JP2018527559A - サイトメータ測定を調整するためのシステム及び方法 - Google Patents

サイトメータ測定を調整するためのシステム及び方法 Download PDF

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Abstract

フローサイトメータの動作方法及びシステムが、非染色試料のイベントの前方散乱値、側方散乱値及び蛍光強度値と、蛍光強度値を前方散乱−側方散乱プロット領域に関連付けるステップとを含むことができる。フローサイトメータの動作方法及びシステムは、染色試料のイベントの前方散乱値、側方散乱値及び蛍光強度値を測定するステップと、染色試料のイベントの前方散乱−側方散乱プロット位置を特定するステップと、染色試料の各イベントについて、前方散乱−側方散乱プロット位置における染色試料のイベントの測定蛍光強度値から、染色試料のイベントの前方散乱−側方散乱プロット位置を含む前方散乱−側方散乱プロット領域に関連する蛍光強度値を減算するステップとを含むこともできる。【選択図】図９

Description

本開示は、一般にフローサイトメトリの分野に関し、具体的には、試料分析の誤りを低減する方法に関する。
フローサイトメータ及びスキャニングサイトメータなどの粒子分析器は、光散乱及び蛍光性などの光学パラメータに基づく粒子特性評価を可能にする分析ツールである。フローサイトメータでは、例えば、流体懸濁液中の分子、検体結合ビード（ａｎａｌｙｔｅ−ｂｏｕｎｄ ｂｅａｄｓ）又は個々の細胞などの粒子を検出領域に通し、ここでこれらの粒子を典型的には１又は２以上のレーザーからの励起光に曝して粒子の光散乱特性及び蛍光特性を測定する。検出、識別及び特性評価を容易にする蛍光色素を含む試薬によって、細胞の細胞表面タンパク質成分などの、際立った特徴として機能できるマーカーの存在を認識することができる。各試薬は、特定のマーカーに選択的に付着する、例えばモノクローナル抗体などの検出分子と共役である、典型的には蛍光分子又は「色素」である標識を含むことができる。スペクトル的に異なる蛍光色素を用いてマーカーに標識付けすることにより、非常に多くの異なる粒子又は成分を区別することができる。いくつかの実装では、分析器に非常に多くの光検出器が含まれる。粒子がレーザービームを通過すると、前方散乱（ＦＳＣ）検出器、側方散乱（ＳＳＣ）検出器、及び場合によっては蛍光放射検出器上に時間相関したパルスが生じる。これが１つの「イベント」であり、イベント毎に各検出器の、すなわちＦＳＣ検出器、ＳＳＣ検出器及び蛍光放射検出器の検出器出力の大きさが記憶される。取得されるデータは、光散乱パラメータ及び蛍光放射の各々について測定された信号を含む。
サイトメータは、検出器出力を記憶してデータを分析するためのコンポーネントをさらに含むことができる。例えば、データの記憶及び分析は、検出エレクトロニクスに接続されたコンピュータを用いて実行することができる。例えば、データは、各行が１つの粒子（又は１つのイベント）のデータに対応し、列が各測定パラメータに対応する表形式で論理的に記憶することができる。フローサイトメータからのデータの記憶に「ＦＣＳ」ファイルフォーマットなどの標準的なファイルフォーマットを使用すると、別個のプログラム及び／又は機械を用いたデータの分析が容易になる。通常、データは、視覚化しやすいように現行の分析方法を用いて２次元（２Ｄ）グラフで表示されるが、他の方法を用いて多次元データを視覚化することもできる。
通常、フローサイトメータを用いて測定されるパラメータは、粒子によって概ね前方方向に沿って散乱される励起光を意味するＦＳＣと、粒子によって概ね側方方向に沿って散乱される励起光を意味するＳＳＣと、蛍光分子から放出される、スペクトルの１又は２以上のチャネル（周波数帯）の光とを含み、この光はＦＬ１、ＦＬ２などと呼ばれ、又は主にそのチャネルにおいて放出する蛍光色素の名前で呼ばれる。色素標識抗体を用いて様々な細胞タンパク質に標識付けすることによって生じる散乱パラメータ及び蛍光放射によって、異なる細胞型を識別することができる。
フローサイトメータ及びスキャニングサイトメータは、いずれも例えばＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（カリフォルニア州サンノゼ）などから市販されている。フローサイトメトリについては、例えば以下の非特許文献１〜５に記載されており、これらは全て引用により本明細書に組み入れられる。蛍光イメージング顕微鏡法については、例えば以下の非特許文献６に記載されており、この文献も引用により本明細書に組み入れられる。
Ｌａｎｄｙ他著、「臨床フローサイトメトリ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）」、ニューヨーク科学アカデミー年報、第６７７巻（１９９３年） Ｂａｕｅｒ他著、「臨床フローサイトメトリ：原理及び応用（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、Ｗｉｌｌｉａｍｓ及びＷｉｌｋｉｎｓ（１９９３年） Ｏｒｍｅｒｏｄ著、「臨床フローサイトメトリ：実践的手法（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、オックスフォード大学出版（１９９７年） Ｊａｒｏｓｚｅｓｋｉ他著、「分子生物学におけるフローサイトメトリプロトコル及び方法（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第９１号、Ｈｕｍａｎａ出版（１９９７年） 「実践的シャピロフローサイトメトリ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）」、第４版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ（２００３年） Ｐａｗｌｅｙ著、「生物学的共焦点顕微鏡法ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）」、第２版、Ｐｌｅｎｕｍ出版（１９８９年）
本発明の１つの態様によれば、フローサイトメトリ実験のための方法が提供される。
