CN1889826A

CN1889826A - 显示与阿尔茨海默氏疾病相关的主要紊乱的转基因动物

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Publication number: CN1889826A
Application number: CNA2004800357140A
Authority: CN
Inventors: C·卡萨斯洛昭; P·伯努瓦; L·普拉迪耶; G·特伦普; J·－M·伊蒂耶; V·布朗沙尔－布雷格安
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 2003-10-02
Filing date: 2004-09-27
Publication date: 2007-01-03
Also published as: AU2004277357A1; FR2860391A1; ZA200602670B; CA2540622A1; ES2347961T3; AU2004277357B2; NO20061954L; IL174726A; PL1670309T3; BRPI0415032A; DE602004027823D1; RU2373707C2; EP1670309A1; EP1670309B1; JP2007507217A; MXPA06003670A; KR20060090988A; KR101164691B1; SI1670309T1; ATE471661T1

Abstract

本发明涉及显示与阿尔茨海默氏疾病相关的主要紊乱的非人转基因动物。该动物可用于发现用于治疗阿尔茨海默氏疾病的化合物。

Description

显示与阿尔茨海默氏疾病相关的主要紊乱的转基因动物

本申请涉及作为阿尔茨海默氏疾病(Alzheimer’s disease，AD)模型的转基因动物。本发明也涉及这些动物的用途。

阿尔茨海默氏疾病是影响大部分老年人群体的渐进性的神经变性疾病。这种疾病在临床上的特征为记忆丧失和认知功能的衰退，在神经病理学上的特征为明确的神经元损失和在脑中存在形成淀粉样蛋白斑的β-淀粉样蛋白肽(Aβ)的胞内神经原纤维沉积和胞外沉积。

淀粉样蛋白斑主要由在Aβ肽前体(APP)的蛋白水解过程期间形成的40或42个残基的Aβ肽组成。Aβ的胞外沉积对于与阿尔茨海默氏疾病相关的紊乱是非常特异的。它们代表所有形式，包括家族性形式(FAD)的阿尔茨海默氏疾病的早期和恒定特征。家族性的形式出现相对较早(在30和60岁之间)并且在5％的FAD病例中是由于APP基因中的突变，其具有已鉴定的8个单或双重错义突变，在50至70％的FAD病例中是由于早老素1(PS1)基因的突变，其具有迄今已鉴定的100个以上的不同突变，以及在更稀有的FAD病例中是由于早老素2基因的突变，其具有所描述的2个错义突变。已经表明这3种基因中的突变诱导APP蛋白水解的变化，其导致Aβ，特别是长形式的Aβ42的过量产生，并且导致与偶发形式的阿尔茨海默氏疾病相似的病理学状况和症状的早期出现。

已经在文献中描述了旨在表现阿尔茨海默氏疾病病理学的某些特征的动物模型。

最初它们是携带APP基因中的突变的转基因小鼠。它们从一岁起发展出与阿尔茨海默氏疾病相似的病理学状况。因此，过表达携带突变V717F的人APP的PDAPP小鼠随着年龄在脑中发展出Aβ沉积，但是在斑块本身位置以外没有显示神经元的损失(Irizarry等人，1997，J.Neurosc.17(18)：7053-7059)。这个现象被称为“斑块效应”。

类似地，表达人同工型APP K670N-M671L(瑞典(Swedish)突变的APPSw)的Tg(HuAPP695.K670N-M671L)2576小鼠显示出淀粉样蛋白-型沉积，但是没有显示神经元的损失(Irizarry等人，1997，J.Neuropathol.Exp.Neurol 56：695-973)。

在Calhoun等人的研究(1998，Nature 395：755-756)中，在表达人APP突变同工型的14-18个月龄的APP23转基因小鼠中，在邻近淀粉样蛋白斑的某些脑区域中显示神经元的损失。这个观察是有争议的，因为损失很小并且发生在相对老的动物中且特别是斑块附近，其可能相应于先前观察到的“斑块效应”。此外，没有记载，或几乎从未提及，而在最新的评述中强调了通用的动物模型没有显示出与阿尔茨海默氏疾病的病理学状况的所有已知特征的完全相似处，特别是神经元的损失(Trojanowski，2002，Am.J.Pathol.160：409-411)。

而且，在PS1基因中携带突变的转基因小鼠是已知的。他们似乎没有发展出阿尔茨海默氏疾病类型的任何病理学状况，但是显示出高数量的Aβ42肽(与野生型PS1相比增加两倍)，这被认为是高度致病的。

此外，在所描述的在小鼠PS1基因中携带FAD突变P264L或M146L(“敲入”)的转基因动物模型中，突变PS1蛋白质没有稳定表达(Siman等人，2000J.Neurosci.，20：8717-8726；Flood等人，2002，Neurobiol.Aging 23：335-348；Rozhmahel等人，2002，23：187-194)。这些小鼠也显示出高数量的Aβ42肽。

申请WO 02/0008407描述了这种转基因小鼠，其中编码早老素1的基因已经通过导入P264L突变而被突变。

由于PS1蛋白质在形成Aβ42形式中的作用，也已经产生了在APP和PS1基因中携带突变的双重转基因小鼠。类似于如上所述的单转基因，这些小鼠显示出Aβ沉积，但是没有显示神经元的损失(Takeuchi等人，2000，Am.J.Pathol.157：331-339)。

因此，现有的阿尔茨海默氏疾病的动物模型不是令人满意的，因为它们未能再现神经元的损失，而这是神经变性疾病，包括阿尔茨海默氏疾病的主要特征。

本申请人因此已经努力产生显示阿尔茨海默氏疾病的主要特征，包括神经元损失的动物。

已经表明有可能通过将特异的突变导入小鼠中编码PS1蛋白质的基因中，并且通过使其与过表达人APP基因的小鼠杂交来获得这种动物。

因此本发明的第一个方面涉及非人动物，其在基因组中有利地具有编码携带相应于小鼠PS1蛋白质上突变M233T和L235P的2个突变中的至少一个的早老素1的核酸序列。

有利地，这种动物携带两个突变。

优选地，携带突变M233T和L235P的PS1蛋白质是鼠起源的。

特别优选地，该突变的早老素1蛋白质是内源的。

因此，本发明所述的动物有利地产生包括序列SEQ ID No.2的蛋白质。它优选产生具有序列SEQ ID No.3的蛋白质。在其基因组中它有利地包括核酸序列SEQ ID No.1或序列SEQ ID No.8。

