JP2019132846A - 微小粒子分析装置及び微小粒子分析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】微小粒子から発せられた蛍光のスペクトラム情報を視覚で理解することができる技術を提供する。【解決手段】複数の微小粒子に対して波長領域毎に検出された複数の検出データに基づき、前記波長領域での強度毎に特定された前記検出データの検出回数を表す情報を、前記波長領域を示す波長情報に対してスペクトル表示し、前記スペクトルに対するゲーティング処理に応じて前記ゲーティング処理された領域のデータのみを表示し、前記検出データは、前記複数の微小粒子のうち流路を通流する一の微小粒子から発せられた蛍光を、複数の波長領域で検出した光を示す値である表示方法等を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、表示方法及び微小粒子分析装置に関する。より詳しくは、微小粒子から発せられる蛍光の種類などを分析する技術に関する。

一般に、細胞、微生物及びリポソームなどの生体関連微小粒子を分析する場合は、フローサイトメトリー（フローサイトメーター）が利用されている（例えば、非特許文献１参照。）。フローサイトメトリーは、流路内を１列になって通流する微小粒子に特定波長のレーザ光（励起光）を照射して、各微小粒子から発せられた蛍光や散乱光を検出することにより、複数の微小粒子を１個ずつ分析する方法である。このフローサイトメトリーでは、光検出器で検出した光を電気的信号に変換して数値化し、統計解析を行うことにより、個々の微小粒子の種類、大きさ及び構造などを判定することができる。

また、近年、フローサイトメトリーにおいて、複数の蛍光色素を使用したマルチカラー分析が普及してきている（例えば、特許文献１，２参照。）。これら従来のフローサイトメータでは、通常、波長が異なる複数の光源と、各色素から発せられた光を検出するための複数の検出器を備えている。一方、蛍光色素はスペクトルを持つため、マルチカラー分析のように一度の測定で複数の蛍光色素を使用すると、検出器に目的以外の蛍光色素からの光が漏れ込み、分析精度が低下する。そこで、従来のフローサイトメータでは、目的の蛍光色素からの光情報のみを取り出すため、光検出器で検出した光を電気的信号に変換して数値化する際に、数学的な補正、即ち、蛍光補正を行っている。

特開２００６−２３０３３３号公報 特表２００８−５００５５８号公報

中内啓光監修，「細胞工学別冊 実験プロトコルシリーズ フローサイトメトリー自由自在」，第２版，株式会社秀潤社，２００６年８月３１日発行

前述したように、蛍光色素はそれぞれ特有のスペクトルを持っており、そのスペクトル情報は、蛍光色素自身の特徴を表すものとして重要なデータとなる。しかしながら、従来のフローサイトメータは、目的とする蛍光色素からの光を、例えば特定のバンド幅をもつ光を受光するセンサで検出し、その検出データを対応データとして扱っているため、各蛍光色素のスペクトル情報を提示することができないという問題点がある。

そこで、本発明は、微小粒子から発せられた蛍光のスペクトラム情報を視覚で理解することができる技術を提供することを主目的とする。

本発明では、流路を通流する微小粒子から発せされた蛍光を複数の波長領域で同時に検出して得た検出データを、前記波長領域を示す波長情報をパラメーターとしてスペクトル表示するデータ表示方法を提供する。
また、本発明では、前記検出は、多チャンネル光電子倍増管によるものとしてもよい。この場合、前記波長情報は、前記多チャンネル光電子倍増管の、チャンネル番号又は波長であるものとしてもよい。また、この場合、前記検出データは、複数の微小粒子を連続して検出することにより取得されたものであるものとしてもよい。この場合、前記複数の微小粒子は、２以上の色素で修飾された微小粒子又はそれぞれ異なる色素で修飾された２種以上の微小粒子であるものとしてもよい。この場合、前記多チャンネル光電子倍増管のチャンネル数は、前記色素の数以上であるものとしてもよい。
更に、本発明では、更に、前記検出データを演算処理し、その結果を表示してもよい。
加えて、本発明では、前記スペクトルは、前記検出データに基づく蛍光強度を縦軸として表示してもよい。
また、本発明では、前記スペクトルは、前記波長情報を横軸として表示してもよい。
更に、本発明では、更に、前記スペクトルに対するゲーティング処理に応じて前記ゲーティング処理された領域のデータを表示してもよい。この場合、前記ゲーティング処理された領域のデータは、二次元プロットとして表示されていてもよい。