１つの実施形態では、前方散乱検出器と、側方散乱検出器と、各々が蛍光チャネルに対応する複数の蛍光放射検出器とを有するフローサイトメータの動作方法を提供する。この方法は、フローサイトメータを用いて、非染色試料の１又は２以上のイベントの、前方散乱検出器における１又は２以上の前方散乱値と、側方散乱検出器における１又は２以上の側方散乱値と、複数の蛍光放射検出器のうちの１又は２以上の蛍光放射検出器における１又は２以上の蛍光強度値とを測定するステップを含む。方法は、非染色試料の１又は２以上のイベントを測定したことに少なくとも部分的に基づいて、複数の蛍光放射検出器のうちの１又は２以上の蛍光放射検出器の１又は２以上の蛍光強度値を１又は２以上の前方散乱−側方散乱プロット領域に関連付けるステップをさらに含む。方法は、フローサイトメータを用いて、染色試料の１又は２以上のイベントの、１又は２以上の前方散乱値と、１又は２以上の側方散乱値と、複数の蛍光放射検出器のうちの１又は２以上の蛍光放射検出器における１又は２以上の蛍光強度値とを測定するステップをさらに含む。方法は、染色試料の１又は２以上のイベントの前方散乱−側方散乱プロット位置を特定するステップをさらに含む。方法は、染色試料の１又は２以上のイベントの各々について、複数の蛍光放射検出器のうちの少なくとも１つの蛍光放射検出器において測定された、前方散乱−側方散乱プロット位置における染色試料のイベントの測定蛍光強度値から、複数の蛍光放射検出器のうちの少なくとも１つの蛍光放射検出器の、染色試料のイベントの前方散乱−側方散乱プロット位置を含む前方散乱−側方散乱プロット領域に関連する蛍光強度値を減算するステップをさらに含む。
別の実施形態では、フローサイトメータが提供される。このフローサイトメータは、励起レーザーと、１又は２以上の試料からの粒子を励起レーザーのビーム経路に移送するように構成された流体工学システムと、１又は２以上の検出器と、処理回路とを含む。１又は２以上の検出器は、非染色試料の１又は２以上のイベントの１又は２以上の前方散乱値と、１又は２以上の側方散乱値と、１又は２以上の蛍光強度値とを測定するとともに、染色試料の１又は２以上のイベントの１又は２以上の前方散乱値と、１又は２以上の側方散乱値と、１又は２以上の蛍光強度値とを測定するように構成される。処理回路は、非染色試料の１又は２以上のイベントの１又は２以上の前方散乱値、１又は２以上の側方散乱値及び１又は２以上の蛍光強度値の測定に少なくとも部分的に基づいて、１又は２以上の蛍光強度値を１又は２以上の前方散乱−側方散乱プロット領域に関連付けるように構成される。処理回路は、染色試料の前方散乱−側方散乱プロット位置を特定するようにも構成される。処理回路は、染色試料の１又は２以上のイベントの各々について、前方散乱−側方散乱プロット位置における染色試料のイベントの測定蛍光強度値から、染色試料のイベントの前方散乱−側方散乱プロット位置を含む前方散乱−側方散乱プロット領域に関連する蛍光強度値を減算するようにさらに構成される。
本発明の例示的な実施形態によるフローサイトメータを示す図である。 本発明による、標識の発光スペクトル及び光検出器のフィルタウィンドウの例を示すグラフである。 本発明による、複数の細胞集団の前方散乱強度及び側方散乱強度を示す２−Ｄ前方散乱−側方散乱ドットプロットの例を示す図である。 本発明による、複数の細胞集団の平均自家蛍光スペクトルを表示するヒストグラムの例を示す図である。 本発明による複数のプロット領域の例を示す図である。 本発明による自家蛍光強度マップの例を示す図である。 本発明によるイベント密度マップの例を示す図である。 本発明による、染色試料の前方散乱−側方散乱プロットの例を示す図である。 図６Ａの染色試料の標識の側方散乱強度及び測定蛍光強度を示すドットプロットの例を示す図である。 本発明による、自家蛍光ノイズ信号を除去した後の図６Ｂのデータを示すドットプロットの例を示す図である。 本発明による、染色試料の前方散乱−側方散乱ドットプロットに重なるようにスケーリングされた非染色試料の前方散乱−側方散乱ドットプロットの例を示す図である。 本発明の例示的な実施形態による、フローサイトメータの動作処理のフローチャートである。
本発明は、フローサイトメトリ実験を行うためのシステム及び方法を提供する。この数年間、フローサイトメトリ実験のイベントについて行われる測定の回数を増やすことが望まれており、計器メーカーは、検出システムと高複雑性及び高性能のデータ分析能力とを有するフローサイトメータ計器を開発した。生化学の進歩は、蛍光標識の選択をますます幅広いものにした。これらの進歩は、フローサイトメトリをかつてないほど有用なものにしたが、この有用性の活用は依然として課題である。標識の選択及び計器の構成が複雑になると同時に、実験の成功が適切な実験設計に依存する度合いも高まっている。例えば、１つの蛍光色素からの発光スペクトルが複数の検出器の検出帯に重なることもあるので、測定データから引き出される結果の正確性にとっては、サイトメトリ実験において使用する蛍光色素の選択が重要である。標識間における相対的輝度の違い、及び実験で標識付けされるマーカーの相対的密度の違いも、イベント特性評価の精度に影響を及ぼすことがある。
図１に、本発明の例示的な実施形態によるフローサイトメトリのためのシステム１００を示す。システム１００は、フローサイトメータ１１０と、コントローラ／プロセッサ１９０と、メモリ１９５とを含む。フローサイトメータ１１０は、１又は２以上の励起レーザー１１５ａ〜ｃと、集束レンズ１２０と、フローチャンバ１２５と、前方散乱検出器１３０と、側方散乱検出器１３５と、蛍光収集レンズ１４０と、１又は２以上のビームスプリッタ１４５ａ〜ｇと、１又は２以上のバンドパスフィルタ１５０ａ〜ｅと、１又は２以上のロングパス（ＬＰ）フィルタ１５５ａ〜ｂと、１又は２以上の蛍光放射検出器１６０ａ〜ｆとを含む。
励起レーザー１１５ａ〜ｃは、レーザービームの形の光を放出する。図１のシステム例では、励起レーザー１１５ａ〜ｃから放出されるレーザービームの波長が、それぞれ４８８ｎｍ、６３３ｎｍ及び３２５ｎｍである。レーザービームは、最初にビームスプリッタ１４５ａ及び１４５ｂの一方又は両方を通じて導かれる。ビームスプリッタ１４５ａは、４８８ｎｍの光を透過させて６３３ｎｍの光を反射する。ビームスプリッタ１４５ｂは、ＵＶ光（１０〜４００ｎｍの波長の光）を透過させ、４８８ｎｍ及び６３３ｎｍの光を反射する。
次に、レーザービームは集束レンズ１２０に向けられ、集束レンズは、フローチャンバ１２５内の流体流の、試料の粒子が存在する部分にビームを集束させる。フローチャンバは、流体工学システムの一部であり、流れ内の粒子を調査のために通常は１つずつ集束レーザービームに向ける。フローチャンバは、卓上型サイトメータではフローセルを含み、又はｓｔｒｅａｍ−ｉｎ−ａｉｒ型サイトメータではノズルチップを含むことができる。
