CN102435313B - 荧光强度补偿方法及荧光强度计算装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了荧光强度补偿方法及荧光强度计算装置，该荧光强度补偿方法包括，向用荧光波段彼此重叠的多种荧光染料多重标记的微粒照射光以激发荧光染料，并使用具有不同接收波段的光检测器接收由激发的荧光染料产生的荧光；以及通过在对算得的荧光强度赋予预定限制条件下补偿所述光检测器的检测值来计算所述荧光染料的荧光强度。

Description

荧光强度补偿方法及荧光强度计算装置

技术领域

本发明涉及一种荧光强度补偿方法及荧光强度计算装置，更具体地，涉及一种用于精确地计算从微粒上多重标记的多种荧光染料的每一种发出的荧光的强度的荧光强度控制方法。

背景技术

为了测量诸如细胞的微粒的特性，现有装置(如流式细胞仪)使用荧光染料标记微粒、向荧光染料照射激光束以激发荧光染料以及测量由激发的荧光染料发出的荧光的强度或图谱(pattern)。近年来，为了更精确地分析例如细胞的特性，使用其中用多种荧光染料标记微粒并使用具有不同接收光波段的多个光检测器(如PD(光电二极管)或PMT(光电倍增管)测量从荧光染料发出的激光束的多色法测量。在多色法测量中，为了检测荧光，根据所使用的荧光染料的荧光波长为光检测器选取一个滤光片。

然而，当前使用的荧光染料(如FITC(异硫氰酸荧光素))或PE(藻红蛋白)在荧光光谱中具有重叠的频段。因此，在使用这些荧光染料的组合进行多色法测量的情况下，即使使用滤光片将从各荧光染料发出的荧光分离为不同的频段，光检测器仍可检测到从不想要的荧光染料中漏入(spillover)的荧光。如果发生荧光漏入，则光检测器检测到的荧光强度偏离从期望的荧光染料发出的荧光的真实强度。因此，产生测量误差。

为了补偿测量误差，通过从由光检测器测出的荧光强度减去漏入的荧光的强度来执行荧光补偿。通过以电的方式或数学的方式补偿脉冲来执行荧光补偿，使得由光检测器测出的荧光强度变为期望荧光的真实荧光强度。

一种以数学方式补偿荧光强度的方法，是通过将由光检测器测出的荧光强度(检测值)定义为向量并将预定的漏入矩阵的逆矩阵作用于该向量来执行。以此方式，可算出从期望的荧光染料发出的荧光的真实强度(参照图3和图4，及日本未审查专利申请公开第2003-83894号)。通过分析被单标记的各微粒的荧光波长分布来生成漏入矩阵。在漏入矩阵中，各荧光染料的荧光波长分布被表示为列向量，并对这些列向量进行排列。漏入矩阵的逆矩阵也被称作“补偿矩阵”。在图3和图4中，示出了使用五种荧光染料(FITC、PE、ECD、PC5和PC7)和五个光检测器进行五色法测量的示例。

发明内容

在使用补偿矩阵对荧光强度进行补偿的方法中，允许负值用作矩阵的元素。因此，补偿的荧光强度可以为负。这是因为包含在各光检测器的检测值中的噪声会影响矩阵元素的值。然而，实际上，从各荧光染料发出的荧光的强度不为负。此外，如果从一种荧光染料发出的荧光的强度被计算为负值，则从其它荧光染料发出的荧光的强度的计算值在正方向上出现误差。

如果在要分析的微粒群中存在一种荧光染料的荧光强度为负的子群，则在二维相关图(细胞直方图)中不绘出该子群，其中在二维相关图中荧光染料的荧光强度标绘在对数轴上(具有对数尺度)。因此，用户可能误解二维相关图上标绘的群少于实际的群。

此外，在现有的荧光强度补偿方法中，在将从微粒发出的自身荧光的强度的检测值当作背景值并从各光检测器的检测值中减去自身荧光的强度时，将整个群的自身荧光强度的平均值用于计算。然而，子群与子群间的自身荧光的强度和图谱是不同的。因此，从所有群的每一个中减去相同平均值的计算引起荧光强度的计算值误差。具体地，如果要分析的子群间的自身荧光差异显著，则误差增加。

