CN102313724B - 荧光强度校正方法和荧光强度计算装置 - Google Patents

荧光强度校正方法和荧光强度计算装置 Download PDF

Info

Publication number
CN102313724B
CN102313724B CN201110185326.2A CN201110185326A CN102313724B CN 102313724 B CN102313724 B CN 102313724B CN 201110185326 A CN201110185326 A CN 201110185326A CN 102313724 B CN102313724 B CN 102313724B
Authority
CN
China
Prior art keywords
photodetector
fluorescent dye
dye
expression formula
spectrum
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201110185326.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102313724A (zh
Inventor
加藤泰信
酒井启嗣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sony Corp
Original Assignee
Sony Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sony Corp filed Critical Sony Corp
Publication of CN102313724A publication Critical patent/CN102313724A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102313724B publication Critical patent/CN102313724B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N15/1429—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers using an analyser being characterised by its signal processing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
    • G01N21/49—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid
    • G01N21/53—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid within a flowing fluid, e.g. smoke
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N15/1456—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
    • G01N15/1459—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
    • G01N2021/4704—Angular selective
    • G01N2021/4707—Forward scatter; Low angle scatter
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
    • G01N2021/4704—Angular selective
    • G01N2021/4726—Detecting scatter at 90°
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6421—Measuring at two or more wavelengths
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/12—Circuits of general importance; Signal processing
    • G01N2201/129—Using chemometrical methods
    • G01N2201/1293—Using chemometrical methods resolving multicomponent spectra

Abstract

本发明提供了荧光强度校正方法和荧光强度计算装置，该荧光强度校正方法包括：利用具有不同输入波段的光检测器，接收通过对微粒照射光而被激发的荧光染料所发出的荧光，这些微粒被具有重叠荧光波长的多个荧光染料多重标记；收集光检测器的检测值，得到测定光谱；并且通过从各荧光染料单独标记的微粒得到的单染色光谱的线性和对测定光谱进行近似；其中，使用受限最小二乘法进行利用单染色光谱的线性和的测定光谱的近似。