（単複の）レーザービームからの光は、サイズ、内部構造などの粒子の特徴と、粒子に付着した、或いは粒子上又は粒子内に自然に存在する１又は２以上の蛍光分子の存在とに依存して、様々な異なる波長の再放出による回折、屈折、反射、散乱及び吸収によって試料内の粒子と相互作用する。蛍光放射、並びに回折光、屈折光、反射光及び散乱光は、ビームスプリッタ１４５ａ〜ｇ、バンドパスフィルタ１５０ａ〜ｅ、ロングパスフィルタ１５５ａ〜ｂ及び蛍光収集レンズ１４０のうちの１つ又は２つ以上を通じて、前方散乱検出器１３０、側方散乱検出器１３５及び１又は２以上の蛍光放射検出器１６０ａ〜ｆのうちの１つ又は２つ以上に経路指定することができる。
蛍光収集レンズ１４０は、粒子とレーザービームとの相互作用によって放出される光を収集し、この光を１又は２以上のビームスプリッタ及びフィルタに向けて経路指定する。バンドパスフィルタ１５０ａ〜ｅなどのバンドパスフィルタは、狭い範囲の波長を通過させる。例えば、バンドパスフィルタ１５０ａは、５１０／２０フィルタである。最初の数字は、スペクトル帯の中心を表す。２番目の数字は、スペクトル帯の範囲を示す。従って、５１０／２０フィルタは、スペクトル帯の中心の両側１０ｎｍ、すなわち５００ｎｍ〜５２０ｎｍに及ぶ。ショートパスフィルタは、特定の波長以下の波長の光を透過させる。ロングパスフィルタ１５５ａ〜ｂなどのロングパスフィルタは、特定の波長以上の波長の光を透過させる。例えば、６７０ｎｍロングパスフィルタであるロングパスフィルタ１５５ａは、６７０ｎｍ以上の波長の光を透過させる。多くの場合、フィルタは、特定の蛍光色素の検出器の特異性を最適化するように選択される。フィルタは、検出器に伝播する光のスペクトル帯が蛍光色素の放出ピークに近くなるように構成することができる。
ビームスプリッタは、異なる波長の光を異なる方向に向ける。ビームスプリッタは、ショートパス及びロングパスなどのフィルタ特性を特徴とすることができる。例えば、ビームスプリッタ１４５ｇは６２０ＳＰビームスプリッタであり、すなわち６２０ｎｍ以下の波長の光を透過させ、６２０ｎｍよりも長い波長の光を異なる方向に反射する。１つの実施形態では、ビームスプリッタ１４５ａ〜ｇが、ダイクロイックミラーなどの光学ミラーを含むことができる。
前方散乱検出器１３０は、フローセルを通り抜ける直接ビームからわずかに軸外に位置し、粒子を通じて又は粒子の周囲をほぼ前方方向に伝わる励起光である回折光を検出するように構成される。前方散乱検出器によって検出される光の強度は、粒子の全体的なサイズに依存する。前方散乱検出器は、フォトダイオードを含むことができる。側方散乱検出器１３５は、粒子の表面及び内部構造からの、粒子構造の複雑性が増すとともに増加する傾向にある屈折光及び反射光を検出するように構成される。粒子に関連する蛍光分子からの蛍光放射は、１又は２以上の蛍光放射検出器１６０ａ〜ｆによって検出することができる。側方散乱検出器１３５及び蛍光放射検出器は、光電子増倍管を含むことができる。前方散乱検出器１３０、側方散乱検出器１３５及び蛍光放射検出器において検出された信号は、これらの検出器によって電子信号（電圧）に変換することができる。このデータは、試料に関する情報をもたらすことができる。
当業者であれば、本発明の実施形態によるフローサイトメータは、図１に示すフローサイトメータに限定されず、当業で周知のあらゆるフローサイトメータを含むことができると認識するであろう。例えば、フローサイトメータは、様々な波長及び様々な異なる構成のあらゆる数のレーザー、ビームスプリッタ、フィルタ及び検出器を有することができる。
動作時には、サイトメータの動作がコントローラ／プロセッサ１９０によって制御され、検出器からの測定データは、メモリ１９５に記憶してコントローラ／プロセッサ１９０が処理することができる。明示してはいないが、コントローラ／プロセッサ１９０は、検出器に結合されてその出力信号を受け取り、フローサイトメータ１００の電気コンポーネント及び電気機械コンポーネントに結合されてレーザー及び流量パラメータなどを制御することもできる。システムには、入力／出力（Ｉ／Ｏ）機能１９７を設けることもできる。メモリ１９５、コントローラ／プロセッサ１９０及びＩ／Ｏ１９７は、フローサイトメータ１１０の不可欠な部分として完全に設けることができる。このような実施形態では、サイトメータ１００のユーザに実験データを提示するために、ディスプレイがＩ／Ｏ機能１９７の一部を形成することもできる。或いは、メモリ１９５、コントローラ／プロセッサ１９０及びＩ／Ｏ機能の一部又は全部を、汎用コンピュータなどの１又は２以上の外部装置の一部とすることもできる。いくつかの実施形態では、メモリ１９５及びコントローラ／プロセッサ１９０の一部又は全部がサイトメータ１１０と無線又は有線通信することができる。コントローラ／プロセッサ１９０は、メモリ１９５及びＩ／Ｏ１９７と共に、フローサイトメータ実験の準備及び分析に関連する様々な機能を実行するように構成することができる。
図１のシステムは、フローセル１２５から各検出器へのビーム経路内のフィルタ及び／又はスプリッタの構成によって定められる（本明細書では、所与の検出器の「フィルタウィンドウ」又は「蛍光チャネル」と呼ぶこともできる）６つの異なる波長帯の蛍光を検出する６つの異なる検出器を含む。フローサイトメータ実験に使用される様々な蛍光分子は、独自の特徴的な波長帯の光を放出する。実験に使用する特定の蛍光標識、及びその関連する蛍光放射帯は、検出器のフィルタウィンドウと概ね一致するように選択することができる。しかしながら、多くの検出器を設けるにつれて多くの標識が利用されるようになり、フィルタウィンドウと蛍光放射スペクトルとの間の完全な対応は不可能である。１つの特定の検出器のフィルタウィンドウ内には特定の蛍光分子の発光スペクトルのピークが存在することができるが、その標識の発光スペクトルの一部が１又は２以上の他の検出器のフィルタウィンドウにも重なるということは概ね事実である。これをスピルオーバと呼ぶことができる。
Ｉ／Ｏ１９７は、蛍光標識のパネルを有するフローサイトメータ実験と、複数のマーカーを有してそれぞれが複数のマーカーのサブセットも有する複数の細胞集団とに関するデータを受け取るように構成することができる。Ｉ／Ｏ１９７は、１又は２以上の細胞集団に１又は２以上のマーカーを割り当てる生物学的データと、マーカー密度データと、発光スペクトルデータと、１又は２以上のマーカーに標識を割り当てるデータと、サイトメータ構成データとを受け取るように構成することもできる。メモリ１９５には、標識スペクトル特性及びフローサイトメータ構成データなどのフローサイトメータ実験データを記憶することもできる。コントローラ／プロセッサ１９０は、マーカーに対する１又は２以上の標識の割り当てを評価するように構成することができる。