因此，本发明提供了一种在使用多个光检测器对用多种荧光染料多重标记的微粒进行多色法测量时，精确地计算从各荧光染料发出的荧光的强度并向用户呈现算得的强度的技术。

根据本发明的实施方式，一种荧光强度补偿方法包括：向用荧光波段彼此重叠的多种荧光染料多重标记的微粒照射光、激发荧光染料并使用具有不同接收波段的光检测器接收由激发的荧光染料产生的荧光；以及通过在对算得的荧光强度赋予预定限制条件下补偿所述光检测器的检测值来计算所述荧光染料的荧光强度。

在计算荧光强度过程中，可通过使用从标记有一种荧光染料的微粒获得的单染色光谱和从未标记任何一种荧光染料的微粒获得的自身荧光光谱的线性和对测量光谱进行近似来计算各荧光染料的荧光强度和自身荧光强度，该测量光谱是通过收集各光检测器的检测值所获得的。通过在考虑微粒自身荧光成分时执行计算，可精确地计算子群间相互不同的自身荧光成分，因此，可避免由子群之间的自身荧光强度不同引起的测量误差。

限制条件可以为算得的各荧光染料的各荧光强度和自身荧光强度大于或等于预定最小值(例如，零)。通过在这样的限制条件下执行计算，能够避免由荧光染料的荧光强度的算得的负值引起的测量误差的发生和二维相关图(细胞直方图)中群的减少。该限制条件可以还包括算得的各荧光染料的各荧光强度和自身荧光强度小于或等于预定最大值的条件。

用单染色光谱和自身荧光光谱的线性和进行的近似可使用最小二乘方法来执行。更具体地，通过求得使以下的评价函数为最小值的参数a_k(k＝1～M)来计算各荧光染料的各荧光强度和自身荧光强度：

${\mathrm{\χ}}^2\≡\underset{i=1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}{\left[\frac{y_i-\underset{k=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}{a}_k{X}_k\left(x_i\right)}{{\mathrm{\σ}}_i}\right]}^2$

其中，X_k(x_i)表示第k个荧光染料的单染色光谱或自身荧光光谱中第i个光检测器的检测值，y_i表示测量光谱中第i个光检测器的检测值，及σ_i表示第i个光检测器的检测值的加权倒数。

此外，本发明提供了一种荧光强度计算装置。该荧光强度计算装置包括测量单元，被配置为向用荧光波段彼此重叠的多种荧光染料多重标记的微粒照射光、激发荧光染料以及使用具有不同接收波段的光检测器接收由激发的荧光染料产生的荧光；以及计算单元，被配置为通过在对算得的荧光强度赋予预定限制条件下补偿所述光检测器的检测值来计算所述荧光染料的荧光强度。

根据本发明，“微粒”的示例包括与生物有关的微粒，如细胞、微生物和脂质体，以及合成颗粒，如胶乳颗粒、凝胶颗粒和工业颗粒。与生物有关的微粒的示例还包括染色体、脂质体、线粒体和细胞器(细胞器官)。细胞的示例包括动物细胞(如血细胞)和植物细胞。微生物的示例包括诸如大肠菌的细菌、诸如烟草花叶病毒的病毒、和诸如酵母的真菌。此外，与生物有关的微粒的示例包括核酸、蛋白质及其与生物有关的高分子合成物。此外，工业颗粒的示例包括有机或无机高分子材料和金属。有机高分子材料的示例包括聚苯乙烯、苯乙烯-二乙烯基苯和聚甲基丙烯酸甲酯。无机高分子材料的示例包括玻璃、二氧化硅和磁性材料。金属的示例包括金胶体和铝。通常，微粒为球形。然而，微粒也可为非球形。此外，微粒的尺寸和质量可不受限定。