Description

荧光强度校正方法和荧光强度计算装置
技术领域
本发明涉及荧光强度校正方法和荧光强度计算装置。更具体地说，本发明涉及用于精确计算从对微粒进行多重标记的多个荧光染料中的每一种发出的荧光的强度的荧光强度校正方法等。
背景技术
已存在根据测定微粒特性的现有技术的装置(例如，流式细胞仪)，该装置通过使用荧光染料标记微粒(例如细胞等)、通过激光束照射激发这些荧光染料、并且测定从这些荧光染料发出的荧光强度和图案，来测定微粒的特性。近年来，已经开始进行多色测定以更加细致地分析细胞等的特性，在该多色测定中，使用多个荧光染料标记微粒，并且使用具有不同的输入波段的多种光检测器(PD、PMT等)测定从各荧光染料发出的光。利用多色测定，通过根据使用的荧光染料的荧光波长选择在光检测器侧的滤光器进行荧光的检测。
另一方面，目前使用的荧光染料(例如FITC、PE(藻红蛋白)、APC(别藻蓝蛋白)等)在荧光光谱内具有相互重叠的波段。因此，如果将这些荧光染料组合进行多色测定，那么即使通过滤光器将从荧光染料发出的荧光分成各波段，从非目标荧光染料发出的荧光也可能泄漏进光检测器。如果发生荧光的泄漏，在检测器处测定的荧光强度和来自目标荧光染料的真实荧光强度之间将存在差异，导致测定误差。
进行荧光校正，其中，从在光检测器处测定的荧光强度减去与泄漏相等的荧光强度，以校正测定误差。荧光校正涉及对脉冲施加电或数学校正，以使得在光检测器处测定的荧光强度是来自目标荧光染料的真实荧光强度。
正使用这样的技术作为数学地执行荧光校正的方法，其中，通过将在光检测器处测定的荧光强度(检测值)表示为矢量、并且将预设的泄漏矩阵的逆矩阵应用至这些矢量，计算来自目标荧光染料的真实荧光强度(参见图12和图13，以及日本未审专利申请公开第2003-83894号)。通过分析利用荧光染料单独标记的微粒的荧光波长分布建立该泄漏矩阵，其中，荧光染料的荧光波长排列成列向量。泄漏矩阵的逆矩阵也被称为“校正矩阵”。图12和图13示出了使用五个荧光染料(FITC、PE、ECD、PC5、PC7)和五个光检测器进行五色测定的实例。
发明内容
对于利用校正矩阵的荧光校正方法，存在校正后的荧光强度是负值的情况。这是由于包括在各个光检测器的检测值中的噪声影响矩阵计算导致的。然而，在实际中，荧光染料产生的荧光强度是负值是不可能的。此外，同时，被计算成负值的来自特定荧光染料的荧光强度意味着在其他的荧光染料的荧光强度的计算值中在正方向上存在误差。
如果在要分析的微粒群内存在子群(关于该子群，特定的荧光染料的荧光强度表现为负值)，该子群没有被绘制在二维相关图(细胞直方图，cytogram)上，其中该荧光染料的荧光强度被沿着对数轴绘制(对数标度)。因此，用户可能收到在二维相关图上绘制的群的数目小于实际的错觉。
已经发现，在使用多个光检测器对通过多个荧光染料标记的微粒进行的多色测定的情况下，期望提供一种准确计算荧光染料产生的荧光强度并且将这些呈现给用户的技术。
根据本发明的实施方式，一种荧光强度校正方法包括：利用具有不同输入波段的光检测器，接收通过对微粒照射光而被激发的荧光染料所发出的荧光，这些微粒被具有重叠荧光波长的多个荧光染料多重标记；收集光检测器的检测值，得到测定光谱；并且通过从各荧光染料单独标记的微粒得到的单染色光谱的线性和对测定光谱进行近似；其中，使用受限最小二乘法进行利用单染色光谱的线性和的测定光谱的近似。
可通过求出使下面的表达式(1)中所示的评价函数满足下面的表达式(2)并且为最小值的参数xj(j＝1至M)来计算各荧光染料发出的荧光强度。通过进行提供有表达式(2)的约束条件的校正计算，可以解决由于荧光染料产生的荧光强度被计算为负值导致的测定误差，以及在二维相关图(细胞直方图)上的群减少的问题。
χ 2 = Σ i = 1 N ( p i - Σ j = 1 M s ij · x j σ i ) 2 · · · ( 1 )
xj≥Uj  …(2)
其中，Sij表示第j个荧光染料的单染色光谱中的第i个光检测器的检测值，pi表示在测定光谱中第i个光检测器的检测值，σi表示关于第i个光检测器的检测值的权数的倒数，并且Uj表示将要计算的各荧光染料的荧光强度的下限值。
可通过解下面的表达式(3)到(5)的二次规划问题来求出参数xj(j＝1至M)。
最小化‖Sx-p‖2  …(3)
其中满足(subject to)Ax≤b …(4)
x≥0  …(5)
b = - U 1 - U 2 . . . - U M · · · ( 7 )
其中，S表示以sij作为元素的N×M阶矩阵，x表示以xj作为元素的M阶矩阵，p表示以pi作为元素的N阶矢量，A被设置为M×M阶矩阵，b被设置为M×1阶矩阵，并且U1到UM表示下限值。
在上面的表达式(2)中，从通过对未使用第j个荧光染料标记的微粒进行光照射得到的各个光检测器的检测值的平均值求出的第j个荧光染料的无染色平均值Vj，或者根据从检测值的概率密度函数得到的第j个荧光染料的无染色概率密度函数Fj(Uj)所产生的随机数，可被用作下限值Uj，或者，可以从通过对未使用第j个荧光染料标记的微粒进行光照射得到的各个光电检测器的检测值的平均值和离散度求出第j个荧光染料的无染色平均值Vj和无染色标准差ρj，并且根据表达式(9)的无染色概率密度函数Fj(Uj)产生的随机数用作下限值Uj。
F j ( U j ) = 1 2 π ρ j e - ( U j - V j ) 2 2 ρ j 2 · · · ( 9 )
此外，通过在没有上面的表达式(4)的线性约束条件的情况下解下面表达式(10)和(11)的二次规划问题可求出参数xj(j＝1至M)。
最小化‖Sx-p‖2  …(10)
其中满足x≥0  ··(11)
其中，S表示以sij作为元素的N×M阶矩阵，x表示以xj作为元素的M阶矩阵，并且p表示以pi作为元素的N阶矢量。
此外，在没有上面的表达式(4)的线性约束条件的情况下解二次规划问题的情况下，可通过解下面表达式(12)和(13)的二次规划问题，并且执行下面的表达式(14)求出参数xj(j＝1至M)。
最小化‖Sx′-(p-u)‖2  …(12)
其中满足x′≥0  …(13)
x＝x′+U  …(14)
其中，S表示以sij作为元素的N×M阶矩阵，x表示以xj作为元素的M阶矩阵，p表示以pi为元素的N阶矢量，u表示将通过对未使用第j个荧光染料标记的微粒进行光照射得到的第i个光检测器的检测值的平均值vi作为元素的N阶矢量，并且U表示将从平均值vi得到的第j个荧光染料的无染色平均值Vj作为元素的M阶矢量。
可选地，可通过解下面表达式(15)和(16)的二次规划问题，并且执行下面的表达式(17)求出参数xj(j＝1至M)。
最小化‖Sx′-(p-u)‖2  …(15)
其中满足x′≥0  …(16)
x＝x′+U  …(17)
其中，S表示以sij作为元素的N×M阶矩阵，x表示以xj作为元素的M阶矩阵，p表示以pi作为元素的N阶矢量，u表示将根据通过对未使用第j个荧光染料标记的微粒进行光照射得到的第i个光检测器的检测值的概率密度函数fi(ui)而产生的随机数ui作为元素的N阶矢量，并且U表示将根据从概率密度函数fi(ui)得到的第j个荧光染料的无染色概率密度函数Fi(Ui)产生的随机数Uj作为元素的M阶矢量。
此外，可通过解下面表达式(20)和(21)的二次规划问题，并且执行下面的表达式(22)求出参数xj(j＝1至M)。
f i ( u i ) = 1 2 π σ i e - ( u i - v i ) 2 2 σ i 2 · · · ( 18 )
F j ( U j ) = 1 2 π ρ j e - ( U j - V j ) 2 2 ρ j 2 · · · ( 19 )
最小化‖Sx′-(p-u)‖2  …(20)
其中满足x′≥0  …(21)
x＝x′+U  …(22)
其中，S表示以sij作为元素的N×M阶矩阵，x表示以xj作为元素的M阶矩阵，p表示以pi作为元素的N阶矢量，u表示将随机数uj作为元素的N阶矢量，其中通过求出对未使用第j个荧光染料标记的微粒进行光照射所获得的第i个光检测器的检测值的平均值Vj和离散度σi并且根据表达式(18)的概率密度函数fj(uj)来产生uj，并且U表示将随机数Uj作为元素的M阶矢量，其中通过从平均值vi和离散度σi求出第j个荧光染料的无染色平均值Vj和无染色标准差ρj并且根据表达式(19)的概率密度函数Fj(Uj)产生随机数Uj。