図２に、発光スペクトルが異なる標識に対して重複することによって生じるスピルオーバの説明例を示す。図２には、約４７５ｎｍ〜６５０ｎｍの波長に及ぶ曲線で表される、ＦＩＴＣと表記するマーカーの発光スペクトルと、「ＦＩＴＣ検出器」のフィルタウィンドウとを示す。検出器の前には、検出器に到達し得る、フィルタウィンドウを構成する波長範囲を制限する、図１に示すバンドパスフィルタ１５０ｂなどの１又は２以上のフィルタを配置することができる。ＦＩＴＣ検出器のフィルタウィンドウは５３０／３０であり、すなわち５１５ｎｍ〜５４５ｎｍに及ぶ。このＦＩＴＣフィルタウィンドウを、５１５ｎｍ〜５４５ｎｍに及ぶ網掛けした矩形で表す。図２には、約５２５ｎｍ〜約７２５ｎｍに及ぶ曲線で表される、ＰＥと表記するマーカーの発光スペクトルも示す。検出器の前には、図１に示すバンドパスフィルタ１５０ｃなどの１又は２以上のフィルタを配置することができる。ＰＥ検出器のフィルタウィンドウは５８５／４２であり、すなわち５６４ｎｍ〜６０６ｎｍに及ぶ。このＰＥフィルタウィンドウを、５６４ｎｍ〜６０６ｎｍに及ぶ網掛けした矩形で表す。図２には、ＦＩＴＣの発光スペクトルの一部がＰＥ検出器のフィルタウィンドウに重なることを示しており、「ＰＥ内へのＦＩＴＣスピルオーバ」として表記する。従って、ＦＩＴＣ標識の蛍光放射の一部がＰＥ検出器において検出され、ＰＥ標識の蛍光放射と共に測定される。スピルオーバは、粒子上に存在する多数の標識に関する不正確な結果の導出を引き起こすことがある。この問題は、より多くの標識及び検出器を利用して蛍光ピークとフィルタウィンドウとの分離が弱くなる最近のフローサイトメータの使用では特に深刻なものになり得る。また、様々なピーク波長、発光強度及びエネルギー、並びにスペクトル幅特性を有するますます多くの蛍光標識が利用可能であること（一般に、実験者は何十もの選択肢を利用することができる）や、特徴付けられる細胞上の様々なマーカー密度、また場合によっては選択可能なフィルタウィンドウも考慮すると、フローサイトメータ実験に適した構成を設計することは非常に困難である。さらに複雑なのは、細胞又はその他の粒子の自家蛍光が特徴付けられる点である。この自家蛍光信号も、測定時に１又は２以上のフィルタウィンドウに重なってノイズを引き起こす。さらに、この自家蛍光ノイズ信号は、調査する粒子／細胞のタイプにも依存し得る。
蛍光放射検出器において取り込まれる信号は、１又は２以上の蛍光標識、システムバックグラウンド信号及び自家蛍光ノイズ信号からの寄与を含むことができる。しばしば「ベースライン」と呼ばれるシステムバックグラウンドは、ベースライン復元処理を通じて測定信号から除去することができ、この処理では、サイトメトリ実験内のイベントが発生しない時間間隔からベースライン信号を推定した後にこれを測定信号から減算することができる。従来の補償技術では、自家蛍光を補償するために、サイトメトリ実験において使用する蛍光色素毎に、「陰性」試料又は非染色試料と、単一色素で染色された細胞を含む「陽性」試料とを測定することができる。非染色試料からは、色素毎に単一の包括的陰性集団を定めることができる。単一の包括的陰性集団の中央蛍光強度（ＭＦＩ）を試料の自家蛍光ノイズ信号として処理し、陽性試料のデータから減算して自家蛍光スピルオーバ値を計算することができる。しかしながら、試料内の複数の細胞型上に関心マーカーが発現する場合、従来の方法は、各細胞型の自家蛍光ノイズ信号の強度が異なり得ることに起因して、自家蛍光ノイズ信号を正確に除去することができない。従って、たとえ所与の細胞型上にこのようなマーカーが存在していなくても、自家蛍光を１又は２以上のマーカーの蛍光放射として誤って特性評価してしまう可能性がある。この誤った特性評価は、特定のマーカーを発現していない集団と、同じマーカーを弱く発現している集団との区別を困難にする恐れがある。
本明細書で説明する実施形態によれば、自家蛍光ノイズ信号推定を細胞散乱特性に適合させることができる。同様のサイズ及び複雑性を有する細胞は、同様の自家蛍光を有する可能性が高い。粒子のサイズ及び複雑性は、前方散乱検出器によって測定された強度及び側方散乱検出器によって測定された強度とそれぞれ相関し得るので、前方散乱−側方散乱プロットの狭い領域について自家蛍光ノイズ信号を推定すれば、単一の中央蛍光強度に基づいて自家蛍光ノイズ信号を推定するよりも正確な値を得ることができる。前方散乱強度測定値及び側方散乱強度測定値を関連する蛍光強度値と共に使用して、それぞれが前方散乱−側方散乱プロットの１つの領域に関連する複数の推定自家蛍光ノイズ信号をもたらすことができる。その後、測定データが関心マーカー及び関心標識とより直接的に相関するように、推定自家蛍光ノイズ信号に関連する前方散乱−側方散乱プロットの領域に少なくとも部分的に基づいて、蛍光放射検出器によって取り込まれた対応する染色試料についての信号から推定自家蛍光ノイズ信号値を減算することができる。
図３に、２−Ｄ前方散乱−側方散乱ドットプロットの説明例を示す。前方散乱強度と側方散乱強度との相関測定は、非均質細胞集団内の細胞型の区別を可能にすることができる。フローサイトメトリ実験における各イベントは、前方散乱検出器及び側方散乱検出器によって測定された値に基づく前方散乱−側方散乱プロット内の位置を有する。従って、図３に示す各ドットは、１又は２以上のイベントの前方散乱測定値及び側方散乱測定値を表す。同じ型の細胞は、同様の前方散乱測定値及び側方散乱測定値を有する可能性が高く、すなわち２−Ｄ前方散乱−側方散乱プロット上のデータ点の集まりは、単一の細胞集団を表すことができる。図３には、フローサイトメータを用いて測定した複数の細胞集団であるリンパ球、単球及び顆粒球を含む非染色試料の前方散乱−側方散乱ドットプロットを示す。リンパ球測定を表すデータ点は赤色で示される。単球測定を表すデータ点は緑色で示される。顆粒球測定を表すデータ点は青色で示される。リンパ球測定を表すデータ点には「Ｌｙｍｐｈｓ（リンパ）」と表記する。単球測定を表すデータ点には「Ｍｏｎｏｓ（単）」と表記する。顆粒球測定を表すデータ点には「Ｇｒａｎｕｓ（顆粒）」と表記する。色及び各集団の周囲に示すゲートは例示目的にすぎない。