根据本发明，当使用多个光检测器对用多种荧光染料标记的微粒进行多色法测量时，提供了一种精确地计算各荧光染料的荧光强度并向用户呈现算得的强度的技术。

附图说明

图1是示出了通过用单染色光谱的线性和来近似测量光谱所获得的近似曲线的曲线图；

图2示出了N×M矩阵A的元素；

图3示出了使用现有补偿矩阵的荧光补偿方法；以及

图4示出了现有补偿矩阵的元素。

具体实施方式

以下将参照附图描述本发明的示例性实施方式。注意，以下的实施方式仅为了示意性目的，而并不是用于限制所附权利要求书的范围。将以以下顺序进行描述：

1.荧光强度的补偿方法

(1)测量步骤

(2)计算步骤

(2-1)拟合运算

(2-1-1)近似曲线

(2-1-2)自身荧光

(2-1-3)限制条件

(2-2)计算a_k的方法

(2-2-1)线性最小二乘法

(2-2-2)正规方程式

(2-2-3)奇异值分解

2.荧光强度计算装置

1.荧光强度的补偿方法

根据本发明，荧光强度的补偿方法涉及以下两个步骤：测量步骤和计算步骤。

在测量步骤中，向用荧光波段重叠的多个荧光染料多重标记的微粒照射光束，以及由具有不同接收波段的多个光检测器接收从激发的荧光染料发出的荧光；以及在计算步骤中，在对各光检测器的检测值进行补偿以计算从各荧光染料发出的荧光的强度时，对算出的荧光强度值设置预定的限制条件来进行补偿。

(1)测量步骤

用多种荧光染料对要测量的微粒进行多重标记。可使用现有广泛使用的方法来执行微粒的荧光染料标记。例如，当测量细胞时，用于细胞表面分子的荧光标记抗体与细胞混合。因此，抗体与细胞表面分子结合。通过将荧光染料直接结合到抗体或使用抗生物素蛋白/生物素反应将与抗生物素蛋白结合的荧光染料结合到生物素标记的抗体，可生成荧光染料标记的抗体。此外，抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。

对于荧光染料，可以从例如以下广泛使用的材料中选取至少两种材料：藻红蛋白(PE)、FITC、PE-Cy5、PE-Cy7、PE-德克萨斯红、别藻蓝蛋白(APC)、APC-Cy7、溴化乙锭、碘化丙锭、赫斯特33258/33342、DAPI、吖啶橙、色霉素、光神霉素、橄榄霉素、派若宁y、噻唑橙、若丹明101、异硫氰酸盐、BCECF、BCECF-AM、C.SNARF-1、C.SNARF-1-AMA、水母发光蛋白、Indo-1、Indo-1-am、Fluo-3、Fluo-3-AM、Fura-2、Fura-2-AM、含氧杂菁、德克萨斯红、若丹明123、10-N-壬基-吖啶橙、荧光素、二乙酸萤光素、羧基荧光素、羧基荧光素二乙酸酯、羧基二氯荧光素及羧基二氯荧光素二乙酸酯。

之后，向用多种荧光染料多重标记的微粒照射光束，并通过具有不同接收波段的多个光检测器接收从激发的荧光染料发出的荧光。在使用广泛使用的多色法测量流式细胞分析仪的方法中同样可以执行该测量步骤。

(2)计算步骤

在计算步骤中，可通过对测量步骤中获取的各光检测器的检测值进行补偿来计算从各荧光染料发出的荧光的强度。此时，在根据本实施方式的荧光强度补偿方法中，在算出的荧光强度为预定最小值以上的限制条件下，进行荧光强度的补偿。

可使用采用补偿矩阵的现有方法来执行补偿计算。可选地，可使用拟合运算来执行补偿计算，在该拟合运算中，使用从由一种荧光染料标记的各微粒获得的单染色光谱的线性和来近似测量光谱，其中该测量光谱是通过收集光检测器的检测值来获得的。以下详细说明拟合运算的示例。