根据本发明的另一实施方式，一种荧光强度计算装置包括：测定单元，被配置为利用具有不同输入波段的光检测器，接收通过对微粒照射光而被激发的荧光染料所发出的荧光(其中这些微粒被具有重叠荧光波长的多个荧光染料多重标记的)，收集光检测器的检测值，并且得到测定光谱；以及计算单元，被配置为通过从各荧光染料单独标记的微粒得到的单染色光谱的线性和对测定光谱进行近似；其中，计算单元使用受限最小二乘法进行利用单染色光谱的线性和的测定光谱的近似。
在本说明书中，术语“微粒”广泛地包括诸如细胞、微生物、脂质体等的生物体相关微粒，以及诸如乳胶颗粒、凝胶体颗粒、工业颗粒等的合成颗粒。
生物体相关微粒包括组成各种细胞的染色体、脂质体、线粒体、细胞器(细胞器官)等。细胞包括动物细胞(血球型细胞)和植物细胞。微生物包括诸如大肠杆菌的细菌、诸如烟草花叶病毒的病毒、诸如酵母菌的真菌等。此外，我们说生物体相关微粒包括生物体相关高分子，例如，核苷酸、蛋白质及它们的化合物。此外，工业颗粒例如可以是有机或无机高分子材料、或金属等。有机高分子材料包括聚苯乙烯、苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸甲酯等。无机高分子材料包括玻璃、硅石、磁性材料等。金属包括金胶体、铝等。一般地，这些微粒的形状是普通的球形，但这些也可以是非球形的，并且它们的尺寸和重量也没有具体的限制。
附图说明
图1是用于描述通过单染色光谱的线性和、由测定光谱的近似得到的近似曲线的曲线图；
图2是示出了在实施方式中使用的荧光染料的单染色光谱的示图；
图3是在没有进行荧光校正的条件下由虚拟输出数据所产生的二维相关图；
图4是通过利用校正矩阵而进行了荧光校正的虚拟输出数据所产生的二维相关图(比较例)；
图5是通过利用根据第一实施方式的方法而进行了荧光校正的虚拟输出数据所产生的二维相关图，其中将平均值作为下限；
图6是通过利用根据第一实施方式的修改例的方法而进行了荧光校正的虚拟输出数据所产生的二维相关图，其中将平均值作为下限，没有线性约束条件；
图7是通过利用根据第二实施方式的方法而进行了荧光校正的虚拟输出数据所产生的二维相关图，其中下限是根据概率密度函数的随机数；
图8是通过利用根据第二实施方式的修改例的方法而进行了荧光校正的虚拟输出数据所产生的二维相关图，其中下限是根据概率密度函数的随机数，没有线性约束条件；
图9是通过利用根据第三实施方式的方法而进行了荧光校正的虚拟输出数据所产生的二维相关图，其中下限是正态随机数；
图10是通过利用根据第三实施方式的修改例的方法而进行了荧光校正的虚拟输出数据所产生的二维相关图，其中下限是正态随机数，没有线性约束条件；
图11是通过利用根据第四实施方式的方法而进行了荧光校正的虚拟输出数据所产生的二维相关图，其中下限是0；
图12是用于描述根据现有技术的利用校正矩阵的荧光校正方法的示图；以及
图13是用于描述根据现有技术的校正矩阵的矩阵元素的示图。
具体实施方式
将参照附图描述用于实现本发明的优选实施方式。注意下面所述的实施方式仅作为对本发明代表性实施方式的示例性说明，并且并不通过其来来限制性地说明本发明要求保护的范围。将按下面的顺序进行说明。
1.荧光强度校正方法
(1)测定步骤
(2)计算步骤
(2-1)近似曲线
(2-2)受限最小二乘法
(2-3)约束条件(下限条件)
(2-3-1)平均值作为下限条件(第一实施方式及其修改例)
(2-3-2)根据概率密度函数的随机数作为下限条件(第二实施方式及其修改例)
(2-3-3)根据正态分布的随机数作为下限条件(第三实施方式及其修改例)
(2-3-4)0作为下限条件(第四实施方式)
2.荧光强度计算装置
1.荧光强度校正方法
根据本发明的实施方式的荧光强度校正方法包括下面的两个步骤：
测定步骤：利用具有不同输入波段的光检测器接收通过对微粒照射光而被激发的荧光染料所发出的荧光(其中这些微粒被具有重叠荧光波长的多个荧光染料多重标记)、收集光检测器的检测值、并且得到测定光谱的步骤。
计算步骤：使用受限最小二乘法，通过从使用荧光染料单独标记的微粒得到的单染色光谱的线性和，对测定光谱进行近似的步骤。
(1)测定步骤
首先，使用多个荧光染料多重标记要测定的微粒。可使用根据相关领域的现有技术进行微粒的荧光染料标记。例如，如果测定对象是细胞，将与细胞表面分子对应的荧光染料标记抗体与细胞混合，使得抗体与细胞表面分子结合。荧光染料标记抗体可以是直接结合有荧光染料的抗体，或者可以是生物素标记抗体和通过抗生物素蛋白-生物素反应结合的抗生物素蛋白结合荧光染料。此外，所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
可将根据现有技术的两种以上的物质组合用于荧光染料。实例包括藻红蛋白(PE)、FITC、PE-Cy5、PE-Cy7、PE-德克萨斯红、藻青蛋白(APC)、APC-Cy7、溴化乙锭、碘化丙啶(Propidium iodide)、赫斯特(Hoechst)33258/33342、DAPI、吖啶橙、色霉素、光神霉素(Mithramycin)、橄榄霉素、派洛宁Y、噻唑橙、若丹明101异硫氰酸酯(Rhodamine 101isothiocyanate)、BCECF、BCECF-AM、C.SNARF-1、C.SNARF-1-AMA、水母素、Indo-1、Indo-1-AM、Fluo-3、Fluo-3-AM、Fura-2、Fura-2-AM、羊杂菁(Oxonol)、德克萨斯红、若丹明123(Rhodamine 123)、10-N-壬基-吖啶橙(10-N-nony-Acridine orange)、荧光素、荧光素二乙酸酯(Fluorescein diacetate)、羟基荧光素(Carboxyfluorescein)、羟基荧光素二乙酸酯(Caboxyfluorescein diacetate)、羟基二氯荧光素(Carboxydichlorofluorescein)和羟基二氯荧光素二乙酸酯(Carboxydichlorofluorescein diacetate)。
接着，对由多个荧光染料多重标记的微粒照射光，并且使用具有不同输入波段的光检测器接收被激发的荧光染料发出的荧光。可通过与使用根据现有技术的多色测定流式细胞仪的方法相同的方式进行测定步骤。
(2)计算步骤
(2-1)近似曲线
通过计算步骤，对已经在测定步骤中得到的各个光检测器产生的检测值进行校正计算，并且计算各荧光染料产生的荧光强度。此时对于根据本发明的实施方式的荧光强度校正方法，使用受限最小二乘法，通过从荧光染料单独标记的微粒得到的单染色光谱的线性和，对测定光谱进行近似，从而计算各荧光染料产生的真实荧光强度。
现在，通过利用具有不同输入波段的光检测器，接收通过对微粒照射光而被激发的荧光染料所发出的荧光(其中这些微粒被具有重叠荧光波长的多个荧光染料多重标记)，并且收集光检测器的检测值得到“测定光谱”。此外，“单染色光谱”是各荧光染料的荧光波长分布，并且通过利用光检测器接收通过对由荧光染料单独标记的微粒照射光而被激发的荧光染料所发出的荧光，并收集光检测器的检测值而得到“单染色光谱”。
基于图1，将描述通过单染色光谱的线性和、对测定光谱进行近似得到的近似曲线。
在图中，X轴表示观察点，并且Y轴表示检测值。在图中，p1表示光检测器1处接收的荧光的检测值，p2表示光检测器2处接收的荧光的检测值，并且pn表示光检测器n处接收的荧光的检测值。连接测定值p1到pn的线是测定光谱。
此外，在图中，S1(i)表示代表第一荧光染料(荧光染料1)的单染色光谱的曲线(基础函数)，S2(i)表示代表第二荧光染料(荧光染料2)的单染色光谱的曲线，并且SM(i)表示代表第M荧光染料(荧光染料M)的单染色光谱的曲线。可通过每次进行测定时制备的由荧光染料单独标记的样本来得到单染色光谱，或者可以使用预先存储在装置中的参考光谱。
在光检测器处，以从荧光染料1到荧光染料M的所有荧光染料发出的荧光各自以预定的比率漏入的状态接收光。因此，可通过下面的表达式y(i)，将各光检测器处的检测值pi近似为将从荧光染料1到荧光染料M的各基础函数乘以预定比率得到的值的和。因此，由各荧光染料的发光强度(真实荧光强度)规定从各荧光染料到各个光检测器的荧光的泄漏比率xj。