図４に、フローサイトメータを用いて４００〜８００ｎｍの非染色試料から測定されたリンパ球、単球、顆粒球の平均自家蛍光スペクトルを表示するヒストグラムの説明例を示す。図４に示すように、自家蛍光強度値は細胞集団毎に異なり、この差分は蛍光チャネルにわたって変動する。上述したように、図３に示すリンパ球、単球、顆粒球の測定値などの、複数の細胞型を含む非染色試料の前方散乱強度測定値及び側方散乱強度測定値を、図４に示すような関連する蛍光強度値と共に使用して、それぞれが前方散乱−側方散乱プロットの１つの領域に関連する複数の推定自家蛍光ノイズ信号をもたらすことができる。
前方散乱−側方散乱プロット領域は、非染色試料のイベントの測定に少なくとも部分的に基づく１又は２以上の自家蛍光強度値と相関することができる。１つの実施形態では、前方散乱−側方散乱プロット領域が、一連の重複しない前方散乱強度値及び側方散乱強度値の範囲を含むことができる。プロット領域に関連する自家蛍光強度値は、プロット領域内に位置する非染色試料のイベントに関連する測定強度の中央値又は平均値を含むことができる。図５に、領域５１０、領域５２０及び領域５３０という複数のプロット領域の説明例を示す。各プロット領域は、各蛍光チャネルの自家蛍光強度値に関連することができる。例えば、図１に示すフローサイトメータに非染色試料を通すと、６つの蛍光放射検出器のそれぞれについて１つの、各プロット領域に関連する６つの自家蛍光強度値を得ることができる。蛍光チャネルＦＬ１に対応する図１の蛍光放射検出器１６０ａでは、プロット領域５１０に関連する自家蛍光強度値δ1と、プロット領域５２０に関連する自家蛍光強度値α1と、プロット領域５３０に関連する自家蛍光強度値β1とが存在する。蛍光チャネルＦＬ２に対応する図１の蛍光放射検出器１６０ｂでは、プロット領域５１０に関連する自家蛍光強度値δ2と、プロット領域５２０に関連する自家蛍光強度値α2と、プロット領域５３０に関連する自家蛍光強度値β2とが存在する。同様に、蛍光放射検出器１６０ｃ〜ｆの各々も、各プロット領域に関連する自家蛍光強度値を有することができる。いくつかの実施形態では、プロット領域の形状を正方形とすることができる。プロット領域の寸法は、イベントの前方散乱−側方散乱プロット内の異なる位置におけるイベントの密度に少なくとも部分的に基づいて選択することができる。従って、単一の非染色試料のプロット領域は、複数の異なるサイズを有することができる。例えば、高密度のイベントを含む位置のプロット領域は、相対的に低密度のイベントを含む位置のプロット領域よりも小さくなり得る。
１つの実施形態では、測定された非染色試料の蛍光強度値を、自家蛍光強度マップを通じて前方散乱強度測定値及び側方散乱強度測定値に関連付ける。図６Ｂに、イベント密度マップの説明例を示す。図６Ａには、図６Ｂのイベントから導出された自家蛍光強度マップを示す。自家蛍光強度マップは、所与の前方散乱強度及び側方散乱強度の蛍光チャネルにおける測定蛍光強度を示す。このマップは、各前方散乱−側方散乱位置がプロット領域に関連するように構成することができる。各プロット領域は、その領域内のイベントからの中央又は平均自家蛍光強度と相関することができる。
ＦＳＣ−ＳＳＣプロットの選択領域における染色試料の蛍光強度測定値から、ＦＳＣ−ＳＳＣプロットの同じ選択領域内で測定された非染色試料の中央又は平均自家蛍光強度値を減算して、測定データ上の自家蛍光ノイズ信号を補償することができる。測定された染色試料の全てのイベントについて、イベントの前方散乱−側方散乱位置を非染色試料の前方散乱−側方散乱領域と相関させた後に、例えば図６Ａに示すマップなどの、ルックアップテーブル又はその他のデータフォーマットとして記憶できる自家蛍光強度マップを用いてその領域の自家蛍光強度値を見つけることができる。その後、関連するプロット位置における測定された染色試料の強度から対応する前方散乱−側方散乱領域の自家蛍光強度値を減算することができる。例えば、図５を参照すると、ある染色試料からイベントが測定され、イベントの前方散乱−側方散乱位置がプロット領域５１０と相関する場合には、各検出器において測定された染色試料の測定強度値からその領域に関連する各検出器の自家蛍光強度値をそれぞれ減算することによって、測定データに対する自家蛍光ノイズ信号の影響を補償することができる。蛍光放射検出器１６０ａにおいて測定されたイベントの強度値から自家蛍光強度値δ1を減算し、蛍光放射検出器１６０ｂにおいて測定されたイベントの強度値から自家蛍光強度値δ2を減算することができる。領域５１０に関連する蛍光放射検出器１６０ｃ〜ｆの自家蛍光強度値から、これらの検出器において測定されたイベントの強度値を減算することもできる。
図７Ａ〜図７Ｃに、上記の原理に従って処理した一連のドットプロットの説明例を示す。図７Ａには、ＣＤ４マーカーのための標識として使用できる蛍光色素であるＢＶ５１０で染色した試料の前方散乱−側方散乱プロットを示す。この試料のデータ点は、説明目的でゲート及び色を付けて示しており、リンパ球を赤色で示し、単球を緑色で示し、顆粒球を青色で示す。図７Ａでは、リンパ球、単球及び顆粒球をそれぞれ「Ｌｙｍｐｈｓ（リンパ）」、「Ｍｏｎｏｓ（単）」及び「Ｇｒａｎｕｓ（顆粒）」と表記する。図７Ｂには、従来のデータ分析を用いた図７Ａの試料のＢＶ５１０の側方散乱強度及び測定蛍光強度を表すドットプロットを示す。図７Ｂに示すように、リンパ球集団、単球集団及び顆粒球集団の測定強度値が存在し、これらの各集団上でＣＤ４が発現していることが示唆される。図７Ｃには、本発明による、自家蛍光ノイズ信号を除去した後の図７Ｂのデータを表すドットプロットを示す。除去後には、非発現細胞が、ゼロに近い中央蛍光強度値を有するはずである。図７Ｃには、ゼロに近い測定強度値を有する第１のグループと、１０4〜１０5の測定強度値を有する第２のリンパ球のグループという２つのリンパ球グループが示されている。顆粒球の大部分も、ゼロに近い測定強度値を有する。従って、第１のグループのリンパ球及び顆粒球の大部分はＣＤ４を発現していないと結論づけることができる。
非染色ＦＳＣ−ＳＳＣ領域の自家蛍光強度を構築する際には、染色試料の測定値と非染色試料の測定値との間の散乱利得の差分によって、染色実験と非染色実験との間で同じ細胞型のＦＳＣ−ＳＳＣイベント位置が異なる場合がある。これにより、染色試料の１又は２以上のイベントの前方散乱−側方散乱位置と、非染色試料の前方散乱−側方散乱領域との間に誤った相関が生じることがある。いくつかの実施形態では、非染色試料について測定されたイベントと染色試料について測定されたイベントとの比較に少なくとも部分的に基づいて、非染色試料において測定されたイベントの前方散乱−側方散乱プロット位置を調整することができる。非染色試料の前方散乱−側方散乱測定値のスケールを、散乱密度パターンが染色試料の前方散乱−側方散乱測定値のスケールと良好に一致するように調整することができる。図８に、このような調整の説明例を示す。図８には、黒色で示す染色試料の前方散乱−側方散乱プロットに赤色の一致する非染色試料の前方散乱−側方散乱プロットを重ねたものを示す。このような調整は、例えば非染色試料データにスケール因子を適用することによって行うことができる。