(2-1)拟合运算

(2-1-1)近似曲线

在拟合运算中，通过用单染色光谱的线性和近似测量光谱来计算从各荧光染料发出的真实荧光强度。此时，可通过用单染色光谱和自身荧光光谱的线性和近似测量光谱来计算真实荧光强度。如本文中所使用的，术语“测量光谱”指的是用以接收向使用荧光波段彼此重叠的荧光染料多重标记的微粒照射光时从激发的荧光染料发出的荧光并且具有不同接收波段的光检测器的检测值的集合。此外，术语“单染色光谱”指的是各荧光染料的荧光波长分布。可通过收集标记有荧光染料的微粒照射光时从激发的荧光染料发出的荧光的光检测器的检测值来获得单染色光谱。此外，术语“自身荧光光谱”指的是从微粒本身发出的荧光的波长分布。通过向未标记荧光染料的微粒照射光，由光检测器接收从微粒发出的荧光。因此，收集检测值以获得自身荧光光谱。上述测量的光谱的光谱成分包括自身荧光光谱。

接下来将参照图1描述通过使用单染色光谱的线性和近似测量光谱所获得的近似曲线。

在图1中，X轴表示观察点，Y轴表示检测值。y₁表示由光检测器x₁接收的荧光的检测值。y₂表示由光检测器x₂接收的荧光的检测值。y_n表示由光检测器x_n接收的荧光的检测值。将y₁至y_n连接的曲线表示测量的光谱。

此外，在图1中，表示第一种荧光染料(荧光染料1)的单染色光谱的曲线(基函数)指示为X₁(x)。表示第二种荧光染料(荧光染料2)的单染色光谱的曲线指示为X₂(x)。表示第M种荧光染料(荧光染料M)的单染色光谱的曲线指示为X_M(x)。单染色光谱可通过每次进行测量时制备标记有一种荧光染料的样本来获得。可选地，可使用预先存储的标准光谱。

各光检测器以预定的漏入比率接收从所有荧光染料(荧光染料1～M)发出的荧光。因此，可通过如下式对通过将荧光染料1～M的各基函数乘以相应的预定比率所获得的值求和来近似各光检测器的检测值：

$y\left(x\right)=\underset{k=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}{a}_k\·X_k\left(x\right)...\left(1\right)$

注意，从各荧光染料进入一个光检测器的荧光漏入比率a_k是通过荧光染料的发光强度(真实荧光强度)来确定的。

更具体地，例如，光检测器x₁的检测值y₁可近似为通过将荧光染料1的荧光强度X₁(x₁)乘以比率a₁获得的值至将荧光染料M的荧光强度X_M(x₁)乘以比率a_M获得的值求和所获得的总和y(x₁)。注意，从荧光染料1到M进入光检测器x₁的荧光漏入比率a_k(k＝1～M)对应于荧光染料1～M的发光强度。

(2-1-2)自身荧光

测量光谱的光谱成分包括自身荧光光谱。因此，可使用单染色光谱和自身荧光光谱的线性和来近似测量光谱。通过每次进行测量时制备未标记的样本来获得自身荧光光谱。可选地，可使用预先存储的标准光谱。当通过附加地使用由微粒的自身荧光引起的检测值来执行计算时，在式(1)中，通过在表示荧光染料的单染色光谱的曲线上加入表示自身荧光光谱的曲线来定义荧光染料M的基函数X_M(x₁)。微粒的子群间的自身荧光光谱可能彼此不同。因此，如果样本中包括多个子群，则使用多个基函数X_M(x)，其中为每个子群设定基函数。

各光检测器接收从荧光染料发出的荧光和预定比例的自身荧光成分。因此，可使用荧光染料的基函数乘以预定的比率加上自身荧光的基函数乘以预定的比率来近似各光检测器的检测值。此时，各光检测器的荧光漏入比率a_k由荧光染料的发光强度(真实荧光强度)来确定。