p i ≈ y ( i ) = Σ j = 1 M S j ( i ) · x j
具体地说，例如，光检测器1的检测值p1被近似为从将荧光染料1的荧光强度S1(1)乘以比率x1到将荧光染料M的荧光强度SM(1)乘以比率xM的值的和y(1)。从荧光染料1至M到光检测器1的荧光的泄漏比率xj(j＝1至M)相应于荧光染料1至M的发光强度。
该表达式中所示的近似曲线可通过下面所述的受限最小二乘法得到xj而获得。该xj等于各荧光染料的真实荧光强度，并且是物理上不可能为负值的值。因此，使用根据本发明的实施方式的荧光强度校正方法，通过建立xj大于预定值的约束条件(下限条件)进行校正计算。通过设置下限条件来进行校正计算，可以解决由于荧光染料产生的荧光强度被计算为负值所导致的测定误差，以及在二维相关图(细胞直方图)上的群减少的问题。
(2-2)受限最小二乘法
下面是用于得到xj的步骤的描述。首先，定义下面的表达式(1)中所示的评价函数(χ二乘)。得到使该评价函数满足下面的表达式(2)并且为最小值的参数xj(j＝1至M)。
χ 2 = Σ i = 1 N ( p i - Σ j = 1 M s ij · x j σ i ) 2 · · · ( 1 )
其中，Sij表示第j个荧光染料的单染色光谱中的第i个光检测器的检测值Sj(i)，pi表示测定光谱中第i个光检测器的检测值，并且σi代表关于第i个光检测器的检测值的权数的倒数。
xj≥Uj    …(2)
其中Uj表示将要计算的各荧光染料的荧光强度的下限值。
上面的表达式(2)表示荧光强度xj大于预定值(Uj)的约束条件(下限条件)。
现在，如果我们设置以sij作为元素的N×M阶矩阵S，以xj作为元素的M阶矩阵x，和以pi作为元素的N阶矢量p，得到满足表达式(2)并且还给出表达式(1)中所示的评价函数的最小值的参数xj与解下面的问题是等同的。
最小化‖Sx-p‖2  …(3)
其中满足Ax≤b  …(4)
x≥0  …(5)
将M×M阶矩阵A和M×1阶矩阵b设置成将荧光强度x限制成大于预定值(U)的不等式，如下面的表达式(6)至(7)中所示。
b = - U 1 - U 2 . . . - U M · · · ( 7 )
对上面的表达式(3)进行平方和扩展产生了下面的表达式(23)。
(‖Sx-p‖2)2＝(Sx-p)T(Sx-p)
            ＝xTSTSx-xTSTp-pTSx+pTp
            ＝xT(STS)x-2pTSx+pTp    …(23)
可省略最后项pTp以最小化表达式(23)。因此，最小化表达式(23)等同于最小化下面的表达式(24)。
1 2 x T ( S T S ) x - p T Sx · · · ( 24 )
表达式(24)和上面的表达式(4)和(5)被称为二次规划问题。“二次规划问题”是这样的问题，其中以D作为n×n半正定对称矩阵，c作为n阶矢量，A作为m×n阶矩阵，并且b作为m阶矢量，求出使得以二次形式给出的目标函数“f(x)＝xTAx/2+cTx”为最小的满足线性约束条件“Ax≤b，x≥0”的n阶矢量的问题。下面的表达式(25)到(27)示出了二次规划问题。二次规划问题是一种特殊的非线性规划问题，其中通过有限次重复得到严格的最优解。
最小化 1 2 x T Dx + c T x · · · ( 25 )
其中满足Ax≤b  …(26)
x≥0  …(27)
上面的表达式(24)、(4)和(5)等同于在表达式(25)中替换如下面所示的D和c并且在表达式(26)中替换如表达式(6)和(7)中所示的A和b以解二次规划问题。
D＝STS  …(28)
c＝-(pTS)T＝-STp  …(29)
(2-3)约束条件(下限条件)
(2-3-1)平均值作为下限条件(第一实施方式及其修改例)
为了将下限值Uj(j＝1至M)用作解下面的表达式(3)到(5)中的二次规划问题的约束条件，假设已经测定了没有被荧光染料标记的无染色微粒，将合适的值设置为第j个荧光染料的最小检测值。具体地说，对于下限值Uj，可使用通过对未使用第j个荧光染料标记的微粒进行光照射得到的各个光检测器的检测值的平均值而求出的第j个荧光染料的无染色平均值Vj。对于无染色平均值Vj，例如，使用第j个荧光染料的单染色光谱表现出最大检测值的光检测器的检测值的平均值。可选地，表现出最大检测值的光检测器的平均值和在该光检测器之前和之后的光检测器(第(j-1)和第(j+1)个光检测器)的检测平均值可进一步进行平均以用作无染色平均值Vj等。
最小化‖Sx-p‖2  …(3)
其中满足Ax≤b  …(4)
x≥0  …(5)
b = - U 1 - U 2 . . . - U M · · · ( 7 )
作为修改例，可应用不具有上面的表达式(4)的线性约束条件的二次规划方法。在这种情况下，可通过解下面的表达式(12)和(13)的二次规划问题，并且执行下面的表达式(14)求出前述的参数xj(j＝1至M)。
最小化‖Sx′-(p-u)‖2  …(12)
其中满足x′≥0  …(13)
x＝x′+U  …(14)
其中，S表示以sij作为元素的N×M阶矩阵，x表示以xj作为元素的M阶矩阵，p表示以pi作为元素的N阶矢量，u表示将通过对未使用第j个荧光染料标记的微粒进行光照射得到的第i个光检测器的检测值的平均值vi作为元素的N阶矢量，并且U表示将从平均值vi得到的第j个荧光染料的无染色平均值Vj作为元素的M阶矢量。对于所述无染色平均值Vj，例如，使用第j个荧光染料的单染色光谱表现出最大检测值的光检测器的检测值的平均值。可选地，表现出最大检测值的光检测器的平均值和在该光检测器之前和之后的光检测器(第(j-1)和第(j+1)个光检测器)的检测平均值可进一步进行平均以用于无染色平均值Vj等。
(2-3-2)根据概率密度函数的随机数作为下限条件(第二实施方式及其修改例)
为了将下限值Uj(j＝1至M)用作解下面的表达式(3)到(5)中的二次规划问题的约束条件，可使用根据通过对未使用第j个荧光染料标记的微粒进行光照射得到的各个光检测器的检测值的概率密度函数得到的第j个荧光染料的无染色概率密度函数Fj(Uj)而产生的随机数。对于所述无染色概率密度函数Fj(Uj)，例如，使用第j个荧光染料的单染色光谱表现出最大检测值的光检测器的检测值的概率密度函数。可选地，可将由表现出最大检测值的光检测器的概率密度函数和在该光检测器之前和之后的光检测器(第(j-1)和第(j+1)个光检测器)的概率密度函数计算出的函数用作无染色概率密度函数Fj(Uj)等。
作为修改例，如果应用不具有上面的表达式(4)的线性约束条件的二次规划问题，可通过解下面的表达式(15)和(16)的二次规划问题，并且执行下面的表达式(17)求出前述的参数xj(j＝1至M)。
最小化‖Sx′-(p-u)‖2  …(15)
其中满足x′≥0  …(16)
x＝x′+U  …(17)
其中，S表示以sij作为元素的N×M阶矩阵，x表示以xj作为元素的M阶矩阵，p表示以pi作为元素的N阶矢量，u表示将根据通过对未使用第j个荧光染料标记的微粒进行光照射得到的第i个光检测器的检测值的概率密度函数fi(ui)而产生的随机数ui作为元素的N阶矢量，并且U表示将根据从概率密度函数fi(ui)得到的第j个荧光染料的无染色概率密度函数Fi(Ui)而产生的随机数Uj作为元素的M阶矢量。对于所述无染色概率密度函数Fj(Uj)，例如，使用第j个荧光染料的单染色光谱表现出最大检测值的光检测器的检测值的概率密度函数fi(ui)。可选地，可将由表现出最大检测值的光检测器的概率密度函数和在该光检测器之前和之后的光检测器(第(j-1)和第(j+1)个光检测器)的概率密度函数计算出的函数用作无染色概率密度函数Fj(Uj)等。
(2-3-3)根据正态分布的随机数作为下限条件(第三实施方式及其修改例)
此外，为了将下限值Uj(j＝1至M)用作解下面的表达式(3)到(5)中的二次规划问题的约束条件，可使用通过对未使用第j个荧光染料标记的微粒进行光照射得到的各个光检测器的检测值的平均值和离散度得到的第j个荧光染料的无染色平均值Vj和无染色标准差ρj，并且根据下面的表达式(9)的无染色概率密度函数Fj(Uj)产生的随机数，作为前述的下限值Uj。该随机数将是根据正态分布的随机数(正态随机数)。对于无染色平均值Vj和无染色标准差ρj，例如，使用第j个荧光染料的单染色光谱表现出最大检测值的光检测器的平均值和标准差。可选地，可将由表现出最大检测值的光检测器的平均值和标准差与在该光检测器之前和之后的光检测器(第(j-1)和第(j+1)个光检测器)的平均值和标准差计算出的值用作无染色平均值Vj和无染色标准差ρj等。
