RU2373707C2 - Трансгенные животные, имеющие основные расстройства, связанные с болезнью альцгеймера - Google Patents
Трансгенные животные, имеющие основные расстройства, связанные с болезнью альцгеймера Download PDFInfo
- Publication number
- RU2373707C2 RU2373707C2 RU2006114692/13A RU2006114692A RU2373707C2 RU 2373707 C2 RU2373707 C2 RU 2373707C2 RU 2006114692/13 A RU2006114692/13 A RU 2006114692/13A RU 2006114692 A RU2006114692 A RU 2006114692A RU 2373707 C2 RU2373707 C2 RU 2373707C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- mutations
- disease
- mouse
- animal according
- Prior art date
Links
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 50
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 title claims abstract description 28
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 57
- 102100022033 Presenilin-1 Human genes 0.000 claims abstract description 51
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 108010036933 Presenilin-1 Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 23
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 24
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 19
- 108010064539 amyloid beta-protein (1-42) Proteins 0.000 claims description 15
- 230000034994 death Effects 0.000 claims description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 5
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 2
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 claims description 2
- 102400000574 Amyloid-beta protein 42 Human genes 0.000 claims 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 60
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 37
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 29
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 description 15
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 13
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 12
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 11
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 11
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 11
- 101150089079 PS1 gene Proteins 0.000 description 8
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 7
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 6
- 101150031224 app gene Proteins 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 208000015756 familial Alzheimer disease Diseases 0.000 description 6
- DWCZIOOZPIDHAB-UHFFFAOYSA-L methyl green Chemical compound [Cl-].[Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(C=1C=CC(=CC=1)[N+](C)(C)C)=C1C=CC(=[N+](C)C)C=C1 DWCZIOOZPIDHAB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 6
- 210000001103 thalamus Anatomy 0.000 description 6
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 5
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 230000003961 neuronal insult Effects 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000823051 Homo sapiens Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 3
- 210000004720 cerebrum Anatomy 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 102000046783 human APP Human genes 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 3
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 101150057615 Syn gene Proteins 0.000 description 2
- 101150052863 THY1 gene Proteins 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- WZSDNEJJUSYNSG-UHFFFAOYSA-N azocan-1-yl-(3,4,5-trimethoxyphenyl)methanone Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(C(=O)N2CCCCCCC2)=C1 WZSDNEJJUSYNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N isopentane Chemical compound CCC(C)C QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 2
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 2
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 2
- 231100000189 neurotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 210000001176 projection neuron Anatomy 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 210000002763 pyramidal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010174 APPSwe Methods 0.000 description 1
- 208000000044 Amnesia Diseases 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 230000007082 Aβ accumulation Effects 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 101100268553 Homo sapiens APP gene Proteins 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 208000026139 Memory disease Diseases 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 101800001442 Peptide pr Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010036908 Presenilin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 244000078912 Trichosanthes cucumerina Species 0.000 description 1
- 235000008322 Trichosanthes cucumerina Nutrition 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006933 amyloid-beta aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 210000001109 blastomere Anatomy 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000006999 cognitive decline Effects 0.000 description 1
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008094 contradictory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005137 deposition process Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N dimethyl butane Natural products CCCC(C)C AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 102000010982 eIF-2 Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010037623 eIF-2 Kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000005584 early death Effects 0.000 description 1
- 208000025688 early-onset autosomal dominant Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- -1 etc. Substances 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013388 immunohistochemistry analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000006984 memory degeneration Effects 0.000 description 1
- 208000023060 memory loss Diseases 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000007171 neuropathology Effects 0.000 description 1
- 210000002267 nissl body Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Inorganic materials [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 210000003935 rough endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 102200158871 rs33955330 Human genes 0.000 description 1
- 102220092852 rs754853086 Human genes 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000012764 semi-quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 210000001768 subcellular fraction Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011820 transgenic animal model Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/107—Rabbit
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
- A01K2267/0312—Animal model for Alzheimer's disease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
- C12N2517/02—Cells from transgenic animals
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Neurology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области генетической инженерии и медицины. Раскрыто животное, не являющееся человеком, имеющее последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пресенилин 1, несущий мутации, соответствующие мутациям М233Т и L235P в белке PS1 мыши. Также животное содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую весь ген или часть гена, кодирующего АРР. При этом, белок АРР представляет собой АРР751, происходит от человека и несет мутации Swedish и London. Животное предназначено для использования для борьбы с болезнью Альцгеймера. Раскрыты также белок PS1 и нуклеиновая кислота, кодирующая его. Изобретение может быть использовано в медицине для выявления соединений, предназначенных для лечения болезни Альцгеймера. 9 н. и 11 з.п. ф-лы, 50 ил., 1 табл.
Description
Настоящая заявка относится к трансгенным животным моделям болезни Альцгеймера (AD). Ее объектом является, кроме того, применение этих животных.
Болезнь Альцгеймера представляет собой прогрессивное нейродегенеративное заболевание, которое затрагивает широкую пропорцию населения в возрасте. Это заболевание характеризуется в клиническом плане потерей памяти и упадком когнитивных функций, и в невропатологическом плане выраженной гибелью нейронов и присутствием в мозге внутриклеточных нейрофибриллярных отложений и внеклеточных отложений β-амилоидного пептида (Aβ), образующего амилоидные бляшки.
Амилоидные бляшки состоят в большинстве своем из пептидов Aβ из 40 или 42 остатков, которые образуются в ходе протеолиза предшественника пептида Aβ (APP). Внеклеточные отложения Aβ очень характерны для расстройств, связанных с болезнью Альцгеймера. Они представляют раннюю и неизменяемую характеристику всех форм болезни Альцгеймера, включая семейные формы (FAD). Семейные формы проявляются относительно рано (между 30 и 60 годами) и вызваны мутациями в гене APP в 5% случаев FAD с восьмью идентифицированными простыми или двойными миссенс-мутациями, в гене пресенилина 1 (PS1) в 50-70% случаев FAD с более чем 100 различными мутациями, идентифицированными до настоящего времени, и в гене пресенилина 2 в более редких случаях FAD с двумя описанными миссенс-мутациями. Показано, что мутации в этих трех генах индуцировали изменения в протеолизе APP, которые ведут к повышенному продуцированию Aβ, особенно длинной формы Aβ42, и к раннему появлению патологии и симптомов, подобных симптомам спорадических форм болезни Альцгеймера.
Животные модели, предназначенные для воспроизводства некоторых характеристик патологии болезни Альцгеймера, были уже описаны в литературе.
Речь идет, с одной стороны, о трансгенных мышах, несущих мутации в гене APP. У них развиваются патологии, подобные болезни Альцгеймера, начиная с одного года. Так, у мыши PDAPP, суперэкспрессирующей человеческий APP, несущий мутацию V717F, развиваются с возрастом отложения Aβ в мозге, но не наблюдается гибели нейронов вне расположения самих бляшек (Irizarry et al., 1997, J. Neurosc. 17(18): 7053-7059). Это явление можно назвать «эффект бляшки».
Также, мышь Tg(HuAPP695. K670N-M671L)2576, экспрессирующая человеческую изоформу APP K670N-M671L (APPSw для мутации типа Swedish), демонстрирует отложения амилоидного типа, но не обнаруживает гибели нейронов (Irizarry et al., 1997, J. Neuropathol. Exp. Neurol 56:695-973).
