するアデニン（Ａ），グアニン（Ｇ），シトシン
（Ｃ）およびチミン（Ｔ）を規則正しく検出する必要が
あるので、検体の注入失敗はとりもなおさず、分析結果
のエラーにつながりやすい。このため、検体の注入は細
心の注意を払いながら行わなければならず、作業能率を
大幅に低下させる原因にもなっていた。特に、泳動路の
うちの一つの泳動路へのサンプル注入の失敗は泳動板全
体について注入作業をやり直す羽目になるので、サンプ
ル注入を行う作業者の精神的及び肉体的疲労は無視でき
ないものがある。
【００１２】また、従来のＤＮＡ塩基配列決定装置で
は、分析すべきＤＮＡサンプルをＰＣＲ法及びシーケン
ス反応により別途作成し、作成されたサンプルを前記の
ようなシャークコームを使用し、泳動板の所定の泳動路
にローディングしなければならなかった。従って、サン
プルの調製からサンプルローディングまで、人間が介在
する必要があり、１回の電気泳動にかかる手間が膨大で
あった。
は、分析すべきＤＮＡサンプルをＰＣＲ法及びシーケン
ス反応により別途作成し、作成されたサンプルを前記の
ようなシャークコームを使用し、泳動板の所定の泳動路
にローディングしなければならなかった。従って、サン
プルの調製からサンプルローディングまで、人間が介在
する必要があり、１回の電気泳動にかかる手間が膨大で
あった。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、ＤＮＡサンプルの調製からサンプルローディングま
で一貫して行うことのできる、ゲル電気泳動装置用のサ
ンプルローディングツールを提供することである。
は、ＤＮＡサンプルの調製からサンプルローディングま
で一貫して行うことのできる、ゲル電気泳動装置用のサ
ンプルローディングツールを提供することである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】前記課題は、一方の面に
導電性薄膜電極が蒸着された支持基板と、該支持基板の
電極蒸着面側に固着された、サンプル及び精製反応試薬
注入部を複数個有するセル板とからなるＤＮＡサンプル
ローディングツールにより解決される。
導電性薄膜電極が蒸着された支持基板と、該支持基板の
電極蒸着面側に固着された、サンプル及び精製反応試薬
注入部を複数個有するセル板とからなるＤＮＡサンプル
ローディングツールにより解決される。
【００１５】
【発明の実施の形態】以下、図面を参照しながら本発明
のＤＮＡサンプルローディングツールについて具体的に
説明する。図１は、本発明のＤＮＡサンプルローディン
グツールの構成の一例を示す概要斜視図である。本発明
のＤＮＡサンプルローディングツールは、基本的に一方
の面に導電性薄膜電極が蒸着された支持基板１と、該支
持基板の電極蒸着面側に配設されたセル板３とからな
る。
のＤＮＡサンプルローディングツールについて具体的に
説明する。図１は、本発明のＤＮＡサンプルローディン
グツールの構成の一例を示す概要斜視図である。本発明
のＤＮＡサンプルローディングツールは、基本的に一方
の面に導電性薄膜電極が蒸着された支持基板１と、該支
持基板の電極蒸着面側に配設されたセル板３とからな
る。
【００１６】図２は、図１に示されたＤＮＡサンプルロ
ーディングツールの部分拡大斜視図である。基板１に
は、薄膜電極５が蒸着されている。電極５は蒸着ではな
く、印刷、メッキなどの公知慣用の手段によっても設け
ることができる。基板１は例えば、導電性金属（例え
ば、ステンレス、金、銀など）から形成し、電極５に電
源を接続したときに、ジュール熱で加熱できることが好
ましい。セル板３は複数個のサンプル及び精製反応試薬
注入部７を有する。注入部７の容量は約２０〜約１００
μｌ程度の容量を有することが好ましい。また、注入部
７の個数は４０〜６０個程度設けることが好ましい。注
入部７の個数が少なすぎると、分析のスループットを向
上させることができない。一方、注入部７の個数が多す
ぎると、隣接する泳動路の分離が不良になる可能性があ
る。セル板３はプラスチック、金属など任意の材料から
形成することができる。注入部７の底部９はサンプル調
製中は任意の適当な部材（例えば、テープなど）（図示
されていない）で封止されており、サンプル調製が終了
し、泳動板に装着する際に、封止部材を除去する。従っ
て、本発明のＤＮＡサンプルローディングツールによる
サンプル調製はＤＮＡ塩基配列決定分析と別の箇所で行
うことができる。
ーディングツールの部分拡大斜視図である。基板１に
は、薄膜電極５が蒸着されている。電極５は蒸着ではな
く、印刷、メッキなどの公知慣用の手段によっても設け
ることができる。基板１は例えば、導電性金属（例え
ば、ステンレス、金、銀など）から形成し、電極５に電