１つの実施形態では、スケール因子の決定が、非染色試料と染色試料の両方の前方散乱−側方散乱プロットを密度に基づいてグレースケール画像に変換することを含む。次に、形態学的画像オープン処理（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｍａｇｅ ｏｐｅｎｉｎｇ）を行って小さなオブジェクト、すなわち散乱するドットを除去することができる。次に、結果として得られた画像を閾値化して二値画像を生成することができる。次に、各画像の最も大きな接続領域のうちの１つ又は２つ以上を特定し、これらの１又は２以上の領域の重心を計算することができる。次に、非染色画像の各次元における重心位置と染色画像の重心位置との比率を用いてスケール因子を計算することができる。その後、特定されたスケール因子を用いて前方散乱−側方散乱データを調整することができる。
図９に、本発明の実施形態によるフローサイトメータの動作処理９００の実施形態のフローチャートを示す。処理９００は、ステップ９１０から開始し、図１に示すフローサイトメータ１１０などのフローサイトメータを用いて、非染色試料の１又は２以上のイベントの、１又は２以上の前方散乱値、１又は２以上の側方散乱値及び１又は２以上の蛍光強度値を測定する。１又は２以上の前方散乱値、１又は２以上の側方散乱値及び１又は２以上の蛍光強度値は、前方散乱検出器１３０、側方散乱検出器１３５及び蛍光放射検出器１６０ａ〜ｆなどの１又は２以上の検出器によって測定することができる。
処理９００は、非染色試料のイベントの前方散乱値、側方散乱値及び蛍光強度値を測定した後にステップ９２０に進み、非染色試料について行った測定に少なくとも部分的に基づいて、１又は２以上の蛍光強度値を１又は２以上の前方散乱−側方散乱プロット領域に関連付ける。蛍光強度値は、図１に示すコントローラ／プロセッサ１９０などの処理回路によって前方散乱−側方散乱プロット領域に関連付けることができる。図３に、本発明の実施形態による前方散乱−側方散乱プロットの例を示している。蛍光強度値は、図６Ａに示す自家蛍光強度マップなどの自家蛍光強度マップ内の１又は２以上の前方散乱−側方散乱プロット領域に関連付けることができる。或いは、自家蛍光強度マップを生成せずに関連データを記憶することもできる。
処理９００は、蛍光強度値を前方散乱−側方散乱プロット領域に関連付けた後にステップ９３０に進み、フローサイトメータを用いて、染色試料の１又は２以上のイベントの、１又は２以上の前方散乱値、１又は２以上の側方散乱値及び１又は２以上の蛍光強度値を測定する。染色試料は、単一の蛍光色素で染色することができ、非染色試料と同じドナーから取得することができる。
処理９００は、染色試料のイベントの前方散乱値、側方散乱値及び蛍光強度値を測定した後にステップ９４０に進み、プロセッサが染色試料の１又は２以上のイベントについて前方散乱−側方散乱プロット位置を特定する。
処理９００は、前方散乱−側方散乱プロット位置を特定した後にステップ９５０に進み、染色試料の各イベントについて、染色試料のイベントの前方散乱−側方散乱プロット位置に関連する測定された染色試料の蛍光強度値から、この前方散乱−側方散乱プロット位置を含む前方散乱−側方散乱プロット領域に関連する非染色試料の蛍光強度値を減算する。
本明細書において使用する「決定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ、又はｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）」という用語は、様々な動作を含む。例えば、「ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ」は、計算、算出、処理、導出、調査、検索（例えば、テーブル、データベース、又は別のデータ構造における検索）、確認などを行うことを含むことができる。また、「ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ」は、受け取り（例えば、情報の受け取り）、アクセス（例えば、メモリ内のデータへのアクセス）などを行うことを含むこともできる。また、「ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ」は、解決、選択、選出、確立などを行うことを含むこともできる。
本明細書で使用する「提供する（ｐｒｏｖｉｄｅ、又はｐｒｏｖｉｄｉｎｇ）」という用語は、様々な動作を含む。例えば、「ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ」は、後で検索できるようにある位置に値を記憶すること、受信先に値を直接送信すること、或いは値への参照を送信又は記憶すること、などを含むことができる。「ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ」は、符号化、復号、暗号化、暗号解読、確認、検証などを行うことを含むこともできる。
本明細書で使用する項目リスト「のうちの少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ ｏｆ）」という表現は、単一の要素を含むこれらの項目のあらゆる組み合わせを意味する。一例として、「ａ、ｂ又はｃのうちの少なくとも１つ」は、ａ、ｂ、ｃ、ａとｂ、ａとｃ、ｂとｃ、及びａとｂとｃをカバーするように意図される。
当業者であれば、情報及び信号は、様々な異なる技術及び技法のうちのいずれかを用いて表すことができると理解するであろう。例えば、上記の説明全体を通じて参照できるデータ、命令、コマンド、情報、信号、ビット、記号及びチップは、電圧、電流、電磁波、磁場又は磁性粒子、光場又は光粒子、或いはこれらのあらゆる組み合わせによって表すことができる。