更具体地，例如，可通过总和y(x₁)来近似光检测器x₁的检测值y₁，该总和为将荧光染料1的荧光强度X₁(x₁)乘以比率a₁获得的值至荧光染料L的荧光强度X_L(x₁)乘以比率a_L获得的值求和加上将自身荧光(L+1)的荧光强度X_L+1(x₁)乘以比率a_L+1获得的值至自身荧光M的荧光强度X_M(x₁)乘以比率a_M获得的值求和。光检测器x₁的荧光漏入比率a_k(k＝(L+1)到M)与自身荧光的发光强度对应。注意，L为1到M的整数，并根据使用中的荧光染料数量和样本中微粒的子群数量来设定。

在现有荧光强度补偿方法中，把群全体的自身荧光强度的平均值作为背景值，并从各光检测器的检测值中减去平均值。因此，执行计算时，未考虑子群之间自身荧光强度和图谱的差异。这是引起荧光强度计算值误差的主要原因。在根据本发明的荧光强度补偿方法中，考虑微粒的自身荧光成分的同时执行计算。从而，可精确计算子群之间彼此不同的自身荧光成分，因此，可消除子群之间自身荧光强度差异所引起的测量误差。

与从荧光染料发出的荧光的强度一样，与各子群的算得的自身荧光强度相关的信息可显示在二维相关图(细胞直方图)中，并可呈现给用户。因此，用户可根据自身荧光强度水平选取期望的子群(执行选通(grating))或确定微粒的类型和微粒的状态。以此方式，提供了一种新型的分析方法。

(2-1-3)限制条件

可通过使用以下说明的线性最小二乘法计算a_k来获得式(1)所表示的近似曲线。a_k相当于各荧光染料的真实荧光强度或微粒的自身荧光强度。从而，物理上，a_k不是负值。因此，在根据本发明的荧光强度补偿方法中，在a_k大于或等于预定最小值的预定条件(下限条件)下对a_k执行补偿计算。例如，用于限制条件的最小值可以为零，这是因为各荧光染料的荧光强度或微粒的自身荧光强度不为负。可选地，大于零的值可用作最小值。而且，可在a_k小于预定最大值的附加第二限制条件(上限条件)下执行补偿计算。

通过在下限条件下执行补偿计算，可解决荧光染料的荧光强度算得为负值时所引起的测量误差的问题和二维相关图(细胞直方图)中群减少的问题。

此外，自身荧光的强度小于荧光染料的荧光强度。因此，自身荧光的信号质量较差。从而，各光检测器的检测值中所包含的噪声对算得的自身荧光强度值会有显著的影响，因此产生误差。通过在下限条件和/或上限条件下执行计算，可解决由噪声引起的测量误差的问题。

具体地，当要测量的微粒的自身荧光的强度较高且荧光染料的荧光强度较低时，难以确定微粒的荧光为负还是为正。通过对检测出的自身荧光值设置零下限条件，对于负数据的检测值总是为零。因此，即使当荧光染料的荧光强度相对较低时，仍可容易地进行正性数据的确定。

(2-2)计算a_k的方法

(2-2-1)线性最小二乘方法

下面将详细描述获得a_k的过程。将参照仅使用单染色光谱的线性和近似测量光谱的情形进行说明。然而，该过程可适用于使用单染色光谱和自身荧光光谱的线性和近似测量光谱的情形。首先，定义由下式(2)表示的评价函数(卡方)。

${\mathrm{\χ}}^2\≡\underset{i=1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}{\left[\frac{y_i-\underset{k=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}{a}_k{X}_k\left(x_i\right)}{{\mathrm{\σ}}_i}\right]}^2...\left(2\right)$

其中，σ_i表示第i个光检测器的测量值的加权倒数(例如，第i个光检测器的测量误差方差。如果该加权倒数不存在，则对于所有的光检测器均可使用“1”)。之后，计算使式(2)为最小值的参数a_k(k＝1～M)。

(2-2-2)正规方程式

之后，定义含有式(3)所表示的元素的N×M矩阵A(参照图2)和长度为N的向量b(参照下式(4))。然后，通过排列经过拟合获得的M个参数a₁～a_M来定义向量a。

$A_{\mathrm{ij}}=\frac{X_j\left(x_i\right)}{{\mathrm{\σ}}_i}...\left(3\right)$

$b_i=\frac{y_i}{{\mathrm{\σ}}_i}...\left(4\right)$

当通过关于M个参数a_k微分χ²获得的所有值均为零时，上述式(2)达到最小值。

$0=\underset{i=1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}\frac{1}{{{\mathrm{\σ}}_i}^2}[y_i-\underset{j=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}{a}_j{X}_j\left(x_i\right)]\·X_k\left(x_i\right)k=1,...,M...\left(5\right)$