源を接続したときに、ジュール熱で加熱できることが好
ましい。セル板３は複数個のサンプル及び精製反応試薬
注入部７を有する。注入部７の容量は約２０〜約１００
μｌ程度の容量を有することが好ましい。また、注入部
７の個数は４０〜６０個程度設けることが好ましい。注
入部７の個数が少なすぎると、分析のスループットを向
上させることができない。一方、注入部７の個数が多す
ぎると、隣接する泳動路の分離が不良になる可能性があ
る。セル板３はプラスチック、金属など任意の材料から
形成することができる。注入部７の底部９はサンプル調
製中は任意の適当な部材（例えば、テープなど）（図示
されていない）で封止されており、サンプル調製が終了
し、泳動板に装着する際に、封止部材を除去する。従っ
て、本発明のＤＮＡサンプルローディングツールによる
サンプル調製はＤＮＡ塩基配列決定分析と別の箇所で行
うことができる。
【００１７】図３は、本発明のＤＮＡサンプルローディ
ングツールを泳動板に装着した状態を示す概要断面図で
ある。注入部７は膨隆しているが、その下部は括れてお
り、２枚の泳動板８６，８８の隙間（約０．３ｍｍ）よ
りも若干小さな厚さを有するように形成されているの
で、両泳動板の上部隙間に本発明のＤＮＡサンプルロー
ディングツールを挿入することができる。前記のよう
に、注入部７の底部９の封止部材（図示されていない）
を除去してあるので、ＤＮＡサンプルローディングツー
ルが挿入されると、注入部７の内部のＤＮＡサンプルは
ゲル電解質層９０の所定位置にローディングされる。斯
くして、従来のサンプルローディングシートを用いてＤ
ＮＡサンプルをローディングするのに比べて、本発明の
ＤＮＡサンプルローディングツールを使用すれば、ロー
ディング作業自体を極めて簡単に行うことができ、ミス
ローディングを完全に防止できるばかりか、ローディン
グ時間も大幅に短縮され、分析効率を飛躍的に向上させ
ることができる。
ングツールを泳動板に装着した状態を示す概要断面図で
ある。注入部７は膨隆しているが、その下部は括れてお
り、２枚の泳動板８６，８８の隙間（約０．３ｍｍ）よ
りも若干小さな厚さを有するように形成されているの
で、両泳動板の上部隙間に本発明のＤＮＡサンプルロー
ディングツールを挿入することができる。前記のよう
に、注入部７の底部９の封止部材（図示されていない）
を除去してあるので、ＤＮＡサンプルローディングツー
ルが挿入されると、注入部７の内部のＤＮＡサンプルは
ゲル電解質層９０の所定位置にローディングされる。斯
くして、従来のサンプルローディングシートを用いてＤ
ＮＡサンプルをローディングするのに比べて、本発明の
ＤＮＡサンプルローディングツールを使用すれば、ロー
ディング作業自体を極めて簡単に行うことができ、ミス
ローディングを完全に防止できるばかりか、ローディン
グ時間も大幅に短縮され、分析効率を飛躍的に向上させ
ることができる。
【００１８】次に、本発明のＤＮＡサンプルローディン
グツールによるＤＮＡサンプル調製について説明する。
ＤＮＡサンプルはＰＣＲ法及びシーケンス反応により調
製される。ＰＣＲ法は、特定のＤＮＡ領域を挟んだ２種
類のプライマーとＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡ合成反応
を繰り返すことにより、その特定領域を数十万倍に増幅
することからなるポリメラーゼ連鎖反応法のことであ
り、１９８５年に米国のＣｅｔｕｓ社により開発され
た。この方法は、その後、耐熱性酵素Ｔａｑポリメラー
ゼを利用した方法に改良されたことで、効率の良いＰＣ
Ｒ法として確立され、現在に至っている。ＰＣＲ法の原
理は、例えば、実験医学，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．２，１４
頁〜１８頁（１９８９）に詳細に説明されている。この
ＰＣＲ法は基本的に、プライマーが結合された２本鎖
ＤＮＡを熱変性により１本鎖に変性し、プライマーを
アニーリングし、Ｔａｑポリメラーゼにより伸長させ
ることからなる一連のサイクルからなり、このサイクル
を数十回繰り返すことにより所望のＤＮＡ断片を増幅さ
せることからなる。
グツールによるＤＮＡサンプル調製について説明する。
ＤＮＡサンプルはＰＣＲ法及びシーケンス反応により調
製される。ＰＣＲ法は、特定のＤＮＡ領域を挟んだ２種
類のプライマーとＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡ合成反応
を繰り返すことにより、その特定領域を数十万倍に増幅
することからなるポリメラーゼ連鎖反応法のことであ
り、１９８５年に米国のＣｅｔｕｓ社により開発され
た。この方法は、その後、耐熱性酵素Ｔａｑポリメラー