序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.8分别从导入野生型序列SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.9的突变得到。序列SEQ ID No.5是小鼠野生型早老素1蛋白质的第229至237位残基序列。序列SEQ ID No.9是编码早老素1蛋白质的小鼠基因的野生型外显子7，即未突变的序列。

有利地，本发明所述的动物共表达APP，优选人APP。这种基因可包括一种或多种FAD突变。因此，APP基因中的突变可以是在迄今为止的文献中描述的多种突变中的一种。APP基因中的突变可选自单独或组合的“瑞典(Swedish)”(S)、“伦敦(London)”(L)和“荷兰(Dutch)”(D)突变。

这些突变在文献中有很好的描述并且通常通过下列改进来表征：

特性和位置	瑞典突变	荷兰突变	伦敦突变
特性和位置	瑞典突变	荷兰突变	伦敦突变	关于APP770	K670N和M671L	E693Q和/或A692G	V717I
关于APP751	K651N和M652L	E674Q和/或A673G	V698I	关于APP770	K670N和M671L	E693Q和/或A692G	V717I
关于APP751	K651N和M652L	E674Q和/或A673G	V698I	关于APP695	K595N和M596L	E618Q和/或A617G	V642I
关于A-β肽(A42)		E22Q和/或A21G	V46I	关于APP695	K595N和M596L	E618Q和/或A617G	V642I

也包括在伦敦突变内的是除了关于APP770的位于第717位的异亮氨酸的所有取代，例如突变V717G和V717F。

可理解用于本发明上下文的APP可以是多种同工型，并且特别为形式695、751和770或例如同工型APP99的截短形式，对于后者排除瑞典突变。

有利地，所述的动物在基因组中也有利地包括编码全部或部分编码APP751的基因的核酸序列。有利地，该APP751蛋白质是人起源的。它优选显示突变K670N和M671L(瑞典)和V717I(伦敦)。

在本发明的上下文中，APP基因有利地处于容许其在神经元中强烈表达的序列，特别是促进转录的序列，例如外源启动子的控制下。通过启动子序列，最特别地可提及HMG启动子(Gautier等人，(1989)，Nucleic Acids Res 17：20，8389)、以及PDGF启动子(Sasahara等人(1991)，Cell 64，217-27)、Thy-1启动子(Luthi等人(1997)，J Neurosci17，4688-99)和朊病毒基因启动子(Scott等人(1992)，Protein Sci 1，986-97)。

根据本发明特别有利的实施方案，该动物模型包括处于Thy1启动子控制下的具有S、D和/或L突变的APP基因。

因此，本发明所述的动物优选地产生包括序列SEQ ID No.7的蛋白质。它可显示核酸序列SEQ ID No.6。

优选地，它是来源于在携带编码人蛋白质APP751SL核酸序列的转基因小鼠ThyAPP(TG53)和携带编码携带突变M233T和L235P的小鼠PS1蛋白质核酸序列的转基因小鼠之间进行杂交的转基因小鼠。

本发明所述的动物首次再现了神经变性疾病的一个最重要的特征，即早期的神经元损失。

此外它们显示通常用于描述这些病理学状况的其它特征。该动物从2月龄时清楚可见，并从6月龄时显著地显示淀粉样蛋白斑的加速沉积。

它们也从2^1/2个月龄时显示Aβ42形式对总Aβ的比率，Aβ42/Aβ大于大约0.9。这种比率与文献中描述的其它转基因小鼠相比是非常高的。

在6月龄的小鼠中已经可见的神经元损失在10月龄时是清楚明确的。

PKR(双链RNA-依赖性的蛋白激酶)是受胁迫活化的激酶，它磷酸化eIF2，与细胞程序性死亡有关。

PKR是在本发明所述的10-月龄的APPxPS1KI小鼠的海马(其中发生神经元损失的结构)中检测到的。它没有在12-月龄的APPxPS1M146L转基因小鼠中被检测到，而且在该小鼠中也没有观察到神经元的损失。

本发明所述动物的新特征使得它们成为比已经描述的模型更完全且更能代表在患有阿尔茨海默氏疾病的患者中观察到的紊乱的研究模型。因此这些动物特别适于发现旨在治疗神经变性疾病，优选阿尔茨海默氏疾病的化合物的神经保护特性。

优选地，本发明所述的动物具有处于纯合状态的ps1突变等位基因和杂合状态的APP突变等位基因。然而，可在具有处于杂合状态的2个突变ps1等位基因和杂合状态的APP突变之一的动物中描述所述动物的相同特征，然而这些动物具有较不明显或出现较晚的表型。

本发明所述动物的另一个优点是由这种转基因小鼠表达的突变PS1蛋白质的水平等于由表达非突变PS1的正常(未转基因)小鼠正常表达的内源PS1蛋白质的水平。这个特征使得它成为没有PS1蛋白质过表达的有利研究模型，其可用于发现旨在治疗神经变性疾病的化合物。

这些化合物可能特别地是对PS1基因在转录、转录后、翻译或翻译后水平起作用、或通过改变或调节其一个或多个特性而对PS1蛋白质本身起作用的化合物，或其对PS1蛋白质的相互作用对或靶物具有相似作用，或对APP的调节以及更广泛的，对在神经变性过程期间起源于PS1和APP信号的任何下游分子的调节起作用的化合物。

在本发明的上下文中，该动物有利地是哺乳动物，例如啮齿类。特别地它们是小鼠、大鼠或兔子。

通过本领域技术人员公知的方法获得允许得到它们的小鼠和构建体。

可根据常规的转基因技术获得它们。举例来说，为了说明转基因的一个方法，可提及如实施例中所描述的，使包含改变的基因的基因构建体电穿孔进入小鼠胚胎干细胞，以及在选择后，使携带所需要的遗传事件的细胞转移进入受体胚囊的方法。在这方面，通过包括核酸的表达盒的电穿孔来获得本发明所述的突变的PS1动物。优选地，这种核酸是DNA，其可能是基因组DNA(gDNA)或互补DNA(cDNA)。

基因组的改变可能是通过“敲入”而改变或修饰一种或多种基因的结果。这种改变可能是由于常规的改变或诱变试剂的作用或另外可能通过定点诱变进行。在本发明中，关于突变的ps1基因，优选涉及采用携带了通过如随后的实施例中所描述的定向诱变而预先突变的转基因的靶向载体进行同源重组。