F j ( U j ) = 1 2 π ρ j e - ( U j - V j ) 2 2 ρ j 2 · · · ( 9 )
作为修改例，如果应用不具有上面的表达式(4)的线性约束条件的二次规划问题，可通过解下面表达式(20)和(21)的二次规划问题，并且执行下面的表达式(17)求出前述的参数xj(j＝1至M)。
f i ( u i ) = 1 2 π σ i e - ( u i - v i ) 2 2 σ i 2 · · · ( 18 )
F j ( U j ) = 1 2 π ρ j e - ( U j - V j ) 2 2 ρ j 2 · · · ( 19 )
最小化‖Sx′-(p-u)‖2  …(20)
其中满足x′≥0  …(21)
x＝x′+U  …(22)
其中，S表示以sij作为元素的N×M阶矩阵，x表示以xj作为元素的M阶矩阵，p表示以pi作为元素的N阶矢量，u表示将通过对未使用第j个荧光染料标记的微粒进行光照获得的第i个光检测器得到检测值的平均值Vj和离散度σi、并且根据表达式(18)的概率密度函数fj(uj)产生的随机数uj作为元素的N阶矢量，并且U表示将通过从平均值vi和离散度σi得到第j个荧光染料的无染色平均值Vj和无染色标准差ρj并且根据表达式(19)的概率密度函数Fj(Uj)而产生的随机数Uj作为元素的M阶矢量。对于无染色平均值Vj和无染色标准差ρj，例如，使用第j个荧光染料的单染色光谱表现出最大检测值的光检测器的检测值的平均值i和标准差。可选地，可将由表现出最大检测值的光检测器的平均值和标准差与在该光检测器之前和之后的光检测器(第(j-1)和第(j+1)个光检测器)的平均值和标准差计算出的值用作无染色平均值Vj和无染色标准差ρj等。
(2-3-4)0作为下限条件(第四实施方式)
如果应用不具有上面的表达式(4)的线性约束条件的二次规划问题，通过将下限值设置成0，可通过解下面的表达式(10)和(11)的二次规划问题，得到前述的参数xj(j＝1至M)。
最小化‖Sx-p‖2  …(10)
其中满足x≥0  …(11)
其中，S表示以sij作为元素的N×M阶矩阵，x表示以xj作为元素的M阶矩阵，并且p表示以pi作为元素的N阶矢量。
2.荧光强度计算装置
根据本发明的实施方式的荧光强度计算装置由流体系统、光学系统、分选系统、数据处理系统等通过与根据现有技术的流式细胞仪相同的方式构成。
流体系统是在流动池(flow cell)流过包含要测定的微粒的样本液体以使其在鞘溶液的层流的中心处流动，从而将微粒在流动池中排列成单行的装置。微粒可以不是在流动池，而是在微芯片上形成的通道中单行排列。
光学系统是使用光检测器接收通过对由荧光染料标记的微粒照射光而被激发的荧光染料所发出的荧光，并且收集各个光检测器的检测值以获得测定光谱的装置。使用该光学结构检测微粒的前向色散光和侧向散射光，以及诸如瑞利(Rayleigh)散射和米氏(Mie)散射等的散射光。更具体地，光学系统由激光源、聚光透镜、分色镜、带通滤波器等组成的收集激光束并且在微粒上进行照射的照射系统，以及用于检测由于激光的照射导致的从微粒发出的荧光和散射光的检测系统构成。检测系统例如由PMT(光电倍增管)或诸如CCD或CMOS装置等的区域成像装置构成，并且设置有不同输入波段的多个光检测器。
如果对微粒进行分选，样本溶液可作为包括微粒的液滴而排出至流动池外部的空间中，并且控制液滴的运动方向以分选具有所需特性的微粒。分选系统由用于以液滴形式从流动池排出样本溶液的振动元件(如压电装置等)、为排出的液滴提供电荷的充电单元、沿着液滴的运动方向、在运动的液滴存在的空间两侧彼此相向设置的对向电极等构成。
数据处理系统输入光检测器的检测值作为电信号，并且基于电信号分析微粒的光学特性。数据处理系统通过根据上述方法的单染色光谱的线性和对通过收集光检测器的检测值而得到的测定光谱进行近似，并且计算各荧光染料发出的真实荧光强度。因此，数据处理系统具有用于存储用于执行上述根据本发明的实施方式的荧光强度计算方法的程序的存储介质(如硬盘等)，以及用于执行程序的CPU和内存等。
为了提高各个光检测器的信号质量，数据处理系统优选设置有用于平滑各个光检测器之间的数据的噪声滤波器。进行平滑处理考虑光检测器的数目、输入波段、使用的荧光染料、要测定的微粒的自发荧光波长、以及装置的噪声频率成分等。进行数据平滑实现了抑制噪声的作用，提高计算精度，并且可更准确地计算荧光强度。
使用32-通道多色测定流式细胞仪、通过虚拟输出数据来比较根据使用校正矩阵的现有技术的荧光校正方法与使用受限最小二乘法的根据本发明的实施方式的荧光校正方法的结果。
使用的荧光染料为FITC(CH5)、Alexa 500(CH6)、Alexa 514(CH10)、Alexa 532(CH12)、PE(CH15)、PE-TR(CH19)、PI(CH21)、Alexa 600(CH20)、PE-Cy5(CH24)、PerCP(CH25)、PerCP-Cy5.5(CH26)和PE-Cy7(CH31)。括号内的通道序号表示对于根据使用校正矩阵的现有技术的方法中的荧光染料的通道的分配。
图2示出了各荧光染料的单染色光谱。通过蒙特卡罗方法(MonteCarlo method)产生模拟数据，其中这些单染色光谱都以排他方式的随机强度出现，并且进一步将检测器和电噪声虚拟地加至各个检测数据。使用图2中所示的单染色光谱和根据现有技术的方法以及根据本发明的实施方式的方法通过对产生的模拟数据进行荧光校正所得到的典型分析结果如下所示。
图3示出了在没有进行荧光校正的条件下从虚拟输出产生的二维相关图。竖直轴(A)到(C)分别表示了Alexa 500、Alexa 514和Alexa 532的荧光强度，并且水平轴表示FITC的荧光强度。上排是对数标度(log-scale)绘制的二维相关图，并且下排是线性标度绘制的二维相关图(这对于下文中的图4到图11是相同的)。
图4示出了通过使用校正矩阵进行荧光校正而从虚拟输出产生的用于比较的二维相关图。在线性标度绘制的二维相关图中，存在FITC和Alexa 500、Alexa 514、Alexa 532的荧光强度被计算为负值的子群。因此，相比于在线性标度的二维相关图上绘制的群，在对数标度的二维相关图上绘制的群明显减少。
图5示出了通过下限为平均值的根据第一实施方式的方法进行荧光校正而从虚拟输出数据产生的二维相关图。在线性标度绘制的二维相关图中，FITC和Alexa 500、Alexa 514、Alexa 532的荧光强度被计算为正值。因此，在线性标度的二维相关图上绘制的群也都被绘制在对数标度的二维相关图上。
图6是通过根据第一实施方式的修改例的方法对虚拟输出数据进行荧光校正产生的二维相关图，其中将平均值作为下限，没有线性约束条件。
图7是通过根据第二实施方式的方法对虚拟输出数据进行荧光校正产生的二维相关图，其中下限是根据概率密度函数的随机数。
图8是通过根据第二实施方式的修改例的方法对虚拟输出数据进行荧光校正产生的二维相关图，其中下限是根据概率密度函数的随机数，没有线性约束条件。
图9是通过根据第三实施方式的方法对虚拟输出数据进行荧光校正产生的二维相关图，其中下限是正态随机数。
图10是通过根据第三实施方式的修改例的方法对虚拟输出数据进行荧光校正产生的二维相关图，其中下限是正态随机数，没有线性约束条件。
图11是通过根据第四实施方式的方法对虚拟输出数据进行荧光校正产生的二维相关图，其中下限是0。
对于图6至图11，FITC和Alexa 500、Alexa 514、Alexa 532的荧光强度也被计算为正值。因此，在线性标度的二维相关图上绘制的群也都被绘制在对数标度的二维相关图上。
本发明包含于2010年7月9日向日本专利局提交的日本在先专利申请JP 2010-156382中披露的主题的相关主题，其全部内容结合于此作为参考。
本领域的技术人员应当理解，根据设计要求和其他因素，可以进行各种修改、组合、子组合和变形，均应包含在所附权利要求或其等同物的范围之内。