ゼを利用した方法に改良されたことで、効率の良いＰＣ
Ｒ法として確立され、現在に至っている。ＰＣＲ法の原
理は、例えば、実験医学，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．２，１４
頁〜１８頁（１９８９）に詳細に説明されている。この
ＰＣＲ法は基本的に、プライマーが結合された２本鎖
ＤＮＡを熱変性により１本鎖に変性し、プライマーを
アニーリングし、Ｔａｑポリメラーゼにより伸長させ
ることからなる一連のサイクルからなり、このサイクル
を数十回繰り返すことにより所望のＤＮＡ断片を増幅さ
せることからなる。
【００１９】ＰＣＲ増幅は米国のパーキン・エルマー社
から市販のキットを用いて行うことができる。この反応
混合物キットは、テンプレートＤＮＡ３μｌ（例えば、
ヒトゲノム約２００ｎｇ）、１０倍ＰＣＲバッファ３μ
ｌ、ｄＮＴＰ（２．５ミリモル）３μｌ、プライマ１
（１０マイクロモル）３μｌ、プライマ２（１０マイク
ロモル）３μｌ、Ｅｘ Ｔａｑ０．２μｌ及びＨ2Ｏ１
５μｌからなる全量３０μｌの溶液である。これを底部
９が封止された注入部７の上部開口部から注入し、電極
に電源を接続し、基板を発熱させ、９６℃で３分間加熱
し、次いで、９６℃で３０秒間と６８℃で３分間の加熱
を１サイクルとして、２５〜３０サイクル反復する。得
られたＰＣＲ増幅産物を１μｌ採取し、ミューピッドに
より増幅状態をチェックする。増幅が不十分であれば、
前記加熱サイクルを更に繰り返す。十分に増幅されてい
れば、ＰＣＲ増幅産物内の未反応物を分解するために酵
素を添加する。酵素としては、未反応ｄＮＴＰを除去す
るためのAlkaline Phosphatase Shrimp(APS)と未反応プ
ライマを除去するためのExonuklease I(Exol)を使用す
る。各酵素をＴＥで２０倍に希釈し、２μｌづつ添加す
る。その後、３７℃で１５分間加熱し、更に８０℃で１
５分間加熱し、未反応物質を分解する。その後、得られ
た精製物をシーケンス反応に付す。シーケンス反応は、
ダイプライマーを使用し、日立製のＲＰＮ２４４０ダイ
レクトシーケンス装置を用いて行うことができる。その
後、必要に応じて、シーケンス反応生成物を更に精製処
理することもできる。
から市販のキットを用いて行うことができる。この反応
混合物キットは、テンプレートＤＮＡ３μｌ（例えば、
ヒトゲノム約２００ｎｇ）、１０倍ＰＣＲバッファ３μ
ｌ、ｄＮＴＰ（２．５ミリモル）３μｌ、プライマ１
（１０マイクロモル）３μｌ、プライマ２（１０マイク
ロモル）３μｌ、Ｅｘ Ｔａｑ０．２μｌ及びＨ2Ｏ１
５μｌからなる全量３０μｌの溶液である。これを底部
９が封止された注入部７の上部開口部から注入し、電極
に電源を接続し、基板を発熱させ、９６℃で３分間加熱
し、次いで、９６℃で３０秒間と６８℃で３分間の加熱
を１サイクルとして、２５〜３０サイクル反復する。得
られたＰＣＲ増幅産物を１μｌ採取し、ミューピッドに
より増幅状態をチェックする。増幅が不十分であれば、
前記加熱サイクルを更に繰り返す。十分に増幅されてい
れば、ＰＣＲ増幅産物内の未反応物を分解するために酵
素を添加する。酵素としては、未反応ｄＮＴＰを除去す
るためのAlkaline Phosphatase Shrimp(APS)と未反応プ
ライマを除去するためのExonuklease I(Exol)を使用す
る。各酵素をＴＥで２０倍に希釈し、２μｌづつ添加す
る。その後、３７℃で１５分間加熱し、更に８０℃で１
５分間加熱し、未反応物質を分解する。その後、得られ
た精製物をシーケンス反応に付す。シーケンス反応は、
ダイプライマーを使用し、日立製のＲＰＮ２４４０ダイ
レクトシーケンス装置を用いて行うことができる。その
後、必要に応じて、シーケンス反応生成物を更に精製処
理することもできる。
【００２０】
【発明の効果】以上説明したように、本発明のＤＮＡサ
ンプルローディングツールによれば、サンプル生成工程
において、従来ＰＣＲ増幅後の精製処理を遠心分離器で
行わずに、酵素を用いて行うことにより、サンプル生成
の全工程が同一のセルで行えるようになり、サンプル生
成作業に必要な時間が大幅に短縮される。しかも、サン
プル生成後、直ちに泳動板にローディングしてＤＮＡ塩
基配列決定分析を開始することができるので、サンプル
生成から配列決定までの全作業時間も飛躍的に短縮され
る。
ンプルローディングツールによれば、サンプル生成工程
において、従来ＰＣＲ増幅後の精製処理を遠心分離器で
行わずに、酵素を用いて行うことにより、サンプル生成
の全工程が同一のセルで行えるようになり、サンプル生
成作業に必要な時間が大幅に短縮される。しかも、サン