通过将基因构建体微注射进入受精卵的细胞核来获得表达突变APP蛋白质的动物。

通过使突变的ps1动物和突变的APP动物杂交来获得双重转基因动物。

本发明所述的动物可有利地用于显现旨在治疗神经变性疾病以及优选阿尔茨海默氏疾病的化合物的神经保护特性。这些化合物可以是化学分子、肽或蛋白质分子、抗体、嵌合分子以及反义RNAs或核糖酶。被显现的化合物可用作药物制品，因为它们是药物学上可接受的溶剂或可与药物学上可接受的溶剂组合以便获得药物组合物。它们可特别地是等渗的、无菌盐水溶液(磷酸钠或磷酸二钠、氯化钠、钾、钙或镁等，或这些盐的混合物)，是干燥的、特别为冷冻干燥的组合物，通过添加合适的无菌水或生理盐水可使其能构成可注射的溶液。可向通过脑功能区定位方式、局部地、口服地、肠胃道外地、产期内地、静脉内地、肌内地、皮下地、眼内地、经皮肤地等方式给予注射。

因此，本发明的另一个主题涉及用于发现旨在治疗神经变性疾病的化合物的方法，至少包括下列步骤：

-将测试化合物或测试化合物的混合物施用于本发明所述的动物，以及

-观察一种或多种再现在人类中观察到的神经病理学的特征性标记物的发展。

因此本发明的另一个主题涉及用于发现旨在治疗神经变性疾病的化合物的方法，至少包括下列步骤：

-使来自本发明所述的动物细胞提取物与化合物或化合物的混合物接触，以及

-测量该化合物对细胞匀浆中完整细胞或对亚细胞部分的影响。

本发明的另一个主题涉及来源于本发明的2种动物之一的任何生物制品并且也涉及其用于发现旨在治疗神经变性疾病，优选阿尔茨海默氏疾病的化合物的用途。术语“生物制品”特别是指细胞、蛋白质提取物、DNA、RNA或其它抗体。

因此，本发明的主题是来源于如上所述的动物的细胞或细胞系，特别是胚胎干细胞。

本发明的主题也是分别在第233和235位携带从M至T和从L至P的氨基酸突变的小鼠PS1蛋白质。有利地，这种蛋白质包括序列SEQ ID No.2。优选地，它具有序列SEQ ID No.3。

本发明的另一个主题是编码分别在第233和235位携带从M至T，和从L至P的氨基酸突变的小鼠PS1蛋白质的核酸。

有利地，权利要求书所述的这种核酸包括序列SEQ ID No.1或序列SEQ ID No.8。

本发明的主题也是与包括这些核酸或其互补序列的这些核酸和载体互补的序列。

本发明的另一个方面涉及这些蛋白质用于显现旨在治疗神经变性疾病的化合物的神经保护特性的用途。

通过下列实施例说明本发明，然而并不只限于这些实施例。

在这些实施例中，所描述的结果证明了PS1KI小鼠的优点并且清楚地支持PS1KIxAPP模型在治疗学策略中的优选使用，因为它在代表迄今已知的神经变性疾病的主要特征方面占优势。

附图简述

图1A：鼠ps1基因结构和野生型外显子7(上面行)和所使用的靶向载体(中间行)周围的主要限制酶切位点的图示。产生密码子突变M233T和L235P，外显子7(*)中突变的核苷酸碱基变化被表示在虚线框中。包含新霉素(Neo)抗性盒的突变等位基因PS1KI表示在下面行上。也标明了用于鉴定新生幼仔的230bp探针的位置。

图1B：利用230bp探针鉴别各种小鼠中的野生型WT等位基因(在9.2kb的条带)和杂合PS1KI(He，双条带)以及纯合PS1KI(在7.4kb的Ho条带)等位基因的Southern印迹。

图1C：PS1的C-末端片段的免疫印迹显示PS1蛋白质的表达水平没有受到PS1KI等位基因突变存在的改变。

图2A、2B和2C：分别定量2.5、4、6和10个月龄时总Aβ、Aβ42和总Aβ/Aβ42的比率。

图3：Aβ肽在APP751SLxPS1KI Ho小鼠中沉积过程的加速。说明6个月龄时Aβ肽在脑中的胞外沉积的区域分布的图版。该图像表示3只APP751SL小鼠中(图3A、3B和3C)和3只APP751SLxPS1KIHo小鼠中(图3D、3E和3F)的Aβ免疫标记(Ab 4G8)。免疫标记证明最初的沉积在6个月时出现，其在APP751SL小鼠的皮层(Cx)和海马(Hp)中仍然是稀少的。比较起来，在同龄的APP751SLxPS1KIHo小鼠中，在这些区域中的沉积物数目极大地增加。应注意到，在这些小鼠中，沉积物以显著的数量存在于丘脑中(T)。

图4：Aβ肽沉积过程随着年龄发展。说明10个月时Aβ在脑中沉积的区域分布的图版。该图像相应于2只APP751SL小鼠(图4A和4B)和2只APP751SLxPS1KI Ho小鼠(图4C和4D)。在APP751SL小鼠中，免疫标记证明10个月时皮层(Cx)和海马(Hp)中沉积物的数目和尺寸与6月龄时和在丘脑中出现最初沉积(参见图3)时相比有相当可观的增加。10个月时APP751SLxPS1KI Ho小鼠的皮层、海马和丘脑中沉积物的密度和尺寸也是更大的。应注意到，在这些小鼠中，可在纹状体(St)中检测到少量的沉积。

图5：APP751SLxPS1KI Ho小鼠的CA1中神经元死亡的过程。说明10个月龄时APP751SLxPS1KI Ho小鼠的海马中受影响的锥形神经元的图版。该图像表示在低放大倍数下，2只PS1KI Ho小鼠(图5A和5B)、2只APP751SL小鼠(图5C和5D)和2只APP751SLxPS1KIHo小鼠(图5E和5F)的海马中的甲酚紫染色。10个月龄时APP751SL小鼠和PS1KI Ho小鼠中海马的锥体细胞层的密度和厚度是质量上可比较的。另一方面，在相同年龄的APP751SLxPS1KI Ho小鼠中，特别在阿蒙氏角(CA1)的第1层中它们是明显减少的。应注意到在APP751SLxPS1KI Ho小鼠的海马中染成蓝色的小细胞(神经胶质型细胞)的数目看来似乎有增加。