さらに、当業者であれば、本明細書で開示する実施形態に関連して説明した様々な例示的な論理ブロック、モジュール、回路及びアルゴリズムステップは、電子ハードウェア、コンピュータソフトウェア、又はこれらの組み合わせとして実装することができると理解するであろう。上記では、このハードウェアとソフトウェアの互換性を明確に示すために、様々な例示的なコンポーネント、ブロック、モジュール、回路及びステップを、一般にこれらの機能面から説明した。このような機能がハードウェアとして実装されるか、それともソフトウェアとして実装されるかは、システム全体に課される特定の用途及び設計制約に依存する。当業者であれば、説明した機能を各特定の用途に見合った様々な方法で実装することができるが、このような実装の決定を、本開示の範囲からの逸脱を引き起こすものとして解釈すべきではない。
本明細書で説明した技術は、ハードウェア、ソフトウェア、ファームウェア、又はこれらのあらゆる組み合わせで実装することができる。このような技術は、汎用コンピュータ、無線通信装置、又は無線通信装置ハンドセット及びその他の装置での用途を含む複数の用途を有する集積回路装置などの、様々な装置のいずれかに実装することができる。モジュール又はコンポーネントとして説明したあらゆる機能は、集積論理装置において共に実装することも、或いは異なるものではあるが相互運用可能な論理装置として単独で実装することもできる。これらの技術は、ソフトウェアで実装された場合、実行時に上述した方法の１つ又は２つ以上を実行する命令を含むプログラムコードを有するコンピュータ可読データ記憶媒体によって少なくとも部分的に実現することができる。コンピュータ可読データ記憶媒体は、パッケージング材料を含むことができるコンピュータプログラム製品の一部を成すことができる。コンピュータ可読媒体は、同期型ダイナミックランダムアクセスメモリ（ＳＤＲＡＭ）などのランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリメモリ（ＲＯＭ）、不揮発性ランダムアクセスメモリ（ＮＶＲＡＭ）、電気的消去可能プログラム可能リードオンリメモリ（ＥＥＰＲＯＭ）、フラッシュメモリ、及び磁気又は光学データ記憶媒体などのメモリ又はデータ記憶媒体を含むことができる。コンピュータ可読媒体は、非一時的記憶媒体とすることができる。これに加えて、又はこれとは別に、これらの技術は、プログラムコードを命令又はデータ構造の形で搬送又は通信し、コンピュータによってアクセス、読み取り及び／又は実行することができる、伝搬信号又は伝搬波などのコンピュータ可読通信媒体によって少なくとも部分的に実現することもできる。
プログラムコードは、１又は２以上のデジタルシグナルプロセッサ（ＤＳＰ）、汎用マイクロプロセッサ、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブル論理アレー（ＦＰＧＡ）、又はその他の同等の集積回路又は個別論理回路などの１又は２以上のプロセッサを含むことができるプロセッサによって実行することができる。このようなプロセッサは、本開示において説明した技術のいずれかを実行するように構成することができる。汎用プロセッサは、マイクロプロセッサとすることもできるが、代替例では、いずれかの従来のプロセッサ、コントローラ、マイクロプロセッサ又は状態機械とすることもできる。プロセッサは、例えばＤＳＰとマイクロプロセッサとの組み合わせなどのコンピュータ装置の組み合わせ、複数のマイクロプロセッサ、ＤＳＰコアと連動する１又は２以上のマイクロプロセッサ、又は他のいずれかのこのような構成として実装することもできる。従って、本明細書で使用する「プロセッサ」という用語は、上述した構造、上述した構造のあらゆる組み合わせ、或いは本明細書で説明した技術の実装に適した他のいずれかの構造又は装置、のうちのいずれかを意味することができる。また、いくつかの態様では、本明細書で説明した機能を、符号化及び復号のために構成された、又は一体型ビデオエンコーダデコーダ（ＣＯＤＥＣ）に組み込まれた専用ソフトウェアモジュール又はハードウェアモジュール内に提供することもできる。
本明細書で開示した方法は、説明した方法を実現するための１又は２以上のステップ又は動作を含む。方法のステップ及び／又は動作は、特許請求の範囲の範囲から逸脱することなく互いに入れ換えることもできる。換言すれば、ステップ又は動作の具体的な順序を特定していない限り、特許請求の範囲の範囲から逸脱することなく、特定のステップ及び／又は動作の順序及び／又は使用を修正することもできる。
本発明の様々な実施形態について説明した。これらの及びその他の実施形態は、以下の特許請求の範囲に含まれる。
９００ フローサイトメータの動作処理
９１０ 非染色試料の１又は２以上の散乱値及び蛍光強度値を測定
９２０ １又は２以上の蛍光強度値を１又は２以上のＦＳＣ−ＳＳＣプロット領域に関連付け
９３０ 染色試料の１又は２以上の散乱値及び蛍光強度値を測定
９４０ 染色試料の１又は２以上のイベントのＦＳＣ−ＳＳＣプロット位置を特定
９５０ 蛍光強度値を減算

Claims (17)

  1. 前方散乱検出器と、側方散乱検出器と、各々が蛍光チャネルに対応する複数の蛍光放射検出器とを有するフローサイトメータの動作方法であって、
    前記フローサイトメータを用いて、非染色試料の１又は２以上のイベントの、前記前方散乱検出器における１又は２以上の前方散乱値と、前記側方散乱検出器における１又は２以上の側方散乱値と、前記複数の蛍光放射検出器のうちの１又は２以上の蛍光放射検出器における１又は２以上の蛍光強度値とを測定するステップと、
    前記非染色試料の前記１又は２以上のイベントを測定する前記ステップに少なくとも部分的に基づいて、前記複数の蛍光放射検出器のうちの１又は２以上の蛍光放射検出器の前記１又は２以上の蛍光強度値を１又は２以上の前方散乱−側方散乱プロット領域に関連付けるステップと、
    前記フローサイトメータを用いて、染色試料の１又は２以上のイベントの、１又は２以上の前方散乱値と、１又は２以上の側方散乱値と、前記複数の蛍光放射検出器のうちの１又は２以上の蛍光放射検出器における１又は２以上の蛍光強度値とを測定するステップと、
    前記染色試料の前記１又は２以上のイベントの前方散乱−側方散乱プロット位置を特定するステップと、
    前記染色試料の前記１又は２以上のイベントの各々について、前記複数の蛍光放射検出器のうちの少なくとも１つの蛍光放射検出器において測定された、前記前方散乱−側方散乱プロット位置における前記染色試料のイベントの測定蛍光強度値から、前記複数の蛍光放射検出器のうちの前記少なくとも１つの蛍光放射検出器の、前記染色試料のイベントの前記前方散乱−側方散乱プロット位置を含む前記前方散乱−側方散乱プロット領域に関連する蛍光強度値を減算するステップと、