Claims (4)

1.一种荧光强度校正方法，包括：
利用具有不同输入波段的光检测器，接收通过对微粒照射光而被激发的荧光染料所发出的荧光，所述微粒被具有重叠荧光波长的多个荧光染料多重标记；
收集所述光检测器的检测值，得到测定光谱；以及
通过从各荧光染料单独标记的微粒得到的单染色光谱的线性和对所述测定光谱进行近似；
其中，使用受限最小二乘法进行利用所述单染色光谱的线性和的所述测定光谱的近似，并且
通过求出使下面的表达式(1)所示的评价函数满足下面的表达式(2)并且为最小值的参数xj而计算出各荧光染料发出的荧光强度，其中j＝1至M，
χ 2 = Σ i = 1 N ( p i - Σ j = 1 M S ij · x j σ i ) 2 . . . ( 1 )
xj≥Uj  ...(2)
其中，Sij表示在第j个荧光染料的单染色光谱中的第i个光检测器的检测值，pi表示测定光谱中第i个光检测器的检测值，σi表示关于第i个光检测器的检测值的权数的倒数，x表示以xj作为元素的M阶矩阵，并且Uj表示要计算的各荧光染料的荧光强度的下限值，并且
在所述表达式(2)中，从通过对未使用第j个荧光染料标记的微粒进行光照得到的各个所述光检测器的检测值的平均值得到的第j个荧光染料的无染色平均值Vj被用作所述下限值Uj，或者
在所述表达式(2)中，从通过对未使用第j个荧光染料标记的微粒进行光照射得到的各个所述光检测器的检测值的平均值和离散度求出第j个荧光染料的无染色平均值Vj和无染色标准差ρj，并且根据表达式(9)的无染色概率密度函数Fj(Uj)产生的随机数被用作所述下限值Uj，
F j ( U j ) = 1 2 π ρ j e ( U j - V j ) 2 2 ρ j 2 . . . ( 9 ) .
2.根据权利要求1所述的荧光强度校正方法，其中，通过解下面的表达式(3)到(5)的二次规划问题求出所述参数xj，其中j＝1至M，
最小化||Sx-p||2 ...(3)
其中满足Ax≤b ...(4)
x≥0 ...(5)
b = - U 1 - U 2 . . . - U M . . . ( 7 )
其中，S表示以sij作为元素的N×M阶矩阵，p表示以pi作为元素的N阶矢量，A被设置为M×M阶矩阵，b被设置为M×1阶矩阵，并且U1到UM表示所述下限值。
3.根据权利要求1所述的荧光强度校正方法，其中，通过解下面的表达式(10)和(11)的二次规划问题求出所述参数xj，其中j＝1至M，
最小化||Sx-p||2 ...(10)
其中满足x≥0 ...(11)
其中，S表示以sij作为元素的N×M阶矩阵，x表示以xj作为元素的M阶矩阵，并且p表示以pi作为元素的N阶矢量。
4.一种荧光强度计算装置，包括：
测定单元，被配置为
利用具有不同输入波段的光检测器，接收通过对微粒照射光而被激发的荧光染料所发出的荧光，所述微粒被具有重叠荧光波长的多个荧光染料多重标记，
收集所述光检测器的检测值，并且
得到测定光谱；以及
计算单元，被配置为通过从各荧光染料单独标记的微粒得到的单染色光谱的线性和对所述测定光谱进行近似；
其中，所述计算单元使用受限最小二乘法进行利用所述单染色光谱的线性和的所述测定光谱的近似，并且
通过求出使下面的表达式(1)所示的评价函数满足下面的表达式(2)并且为最小值的参数xj而计算出各荧光染料发出的荧光强度，其中j＝1至M，
χ 2 = Σ i = 1 N ( p i - Σ j = 1 M S ij · x j σ i ) 2 . . . ( 1 )
xj≥Uj  ...(2)
其中，Sij表示在第j个荧光染料的单染色光谱中的第i个光检测器的检测值，pi表示测定光谱中第i个光检测器的检测值，σi表示关于第i个光检测器的检测值的权数的倒数，x表示以xj作为元素的M阶矩阵，并且Uj表示要计算的各荧光染料的荧光强度的下限值，并且
在所述表达式(2)中，从通过对未使用第j个荧光染料标记的微粒进行光照得到的各个所述光检测器的检测值的平均值得到的第j个荧光染料的无染色平均值Vj被用作所述下限值Uj，或者
在所述表达式(2)中，从通过对未使用第j个荧光染料标记的微粒进行光照射得到的各个所述光检测器的检测值的平均值和离散度求出第j个荧光染料的无染色平均值Vj和无染色标准差ρj，并且根据表达式(9)的无染色概率密度函数Fj(Uj)产生的随机数被用作所述下限值Uj，
F j ( U j ) = 1 2 π ρ j e ( U j - V j ) 2 2 ρ j 2 . . . ( 9 ) .
CN201110185326.2A 2010-07-09 2011-07-01 荧光强度校正方法和荧光强度计算装置 Active CN102313724B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010-156382 2010-07-09
JP2010156382A JP5540952B2 (ja) 2010-07-09 2010-07-09 蛍光強度補正方法及び蛍光強度算出装置