图6：APP751SLxPS1KI Ho小鼠的CA1中神经元死亡的过程。借助于使用其它的神经元标记物，甲基绿和BIP免疫标记说明10个月时CA1中受影响神经元的图版。该图像表示在高倍放大下，非转基因小鼠(图6A)、PKS1KI Ho小鼠(图6B)、APP751SL小鼠(图6C)和APP751SLxPS1KI Ho小鼠(图6D)中CA1的甲基绿染色。它们表示在高倍放大下，PS1KI Ho小鼠(图6E)和APP751SLxPS1KIHo小鼠(图6F)中CA1的BIP免疫标记。与非转基因的、PS1KI Ho和APP751SL小鼠相比，APP751SLxPS1KI Ho小鼠的CA1区域中用甲基绿染色的神经元细胞的数目明显减少。应注意检测到该双重转基因小鼠的海马薄壁组织中相当大数目的染色的神经胶质型细胞。BIP免疫标记也证实10个月龄时APP751SLxPS1KI Ho小鼠的CA1中锥形神经元的相当可观的损失。

图7：CA1中神经元的死亡和Aβ肽的胞内沉积。说明2种病理过程，10个月龄时受影响的神经元和Aβ肽的异常脑内积聚的图版。该图像表示在高倍放大下，2只APP751小鼠(图7A和7B)和2只APP751SLxPS1KI Ho小鼠(图7E和7F)中CA1的Aβ免疫标记。它们表示在高倍放大下，APP751小鼠(图7C和7D)、APP751SLxPS1KIHo小鼠(图7G和7H)和2只PS1KI Ho小鼠(7I和7J)中CA1的甲酚紫染色。10个月龄时、在单APP751SL小鼠和APP751SLxPS1KIHo双重小鼠中，主要在CA1的神经元层两侧都观察到Aβ的胞外沉积。另一方面，在CA1中(特征在于APP751SLxPS1KI Ho小鼠中一直沿着该层对神经元有明显的影响，图7C和7D)，伴随有颗粒状出现(相应于Aβ肽的异常内神经元积聚，参见箭头)的Aβ免疫标记在APP751SLxPS1KI Ho小鼠中显得更为强烈。这在6个月龄时也确实是这样(参见图8)。

图8：APP751SLxPS1KI Ho小鼠的CA1中神经元死亡过程的早期发病。说明6个月龄时海马的CA1区域的图版。该图像表示在高倍放大下，3只APP751小鼠(8A、8B和8C)和3只APP751SLxPS1KIHo小鼠(图8G、8H和8I)CA1中的Aβ免疫标记。它们表示APP751小鼠(图8D、8E和8F)和APP751SLxPS1KI Ho小鼠(8J、8K和8L)中的甲酚紫染色。在6个月龄时，APP751SLxPS1KI Ho小鼠中海马的CA1区域的特征在于已相当大数目的Aβ胞外沉积(图8I)、Aβ的强烈胞内颗粒状标记(参见箭头)和与神经胶质型细胞数目增加相关的甲酚紫染色的神经元损失(图8L)。对于另外的2只APP751SLxPS1KI Ho小鼠，用甲酚紫染色的CA1神经元层看来几乎不紊乱(图8J)或根本不紊乱(图8K)。应注意到，对于这2只小鼠，胞内Aβ免疫标记比在第三只小鼠(图8I)中显得较少强烈以及更为扩散(图8G和8H)。

实施例

实施例1：构建携带突变M233T和L235P的靶向载体。目标是将两个突变导入小鼠PS1基因的外显子7，导致残基M233变为T并且残基L235变为P。两个新密码子相应于在阿尔茨海默氏病患者(FAD)早期发病时鉴定的突变。

利用与Kwok等人(1997 Neuroreport 8；157-42)和Champion等人(1996，Neuroreport 7，1582-4)所描述的相似的2-步诱变策略产生PS1敲入(PS1KI)的小鼠品系。

该策略的目的在于构建携带鼠ps1基因密码子233和235有变化的核酸的靶向载体(参见图1A)。

简明地，通过筛选在λ细菌噬菌体(Stratagene，目录#946313)中构建的129SvJ小鼠基因组DNA文库来分离小鼠PS1基因的17kb基因组片段。用限制性内切酶消化分析、测序、并且与鼠PS1基因的可利用的部分序列(Mitsuda等人1997，JBC 272，23489-97)进行比较，表明该片段包含小鼠PS1基因的内含子5至外显子11区域。将包含内含子5、外显子6、内含子6、外显子7部分和内含子7部分的9.8Kb BamHI-HindIII亚片段亚克隆到质粒pGEM-11Zf(+)中(Promega，法国)(图1A)。利用基因编辑试剂盒(Gene Editor kit)(Promega)在包含外显子7的DNA片段上进行2个密码子的诱变并且通过核苷酸测序加以证实。

通过克隆包含外显子6的7Kb BamHI-XbaI片段获得同源重组载体的长(5’)臂。通过亚克隆已经经受诱变的包含外显子7的1.8KbXbaI-EcoRI片段本身产生短(3’)臂。将阳性选择盒(pMCI-Neo盒)导入位于内含子6中的的XbaI位点，它位于外显子7的5’位的第-470bp位(参见图1A)。

实施例2：产生包括PS1KI的ES细胞

通过用NotI消化使实施例1中所描述的靶向载体线性化，并且电穿孔进入由法国巴黎巴斯德研究所的Charles Babinet博士提供的胚胎干(ES)细胞系CK35中。

如先前所描述的方法(W.Wurtz和A.Joyner，Gene Targeting：APractical Approach by Alexandra L.Joyner(Editor).牛津大学出版社；第二版(2月15，2000))培养该细胞。

在存在G418时筛选可能携带同源重组的430细胞克隆。如先前所描述的(Sambrook，Fritsch和Maniatis，Molecular Cloning；ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，第二版，1989)利用位于重组结构域长臂外部的PS1探针，通过Southern印迹分析这些克隆的基因组DNA(图1A)。因此鉴定出在PS1基因中携带所需要突变的4个细胞克隆。使用这些细胞克隆来建立PS1KI转基因小鼠品系。

实施例3：构建PS1KI小鼠品系

把克隆18C5注射到C57Bl/6小鼠的胚囊中。

获得了5只嵌合小鼠，显示ps1突变等位基因被传递到胚胎系(因此传递至其后代)。

从这些建立者体系，使PS1KI小鼠品系建立在纯的129SV遗传背景和混合的129SV-C57Bl/6背景上。

通过使用230bp ps1探针的Southern印迹测定以杂合(He)或纯合(Ho)状态存在的突变PS1KI等位基因。突变小鼠是能存活和可生育的。

实施例4：测定PS1KI品系中的PS1

安乐死后，移出小鼠的脑并称重。保藏一个半球用于免疫组织化学(定影后)而冷冻另一个半球，然后利用于冰上的波特氏匀浆器，在2ml缓冲溶液：0.32M蔗糖、含有蛋白酶抑制剂混合物(Complete^TM，Roche Diagnostics)的4mM Tris-HCl，pH7.4中分别均质化。通过BCA方法(Pierce)测定蛋白质浓度。将该匀浆物保藏在80℃。