プル生成後、直ちに泳動板にローディングしてＤＮＡ塩
基配列決定分析を開始することができるので、サンプル
生成から配列決定までの全作業時間も飛躍的に短縮され
る。
【図１】本発明のＤＮＡサンプルローディングツールの
一例の概要斜視図である。
一例の概要斜視図である。
【図２】図１に示されたＤＮＡサンプルローディングツ
ールの部分概要拡大斜視図である。
ールの部分概要拡大斜視図である。
【図３】本発明のＤＮＡサンプルローディングツールを
泳動板に装着した状態を示す概要斜視図である。
泳動板に装着した状態を示す概要斜視図である。
【図４】特開昭６３−２１５５６号公報に開示されたＤ
ＮＡ塩基配列決定装置の模式的構成図である。
ＮＡ塩基配列決定装置の模式的構成図である。
【図５】図４に示された装置で使用される泳動板の部分
拡大斜視図である。
拡大斜視図である。
【図６】従来のシャークコームの一例の平面図である。
【図７】図６に示されたシャークコームを泳動板に挿入
した状態を示す部分拡大平面図である。
した状態を示す部分拡大平面図である。
【図８】図７におけるVIII−VIII線に沿った部分概要断
面図であり、ＤＮＡサンプルをゲル電解質層上部に注入
する状態を模式的に示す。
面図であり、ＤＮＡサンプルをゲル電解質層上部に注入
する状態を模式的に示す。
１ 支持基板 ３ セル板 ５ 電極 ７ サンプル及び精製反応試薬注入部 ９ 注入部底部
フロントページの続き (72)発明者 高木 新一 東京都渋谷区東３丁目16番３号 日立電子 エンジニアリング株式会社内 Ｆターム(参考） 4B029 AA07 AA23 BB20 CC01 FA12 FA15
Claims (4)
- 【請求項１】 一方の面に導電性薄膜電極が蒸着された
支持基板と、該支持基板の電極蒸着面側に固着された、
サンプル及び精製反応試薬注入部を複数個有するセル板
とからなることを特徴とするＤＮＡサンプルローディン
グツール。 - 【請求項２】 前記支持基板は導電性金属から形成され
ていることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡサンプ
ルローディングツール。 - 【請求項３】 前記サンプル及び精製反応試薬注入部は
２０μｌ〜１００μｌの範囲内の容積を有することを特
徴とする請求項１に記載のＤＮＡサンプルローディング
ツール。 - 【請求項４】 前記セル板はプラスチックからなること
を特徴とする請求項１に記載のＤＮＡサンプルローディ
ングツール。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000127096A JP2001305106A (ja) | 2000-04-27 | 2000-04-27 | Ｄｎａサンプルローディングツール |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000127096A JP2001305106A (ja) | 2000-04-27 | 2000-04-27 | Ｄｎａサンプルローディングツール |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001305106A true JP2001305106A (ja) | 2001-10-31 |
Family
ID=18636754
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000127096A Pending JP2001305106A (ja) | 2000-04-27 | 2000-04-27 | Ｄｎａサンプルローディングツール |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001305106A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013094696A1 (ja) * | 2011-12-20 | 2013-06-27 | シャープ株式会社 | 電気泳動用カセット、電気泳動用カセットの製造方法、および電気泳動方法 |
-
2000
- 2000-04-27 JP JP2000127096A patent/JP2001305106A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013094696A1 (ja) * | 2011-12-20 | 2013-06-27 | シャープ株式会社 | 電気泳動用カセット、電気泳動用カセットの製造方法、および電気泳動方法 |
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