    を含むことを特徴とする方法。
  2. 前記非染色試料について測定された前記イベントと、前記染色試料について測定された前記イベントとの比較に少なくとも部分的に基づいて、前記非染色試料について測定された前記イベントの前記前方散乱−側方散乱プロット位置を調整するステップをさらに含む、
    請求項１に記載の方法。
  3. 前記調整するステップは、前記非染色試料のイベント位置を前記染色試料のイベント位置にさらに厳密に一致させるように前記非染色試料の前記イベントの前方散乱−側方散乱プロットのスケールを調整するステップを含む、
    請求項２に記載の方法。
  4. 前記複数の蛍光放射検出器のうちの１つの蛍光放射検出器の各前方散乱−側方散乱プロット領域に関連する前記蛍光強度値は、前記複数の蛍光放射検出器のうちの前記１つの蛍光放射検出器の、各それぞれの領域内に位置する前記非染色試料のイベントに関連する前記測定蛍光強度値の中央値又は平均値である、
    請求項１に記載の方法。
  5. 前方散乱−側方散乱プロット領域は、一連の重複しない前方散乱強度値及び側方散乱強度値の範囲として定められる、
    請求項４に記載の方法。
  6. 前記領域は正方形である、
    請求項５に記載の方法。
  7. 前記領域の寸法は、イベントの前記前方散乱−側方散乱プロット内の異なる位置におけるイベントの密度に少なくとも部分的に基づいて選択される、
    請求項５に記載の方法。
  8. 非染色試料の１又は２以上のイベントの１又は２以上の蛍光強度値を測定するステップは、前記複数の蛍光放射検出器において実行され、染色試料の１又は２以上のイベントの１又は２以上の蛍光強度値を測定するステップは、前記非染色試料の前記１又は２以上の蛍光強度値を測定するために使用される同じ複数の蛍光放射検出器において実行される、
    請求項１に記載の方法。
  9. 前記染色試料の前記１又は２以上のイベントの各々について、前記複数の蛍光放射検出器において測定された、前記前方散乱−側方散乱プロット位置における前記染色試料のイベントの複数の測定蛍光強度値から、前記複数の蛍光放射検出器の、前記染色試料のイベントの前記前方散乱−側方散乱プロット位置を含む前記前方散乱−側方散乱プロット領域に関連する複数の蛍光強度値を減算するステップを含み、前記染色試料の測定蛍光強度値から減算される、前記染色試料のイベントの前記前方散乱−側方散乱プロット位置を含む前記前方散乱−側方散乱プロット領域に関連する各蛍光強度値は、前記染色試料の前記測定蛍光強度値と同じ蛍光放射検出器に関連する、
    請求項８に記載の方法。
  10. 前記非染色試料及び前記染色試料は、複数の細胞型を含む、
    請求項１に記載の方法。
  11. フローサイトメータであって、
    励起レーザーと、
    １又は２以上の試料からの粒子を前記励起レーザーのビーム経路内に移送するように構成された流体工学システムと、
    １又は２以上の検出器と、
    処理回路と、
    を備え、前記１又は２以上の検出器は、
    非染色試料の１又は２以上のイベントの１又は２以上の前方散乱値と、１又は２以上の側方散乱値と、１又は２以上の蛍光強度値とを測定し、
    染色試料の１又は２以上のイベントの１又は２以上の前方散乱値と、１又は２以上の側方散乱値と、１又は２以上の蛍光強度値とを測定する、
    ように構成され、前記処理回路は、
    前記非染色試料の１又は２以上のイベントの前記１又は２以上の前方散乱値、１又は２以上の側方散乱値及び１又は２以上の蛍光強度値の測定に少なくとも部分的に基づいて、１又は２以上の蛍光強度値を１又は２以上の前方散乱−側方散乱プロット領域に関連付け、
    前記染色試料の前方散乱−側方散乱プロット位置を特定し、
    前記染色試料の前記１又は２以上のイベントの各々について、前記前方散乱−側方散乱プロット位置における前記染色試料のイベントの測定蛍光強度値から、前記染色試料のイベントの前記前方散乱−側方散乱プロット位置を含む前記前方散乱−側方散乱プロット領域に関連する蛍光強度値を減算する、
    ように構成される、
    ことを特徴とするフローサイトメータ。
  12. 前記処理回路は、前記非染色試料について測定された前記イベントと、前記染色試料について測定された前記イベントとの比較に少なくとも部分的に基づいて、前記非染色試料について測定された前記イベントの前記前方散乱−側方散乱プロット位置を調整するようにさらに構成される、
    請求項１１に記載のフローサイトメータ。
  13. 前記プロセッサは、前記非染色試料のイベント位置を前記染色試料のイベント位置にさらに厳密に一致させるように前記非染色試料の前記イベントの前方散乱−側方散乱プロットのスケールを調整するように構成される、
    請求項１２に記載のフローサイトメータ。
  14. 前記１又は２以上の検出器は、１又は２以上の蛍光チャネルにおいて測定を行うように構成される、
    請求項１１に記載のフローサイトメータ。
  15. 前記非染色試料及び前記染色試料は、複数の細胞型を含む、
    請求項１２に記載のフローサイトメータ。
  16. 前記１又は２以上の検出器は、複数の蛍光放射検出器を含み、各検出器は、非染色試料の１又は２以上のイベントの蛍光強度値を測定するように構成され、各蛍光放射検出器は、染色試料の１又は２以上のイベントの蛍光強度値を測定するようにさらに構成される、
    請求項１１に記載のフローサイトメータ。
  17. 前記処理回路は、前記染色試料の前記１又は２以上のイベントの各々について、前記複数の蛍光放射検出器の各々の、前記前方散乱−側方散乱プロット位置における前記染色試料のイベントの複数の測定蛍光強度値から、前記複数の蛍光放射検出器の各々の、前記染色試料のイベントの前記前方散乱−側方散乱プロット位置を含む前記前方散乱−側方散乱プロット領域に関連する複数の蛍光強度値を減算するように構成され、前記染色試料の測定蛍光強度値から減算される、前記染色試料のイベントの前記前方散乱−側方散乱プロット位置を含む前記前方散乱−側方散乱プロット領域に関連する各蛍光強度値は、前記染色試料の前記測定蛍光強度値と同じ蛍光放射検出器に関連する、
    請求項１６に記載のフローサイトメータ。
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