为了检测PS1，使25μg脑蛋白质提取物在含有8M尿素和50mM二硫苏糖醇的Laemmli加样缓冲液中于56℃孵育20min。通过在MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)缓冲液中的NuPAGE 4-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分级分离蛋白质。将蛋白质转移到硝酸纤维素滤膜(Amersham，法国)上后，为了增加灵敏性，在PBS中加热滤膜5分钟，并且立即用在PBST(0.05％PBS(V/V)，Tween 20)缓冲液中的5％(w/v)脱脂奶粉浸透1h，并且与单独PBST缓冲液中的第一抗体于4℃孵育过夜。利用在PBST中稀释度为1/10 000的、共轭至辣根过氧化物酶的抗-IgG(抗-小鼠)抗体(Amersham，法国)，然后通过化学发光检测系统(Amersham，法国)根据制造商的指导说明检测抗体结合。为了检测PS1，使用1/10 000稀释度的第一抗体MAB1563(Chemicon，美国)。为了半定量分析，用GeneGnome 16位CCD照相机(Syngene，剑桥，英格兰)数字化荧光信号并且用Genetools软件(Syngene)分析。通过用每泳道2.5至10μg匀浆物的样品建立的标准曲线来检验信号的线性度。

经免疫印迹的这些分析使得确定保持正常并在PS1KI233/235小鼠中没有减少的突变PS1 C-末端片段的表达水平成为可能。

实施例5：通过使PS1KI和APP品系杂交产生PS1KIxAPP品系

使PS1KI小鼠(实施例1至4中所描述的)与过表达人形式的APP751 cDNA的转基因小鼠品系杂交，该APP751 cDNA携带在Thy-1启动子控制下的瑞典突变(突变K670N；M671L)和伦敦(V717I)FAD突变。如专利申请WO 01/20977所描述的方式获得过表达携带该突变的人形式APP751 cDNA的小鼠。

在下列所有的实验中，使用具有相同遗传背景的小鼠来使由于遗传背景变化而造成的任何效应最小化。

实施例6：通过免疫电化学发光方法测定总Aβ和Aβ42淀粉样蛋白肽

为了定量脑中Aβ(可溶形式和聚集的或不溶形式)的所有汇集，用2体积的在50mM Tris，pH 7.4中的9M盐酸胍(GH)溶液处理脑匀浆物等分样品。用3时段的超声处理15min来混合该匀浆物1h，然后于4℃在50 000g下离心2h。在包含150mM NaCl、0.5％BSA(w/v)和0.05％Tween 20(w/v)的20mM Tris-HCl，pH 7.6缓冲液，pH7.6中将胍提取物稀释至1/20。通过免疫电化学发光(Yang等人，1994，生物技术(NY)12(2)，193-194)，利用2个抗-Aβ肽小鼠单克隆抗体(4G8和6E10)以及Origen M8分析读取仪(IGEN Europe Inc.Oxford)，按照Khorkova等人(J.Neurosci.Methods 82，159-166(1998))所述的改进方法来测定分离部分中Aβ肽的浓度。

根据供应商的方法(IGEN Europe Inc.，牛津)借助于TAG-NHS酯将识别Aβ肽的第17-24位残基表位的单克隆抗体4G8(Senetek PLC)钌化。使Ru-4G8和生物素酰化的抗体6E10、Aβ肽的表位1-10(SenetekPLC)接触脑的可溶部分，并利用Origen读取仪定量Ru-4G8/Aβ/6E10-生物素三联复合物。使用合成肽Aβ(Bachem)的量程校准各个实验。将肽Aβ的数量计算为纳克/每g脑组织原始重量。

为了特异性地测量终止于第42位的Aβ肽形式(Aβ42)，用特异结合Aβ42C-末端的单克隆抗体22F9(Wirths等人，2002，BrainPathol.12，275-286)替换抗体6E10。

总之，ps1敲入(PS1-KI)基因的存在导致：

-脑中加速积聚Aβ(图2A)和Aβ42(图2B)，当PS1KI等位基因以纯合状态存在时该效应愈加显著(基因-剂量效应)。PS1KI(Ho)的效应比先前在申请WO 01/20977中描述的过表达PS1M146L的转基因小鼠更为增强。

-如图2C所示当PS1KI突变是纯合状态时，显示表示大多数Aβ的β42末端的Aβ肽的比例大幅度增加(2^1/2个月龄时Aβ42/总Aβ的比率等于0.92，相比之下，缺少PS1KI时为0.25以及在只存在一个PS1KI等位基因时为中间值0.70：基因-药量效应)。在文献中承认结束于β42末端的Aβ肽种类表示该肽的最致病形式。因此PS1KIxAPP品系表示特别富集致病型的模型。

实施例7：通过免疫组织化学分析Aβ肽的沉积

对于免疫组织化学/组织学实验，在已经移出半脑然后在4％多聚甲醛中固定后，使半脑在含有20％(P/V)蔗糖的0.2M磷酸钠缓冲液(NaH₂PO₄·2H₂O/Na₂HPO₄·12H₂O，pH 7.4)中于4℃冷冻保藏过夜。然后使其在保持于干冰中的-30℃温度的异戊烷中冷冻1min。最终将在恒温于-30℃的低温切片机(LEICA CM3000)上切下的25μm厚的切片置于0.02M PBS缓冲液中并于4℃保藏。

通过涉及形成抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)的显示系统来对这些切片进行Aβ肽的免疫酶检测，其中该系统中偶连于抗生物素蛋白的辣根过氧化物酶是生物素酰化的。简而言之，在封闭缓冲液(包含0.1％triton(Sigma)和10％常规山羊血清(Chemicon)的PBS)中孵育30min后，使脑切片与0.3％H₂O₂溶液接触以消除存在于组织中的内过氧化酶。然后在包含0.3％triton和2％常规血清的第一抗体溶液中孵育这些切片(4℃过夜)。所使用的抗-Aβ第一抗体(4G8，Senetek)(指向Aβ肽的残基17-24的单克隆抗体)是生物素酰化的。漂洗后，根据制造商的指导说明(Vectastin ABCKit，Vector Laboratories，Burlingame，CA)使切片直接与ABC复合物接触1小时。使用3，3’-二氨基联苯胺作为过氧化物酶的色素基因。