本発明では、流路を通流する微小粒子に励起光を照射する光照射部と、前記微小粒子から発せされた蛍光を複数の波長領域で同時に検出する検出部と、前記検出部に基づく検出データを、前記複数の波長領域を示す波長情報をパラメーターとしてスペクトル表示する表示部と、を少なくとも有する、微小粒子分析装置も提供する。
また、本発明では、前記検出部は、多チャンネル光電子倍増管を含むものであってもよい。この場合、前記波長情報は、前記多チャンネル光電子倍増管の、チャンネル番号又は波長であってもよい。
更に、本発明では、前記検出部で取得した前記波長領域毎の光に対応する検出データを取得する解析部、を更に有していてもよい。

本発明によれば、微小粒子から発せられた蛍光のスペクトラム情報を提示することが可能であるため、ユーザーが測定データを視覚で理解することができる。

本発明の第２の実施形態に係る微小粒子分析装置の構成を示す図である。 測定結果の表示例を示す図である。 図２に示す表示例についてゲートをかける方法を示す図である。 ゲート後の表示例を示す図である。

以下、本発明を実施するための形態について、添付の図面を参照して詳細に説明する。なお、本発明は、以下に示す各実施形態に限定されるものではない。また、説明は、以下の順序で行う。

１．第１の実施の形態
（スペクトル表示の方法の例）
２．第２の実施の形態
（スペクトル表示する微小粒子分析装置の例）

＜１．第１の実施の形態＞
［全体構成］
先ず、本発明の第１の実施形態のデータ表示方法について説明する。本実施形態のデータ表示方法においては、細胞やマイクロビーズなどの微小粒子から発せられた蛍光を、複数の波長領域で同時に検出し、波長領域毎の検出データをスペクトル表示する。

［検出データ］
本実施形態のデータ表示方法では、光検出器により検出された光を、波長領域毎に電圧パルス（電気的信号）に変換し、定量化して検出データとする。具体的には、電圧パルスの高さ、幅又は面積を求めて、検出データとする。

［表示形態］
本実施形態のデータ表示方法では、前述した方法で求めた波長領域毎の検出データを、スペクトル表示する。その表示方法は、特に限定されるものではないが、例えば、密度プロット、ドットプロット又は等高線などが挙げられる。また、表示されているスペクトルから特定領域のデータのみを抽出し、そのスペクトラムチャートを拡大表示したり、ヒストグラムや二次元プロットを表示したりすることもできる。

更に、このデータ表示方法では、複数の微小粒子を連続して検出することにより取得された検出データを演算処理し、その結果を表示することも可能である。その演算処理としては、例えば、検出データを積算したり、全微粒子の検出データの平均値を算出したりすることなどが挙げられる。更にまた、本実施形態のデータ表示方法では、検出しながら表示を行うこともできるが、検出データを一旦保存し、この保存されたデータを読み出して表示してもよい。その場合も、検出データを演算処理し、その結果を表示してもよい。

従来の二次元プロットでは、蛍光補正を行っても、そのデータをユーザーが視覚で判断することは困難であった。これに対して、本実施形態のデータ表示方法では、微小粒子から発せられた蛍光のスペクトラム情報を提示することができるため、蛍光補正の有無及び蛍光補正の結果にかかわらず、ユーザーが測定データを視覚で理解することができる。また、本実施形態のデータ表示方法では、特定領域のデータを抽出することにより、微小粒子について種々の情報を得ることが可能である。

本実施形態のデータ表示方法は、微小粒子や細胞などの分析装置に限らず、例えば、製造装置、検査装置及び医療用装置などにも適用可能である。

＜２．第２の実施の形態＞
［装置の全体構成］
次に、本発明の第２の実施形態に係る微小粒子分析装置について説明する。図１は本実施形態の微小粒子分析装置の構成を示す図であり、図２はその測定結果の表示例を示す図である。図１に示すように、本実施形態の微小粒子分析装置１には、少なくとも、検出部２と、変換部３と、解析部４と、表示部５が設けられている。

［検出部２の構成］
検出部２は、分析対象の微小粒子から発せられた蛍光を、複数の波長領域で同時に検出可能な構成であればよい。具体的には、波長領域毎にその波長領域を検出可能なセンサを配置した構成や、多チャンネル光電子倍増管（Photo-Multiplier Tube：ＰＭＴ）などのように複数の光を同時に検出可能な検出器を備えた構成とすることができる。この検出部２で検出する波長領域の数、即ち、検出部２に配設される検出器のチャンネル数又はセンサ数などは、使用する色素の数以上であればよいが、現在のマルチカラー分析では６〜８色が一般的で、最大でも１０〜１２色であることから、１２以上であることが好ましい。