В исследовании Calhoun et al. (1998, Nature 395:755-756) гибель нейронов была показана в некоторых областях мозга вблизи от амилоидных бляшек у трансгенных мышей APP23 в возрасте 14-18 месяцев, экспрессирующих мутированную изоформу человеческого APP. Это наблюдение является противоречивым, так как гибель нейронов выражена слабо и происходит у животных в относительно большом возрасте и главным образом вблизи от бляшек, что могло бы соответствовать обнаруженному раньше «эффекту бляшки». Кроме того, оно почти или совсем не упоминается в недавнем комментарии, который подчеркивает, что настоящие животные модели не представляют полного подобия всем известным характеристикам патологии болезни Альцгеймера, в том числе гибели нейронов (Trojanowski, 2002, Am. J. Pathol. 160: 409-411).
С другой стороны, известно о трансгенных мышах, несущих мутации в гене PS1. У них, по-видимому, не развиваются патологии типа болезни Альцгеймера, но имеется высокое количество пептида Aβ42 (увеличение фактора 2 по отношению к PS1 дикого типа), который признан как высоко патогенным.
Кроме того, в описанных моделях трансгенных животных, несущих мутации FAD P264L или M146L в гене PS1 мыши («knock-in»), мутантный белок PS1 не экспрессируется устойчивым образом (Siman et al., 2000, J. Neurosci., 20: 8717-8726; Flood et al., 2002, Neurobiol. Aging 23: 335-348; Rozmahel et al., 2002, 23: 187-194). Эти мыши представляют также высокое количество пептида Aβ42.
В заявке WO 02/0008407 описаны такие трансгенные мыши, у которых ген, кодирующий пресенилин 1, был мутирован введением мутации P264L.
Ввиду роли белка PS1 в образовании форм Aβ42, были также получены двойные трансгенные, несущие мутации в генах APP и PS1. Как и простые трансгенные мыши, описанные выше, эти мыши демонстрируют отложения Aβ, но не демонстрируют гибели нейронов (Takeuchi et al., 2000, Am. J.Pathol. 157: 331-339).
Таким образом, существующие животные модели болезни Альцгеймера неудовлетворительны, так как с их помощью нельзя смоделировать гибель нейронов, являющуюся одной из основных характеристик нейродегенеративных заболеваний, в том числе болезни Альцгеймера.
Заявитель стремился таким образом получить животных, представляющих главные характеристики болезни Альцгеймера, в том числе гибель нейронов.
Он показал, что было возможно получать таких животных, вводя специфические мутации в ген, кодирующий белок PS1 у мышей, и скрещивая их с мышами, осуществляющими суперэкспрессию человеческого гена APP.
Первый аспект изобретения касается, таким образом, не являющегося человеком животного, имеющего, предпочтительно, в своем геноме по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пресенилин 1, имеющий по меньшей мере одну из двух мутаций, соответствующих мутациям M233T и L235P в белке PS1 мыши.
Предпочтительно, такое животное несет обе мутации.
Предпочтительно, белок PS1, несущий мутации M233T и L235P, происходит от мыши.
Особенно предпочтительно, мутантный белок пресенилин 1 является эндогенным.
Таким образом, животное согласно настоящему изобретению продуцирует предпочтительно белок, включающий последовательность SEQ ID NO:2. Предпочтительно, оно продуцирует белок, представляющий последовательность SEQ ID NO:3. Он предпочтительно заключает в своем геноме последовательность нуклеиновых кислот SEQ ID NO:1 или последовательность SEQ ID NO:8.
Последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:8 следуют соответственно из мутаций, введенных в последовательности дикого типа SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:9. Последовательность SEQ ID NO:5 - последовательность остатков 229-237 мышиного белка пресенилина 1 дикого типа. Последовательность SEQ ID NO:9 является последовательностью экзона 7 дикого типа гена мыши, кодирующего белок пресенилин 1, т.е. не мутантного.
Предпочтительно, животное согласно настоящему изобретению совместно экспрессирует APP, предпочтительно, человеческий APP. Такой ген может включать одну или несколько мутаций FAD. Так, мутации в гене APP могут быть одной из различных мутаций, описанных до настоящего времени в литературе. Мутации в гене APP могут быть выбраны среди мутаций "Swedish" (S), "London" (L) и "Dutch" (D), по отдельности или в сочетании.
Эти мутации хорошо описаны в литературе и характеризуются обобщенно следующими изменениями:
| Природа и положение | Мутация Swedish | Мутация Dutch | Мутация London |
| По отношению к АРР770 | К670N и М671L | E693Q и/или А692G | V717I |
| По отношению к АРР751 | K651N и M652L | E674Q и/или А673G | V698I |
| По отношению к АРР695 | K595N и M596L | E618Q и/или A617G | V642I |
| По отношению к пептиду A-β (А42) |
E22Q и/или A21G | V46I |
Также под мутацией London понимают все замены, кроме замены на изолейцин, которые расположены в положении 717 по отношению к APP770, такие как, например, мутации V717G и V717F.
Конечно, APP, который может быть использован в рамках изобретения, может быть в различных изоформах и, в частности, в формах 695, 751 и 770 или в усеченной форме, такой как, например, изоформа APP99, исключая мутацию Swedish для этой изоформы.
Предпочтительно, указанное животное включает, кроме того, предпочтительно в своем геноме последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую весь или часть гена, кодирующего APP751. Предпочтительно, белок APP751 имеет человеческое происхождение. Он представляет предпочтительно мутации K670N и M671L (Swedich) и V717I (London).
В рамках настоящего изобретения ген APP предпочтительно находится под контролем последовательностей, обеспечивающих его сильную экспрессию в нейронах и в особенности последовательностей промоторов транскрипции, таких как экзогенный промотор. В качестве промотирующих последовательностей можно, в частности, назвать промотор HMG (Gautier et al. (1989), Nucleic Acids Res 17:20, 8389.), а также промотор PDGF (Sasahara et al. (1991), Cell 64, 217-27), промотор Thy-1 (Luthi et al. (1997, J. Neurosci 17, 4688-99) и промотор гена Приона (Scott et al. (1992), Protein Sci 1, 986-97).
Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения животная модель включает ген APP, имеющий мутации S, D и/или L, под контролем промотора Thyl.
Таким образом, животное согласно настоящему изобретению продуцирует предпочтительно белок, включающий последовательность SEQ ID NO:7. Оно может содержать последовательность нуклеиновых кислот SEQ ID NO:6.
Предпочтительно, речь идет о трансгенной мыши, происходящей из скрещивания между трансгенной мышью ThyAPP (TG53), несущей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую человеческий белок APP751SL, и трансгенной мышью, несущей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок PS1 мыши, несущий мутации M233T и L235P.
Животные согласно настоящему изобретению воспроизводят впервые одну из наиболее важных характеристик нейродегенеративных заболеваний, которой является ранняя гибель нейронов.
Они показывают к тому же другие характеристики, традиционно описываемые для этих патологий. Животные демонстрируют ускоренное отложение амилоидных бляшек, ясно видимое с возраста 2 месяцев и особенно с 6 месяцев.
Они также демонстрируют отношение форм Aβ42 к общему Aβ, Аβ42/Aβ более приблизительно 0,9, и это наблюдается с 2,5 месяцев. Такое отношение является очень высоким по сравнению с описанным в литературе для других трансгенных мышей.
Уже видимая у мышей в возрасте 6 месяцев гибель нейронов становится ярко выраженной в 10 месяцев.