因此，通过免疫组织化学证实先前通过对半脑匀浆物进行生化测定所检测到的Aβ肽在APP751SLxPS1KI Ho双重转基因小鼠脑中的异常积聚加速。具体地，在半脑切片上获得的Aβ免疫标记的显微分析证明，在这些小鼠的脑薄壁组织中存在Aβ肽沉积过程的加速。事实上，当最初的沉积出现在约6个月龄的APP751SL小鼠的皮层和海马中时(图3)，可从2个月龄的APP751SLxPS1KI双重纯合状态的转基因小鼠检测到它们。与APP751SL单转基因相比，在6个月龄的双重转基因(APP751SLxPS1KI Ho)中，Aβ沉积的密度明显大于在海马和皮层中的密度。此外，沉积是更广泛分布的；特别地，已经在丘脑和脑桥中检测到沉积(图3)。

随着年龄，特别在10个月龄时，APP751SL单转基因小鼠的脑中沉积物的密度和尺寸增加了(图4)。这些沉积物的分布也更广泛，因为它们存在于丘脑中。在10个月龄的APP751SLxPS1KI Ho双重转基因中，在海马、皮层、丘脑和脑桥中观察到Aβ肽沉积过程的相似发展。可在纹状体中检测到有限数目的最初沉积物(图4)。另一方面，小脑保持Aβ沉积过程的空闲状态。应注意到，在10月龄的PS1KIHo小鼠脑中(n＝4)，没有检测到Aβ肽的沉积。

实施例8：通过组织学和免疫组织化学分析神经元的损失

极高比例的病理学Aβ42肽的存在导致分析APP751SLxPS1KI Ho品系中除Aβ肽的沉积过程加速之外，神经元的损失是否随着年龄发展。为此，3类染色法使得在脑组织切片上观察神经元细胞的消失成为可能：a)使用染色尼斯尔氏体(Nissl bodies)(与粗糙型内质网的核糖体相关的胞质细胞器)的甲酚紫的组织学，并且使证明脑切片上的所有神经元和胶质细胞成为可能；b)使用染色所有细胞的DNA的甲基绿的组织学；c)使用显示内质网驻留伴侣蛋白质在细胞中的表达的BIP的免疫组织化学。

对于甲酚紫染色，将脑组织切片固定在涂胶的载片上，然后在含0.5％甲酚紫溶液(C 1791，Sigma)的蒸馏水中孵育10分钟。在酸性介质中漂洗后，最终使切片脱水。

对于甲基绿染色，将切片固定在涂胶的载片上，然后在含1％甲基绿溶液(来自Sigma的M5015)的蒸馏水中孵育10分钟，漂洗，然后脱水。

对于BIP免疫组织化学(多克隆抗体，SPA-826，Stressgen)，除使切片在孵育于ABC复合物中之前，在生物素酰化的第二抗体(在山羊中制备的抗-兔IgG抗体，Vector)溶液中另外孵育(1h，室温)外，该方法与应用于Aβ肽的免疫组织化学(参见上文)相同。

显微分析证明，通过使用各种组织学/免疫组织化学标记物，APP751SLxPS1KI Ho小鼠(n＝3/3)脑中海马，特别是CA1的锥体细胞层厚度减小。这种减小表明了在10个月龄时存在已经很好确定的神经元死亡过程。在6个月时，存在于1/3小鼠脑中的神经元死亡表明神经毒害过程的早期开始(图8)。在海马、特别在CA1中2个病理过程，即脑中Aβ肽的异常积聚和受影响的神经元的并行分析，表明了Aβ胞内积聚(已经在Thy-1APP751SLxPS1 M146L小鼠中描述的现象)比其胞外沉积的积聚在神经毒害过程中更可能发挥作用(图7)。事实上，神经元仍然存在于显示Aβ肽异常高表达的CA1中。此外，对CA1中神经元的影响明显存在于缺乏胞外沉积的区域中。应注意到CA1的神经元死亡过程中存在可能的基因-剂量效应。也在只具有一个PS1KI等位基因的非常老的(＞15个月)APP751SLxPS1KI小鼠中发现对神经元有影响。

序列表

<110>AVENTIS PHARMA S.A.

<120>显示与阿尔茨海默氏疾病相关的主要紊乱、表达PSI和APP突变的转基因动物

<130>PRJ03034

<160>9

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>27

<212>DNA

<213>小鼠

<400>1

atcagtgccc tcacggcacc ggtattt 27

<210>2

<211>9

<212>PRT

<213>小鼠

<400>2

Ile Ser Ala Leu Thr Ala Pro Val Phe

1 5

<210>3

<211>467

<212>PRT

<213>小鼠

<400>3

Met Thr Glu Ile Pro Ala Pro Leu Ser Tyr Phe Gln Asn Ala Gln Met

1 5 10 15

Ser Glu Asp Ser His Ser Ser Ser Ala Ile Arg Ser Gln Asn Asp Ser

20 25 30

Gln Glu Arg Gln Gln Gln His Asp Arg Gln Arg Leu Asp Asn Pro Glu

35 40 45

Pro Ile Ser Asn Gly Arg Pro Gln Ser Asn Ser Arg Gln Val Val Glu

50 55 60

Gln Asp Glu Glu Glu Asp Glu Glu Leu Thr Leu Lys Tyr Gly Ala Lys

65 70 75 80

His Val Ile Met Leu Phe Val Pro Val Thr Leu Cys Met Val Val Val

85 90 95

Val Ala Thr Ile Lys Ser Val Ser Phe Tyr Thr Arg Lys Asp Gly Gln

100 105 110

Leu Ile Tyr Thr Pro Phe Thr Glu Asp Thr Glu Thr Val Gly Gln Arg

115 120 125

Ala Leu His Ser Ile Leu Asn Ala Ala Ile Met Ile Ser Val Ile Val

130 135 140

Ile Met Thr Ile Leu Leu Val Val Leu Tyr Lys Tyr Arg Cys Tyr Lys

145 150 155 160

Val Ile His Ala Trp Leu Ile Ile Ser Ser Leu Leu Leu Leu Phe Phe

165 170 175

Phe Ser Phe Ile Tyr Leu Gly Glu Val Phe Lys Thr Tyr Asn Val Ala

180 185 190

Val Asp Tyr Val Thr Val Ala Leu Leu Ile Trp Asn Phe Gly Val Val

195 200 205

Gly Met Ile Ala Ile His Trp Lys Gly Pro Leu Arg Leu Gln Gln Ala

210 215 220

Tyr Leu Ile Met Ile Ser Ala Leu Thr Ala Pro Val Phe Ile Lys Tyr

225 230 235 240

Leu Pro Glu Trp Thr Ala Trp Leu Ile Leu Ala Val Ile Ser Val Tyr

245 250 255

Asp Leu Val Ala Val Leu Cys Pro Lys Gly Pro Leu Arg Met Leu Val

260 265 270

Glu Thr Ala Gln Glu Arg Asn Glu Thr Leu Phe Pro Ala Leu Ile Tyr

275 280 285

Ser Ser Thr Met Val Trp Leu Val Asn Met Ala Glu Gly Asp Pro Glu

290 295 300

Ala Gln Arg Arg Val Pro Lys Asn Pro Lys Tyr Asn Thr Gln Arg Ala

305 310 315 320

Glu Arg Glu Thr Gln Asp Ser Gly Ser Gly Asn Asp Asp Gly Gly Phe

325 330 335

Ser Glu Glu Trp Glu Ala Gln Arg Asp Ser His Leu Gly Pro His Arg

340 345 350

Ser Thr Pro Glu Ser Arg Ala Ala Val Gln Glu Leu Ser Gly Ser Ile

355 360 365

Leu Thr Ser Glu Asp Pro Glu Glu Arg Gly Val Lys Leu Gly Leu Gly

370 375 380

Asp Phe Ile Phe Tyr Ser Val Leu Val Gly Lys Ala Ser Ala Thr Ala

385 390 395 400

Ser Gly Asp Trp Asn Thr Thr Ile Ala Cys Phe Val Ala Ile Leu Ile

405 410 415

Gly Leu Cys Leu Thr Leu Leu Leu Leu Ala Ile Phe Lys Lys Ala Leu

420 425 430

Pro Ala Leu Pro Ile Ser Ile Thr Phe Gly Leu Val Phe Tyr Phe Ala

435 440 445

Thr Asp Tyr Leu Val Gln Pro Phe Met Asp Gln Leu Ala Phe His Gln

450 455 460

Phe Tyr Ile

465

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>小鼠

<400>4

atcagtgccc tcatggccct ggtattt 27

<210>5

<211>9

<212>PRT

<213>小鼠

<400>5

Ile Ser Ala Leu Met Ala Leu Val Phe

1 5

<210>6

<211>2265

<212>DNA

<213>人

<400>6

cccgggtcca ccatgctgcc cggtttggca ctgctcctgc tggccgcctg gacggctcgg 60

gcgctggagg tacccactga tggtaatgct ggcctgctgg ctgaacccca gattgccatg 120

ttctgtggca gactgaacat gcacatgaat gtccagaatg ggaagtggga ttcagatcca 180

tcagggacca aaacctgcat tgataccaag gaaggcatcc tgcagtattg ccaagaagtc 240

taccctgaac tgcagatcac caatgtggta gaagccaacc aaccagtgac catccagaac 300

tggtgcaagc ggggccgcaa gcagtgcaag acccatcccc actttgtgat tccctaccgc 360

tgcttagttg gtgagtttgt aagtgatgcc cttctcgttc ctgacaagtg caaattctta 420

caccaggaga ggatggatgt ttgcgaaact catcttcact ggcacaccgt cgccaaagag 480

acatgcagtg agaagagtac caacttgcat gactacggca tgttgctgcc ctgcggaatt 540

gacaagttcc gaggggtaga gtttgtgtgt tgcccactgg ctgaagaaag tgacaatgtg 600

gattctgctg atgcggagga ggatgactcg gatgtctggt ggggcggagc agacacagac 660

tatgcagatg ggagtgaaga caaagtagta gaagtagcag aggaggaaga agtggctgag 720

gtggaagaag aagaagccga tgatgacgag gacgatgagg atggtgatga ggtagaggaa 780

gaggctgagg aaccctacga agaagccaca gagagaacca ccagcattgc caccaccacc 840

accaccacca cagagtctgt ggaagaggtg gttcgagagg tgtgctctga acaagccgag 900

acggggccgt gccgagcaat gatctcccgc tggtactttg atgtgactga agggaagtgt 960

gccccattct tttacggcgg atgtggcggc aaccggaaca actttgacac agaagagtac 1020

tgcatggccg tgtgtggcag cgccattcct acaacagcag ccagtacccc tgatgccgtt 1080

gacaagtatc tcgagacacc tggggatgag aatgaacatg cccatttcca gaaagccaaa 1140

gagaggcttg aggccaagca ccgagagaga atgtcccagg tcatgagaga atgggaagag 1200

gcagaacgtc aagcaaagaa cttgcctaaa gctgataaga aggcagttat ccagcatttc 1260

caggagaaag tggaatcttt ggaacaggaa gcagccaacg agagacagca gctggtggag 1320

acacacatgg ccagagtgga agccatgctc aatgaccgcc gccgcctggc cctggagaac 1380

tacatcaccg ctctgcaggc tgttcctcct cggcctcgtc acgtgttcaa tatgctaaag 1440

aagtatgtcc gcgcagaaca gaaggacaga cagcacaccc taaagcattt cgagcatgtg 1500

cgcatggtgg atcccaagaa agccgctcag atccggtccc aggttatgac acacctccgt 1560

gtgatttatg agcgcatgaa tcagtctctc tccctgctct acaacgtgcc tgcagtggcc 1620

gaggagattc aggatgaagt tgatgagctg cttcagaaag agcaaaacta ttcagatgac 1680

gtcttggcca acatgattag tgaaccaagg atcagttacg gaaacgatgc tctcatgcca 1740

tctttgaccg aaacgaaaac caccgtggag ctccttcccg tgaatggaga gttcagcctg 1800

gacgatctcc agccgtggca ttcttttggg gctgactctg tgccagccaa cacagaaaac 1860

gaagttgagc ctgttgatgc ccgccctgct gccgaccgag gactgaccac tcgaccaggt 1920

tctgggttga caaatatcaa gacggaggag atctctgaag tgaatctgga tgcagaattc 1980

cgacatgact caggatatga agttcatcat caaaaattgg tgttctttgc agaagatgtg 2040

ggttcaaaca aaggtgcaat cattggactc atggtgggcg gtgttgtcat agcgacagtg 2100

atcatcatca ccttggtgat gctgaagaag aaacagtaca catccattca tcatggtgtg 2160

gtggaggttg acgccgctgt caccccagag gagcgccacc tgtccaagat gcagcagaac 2220

ggctacgaaa atccaaccta caagttcttt gagcagatgc agaac 2265

<210>7

<211>751

<212>PRT

<213>人

<400>7

Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg

1 5 10 15

Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro

20 25 30

Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln

35 40 45

Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp

50 55 60

Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu

65 70 75 80

Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn

85 90 95

Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val

100 105 110

Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu

115 120 125

Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys

130 135 140

Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu

145 150 155 160

Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile

165 170 175

Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu

180 185 190

Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val

195 200 205

Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys

210 215 220

Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu

225 230 235 240

Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu

245 250 255

Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile

260 265 270

Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg

275 280 285

Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile

290 295 300

Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe

305 310 315 320

Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr

325 330 335

Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Ile Pro Thr Thr Ala Ala Ser Thr