また、本実施形態の微小粒子分析装置１では、検出部２に分光器を設け、微小粒子から発せられた蛍光が、この分光器で分光された後、多チャンネルＰＭＴなどの検出器に入射する構成としてもよい。更に、検出部２には、必要に応じて、対物レンズ、集光レンズ、ピンホール、バンドカットフィルター、ダイクロックミラーなどを設けることもできる。

［変換部３の構成］
変換部３は、検出部２で検出した各波長領域の光を、それぞれ電圧パルス（電気的信号）に変換するものであり、例えばＡＤコンバータなどを使用することができる。

［解析部４の構成］
解析部４では、電子計算機などを用いて変換部３で変換された電圧パルスを処理して定量化し、検出データとする。具体的には、電圧パルスの高さ（ｐｅａｋ）、幅（ｗｉｄｔｈ）又は面積（ｉｎｔｅｇｒａｌ）を求め、これらを検出データとして使用する。そして、その結果は、波長領域毎に関連付けられ、記憶部（図示せず）などに保存される。

［表示部５の構成］
表示部５は、解析部４での処理で得た検出データ、即ち、本実施形態の微小粒子分析装置１の測定結果を表示するものである。具体的には、表示部５には、例えば、図２に示すように、横軸に検出部のチャンネル番号をとり、縦軸に強度をとって、チャンネル毎の蛍光強度を示した「密度プロット」などが表示される。このとき、チャンネル番号が大きくなるに従い、検出波長が高くなるようにすると、検出光（蛍光）のスペクトラム情報が得られる。

［微小粒子分析装置１の動作］
次に、本実施形態の微小粒子分析装置１の動作について説明する。本実施形態の微小粒子分析装置１で分析とする微小粒子は、特に限定されるものではないが、例えば細胞やマイクロビーズなどが挙げられる。また、これら微小粒子を修飾する蛍光色素の種類及び数も、特に限定されるものではなくＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanete：Ｃ２１Ｈ１１ＮＯ５Ｓ）、ＰＥ（phycoerythrin）、ＰｅｒＣＰ（periidinin chlorophyll protein）、ＰＥ−Ｃｙ５及びＰＥ−Ｃｙ７などの公知の色素を、必要に応じて適宜選択して使用することができる。更に、各微小粒子が複数の蛍光色素で修飾されていてもよい。

この微小粒子分析装置１を使用して微小粒子を光学的に分析する際は、先ず、光照射部の光源から励起光を出射し、流路内を通流する微小粒子に照射する。次に、微小粒子から発せられた蛍光を、検出部２で検出する。その際、例えば、微小粒子から発せられた蛍光を、プリズムや回折格子などの分光器で分光し、検出部２に配設された各センサやＰＭＴの各チャンネルに、それぞれ異なる波長領域の光を入射させる。

その後、検出部２において取得された各波長領域のデータは、変換部３で電圧パルスに変換され、更に、解析部４において定量化され、保存される。そして、その結果は、例えば図２に示す「密度プロット」などの形式で、表示部５に表示される。なお、図２に示す「密度プロット」は、３２チャンネルＰＭＴを使用し、ＦＩＴＣのみで修飾されているサンプル、ＰＥのみで修飾されているサンプル及びＮｅｇａｔｉｖｅサンプルを混合したものを測定した結果である。

この「密度プロット」は、横軸にＰＭＴのチャンネル番号（波長依存番号）をとり、縦軸に蛍光強度をとって、積算数０を青色とし、積算数が増す、即ち、密度が高くなるに従い赤色になるようにしている。このとき、検出波長が最も小さいチャンネルの番号を１とし、番号が大きくなるに従い検出波長が高くなるようにすれば、蛍光スペクトルに相当する情報が得られる。そして、このスペクトラム情報から、ユーザーは、サンプルが何の蛍光にラベルされているかを認識することができる。

更に、本実施形態の微小粒子分析装置１では、図２に示すデータについて、特定のサンプル群だけを選び出し、そのサンプル（微小粒子）のみのデータを抽出し表示するゲーティングを行うこともできる。その際の表示形態は特に限定されるものではなく、ヒストグラム、二次元プロット及びスペクトラムチャートなど、種々の形態で表示することが可能である。図３は図２に示す表示例についてゲートをかける方法を示す図であり、図４はゲート後の表示例を示す図である。従来のフローサイトメータでは、通常、二次元プロットに対してゲーティング処理を行っているため、２チャンネル分の情報にのみゲートをかけることとなる。

これに対して、図３に示すように、本実施形態の微小粒子分析装置１では、蛍光スペクトルについて、例えば１０チャンネル分まとめてゲートをかける。そして、図４に示すように、ゲーティングしたサンプルのデータを、スペクトラムプロットで、ドットプロットモードにしたり、色を変化させたりすることも可能である。これにより、より明示的なゲーティングを実現することが可能であり、そのデータをユーザーが明確に確認することができる。また、ゲーティングしたサンプルのデータを、二次元プロットで表示することも可能である。

また、蛍光スペクトルに基づきゲートする領域を選択できるため、例えば１つの微小粒子に２種類の蛍光色素が固定されているのか、それぞれ異なる蛍光色素で修飾された２個の微小粒子を含むのかも、容易に切り分けることができる。更に、他の蛍光色素からの漏れ込みがない部分をゲーティングすることにより、蛍光補正の有無及び蛍光補正の結果にかかわらず、ユーザーは、視覚によって、表示されているデータから、種々の情報を得ることが可能である。

なお、本実施形態の微小粒子分析装置１では、前述した「密度プロット」、「ドットプロット」だけでなく、「等高線プロット」、「二次元プロット」、「二次元ヒストグラム」などを表示することも可能である。また、複数の微小粒子を連続して測定し、検出部２で検出されたデータを随時積算し、表示部５に表示されている蛍光スペクトルにリアルタイムで反映させることもできる。更に、保存されたデータを読み出して使用して表示したり、複数の微小粒子を連続して測定した結果を一旦保存し、全サンプルの平均値を使用して表示したりすることもできる。

１ 微小粒子分析装置
２ 検出部
３ 変換部
４ 解析部
５ 表示部

本発明では、流路を通流する色素で修飾された複数の微小粒子に一つの励起光を照射する光照射部と、前記励起光の照射により前記微小粒子から発せられた蛍光を、複数の波長領域で同時に検出する複数の検出器を有する検出部と、前記検出部において前記微小粒子毎に前記色素の数以上の波長領域で蛍光を検出し、前記検出した蛍光データに基づいて、微小粒子に修飾した色素に関する情報を解析する解析部を有する、微小粒子分析装置を提供する。
本発明では、前記検出部で検出した各波長領域の光を電圧パルスに変換する変換部を有していてもよい。
また、本発明では、前記色素で修飾された複数の微小粒子は、無染色の微小粒子、一つの色素で修飾された微小粒子、二つ以上の色素で修飾された微小粒子、又はこれらのいずれか２種以上を混合したものであってもよい。
更に、本発明では、前記光照射部は、波長が異なる励起光を照射する複数の光源を有してしてもよい。
加えて、本発明では、前記検出器は、センサ又は多チャンネル光電子倍増管のチャンネルであってもよく、この場合、前記センサ又は多チャンネル光電子倍増管のチャンネルの数が６以上であってもよい。
また、本発明では、前記検出部は、前記微小粒子に修飾された色素の数以上の検出器を有していてもよい。
更に、本発明では、前記解析部は、前記検出した蛍光データに基づいて、微小粒子に修飾した色素に関する情報を解析し、微小粒子の群を特定してもよい。
加えて、本発明では、前記検出した蛍光データを、前記波長領域を示す波長情報をパラメーターとしてスペクトル表示する表示部を有していてもよく、この場合、前記表示部は、前記スペクトルに対するゲーティング処理に応じて前記ゲーティング処理された領域のデータを表示してもよい。また、この場合、前記ゲーティング処理された領域のデータは、二次元プロットとして表示されてもよい。

本発明では、流路を通流する色素で修飾された複数の微小粒子に一つの励起光を照射し、前記励起光の照射により前記微小粒子から発せられた蛍光を、複数の波長領域で同時に検出する複数の検出器を有する検出部において、前記微小粒子毎に前記色素の数以上の波長領域で蛍光を検出し、前記検出した蛍光データに基づいて、微小粒子に修飾した色素に関する情報を解析する、微小粒子分析方法も提供する。

Claims (1)

1. 複数の微小粒子に対して波長領域毎に検出された複数の検出データに基づき、前記波長領域での強度毎に特定された前記検出データの検出回数を表す情報を、前記波長領域を示す波長情報に対してスペクトル表示し、
   前記スペクトルに対するゲーティング処理に応じて前記ゲーティング処理された領域のデータのみを表示し、
   前記検出データは、前記複数の微小粒子のうち流路を通流する一の微小粒子から発せられた蛍光を、複数の波長領域で検出した光を示す値である表示方法。