通过改变求和顺序，式(5)可改写为以下形式的矩阵方程式(正规方程式)：

$\underset{j=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}{a}_{\mathrm{kj}}{a}_j={\mathrm{\β}}_k...\left(6\right)$

其中，[a_kj]为M×M矩阵，[β_k]为长度为M的向量。

$a_{\mathrm{kj}}=\underset{i=1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}\frac{X_j\left(x_i\right)\·X_k\left(x_i\right)}{{{\mathrm{\σ}}_i}^2}$ 即，[α]＝A^T·A…(7)

${\mathrm{\β}}_k=\underset{i=1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}\frac{y_j\·X_k\left(x_i\right)}{{{\mathrm{\σ}}_i}^2}$ 即，[β]＝A^T·b…(8)

因此，式(5)可改写成以下矩阵形式：

[α]·a＝[β]或(A^T·A)·a＝A^T·b…(9)

式(9)表示M联立线性方程。通过求解式(9)，可获得a_j。

(2-2-3)奇异值分解

代替采用使用上述正规方程式的方法，可使用奇异值分解来计算排列有M个参数a₁～a_M的向量a。

奇异值分解(SVD)基于规定任一N×M矩阵A可改写成三个矩阵U、W和V^T的乘积的线性代数定理(参照下式(10))。矩阵U为N×M列正交矩阵，矩阵W为M×M对角矩阵(对角元素w_i为非负，且称作“奇异值”)，及矩阵V^T为M×M正交矩阵V的逆矩阵。此外，矩阵U和V是所有列为正规正交的正规正交矩阵(参照下式(11))。

$\left(U^T\right)\·\left(U\right)=\left(V^T\right)\·\left(V\right)=\left(1\right)...\left(11\right)$

上述式2可改写为如下：

χ²＝|A·a-b|²  …(12)

当对矩阵A进行奇异值分解且获得如上式(10)的矩阵U、W和V时，使式(12)为最小值的向量a可计算为如下：

a＝V·[diag(1/w_j)]·(U^T·b)…(13)

这种运算称作“回代法”。如果找到足够小的值w_i，则将1/w_i替换为0，处理继续进行。

2.荧光强度计算装置

根据本发明的实施方式，与现有流式细胞分析仪一样，荧光强度计算装置包括流体结构系统、光学系统、分选系统和数据处理系统。

流体结构系统使含有要测量的微粒的样本液流向鞘液的层流的中心，使得微粒在流动室中排列成一行。代替流动室，微粒在形成于微芯片上的流路内排列成一行。

光学系统用作向标记有荧光染料的微粒照射光、激发荧光染料并接收由激发的荧光染料产生的荧光的测量单元。光学系统还检测前方散射光、侧方散射光及诸如瑞利散射和米氏散射的散射光。更具体地，光学系统包括光照射子系统，其具有用于向微粒照射激光束并收集来自微粒的激光束的激光光源、聚光透镜、分色镜和带通滤波器；以及检测子系统，用于检测由激光束的照射引起的从微粒发出的荧光及散射光。例如，检测子系统包括诸如光电倍增管(PMT)、CCD或CMOS元件的区域图像拾取元件。在检测子系统中，配置有具有不同接收波段的多个光检测器。

在进行微粒的分选时，样本液以含有微粒的液滴形式排出到流动室外的空间，并控制液滴移动的方向。因此，分选出具有期望特性的微粒。分选系统包括振动元件(如压电元件)，其将样本液改变为液滴并使液滴排出；充电单元，使排出的液滴带电；以及一对电极，关于在它们之间移动的液滴彼此面对。

数据处理系统以电信号的形式接收光检测器的检测值，并基于电信号分析微粒的光学特性。数据处理系统使用上述技术用单染色光谱与自身荧光光谱的线性和近似测量光谱，并计算各荧光染料的真实荧光强度和微粒的自身荧光强度。为了执行计算，数据处理系统包括记录介质(如硬盘)，用于存储执行上述荧光强度计算方法的步骤的程序；以及用于执行程序的中央处理器(CPU)和内存。

为了提高从各光检测器输出的信号质量，期望的是，数据处理系统包括使光检测器之间交换的数据平滑的噪声滤波器。在考虑例如光检测器数量、接收波段、使用的荧光染料、自身荧光波长及各装置的噪声频率成分的同时执行求平均运算。通过使数据平滑，可降低噪声的负面影响，从而可提高计算的精度。因此，能够更精确地计算荧光强度。

本发明包含于2010年9月3日向日本专利局提交的日本优先权专利申请JP 2010-197495所公开的相关主题，其全部内容通过引证结合于此。

本领域的技术人员应当理解，根据设计要求和其它因素，可以进行各种修改、组合、子组合以及替换，只要它们在所附权利要求书或其等同物的范围内。

Claims (6)

1.一种荧光强度补偿方法，包括：

向用荧光波段彼此重叠的多种荧光染料多重标记的微粒照射光以激发所述荧光染料，并使用具有不同接收波段的光检测器接收由激发的荧光染料产生的荧光；以及

通过在对算得的荧光强度赋予预定限制条件下补偿所述光检测器的检测值来计算所述荧光染料的荧光强度，

其中，在计算荧光强度的过程中，通过使用从标记有一种所述荧光染料的微粒获得的单染色光谱和从未标记任何一种所述荧光染料的微粒获得的自身荧光光谱的线性和对测量光谱进行近似来计算各个所述荧光染料的荧光强度和自身荧光强度，所述测量光谱是通过收集所述光检测器的检测值来获得的。

2.根据权利要求1所述的荧光强度补偿方法，其中，所述限制条件为算得的各个所述荧光染料的各个荧光强度和自身荧光强度大于或等于预定最小值。

3.根据权利要求2所述的荧光强度补偿方法，其中，所述限制条件还包括算得的各个所述荧光染料的各个荧光强度和自身荧光强度小于或等于预定最大值的条件。

4.根据权利要求3所述的荧光强度补偿方法，其中，在计算荧光强度的过程中，使用单染色光谱和自身荧光光谱的线性和对所述测量光谱的近似采用最小二乘方法来执行。

5.根据权利要求4所述的荧光强度补偿方法，其中，在计算荧光强度的过程中，通过求得使下式的评价函数为最小值的参数a_k来计算各个所述荧光染料的各个荧光强度和自身荧光强度：

${\mathrm{\χ}}^2\≡\underset{i=1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}{\left[\frac{y_i-\underset{k=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}{a}_k{X}_k\left(x_i\right)}{{\mathrm{\σ}}_i}\right]}^2$

其中，k＝1～M，X_k(x_i)表示第k种荧光染料的单染色光谱或自身荧光光谱中第i个光检测器的检测值，y_i表示测量光谱中第i个光检测器的检测值，及σ_i表示第i个光检测器的检测值的加权倒数。

6.一种荧光强度计算装置，包括：

测量单元，被配置为向用荧光波段彼此重叠的多种荧光染料多重标记的微粒照射光以激发所述荧光染料，并使用具有不同接收波段的光检测器接收由激发的荧光染料产生的荧光；以及

计算单元，被配置为通过在对算得的荧光强度赋予预定限制条件下补偿所述光检测器的检测值来计算所述荧光染料的荧光强度，

其中，所述计算单元通过使用从标记有一种所述荧光染料的微粒获得的单染色光谱和从未标记任何一种所述荧光染料的微粒获得的自身荧光光谱的线性和对测量光谱进行近似来计算各个所述荧光染料的荧光强度和自身荧光强度，所述测量光谱是通过收集所述光检测器的检测值来获得的。