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102313724A CN102313724A (zh) 2012-01-11
CN102313724B true CN102313724B (zh) 2015-07-22

Family

ID=44558438

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201110185326.2A Active CN102313724B (zh) 2010-07-09 2011-07-01 荧光强度校正方法和荧光强度计算装置

Country Status (4)

Country Link
US (1) US8990024B2 (zh)
EP (1) EP2405252B1 (zh)
JP (1) JP5540952B2 (zh)
CN (1) CN102313724B (zh)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5985140B2 (ja) 2010-04-28 2016-09-06 ソニー株式会社 蛍光強度補正方法、蛍光強度算出方法及び蛍光強度算出装置
JP5817369B2 (ja) 2011-09-13 2015-11-18 ソニー株式会社 スペクトル解析装置及び微小粒子測定装置、並びにスペクトル解析あるいはスペクトルチャート表示のための方法及びプログラム
US8918503B2 (en) 2011-12-06 2014-12-23 Seven Networks, Inc. Optimization of mobile traffic directed to private networks and operator configurability thereof
JP5870851B2 (ja) * 2012-05-29 2016-03-01 ソニー株式会社 情報処理装置、情報処理方法、及びプログラム
CN103592287B (zh) * 2012-08-13 2019-09-17 天津精利为科技有限公司 通过元素的测量强度和浓度计算被干扰元素浓度的方法
CN103592286A (zh) * 2012-08-13 2014-02-19 天津精利为科技有限公司 通过元素的计算浓度来计算被干扰元素浓度的方法
CN106644901A (zh) * 2015-10-14 2017-05-10 北京信息科技大学 一种用于流式细胞仪的荧光补偿方法
US11561161B2 (en) 2017-08-08 2023-01-24 Sony Corporation Information processing apparatus, information processing method, and program
EP3680645A4 (en) * 2017-09-08 2020-11-11 Sony Corporation MICROPARTICLE MEASUREMENT DEVICE, INFORMATION PROCESSING DEVICE AND INFORMATION PROCESSING PROCESS
CN109490176B (zh) * 2018-11-30 2019-11-22 苏州深析智能科技有限公司 流式细胞检测数据处理方法、装置及分型方法、装置
US11761895B2 (en) 2019-03-04 2023-09-19 Sony Group Corporation Information processing apparatus and microscope system
JP2021081342A (ja) 2019-11-20 2021-05-27 ソニーグループ株式会社 情報処理システムおよび情報処理装置
JP2021162393A (ja) * 2020-03-31 2021-10-11 ソニーグループ株式会社 情報処理装置、情報処理方法、プログラム及び光学測定システム
CN112903543B (zh) * 2021-01-20 2022-04-01 华中科技大学 基于光散射的气溶胶颗粒物椭圆度测量方法和系统