340 345 350

Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp Glu Asn Glu

355 360 365

His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala Lys His Arg

370 375 380

Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala Glu Arg Gln

385 390 395 400

Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile Gln His Phe

405 410 415

Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn Glu Arg Gln

420 425 430

Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met Leu Asn Asp

435 440 445

Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu Gln Ala Val

450 455 460

Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys Tyr Val Arg

465 470 475 480

Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe Glu His Val

485 490 495

Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser Gln Val Met

500 505 510

Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser Leu Ser Leu

515 520 525

Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp Glu Val Asp

530 535 540

Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val Leu Ala Asn

545 550 555 560

Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala Leu Met Pro

565 570 575

Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro Val Asn Gly

580 585 590

Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe Gly Ala Asp

595 600 605

Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val Asp Ala Arg

610 615 620

Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser Gly Leu Thr

625 630 635 640

Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Asn Leu Asp Ala Glu Phe

645 650 655

Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe

660 665 670

Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val

675 680 685

Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Ile Ile Thr Leu Val Met Leu

690 695 700

Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val Glu Val Asp

705 710 715 720

Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met Gln Gln Asn

725 730 735

Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met Gln Asn

740 745 750

<210>8

<211>221

<212>DNA

<213>小鼠

<400>8

ggaagtattt aagacctaca atgtcgccgt ggactacgtt acagtagcac tcctaatctg 60

gaattttggt gtggtcggga tgattgccat ccactggaaa ggcccccttc gactgcagca 120

ggcgtatctc attatgatca gtgccctcac ggcaccggta tttatcaagt acctccccga 180

atggaccgca tggctcatct tggctgtgat ttcagtatat g 221

<210>9

<211>221

<212>DNA

<213>小鼠

<400>9

ggaagtattt aagacctaca atgtcgccgt ggactacgtt acagtagcac tcctaatctg 60

gaattttggt gtggtcggga tgattgccat ccactggaaa ggcccccttc gactgcagca 120

ggcgtatctc attatgatca gtgccctcat ggccctggta tttatcaagt acctccccga 180

atggaccgca tggctcatct tggctgtgat ttcagtatat g 221

Claims

1.一种具有编码携带相应于小鼠PS1蛋白质上的突变M233T和L235P中的至少一个突变的早老素1蛋白质的核酸序列的非人动物。

2.如权利要求1中所述的动物，其特征在于所述的突变处于纯合状态。

3.如权利要求1和2中任何一项所述的动物，其特征在于它携带两个突变。

4.如权利要求1至3中任一项所述的动物，它还包括编码全部或部分编码APP的基因的核酸序列。

5.如权利要求1至4中任一项所述的动物，其特征在于它表达的突变PS1的数量比得上表达非突变PS1的动物的内源PS1的数量。

6.如权利要求1至5中任一项所述的动物，其特征在于所述的携带突变M233T和L235P的早老素1蛋白质是鼠起源的。

7.如权利要求4至6中任一项所述的动物，其特征在于所述的APP蛋白质是APP751并且是人起源的。

8.如权利要求4至7中任一项所述的动物，其特征在于所述的APP751蛋白质是人起源的并且具有瑞典突变和伦敦突变。

9.如权利要求1至8中任一项所述的动物，其特征在于它是啮齿类。

10.如权利要求1至9中任一项所述的动物，其特征在于它是小鼠、大鼠或兔子。

11.如权利要求1至10中任一项所述的动物，其特征在于它产生包括序列SEQ ID No.2的蛋白质。

12.如权利要求1至11中任一项所述的动物，其特征在于它在其基因组中具有核酸序列SEQ ID No.1。

13.如权利要求4至12中任一项所述的动物，其特征在于所述的编码APP的基因的表达是在外源启动子的控制之下。

14.如权利要求1至13中任一项所述的动物，其特征在于它显示出神经元的损失。

15.如权利要求1至12中任一项所述的动物，其特征在于它显示出大于大约0.9的Aβ42/总Aβ比率。

16.如权利要求1至15中任一项所述的动物，其特征在于所述的突变的早老素1蛋白质是内源的。

17.一种来源于如权利要求1至16中任一项所述的动物的细胞或细胞系。

18.一种包括编码M233T-和L235P-突变形式的鼠早老素1基因的核酸序列的细胞或细胞系。

19.一种来源于如权利要求1至16中任一项所述的动物的胚胎干细胞。

20.一种分别在第233和235位携带从M至T和从L至P的氨基酸突变的小鼠PS1蛋白质。

21.如权利要求20中所述的蛋白质，其特征在于它包括序列SEQID No.2。

22.一种编码分别在第233和235位携带从M至T和从L至P的氨基酸突变的小鼠PS1蛋白质的核酸。

23.如权利要求22中所述的核酸，其特征在于它包括序列SEQ IDNo.1。

24.一种包括如权利要求23中所述的核酸的载体。

25.如权利要求1至16中任一项所述的动物的用途，其用于发现用于治疗阿尔茨海默氏疾病的化合物。

26.一种用于发现用于治疗神经变性疾病的化合物的方法，包括下列步骤：

-将所述的测试化合物或测试化合物的混合物施用于如权利要求1至16中任一项所述的动物，以及

27.一种用于发现用于治疗神经变性疾病的化合物的方法，包括下列步骤：

-使来自如权利要求1至16中任一项所述动物的细胞提取物与一种化合物或化合物的混合物接触，以及

-测量所述的化合物对细胞匀浆中的完整细胞或对亚细胞部分的影响。

28.如权利要求20和21中任何一项所述的蛋白质的用途，其用于发现用于治疗阿尔茨海默氏疾病的化合物。