PKR (Double strand RNA-dependent Protein Kinase) представляет собой киназу, активируемую стрессом и фосфорилирующую IF2, участвующую в апоптозе.
PKR обнаруживается в гипокампе (структура, где имеет место гибель нейронов) мыши APPxPS1KI согласно изобретению в возрасте 10 месяцев. Она не обнаруживается в гипокампе трансгенных мышей APPxPS1M146L в возрасте 12 месяцев, у которых к тому же не наблюдается гибели нейронов.
Новые характеристики животных согласно настоящему изобретению делают из них исследовательские модели, более полные и типичные для расстройств, наблюдаемых у пациентов, пораженных болезнью Альцгеймера, чем описанные ранее. Эти животные особенно пригодны, таким образом, для обнаружения нейропротективных свойств соединений, предназначенных для лечения нейродегенеративных заболеваний, предпочтительно болезни Альцгеймера.
Предпочтительно, животные согласно настоящему изобретению имеют мутантные аллели ps1 в гомозиготном состоянии и APP - в гетерозиготном состоянии. Между тем, те же характеристики указанного животного могут быть описаны у животного, имеющего один мутантный аллель из двух аллелей ps1 в гетерозиготном состоянии и APP - в гетерозиготном состоянии, при, однако, менее выраженном или проявляющимся позднее фенотипе.
Другое преимущество животных согласно настоящему изобретению заключается в том, что количество мутантного белка PS1, экспрессируемого этой трансгенной мышью, эквивалентно количеству эндогенного белка PS1, в норме экспрессируемого нормальной (не трансгенной) мышью, экспрессирующей немутантный PS1. Эта характеристика делает из них выгодную исследовательскую модель - без суперэкспрессии белка PS1 - для выявления соединений, предназначенных для лечения нейродегенеративных заболеваний.
Эти соединения могут представлять собой, в частности, соединения, действующие на регуляцию гена PS1 на транскрипционном, посттранкрипционном, трансляционном, посттрансляционном уровне или на сам белок PS1, изменяя или регулируя одно или несколько из его свойств, или действуя подобным образом на партнеров взаимодействия, или на мишени белка PS1, или соединения, действующие на регуляцию APP и, более широко, любые молекулы выше сигналов, инициируемых PS1 и APP в ходе нейродегенеративного процесса.
В рамках настоящего изобретения животные предпочтительно являются млекопитающими, такими как грызуны. В частности, это может быть мышь, крыса или кролик.
Мыши и конструкции, обеспечивающие их получение, получены методами, известными специалисту.
Они могут быть получены согласно классическим трансгенным методам. В качестве примера, иллюстрируя один из способов трансгенеза, можно назвать способ электропорации генной конструкции, содержащей модифицированные гены в эмбриональных стволовых клетках мыши, и, после отбора, переноса клеток, несущих требуемое генетическое событие в бластоцисту-реципиент, такой как описывается в примерах. В этом отношении животные, мутантные по PS1, согласно изобретению получены электропорацией кассеты экспрессии, включающей нуклеиновую кислоту. Предпочтительно, эта нуклеиновая кислота представляет собой ДНК, которая может быть геномной ДНК (гДНК) или комплементарной ДНК (кДНК).
Модификация генома может следовать из изменения или модификации одного или некоторых генов "knock-in". Эта модификация может быть вызвана действием классических изменяющих или мутагенных агентов или может быть осуществлена направленным мутагенезом. В настоящем изобретении в том, что касается мутантного гена ps1, речь идет предпочтительно о гомологичной рекомбинации с помощью нацеливающего вектора, несущего предварительно мутированный с помощью направленного мутагенеза трансген, как описано в нижеследующих примерах.
Животные, экспрессирующие мутантный белок APP, получены микроинъекцией генетической конструкции в ядро зиготы.
Двойные трансгенные животные получают скрещиванием животных, мутантных по ps1, и животных, мутантных по APP.
Животные согласно настоящему изобретению могут быть использованы предпочтительно для обнаружения нейропротективных свойств соединений, предназначенных для лечения нейродегенеративных заболеваний, и преимущественно болезни Альцгеймера. Эти соединения могут быть химическими молекулами, пептидными или белковыми молекулами, антителами, химерными молекулами, а также антисмысловыми РНК или рибозимами. Выявленные соединения могут быть использованы в качестве лекарственных средств, тель-кель или в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем для получения фармацевтической композиции. Ими могут быть, в частности, соляные растворы (фосфат мононатрия, динатрия, хлорид натрия, калия, кальция или магния и т.д., или смеси таких солей), стерильные, изотонические или сухие композиции, в частности, лиофилизованные, которые добавлением, смотря по обстоятельствам, стерилизуемой воды или физиологической сыворотки позволяют получить растворы для инъекций. Инъекции могут быть осуществлены стереотаксическим, топическим, пероральным, парентеральным, интраназальным, внутривенным, внутримышечным, подкожным, внутриглазным, чреcкожным и т.д. путем.
Другой объект изобретения касается таким образом способа выявления соединений, предназначенных для лечения нейродегенеративных заболеваний, включающего по меньшей мере следующие стадии:
- введение тестируемого соединения или смеси соединений животным согласно настоящему изобретению, и
- наблюдение эволюции одного или нескольких характерных маркеров, воспроизводящих нейропатологию, наблюдаемую у человека.
Другой объект изобретения касается способа выявления соединений, предназначенных для лечения нейродегенеративных заболеваний, включающего по меньшей мере следующие стадии:
- приведение в контакт клеток, полученных из животных согласно настоящему изобретению, с соединением или смесью соединений, и
- измерение эффекта или эффектов соединений на уровне целых клеток, в клеточных гомогенизатах или на субклеточные фракции.
Другой объект изобретения касается любого биологического продукта, происходящего из одного, из двух животных по изобретению, а также их применения для выявления соединений, предназначенных для лечения нейродегенеративных заболеваний, предпочтительно, болезни Альцгеймера. Под «биологическим продуктом» понимают, в частности, клетки, белковые экстракты, ДНК, РНК или антитела.
Таким образом, объектом настоящего изобретения являются клетки или линии клеток, происходящие от животного, такого как описано выше, в частности, эмбриональные стволовые клетки.
Объектом настоящего изобретения, кроме того, является белок PS1 мыши, несущий мутации аминокислот M в T и L в P соответственно в положениях 233 и 235. Предпочтительно, такой белок включает последовательность SEQ ID NO:2. Предпочтительно, он имеет последовательность SEQ ID NO:3.
Другой объект настоящего изобретения - нуклеиновая кислота, кодирующая белок PS1 мыши, несущий мутации аминокислот M в T и L в P соответственно в положениях 233 и 235.
Предпочтительно, такая нуклеиновая кислота согласно формуле изобретения включает последовательность SEQ ID NO:1 или последовательность SEQ ID NO:8.
Объектом настоящего изобретения, кроме того, являются последовательности, комплементарные этим нуклеиновым кислотам и векторам, включающим эти нуклеиновые кислоты или комплементарные им последовательности.
Другой аспект изобретения касается применения этих белков для выявления нейропротективных свойств соединений, предназначенных для лечения нейродегенеративных заболеваний.
Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами, однако оно не ограничено только этими примерами.
В этих примерах описанные результаты доказывают преимущество мышей PS1KI и подтверждают предпочтительное использование модели PS1KIxAPP в терапевтических стратегиях, так как ее преимущество заключается в том, что она способна вопроизводить главные характеристики известных на сегодняшний день нейродегенеративных заболеваний.
Описание фигур
Фиг.1А: Схематическое представление структуры гена ps1 мыши и основных сайтов рестрикции вокруг экзона 7 дикого типа (верхняя линия) и использованного вектора нацеливания (средняя линия). Замены нуклеотидных оснований для получения мутаций кодонов М233Т и L235P в экзоне 7 (*) представлены в пунктирной рамке. Мутантный аллель PS1KI, содержащий кассету резистентности к неомицину (Neo), изображен на нижней линии. Также указано положение зонда 230 пар оснований, использованного для идентификации новорожденных.
Фиг.1B: Саузерн-блоттинг с использованием зонда 230 пар оснований, чтобы отличать аллели WT дикого типа (полоса 9,2 пар оснований) от гетерозиготных PS1KI (He, двойная полоса) и гомозиготных (Нo, полоса 7,4 пар оснований) у различных мышей.
Фиг.1C: Иммуноперенос С-концевого фрагмента PS1, показывающий, что уровни экспрессии белка PS1 не ухудшены присутствием мутаций в аллеле PS1KI.
Фиг.2А, 2B и 2C: Определение количества соответственно общего Aβ42 и отношения общий Aβ/Aβ42, в возрасте 2,5, 4, 6 и 10 месяцев.
Фиг.3: Ускорение процесса отложения пептида Aβ у мышей APP751SLхPS1KI Ho. Показательная картинка регионального распределения внеклеточных отложений пептида Aβ в мозге в 6 месяцев. Изображения демонстрируют иммуномечение Aβ (Ac 4G8) у 3 мышей APP751SL (фиг.3A, 3B, 3C) и 3 мышей APP751SLxPS1KI Ho (фиг.3D, 3Е, 3F). Иммуномечение выявляет появление в возрасте 6 месяцев первых еще редких отложений в коре (Cx) и в гипокампе (Hp) мышей APP751SL. Для сравнения, у мышей APP751SLxPS1KI Ho того же возраста число отложений в этих областях значительно увеличено. Следует отметить, что у этих мышей отложения присутствуют уже в значительном количестве в таламусе (T).
Фиг.4: Прогрессия с возрастом процесса отложения пептида Aβ. Показательная картинка регионального распределения отложений Aβ в мозге в возрасте 10 месяцев. Изображения соответствуют 2 мышам APP751 SL (фиг.4A, 4B) и 2 мышам APP751SLxPS1KI Ho (фиг.4C, 4D). У мышей APP751SL иммуномечение выявляет значительное увеличение числа и размера отложений в коре (Cx) и в гипокампе (Hp) в возрасте 10 месяцев по сравнению с возрастом 6 месяцев и появление первых отложений в таламусе (см. фиг.3). Плотность и размер отложений также более значительны в 10 месяцев в коре, в гипокампе и таламусе мышей APP751SLxPS1KI Ho. Следует отметить, что у этих мышей небольшое число отложений может быть обнаружено в полосатом теле (St).
Фиг.5: Процесс гибели нейронов в CA1 у мыши APP751SLxPS1KI Ho. Показательная картинка поражения пирамидальных нейронов в гипокампе мышей APP751SLxPS1KI Ho в возрасте 10 месяцев. Изображения представляют окрашивание фиолетовым Crésyl, при слабом увеличении в гипокампе, у 2 мышей PS1KI Ho (фиг.5A, 5B), 2 мышей APP751SL (фиг.5C, 5D) и 2 мышей APP751SLxPS1KI Ho (фиг.5E, 5F). Плотность и толщина слоев пирамидальных клеток в гипокампе качественно сравнимы у мышей APP751SL и мышей PS1KI Ho в возрасте 10 месяцев. Напротив, в том же возрасте, они явно сокращены у мышей APP751SLxPS1KI Ho, в особенности в слое 1 Corne d'Ammon (CA1). Следует отметить, что число мелких клеток, окрашенных в голубой цвет (клетки глиального типа) увеличено в гипокампе мышей APP751SLxPS1KI Ho.
Фиг.6: Процесс гибели нейронов в CA1 у мышей APP751SLxPS1KI Ho. Показательная картинка нейронного поражения в CA1 в возрасте 10 месяцев с использованием других нейронных маркеров, метилового зеленого и иммуномечения BIP. Изображения представляют окрашивание метиловым зеленым, в сильном увеличении в CA1, у не мутантной мыши (фиг.6A), мыши PKS1KI Ho (фиг.6B), мыши APP751SL (фиг.6C) и мыши APP751SLxPS1KI Ho (фиг.6D). Они представляют иммуномечение BIP в сильном увеличении в CA1 у мыши PS1KI Ho (фиг.6E) и мыши APP751SLxPS1KI Ho (фиг.6F). По сравнению с нетрансгенными мышами, PS1KI Ho и APP751SL, число нейронов, окрашенных метиловым зеленым, заметно уменьшено в области CA1 мыши APP751SLxPS1KI Ho. Следует отметить наличие окрашенных клеток глиального типа в значительном количестве в паренхиме гипокампа этой двойной трансгенной мыши. Иммуномечение BIP подтверждает также значительную гибель пирамидальных нейронов в CA1 у мыши APP751SLxPS1KI Ho в возрасте 10 месяцев.
Фиг.7: Гибель нейронов в CA1 и внутриклеточное отложение пептида Aβ. Показательная картинка обоих патологических процессов, нейронное поражение и аномальная внутрицеребральная аккумуляция пептида Aβ в возрасте 10 месяцев. Изображения представляют, в сильном увеличении в CА1, иммуномечение Aβ у 2 мышей APP751 (фиг.7A, 7B) и 2 мышей APP751SLхPS1KI Ho (фиг.7Е, 7F). Они представляют, в сильном увеличении в CA1, окрашивание фиолетовым Crésyl у мыши APP751 (фиг.7C, 7D), мыши APP751SLхPS1KI Ho (фиг.7G, 7Н) и 2 мышей PS1KI Ho (фиг.7I, 7J). В возрасте 10 месяцев как у простых мышей APP751SL, так и у двойных APP751SLxPS1KI Ho, внеклеточные отложения Aβ наблюдаются в большинстве своем с одной и с другой стороны слоя нейронов в CA1. Напротив, в CA1 (характеризующейся нейронным поражением, выраженным по всей длине слоя у мыши APP751SLxPS1KI Ho (фиг.7C, 7D), иммуномечение Aβ зернистого вида (соответствующего аномальной внутринейронной аккумуляции пептида Aβ, см. стрелки) более интенсивно у мышей APP751SLxPS1KI Ho. Это справедливо также в возрасте 6 месяцев (см. фиг.8).
Фиг.8: Ранний запуск процесса гибели нейронов в CA1 у APP751SLxPS1KI Ho. Показательная картинка области CA1 гипокампа в возрасте 6 месяцев. Изображения представляют, в сильном увеличении в CA1, иммуномечение Aβ у 3 мышей APP751 (фиг.8A, 8B, 8C) и 3 мышей APP751SLхPS1KI Ho (фиг.8G, 8Н, 8I). Они представляют окрашивание фиолетовым Crésyl у мышей APP751 (фиг.8D, 8E, 8F) и мышей APP751SLxPS1KI HO (фиг.8J, 8K, 8L). В 6 месяцев область CA1 гипокампа у мыши APP751SLxPS1KI Ho характеризуется уже значительным числом внеклеточных отложений Aβ (фиг.8I), интенсивным внутриклеточным зернистым мечением Aβ (см. стрелки) и гибелью нейронов, окрашенных фиолетовым Crésyl с сопутствующим увеличением числа клеток глиального типа (фиг.8L). Для 2 других мышей APP751SLxPS1KI Ho слой нейронов CA1, окрашенный фиолетовым Crésyl слабо (фиг.8J), или вовсе не дезорганизован (фиг.8K). Следует отметить, что для этих двух мышей внутриклеточное иммуномечение Aβ кажется менее интенсивным и более диффузным (фиг.8G, 8Н), чем у 3-й мыши (фиг.8I).
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Конструирование нацеливающего вектора,
несущего мутации M233T и L235P
Цель состояла в том, чтобы ввести две мутации в экзон 7 гена PS1 мыши с заменой остатков M233 на T и L235 на P. Оба новых кодона соответствуют мутациям, идентифицированным у пациентов с болезнью Альцгеймера с ранним началом (FAD).
Линию мышей PS1 knock-in (PS1KI) получали, используя стратегию двустадийного мутагенеза, подобную описанной в Kwok et al. (1997, Neuroreport 8; 157-42) и Champion et al. (1996, Neuroreport 7, 1582-4).
Стратегия имела целью конструирование нацеливающего вектора, несущего замены нуклеиновых кислот в кодонах 233-235 гена ps1 мыши (см. фиг.1A).
Вкратце, геномный фрагмент 17 пар оснований гена PS1 мыши был выделен путем скрининга банка геномной ДНК мыши 129SvJ, сконструированного в бактериофаге-лямбда (Stratagene, номер по каталогу 946313). Анализ путем расщепления рестрикционными ферментами, секвенирования и сравнения с доступными частичными последовательностями мышиного гена PS1 (Mitsuda et al. 1997, JBC 272, 23489-97) показал, что этот фрагмент содержит область от интрона 5 до экзона 11 гена PS1 мыши.
Субфрагмент BamHI-HindIII (9,8 тыс. пар оснований), содержащий часть интрона 5, экзон 6, интрон 6, экзон 7 и часть интрона 7, был субклонирован в плазмиде pGEM-llZf (+) (Promega, Франция) (фиг.1A). Мутагенез 2 кодонов осуществляли, используя комплект Gene Editor (Promega) на фрагменте ДНК, содержащем экзон 7, и подтверждали секвенированием нуклеотидов.
Длинное плечо (5') вектора гомологичной рекомбинации было получено клонированием фрагмента BamHI-XbaI (7 тыс. пар оснований), содержащего экзон 6. Короткое плечо (3') было получено субклонированием фрагмента XbaI-EcoRI (1,8 тыс. пар оснований), содержащего мутагенизированный экзон 7. Кассета положительного отбора (pMCI-Neo кассета) была введена в сайт XbaI, расположенный в интроне 6 в положении - 470 пар оснований в 5'-конце экзона 7 (см. фиг.1А).
Пример 2
Получение клеток, содержащих PS1KI
Нацеливающий вектор, описанный в примере 1, линеаризовывали расщеплением с NotI и электропорировали в линию эмбриональных стволовых клеток (ES) CK35, предоставленных Dr. Charles Babinet, Институт Пастера, Париж, Франция.
Клетки культивировали, как описано выше (W. Wurtz and A. Joyner, Gene Targeting: A Practical Approach by Alexandra L. Joyner (Editor). Oxford University Press; 2nd edition (February 15, 2000)).
430 клеточных клонов, способных носить гомологичную рекомбинацию, были отобраны в присутствии G418. Геномная ДНК этих клонов была проанализирована Саузерн-блоттингом, как описано раньше (Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold String Harbor Laboratory Press,2nd edition, 1989) с использованием зонда PS1, расположенного вне области рекомбинации (фиг.1A) длинного плеча. Четыре клеточных клона, несущих целевые мутации в гене PS1, были таким образом идентифицированы. Эти клеточные клоны использовали для получения линии трансгенных мышей PS1KI.
Пример 3
Конструирование линии мышей PS1KI
Клон 18C5 инъецировали в бластоциты мышей C57B1/6.
Пять из числа полученных химерных мышей показали передачу мутантного аллеля ps1 зародышевой линии (и, таким образом, их потомству).
Исходя из этих основателей, получили линию мышей PS1KI с чистым генетическим фондом 129SV и со смешанным фондом 129SV-C57B1/6.
Наличие мутантного аллеля PS1KI в гетерозиготном (He) или гомозиготном (Ho) состоянии определяли Саузерн-блоттингом с помощью зонда ps1 230 пар оснований (фиг.1B). Эти мутантные мыши являются жизнеспособными и плодовитыми.
Пример 4
Определение количества PS1 в линии PS1KI
После эвтаназии мозг мышей отбирали и взвешивали. Одно полушарие было сохранено для иммуногистохимии (пост-фиксация), а другое было заморожено, затем гомогенизировано индивидуально на льду при помощи Potter в 2 мл буферного раствора: 0,32 M сахарозы, Tris-HCl 4 мМ, pH 7,4, содержащего коктейль ингибиторов протеаз (CompleteТМ, Roche Diagnostics). Концентрация в белке была определена методом BCA (Pierce). Гомогенат был сохранен при -80°C.
Для обнаружения PS1 25 мкг белкового экстракта мозга инкубировали при 56°C в течение 20 мин в депозитном буфере Laemmli, содержащем мочевину 8M и дитиотреитол 50 мМ. Белки фракционировали электрофорезом на геле NuPAGE 4-12% Бис-Трис полиакриламид (SDS-PAGE) в буфере MES (2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота). После переноса белков на нитроцеллюлозный фильтр (Amersham, Франция) фильтр нагревали в PBS в течение 5 мин для увеличения чувствительности и сразу насыщали 5% (вес./об.) порошковым обезжиренным молоком в буфере PBST (PBS, 0,05% (об./об.) Tween 20)) в течение 1 ч и инкубировали в течение ночи при 4°C с первичным антителом в единственном буфере PBST. Связывание антитела было обнаружено с антителом-анти IgG (анти-мышь), конъюгированным с пероксидазой хрена (Amersham, Франция) в разведении 1/10000 в PBST, с последующим использованием системы детекции хемилюминесценцией (Amersham, Франция) согласно инструкциям производителя. Для обнаружения PS1 первичное антитело MAB1563 (Chemicon, США) использовали в разведении 1/10000. Для полуколичественного анализа, люминесцентные сигналы были оцифрованы с помощью камеры CCD GeneGnome 16 битов (Syngene, Кембридж, Англия) и подвергнуты анализу с программным обеспечением Genetools (Syngene). Линейность сигнала была проверена благодаря стандартным кривым, установленным с образцами от 2,5 до 10 мкг гомогената на полосу.
Этот анализ иммунопереносом позволил определить, что уровни экспрессии С-концевого фрагмента мутантного PS1 остались нормальными и не снижены у мыши PS1KI233/235 (фиг.1C).
Пример 5
Получение линии PS1KIxAPP скрещиванием линий PS1KI и APP
Мыши PS1KI (описанные в примерах 1-4) были скрещены с линией трансгенных мышей, суперэкспрессирующих человеческую форму кДНК APP751, несущую мутации FAD Swedish (мутация K670N; M671L) и London (V717I) под контролем промотора Thy-1. Мыши, суперэкспрессирующие человеческую форму кДНК APP751, несущую мутации, были получены, как описано в заявке на патент WO 01/20977.
Во всех следующих опытах были использованы мыши с одним и тем же генетическим фондом для минимизации эффектов, связанных с изменениями генетического фонда.
Пример 6
Определение количества общего амилоидного пептида Аβ и Аβ42 методом иммуноэлектрохемилюминесценции
Для определения количества общей популяции Аβ в мозге (растворимые формы и агрегированные или нерастворимые формы) аликвоты гомогената мозга обрабатывали 2 объемами раствора 9M гидрохлората гуанидина (GH) в 50 мМ Tris pH7,4. Гомогенаты перемешивали в течение 1 ч с 3 периодами обработки ультразвуком по 15 мин с последующим центрифугированием при 50000×g при 4°C в течение 2 ч. Экстракты гуанидина разводили в степени 1/20 в 20 мМ буфера Tris-HCl, pH 7,6, 150 мМ NaCl, 0,5% BSA (вес./об.) и 0,05% Tween 20 (вес./об.). Концентрация пептида Aβ во фракциях была определена затем с помощью иммуноэлектрохемилюминесценции (Yang et al., 1994, Biotechnology (NY) 12(2), 193-194)) при помощи 2 моноклональных мышиных антител антипептид Aβ (4G8 и 6E10) и считывающего устройства Origen M8 Analyzer (IGEN Europe Inc. Оксфорд) согласно прописи, измененной согласно Khorkova et al. (J. Neurosci. Methods 82, 159-166 (1998)).
Моноклональное антитело 4G8 (Senetek PLC), распознающее эпитоп из остатков 17-24 пептида Aβ, рутенилировали сложным эфиром TAG-NHS согласно прописи поставщика (IGEN Europe Inc., Оксфорд). Ru-4G8 и биотинилированное антитело 6E10, эпитоп 1-10 пептида Aβ (Senetek PLC) вводили в присутствии растворимой фракции мозга и определяли количество трехчастных комплексов Ru-4G8/Аβ/6E10-biot с помощью считывающего устройства Origen. Гамму синтетического пептида Aβ (Bachem) использовали для калибровки каждого опыта. Количество пептида Aβ рассчитывали в нанограммах на грамм начального веса мозговой ткани.
Для измерения специфических форм пептида Aβ, заканчивающихся в положении 42 (Aβ42), антитело 6E10 заменяли моноклональным антителом 22F9, которое фиксируется специфически на C-конце Aβ42 (Wirths et al., 2002, Brain Pathol. 12, 275-286).
В заключение, присутствие гена ps1 knock-in (PS1-KI) приводит к
- ускорению аккумуляции Aβ (фиг.2A) и Aβ42 (фиг.2B) в мозге с эффектом, еще более выраженным, когда аллель PS1KI присутствует в гомозиготном состоянии (эффект ген-дозировка). Эффект PS1KI (Ho) выражен сильнее, чем в случае трансгенной мыши, суперэкспрессирующей PS1M146L, описанной ранее в заявке WO 01/20977;
- массовому увеличению пропорции пептида Aβ, имеющего конец β42, который представляет подавляющее большинство Aβ, когда мутация PS1KI присутствует в гомозиготном состоянии, как показывает фиг.2C (отношение Aβ42/Aβ общий составляет 0,92, в возрасте 2,5 месяца, против 0,25 в отсутствие PS1KI и промежуточная величина 0,70 в присутствии единственного аллеля PS1KI: эффект ген-дозировка). В литературе считается, что виды пептида Aβ, заканчивающиеся концом β42, представляют наиболее патологические формы пептида. Линия PS1KIxAPP представляет таким образом модель, особенно обогащенную патологическими формами.
Пример 7
Анализ отложений пептида Aβ с помощью иммуногистохимии
Для испытаний иммуногистохимии/гистологии после отбора и затем постфиксации в параформальдегиде (4%) полушария мозга подвергали криопротекции в течение 1 ночи при 4°C в буфере фосфата натрия 0,2 M (NaH2PО4, 2H2О/Na2HPO4, 12H2О, pH 7,4), содержащем сахарозу 20% (вес./об.). Затем их замораживали в течение 1 мин в изопентане, имеющем температуру -30°C в сухом льду. Срезы толщиной 25 мкм, полученные в криостате, термостатируемом при -30°C (LEICA CM3000), помещают в конечном счете в буфер PBS 0,02M, затем сохраняют при 4°C.
На этих срезах осуществляют иммуноферментную детекцию пептида Aβ с помощью системы детекции, предполагающей образование комплексов авидин-биотин-пероксидазы (АВС), в которых пероксидаза хрена, соединенная с авидином, биотинилирована. Коротко, после инкубации 30 мин в буфере блокировки (нормальная козья сыворотка (Chemicon) в 10% PBS, содержащем 0,1% тритона (Sigma), срезы помещают в присутствии раствора H2О2 0,3% для того, чтобы удалить эндопероксидазы, присутствующие в ткани. Затем эти срезы инкубируют в растворе первичного антитела, содержащем 0,3% тритона и 2% нормальной сыворотки (в течение ночи при 4°C). Используемое первичное анти-Aβ антитело (4G8, Senetek) (моноклональное антитело, направленное к остаткам 17-24 пептида Aβ) биотинилировано. После промываний срезы помещают непосредственно в присутствии комплекса АВС, в течение 1 часа согласно инструкциям производителя (Kit ABC Vectastin, Laboratories Vector, Burlingame, СА). 3-3'-Диаминобензидин был использован как хромоген для пероксидазного фермента.
Таким образом, ускорение аномальной аккумуляции пептида Aβ в мозге двойных трансгенных мышей APP751SLxPS1KI Ho, обнаруженное раньше биохимическими тестами на гомогенатах полушарий мозга, было подтверждено иммуногистохимией. Действительно, микроскопический анализ иммуномечения Aβ, полученного на срезах полушарий мозга, доказал существование ускоренного процесса отложения пептида Aβ в паренхиме мозга этих мышей. Действительно, в то время как первые отложения появляются в коре и в гипокампе к 6 месяцам возраста у мышей APP751SL (фиг.3), они могут быть обнаруженными с возраста 2 месяцев у двойных APP751SLxPS1KI в гомозиготном состоянии. По сравнению с простыми трансгенными APP751SL, у двойных трансгенных (APP751SLxPS1KI Ho) в возрасте 6 месяцев плотность отложений Aβ значительно больше в гипокампе и коре. Кроме того, распределение отложений является более широким, в частности, отложения уже обнаруживаются в таламусе, а также в мосту (фиг.3).
С возрастом, в частности в возрасте 10 месяцев, плотность, а также размер отложений увеличиваются в мозге простых трансгенных мышей APP751SL (фиг.4). Распределение этих отложений также шире, так как они присутствуют в таламусе. У двойных трансгенных APP751SLxPS1KI Ho в возрасте 10 месяцев подобная прогрессия процесса отложения пептида Aβ наблюдается в гипокампе, коре, таламусе и мосту. Первые отложения могут быть обнаружены в ограниченном количестве в полосатом теле (фиг.4). Напротив, мозжечок остается не затронут процессом отложения Aβ. Следует отметить, что в мозге мышей PS1KI Ho в возрасте 10 месяцев (n=4) никакого отложения пептида Aβ не обнаружено.
Пример 8
Анализ гибели нейронов с помощью гистологии и иммуногистохимии
Присутствие очень значительной пропорции патологического пептида Aβ42 повлекло за собой анализ того, развивается ли с возрастом в линии APP751SLxPS1KI Ho, помимо ускорения процесса отложения пептида Aβ, гибель нейронов. Для этого осуществляли 3 типа окрашиваний, позволяющих визуально отобразить исчезновение нейронных клеток на срезах мозговой ткани: a) гистология в фиолетовом crésyl, который окрашивает тела Nissl (органеллы цитоплазмы, ассоциированные с рибосомами шероховатого эндоплазматического ретикулума) и позволяет обнаружить на срезах мозга все нейронные и глиальные клетки; b) гистология в метиловом зеленом, который окрашивает ДНК всех клеток; c) иммуногистохимия в BIP, которая обнаруживает экспрессию в клетках шаперонного белка эндоплазматического ретикулума.
Для окрашивания в фиолетовом crésyl срезы мозговой ткани помещали на желатинированные пластины, затем инкубировали 10 минут в растворе фиолетового crésyl (C 1791, Sigma) 0,5% в дистиллированной воде. После промывания в кислой среде срезы обезвоживали.
Для окрашивания метиловым зеленым срезы поместили на желатинированные пластины, затем инкубировали 10 минут в растворе метилового зеленого (M5015 сигма) 1% в дистиллированной воде, промывали, затем обезвоживали.
Для иммуногистохимии BIP (поликлональное антитело, SPA-826, Stressgen), протокол идентичен использованному для иммуногистохимии пептида Aβ (см. выше), исключая дополнительную инкубацию (1 ч, при температуре окружающей среды) срезов в растворе вторичного биотинилированного антитела (антитело анти-IgG кролика, полученного у козы, Vector) до их инкубации в комплексе ABC.
Микроскопический анализ выявил через использование различных гистологических/иммуногистохимических маркеров уменьшение толщины слоя пирамидальных клеток гипокампа, в частности CA1, в мозге мышей APP751SLxPS1KI Ho (n=3/3) (фиг.5 и 6). Это уменьшение указывает на наличие процесса гибели нейронов, уже имеющего место в возрасте 10 месяцев. В 6 месяцев гибель нейронов имеет место в мозге 1/3 мышей, что позволяет предположить ранний запуск нейротоксического процесса (фиг.8). Анализ параллельно в гипокампе и, в частности в CA1, 2 патологических процессов, аномальной аккумуляции пептида Aβ в мозге и нейронного поражения, внушает мысль о более вероятной роли в нейротоксическом процессе внутриклеточной аккумуляции Aβ (явление, уже описанное у мышей thy1APP751SLxPS1 M146L) по сравнению с его аккумуляцией в виде внеклеточных отложений (фиг.7). Действительно, в нейронах, еще присутствующих в СА1, наблюдается аномально высокая экспрессия пептида Aβ. Кроме того, нейронное поражение в CA1 ясно наблюдается в областях, лишенных внеклеточных отложений. Следует отметить существование вероятного эффекта ген-дозировка в процессе гибели нейронов в CA1. Нейронное поражение действительно было обнаружено у мышей APP751SLxPS1KI в очень большом возрасте (>15 месяцев), имеющих только один аллель PS1KI.
Claims (20)
1. Животное, не являющееся человеком, имеющее последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пресенилин 1, несущий мутации, соответствующие мутациям М233Т и L235P в белке PS1 мыши, а также последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую весь ген или часть гена, кодирующего АРР, отличающееся тем, что белок АРР представляет собой АРР751, происходит от человека и несет мутации Swedish и London, причем указанное животное предназначено для использования для борьбы с болезнью Альцгеймера.
2. Животное по п.1, отличающееся тем, что мутация или мутации находятся в гомозиготном состоянии.
3. Животное по п.1, отличающееся тем, что оно экспрессирует количество мутантного PS1, сравнимое с количеством эндогенного PS1 животного, экспрессирующего немутантный PS1.
4. Животное по п.1, отличающееся тем, что белок пресенилин 1, несущий мутации М233Т и L235P, происходит от мыши.
5. Животное по п.1, отличающееся тем, что оно является грызуном.
6. Животное по п.5, отличающееся тем, что оно представляет собой мышь, крысу или кролика.
7. Животное по п.1, отличающееся тем, что оно продуцирует белок, включающий последовательность SEQ ID NO:2.
8. Животное по п.1, отличающееся тем, что оно имеет в своем геноме последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:1.
9. Животное по п.1, отличающееся тем, что экспрессия гена, кодирующего АРР, находится под контролем экзогенного промотора.
10. Животное по п.1, отличающееся тем, что у него наблюдается гибель нейронов.
11. Животное по п.1, отличающееся тем, что оно имеет отношение Абета42/Абета общий более чем приблизительно 0,9.
12. Животное по п.1, отличающееся тем, что мутантный белок пресенилин 1 является эндогенным.
13. Клетка или линия клеток, полученная от животного по одному из пп.1-12, предназначенная для использования для борьбы с болезнью Альцгеймера.
14. Клетка или линия клеток, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую мышиный ген пресенилина 1 в мутантной форме с мутациями М233Т и L235P, причем указанная клетка или линия клеток предназначена для использования для борьбы с болезнью Альцгеймера.
15. Эмбриональная стволовая клетка, полученная от животного по одному из пп.1-12, предназначенная для использования для борьбы с болезнью Альцгеймера.
16. Белок PS1 мыши, несущий мутации в виде замены аминокислот М на Т и L на Р, соответственно в положениях 233 и 235, отличающийся тем, что он включает последовательность SEQ ID NO:2.
17. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок PS1 мыши, несущий мутации в виде замены аминокислот М на Т и L на Р, соответственно в положениях 233 и 235, отличающаяся тем, что она включает последовательность SEQ ID NO:1.
18. Вектор, включающий нуклеиновую кислоту по п.17, предназначенный для использования для борьбы с болезнью Альцгеймера.
19. Применение животного по одному из пп.1-12 для выявления соединений, предназначенных для лечения болезни Альцгеймера.
20. Применение белка по п.16 для выявления соединений, предназначенных для лечения болезни Альцгеймера.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0311578A FR2860391B1 (fr) | 2003-10-02 | 2003-10-02 | Animaux transgeniques presentant les troubles majeurs lies a la maladie d'alzheimer |
| FR0311578 | 2003-10-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2006114692A RU2006114692A (ru) | 2007-11-10 |
| RU2373707C2 true RU2373707C2 (ru) | 2009-11-27 |
Family
ID=34307379
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006114692/13A RU2373707C2 (ru) | 2003-10-02 | 2004-09-27 | Трансгенные животные, имеющие основные расстройства, связанные с болезнью альцгеймера |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1670309B1 (ru) |
| JP (1) | JP4806635B2 (ru) |
| KR (1) | KR101164691B1 (ru) |
| CN (1) | CN1889826A (ru) |
| AT (1) | ATE471661T1 (ru) |
| AU (1) | AU2004277357B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0415032A (ru) |
| CA (1) | CA2540622C (ru) |
| CY (1) | CY1110788T1 (ru) |
| DE (1) | DE602004027823D1 (ru) |
| DK (1) | DK1670309T3 (ru) |
| ES (1) | ES2347961T3 (ru) |
| FR (1) | FR2860391B1 (ru) |
| IL (1) | IL174726A (ru) |
| MX (2) | MXPA06003685A (ru) |
| NO (1) | NO334611B1 (ru) |
| PL (1) | PL1670309T3 (ru) |
| PT (1) | PT1670309E (ru) |
| RU (1) | RU2373707C2 (ru) |
| SI (1) | SI1670309T1 (ru) |
| WO (1) | WO2005032244A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA200602670B (ru) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2963791B1 (fr) * | 2010-08-11 | 2012-09-21 | Assist Publ Hopitaux De Paris | Methode de diagnostic des maladies neurodegeneratives |
| JPWO2014007367A1 (ja) * | 2012-07-05 | 2016-06-02 | 国立大学法人 東京大学 | 同一試料中の２種の物質を検出又は測定する方法 |
| JP6583011B2 (ja) * | 2016-01-20 | 2019-10-02 | コニカミノルタ株式会社 | 酸性水溶液を用いた免疫染色スライドの洗浄方法 |
| CN109776665B (zh) * | 2019-02-02 | 2021-02-05 | 首都医科大学宣武医院 | 阿尔茨海默病新突变、其稳转细胞模型及医药用途 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2798556B1 (fr) * | 1999-09-17 | 2004-02-27 | Aventis Pharma Sa | Nouveau modele animal de la maladie d'alzheimer presentant a la fois des plaques amyloides et des dysfonctionnements mitochondriaux |
| EP1235482A1 (fr) * | 1999-09-17 | 2002-09-04 | Aventis Pharma S.A. | Nouveau modele animal de la maladie d'alzheimer presentant a la fois des plaques amyloides et des dysfonctionnements mitochondriaux |
| DK1255437T3 (da) * | 1999-09-27 | 2010-08-09 | Aventis Pharma Sa | Transgent dyr, der eksprimerer en form af presenilin 1, der er muteret flere gange |
| AU2001276995C1 (en) * | 2000-07-20 | 2006-10-26 | Cephalon, Inc. | Gene-targeted non-human mammal with human fad presenilin mutation and generational offspring |
-
2003
- 2003-10-02 FR FR0311578A patent/FR2860391B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-09-27 MX MXPA06003685A patent/MXPA06003685A/es unknown
- 2004-09-27 DK DK04787459.9T patent/DK1670309T3/da active
- 2004-09-27 CN CNA2004800357140A patent/CN1889826A/zh active Pending
- 2004-09-27 RU RU2006114692/13A patent/RU2373707C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2004-09-27 WO PCT/FR2004/002436 patent/WO2005032244A1/fr active Application Filing
- 2004-09-27 EP EP04787459A patent/EP1670309B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 2004-09-27 AT AT04787459T patent/ATE471661T1/de active
- 2004-09-27 ZA ZA200602670A patent/ZA200602670B/en unknown
- 2004-09-27 ES ES04787459T patent/ES2347961T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-09-27 JP JP2006530400A patent/JP4806635B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-09-27 PT PT04787459T patent/PT1670309E/pt unknown
- 2004-09-27 AU AU2004277357A patent/AU2004277357B2/en not_active Ceased
- 2004-09-27 BR BRPI0415032-5A patent/BRPI0415032A/pt not_active IP Right Cessation
- 2004-09-27 MX MXPA06003670A patent/MXPA06003670A/es active IP Right Grant
- 2004-09-27 DE DE602004027823T patent/DE602004027823D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2004-09-27 CA CA2540622A patent/CA2540622C/fr not_active Expired - Fee Related
- 2004-09-27 PL PL04787459T patent/PL1670309T3/pl unknown
- 2004-09-27 KR KR1020067006358A patent/KR101164691B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2004-09-27 SI SI200431505T patent/SI1670309T1/sl unknown
-
2006
- 2006-04-02 IL IL174726A patent/IL174726A/en not_active IP Right Cessation
- 2006-05-02 NO NO20061954A patent/NO334611B1/no not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-09-22 CY CY20101100849T patent/CY1110788T1/el unknown
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| HUANG X.G. et al. "Behavioral and neurochemical characterization oftransgenic mice carrying the human presenilin-1 gene with or without the leucine-to-proline mutation at codon 235", Exp Neurol. 2003 Oct; 183(2): 673-81. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MXPA06003670A (es) | 2006-06-20 |
| BRPI0415032A (pt) | 2006-12-12 |
| NO20061954L (no) | 2006-06-26 |
| JP4806635B2 (ja) | 2011-11-02 |
| SI1670309T1 (sl) | 2010-11-30 |
| CY1110788T1 (el) | 2015-06-10 |
| JP2007507217A (ja) | 2007-03-29 |
| DK1670309T3 (da) | 2010-10-25 |
| AU2004277357B2 (en) | 2011-11-03 |
| KR101164691B1 (ko) | 2012-07-11 |
| DE602004027823D1 (de) | 2010-08-05 |
| MXPA06003685A (es) | 2006-06-20 |
| ATE471661T1 (de) | 2010-07-15 |
| PL1670309T3 (pl) | 2010-11-30 |
| CN1889826A (zh) | 2007-01-03 |
| ES2347961T3 (es) | 2010-11-26 |
| WO2005032244A1 (fr) | 2005-04-14 |
| CA2540622A1 (fr) | 2005-04-14 |
| AU2004277357A1 (en) | 2005-04-14 |
| FR2860391A1 (fr) | 2005-04-08 |
| IL174726A (en) | 2013-05-30 |
| ZA200602670B (en) | 2007-07-25 |
| EP1670309A1 (fr) | 2006-06-21 |
| NO334611B1 (no) | 2014-04-22 |
| CA2540622C (fr) | 2014-01-14 |
| IL174726A0 (en) | 2006-08-20 |
| EP1670309B1 (fr) | 2010-06-23 |
| RU2006114692A (ru) | 2007-11-10 |
| FR2860391B1 (fr) | 2006-01-27 |
| KR20060090988A (ko) | 2006-08-17 |
| PT1670309E (pt) | 2010-09-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Flood et al. | A transgenic rat model of Alzheimer's disease with extracellular Aβ deposition | |
| CA2174429C (en) | Transgenic animals harboring app allele having swedish mutation | |
| US5612486A (en) | Transgenic animals harboring APP allele having swedish mutation | |
| JP2001517065A (ja) | トランスジェニック動物モデルを用いてアルツハイマー病治療薬を同定する方法 | |
| JP2001514528A (ja) | 天然プレセニリン１ヌルバックグラウンド上で非天然野生型および家族性アルツハイマー病突然変異プレセニリン１タンパク質を発現するトランスジェニック動物 | |
| JPH11507821A (ja) | トランスジェニック動物モデルを用いてアルツハイマー病治療薬を同定する方法 | |
| RU2373707C2 (ru) | Трансгенные животные, имеющие основные расстройства, связанные с болезнью альцгеймера | |
| US20070022483A1 (en) | Transgenic animal model for Alzheimer's disease | |
| US7700823B2 (en) | Transgenic animals exhibiting major disorders related to Alzheimer's disease | |
| JP2000515743A (ja) | アルツハイマー病用のトランスジェニック動物モデル | |
| US7432414B2 (en) | Transgenic mouse having an amyloid precursor protein with a modified beta secretase cleavage site | |
| KR100699453B1 (ko) | 신경퇴행성 질환용 모델로서의 형질전환 동물 | |
| Buck et al. | Experimental models of tau aggregation | |
| JP2000504202A (ja) | 本来のアミロイド前駆体タンパク質欠失トランスジェニック動物 | |
| Wadsworth et al. | Transgenic mouse expressing APP 770 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150928 |