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1882278A (zh) * 2003-10-28 2006-12-20 薇拉莱特公司 使用组织荧光确定某一糖化终产物或疾病状态
CN101283241A (zh) * 2005-08-08 2008-10-08 普凯尔德诊断技术有限公司 识别和量化悬浮于液体中的生物样品的系统及方法
CN101636106A (zh) * 2007-03-17 2010-01-27 杜尔牙科股份有限公司 用于对荧光图像记录进行分析处理的方法和设备

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6675106B1 (en) * 2001-06-01 2004-01-06 Sandia Corporation Method of multivariate spectral analysis
US6584413B1 (en) * 2001-06-01 2003-06-24 Sandia Corporation Apparatus and system for multivariate spectral analysis
WO2002103335A1 (en) * 2001-06-18 2002-12-27 Amnis Corporation Spectral deconvolution of fluorescent markers
JP2003083894A (ja) 2001-09-14 2003-03-19 Sumitomo Electric Ind Ltd 蛍光値補正方法、蛍光値補正装置、蛍光値補正プログラム及び前記蛍光値補正プログラムを記録した記録媒体
US6662116B2 (en) * 2001-11-30 2003-12-09 Exxonmobile Research And Engineering Company Method for analyzing an unknown material as a blend of known materials calculated so as to match certain analytical data and predicting properties of the unknown based on the calculated blend
JP4037294B2 (ja) * 2003-03-20 2008-01-23 オリンパス株式会社 分光画像から複数の固有スペクトル成分の存在割合を求める方法
US7400772B1 (en) * 2003-05-20 2008-07-15 Sandia Corporation Spatial compression algorithm for the analysis of very large multivariate images
JP4093934B2 (ja) * 2003-07-16 2008-06-04 株式会社神戸製鋼所 モデルパラメータ決定方法及びそのプログラム，モデル予測方法及びそのプログラム
US7725517B1 (en) * 2004-09-29 2010-05-25 Sandia Corporation Methods for spectral image analysis by exploiting spatial simplicity
GB0611981D0 (en) * 2006-06-16 2006-07-26 Renishaw Plc Spectroscopic analysis methods
US8244021B2 (en) * 2006-12-20 2012-08-14 Ventana Medical Systems, Inc. Quantitative, multispectral image analysis of tissue specimens stained with quantum dots
JP4509163B2 (ja) * 2007-10-26 2010-07-21 ソニー株式会社 微小粒子の測定方法
JP2009233253A (ja) * 2008-03-28 2009-10-15 Terumo Corp 血糖測定装置および血糖測定方法
JP5321051B2 (ja) 2008-12-26 2013-10-23 日本精工株式会社 直動案内装置

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1882278A (zh) * 2003-10-28 2006-12-20 薇拉莱特公司 使用组织荧光确定某一糖化终产物或疾病状态
CN101283241A (zh) * 2005-08-08 2008-10-08 普凯尔德诊断技术有限公司 识别和量化悬浮于液体中的生物样品的系统及方法
CN101636106A (zh) * 2007-03-17 2010-01-27 杜尔牙科股份有限公司 用于对荧光图像记录进行分析处理的方法和设备

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Algorithms for Constrained Linear Unmixing with Application to the Hyperspectral Analysis of Fluorophore Mixtures;M. R. Keenan et al.;《Proceedings of SPIE》;20021101;第4816卷;第193-202页，尤其是第193页摘要，第195页第1-2段、图3，第196页第1段、图5 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2012018108A (ja) 2012-01-26
EP2405252B1 (en) 2017-05-31
EP2405252A2 (en) 2012-01-11
EP2405252A3 (en) 2012-01-25
JP5540952B2 (ja) 2014-07-02
CN102313724A (zh) 2012-01-11
US20120010822A1 (en) 2012-01-12
US8990024B2 (en) 2015-03-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102313724B (zh) 荧光强度校正方法和荧光强度计算装置
CN102435313B (zh) 荧光强度补偿方法及荧光强度计算装置
US11340167B2 (en) Fluorescence intensity correcting method, fluorescence intensity calculating method, and fluorescence intensity calculating apparatus
CN102998240B (zh) 微粒测量装置
US20220082488A1 (en) Methods of forming multi-color fluorescence-based flow cytometry panel
US20060192940A1 (en) Modular flow cytometry system
CN102539397B (zh) 荧光光谱校正方法和荧光光谱测量装置
CN102272584A (zh) 荧光检测装置及荧光检测方法
CN107290265B (zh) 超宽光谱多通道激光流式细胞仪
JP2021162393A (ja) 情報処理装置、情報処理方法、プログラム及び光学測定システム
EP1019687B1 (en) A method for characterizing samples by determination of a function of at least one specific physical property of particles of said sample
CN103792166A (zh) 一种测量球形高氯酸铵粒度的方法
US20240027457A1 (en) High parameter reagent panel and reagent kit for effective detection of aberrant cells in acute myeloid leukemia
JP7451926B2 (ja) 情報処理装置、粒子測定装置、情報処理方法、粒子測定方法、及びコンピュータプログラム
US20210239590A1 (en) Apparatus and Method for Cyclic Flow Cytometry Using Particularized Cell Identification
JP7010293B2 (ja) 情報処理装置、情報処理方法及びプログラム
US20240159673A1 (en) Fluorescence intensity correcting method, fluorescence intensity calculating method, and fluorescence intensity calculating apparatus

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant