NO334611B1 - Transgent ikke-humant dyr med en nukleinsyresekvens som koder for presenilin 1 protein, celle eller cellelinje avledet fra dyret, mutert muse PS1- protein, nukleinsyre som koder for proteinet, vektor omfattende nukleinsyren, anvendelse av det transgene dyret for å påvise forbindelser til behandling av Alzheimers sykdom samt fremgangsmåte for å påvise forbindelsene - Google Patents

Abstract

Oppfinnelsen angår ikke-humane transgene dyr med alvorlige forstyrrelser beslektet med Alzheimers sykdom. Dyrene kan anvendes for å påvise forbindelser som kan behandle Alzheimers sykdom.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår transgene dyr som er modell for Alzheimers sykdom (AD). Oppfinnelsen angår også anvendelse av disse dyrene.

Alzheimers sykdom er en progressiv neurodegenerativ sykdom som påvirker en stor del av den eldre befolkning. Denne sykdom kjennetegnes med kliniske termer av hukommelsestap og nedgang i kognitive funksjoner og med neuropatalogiske termer, ved et uttalt tap av neuroner og tilstedeværelse i hjernen av intracellulære neurofibrilære avsetninger og av ekstracellulære avsetninger av p-amyloid peptid (A|3) som danner amyloide plakk.

Amyloid plakk er hovedsakelig oppbygd av ap peptidene inneholdende 40 eller 42 rester, som er dannet under den proteolytiske prosessen for Ap-peptid forløperen (APP). De ekstracellulære avsetningene av Ap er svært spesifikke på forstyrrelser beslektet med Alzheimers sykdom. De representerer de tidlige og konstante kjennetegn på alle former for Alzheimers sykdom, inkludert familiære former (FAD). De familiære former oppstår relativt tidlig (mellom 30 og 60 år gamle) og er forårsaket av mutasjoner i APP-genet i 5 av FAD-tilfellene, med åtte enkle eller doble missensemutasjoner identifisert, i presenilin 1 (PSl)-genet i 50 til 70% av FAD-tilfellene, med mer enn 100 ulike mutasjoner identifisert frem til dags dato, og i presenilin 2-genet i mer sjeldne FAD-tilfeller, med to missensmutasjoner beskrevet. Det er også vist at mutasjoner i disse tre genene induserer endringer i proteolysen av APP, hvilket fører til en overproduksjon av ap, spesielt av den lange formen ap42, og til en tidlig forekomst av de patologiske tilstandene og av symptomer som tilsvarer de for sporadiske former av Alzheimers sykdom.

Dyremodeller som har til hensikt å representere disse egenskaper ved patologien til Alzeimers sykdom er allerede beskrevet i litteraturen.

Det er for det første, transgene mus som bærer mutasjonene i APP-genet. De utvikler patologiske tilstander tilsvarende Alzheimers sykdom fra de er et år gamle. Følgelig utvikler PDAPP-mus, som overuttrykker humant APP og bærer mutasjonen V717F, av ap avsetninger i hjernen med alderen, men viser ingen tap av neuroner utover posisjoneringen av plakkene selv. (Irizarry et al., 1997, J. Neurose. 17 (18): 7053-7059). Dette betegnes heretter som "plakkeffekten".

Tilsvarende har Tg (HuAPP695. K670N-M67IL) 2576-musen som overuttrykker den humane isoformen APP K671L (AOOSw for svensk mutasjon, amyloid type avsetningen, men viser ingen tap av neuroner (Irizarry et al., 1997, J. Neuropathol Exp. Neurol 56: 695-973).

I en studie av Calhoun et al. (1998, Nature 395: 755-756) ble et neuronalt tap vist i visse områder i nærheten av de amyloide plakk, i APP23-transgene mus 14-18 måneder gamle som overuttrykker en mutert isoform av humant APP. Denne observasjon er kontroversiell siden tapet er lite og forekommer hos relativt gamle dyr og spesielt i nærheten av plakk, hvilket kan korrespondere med den tidligere observerte "plakkeffekten". I tillegg er det ikke nevnt, og heller ikke, i en fersk kommentar som understreker at denne dyremodell ikke har fullstendig overensstemmelse med alle de kjente egenskapene ved de patologiske tilstander av Alzheimers sykdom, blant annet tap av neuroner (Trojanowski, 2002, Am.J. Pathol. 160: 409-411).

Videre er transgene mus som bærer mutasjoner PSl-genet kjent. De synes ikke å utvikle noe patologisk tilstand av Alzheimers sykdomstype, men har en høy mengde av AJ342-peptidet (to gangers økning sammenliknet med villtype PSI) som er kjent å være svært patogent.

I den transgene dyremodell som er beskrevet og som bærer FAD-mutasjonene P264L eller M146L i muse PSl-genet ("knock in"), er i tillegg det muterte PSI-proteinet ikke stabilt uttrykt (Siman et al., 2000, J. Neurosci., 20: 8717-8726; Flood et al., 2002, Neurobiol. Aging 23: 335-348; Rozhmahel et al., 2002, 23: 187-194). Disse mus har også en høy mengde av ctP42-peptidet.

Søknad WO 02/0008407 beskriver slike transgene mus der genet som koder for presenilin er mutert med å introdusere en P264L-mutasjon.

På grunn av den rollen PSI-proteinet har ved dannelsen av A042, er også doble transgene mus som bærer mutasjoner i APP- og PSI-genene også blitt frembrakt. Som de enkle transgene mus beskrevet ovenfor, har disse mus Ap-avsetningen, men har ingen neuronae tap /Takeuchi et al., 2000, Am.J.Pathol. 157: 331-339).

Følgelig er de eksisterende dyremodeller for Alzheimers sykdom ikke tilfredsstillende siden de ikke reproduserer et neuronalt tap som er et hovedkjennetegn på neurodegenerative sykdommer, inkludert Alzheimers sykdom.

Søker har derfor bestrebet seg på å fremstille dyr som viser hovedkjennetegnene på Alzheimers sykdom, inkludert neuronalt tap.

Det er vist at det er mulig å oppnå slike dyr ved å introdusere spesifikke mutasjoner inn i genet som koder for PSI-proteinet hos mus, og ved å krysse dem med mus som overuttrykker det humane APP-genet.

Foreliggende oppfinnelse omfatter ikke-humant dyr, kjennetegnet ved at det har en nukleinsyresekvens som koder for et presenilin 1 protein som i homozygot tilstand bærer mutasjonene som tilsvarer mutasjonene M233T og L235P på mus PSI-proteinet.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse celle eller cellelinje avledet fra et dyr ifølge et hvilket som helst kravene 1 til 14.

Omfattet av foreliggende oppfinnelse er også embryonal stamcelle, kjennetegnet ved at den er avledet fra et dyr ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 14.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre muse PSI-protein som bærer aminosyremutasjonene M til T og L til P, henholdsvis ved posisjonene 233 og 235.

Nukleinsyre som koder for muse PSI-proteinet som bærer aminosyremutasj onene M til T og L til P, henholdsvis ved posisjonene 233 og 235, er også omfattet av foreliggende oppfinnelse.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse vektor omfattende en nukleinsyre ifølge krav 21.

Omfattet av oppfinnelsen er også anvendelse av et dyr ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 14, for å påvise forbindelser tilsiktet å behandle Alzheimers sykdom. Foreliggende oppfinnelse omfatter også fremgangsmåte for å påvise forbindelser tilsiktet behandling av neurodegenerative sykdommer, kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn: administrering av testforbindelsen eller en blanding av testforbindelser til et dyr

ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 14,

- observering av utviklingen av en eller flere karakteristiske markører, som gjengir neuropatologien observert hos mennesker.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også anvendelse av et protein ifølge krav 18 og 19, for påvisning av forbindelser tilsiktet behandling av Alzheimers sykdom.

Et første aspekt ifølge oppfinnelsen angår derfor et ikke-humant dyr som viser, med fordel i sitt genom, minst en nukleinsyresekvens som koder for prensenilin 1 og som bærer de to mutasjonene som tilsvarer mutasjonene M233T og L235P på muse PS1-proteinet.

Fortrinnsvis er PSl-proteinet som bærer mutasjonene M233T og L235P av museopprinnelse.

Særlig foretrukket er det muterte presenilin 1-proteinet endogent.

Derfor produserer et dyr ifølge foreliggende oppfinnelse fortrinnsvis et protein omfattende sekvensen SEQ ID nr. 2. Det er foretrukket at det produseres et protein med sekvensen SEQ ID nr. 3. Fortrinnsvis omfatter det i sitt genom nukleinsyresekvensen SEQ ID nr. 1 eller SEQ ID nr. 8.

Sekvensene SEQ ID nr. 1, SEQ ID nr. 2 og SEQ ID nr. 8 er et resultat henholdsvis av mutasjon produsert i villtypesekvensene SEQ ID nr. 4, SEQ ID nr. 5 og SEQ ID nr. 9. Sekvensen SEQ ID nr. 5 er den av restene 229 til 237 av muse villtype presenilin 1-proteinet. Sekvensen SEQ ID nr. 9 er den fra villtype exon 7 av musegenet som kode for presenilin 1-proteinet, dvs. umutert.

Fortrinnsvis koouttrykker et dyr ifølge foreliggende oppfinnelse APP, fortrinnsvis humant APP. Et slikt kan omfatte en eller flere FAD-mutasjoner. Følgelig kan mutasjonene i APP-genet være en av de ulike mutasjoner beskrevet frem til nå i litteraturen. Mutasjonene i APP-genet kan være valgt fra "Swedish" (S), "London" (L) og "Dutch" (D) mutasjoner, alene eller i kombinasjon.

Disse mutasjoner er vel beskrevet i litteraturen og kjennetegnes generelt ved de følgende modifiseringer:

Også inkludert i London-mutasjonen er alle substitusjoner annet enn med isoleucin som er lokalisert ved posisjon 717 i APP770, slik som feks. mutasjonene V717GogV717

F.

Det er forstått at APP som kan anvendes innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse kan foreligge i ulike isoformer, og i særdeleshet i formene 695,751 og 770 eller i en trunkert form, slik som feks. isoforen APP99, der den svenske-mutasjonen er utelatt.

Fortrinnsvis omfatter også dyret ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis i sitt genom, en nukleinsyresekvens som kode for hele eller deler av genet som kode for APP751. Fortrinnsvis er APP 751-proteinet av human opprinnelse. Det viser fortrinnsvis mutasjonene K670N og M671L (svensk) og V717I (London).

Innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse plasseres fortrinnsvis APP-genet under kontroll av sekvensene som muliggjør streng ekspresjon av disse neuroner, og i særdeleshet av transkripsjons-fremmende sekvenser slik som en eksogen promoter. Som promotersekvenser kan det spesielt nevnes HMG-promoteren (Gautier et al. (1989), Nucleic Avids Res 17: 20, 8589) og også PDGF-promoteren (Sasahara et al. (1991), Cell 64, 217-27, Thy-l-promoteren (Luthi et al. (1997), J. Neurosci 17, 4688-99) og Prion-gen-promoteren (Scott et al. (1992), Protein Sei 1, 986-97).

Det er beskrevet dyremodell omfattende APP-genet med S, D og/eller L-mutasjoner, under kontroll av Thyl-promoteren.

Et dyr kan derfor produsere fortrinnsvis et protein omfattende sekvensen SEQ ID nr. 7. Det kan ha nukleinsyresekvensen SEQ ID nr. 6.

Fortrinnsvis er det en transgen mus avledet fra kryssing mellom en transgen mus ThyAPP (TG53) som bærer en nukleinsyresekvens som koder for det humane protein APP 751 SL og en transgen mus som bærer en nukleinsyresekvens som koder for mus PSI-proteinet som bærer mutasjonen M233T og L235P.

Dyrene ifølge oppfinnelsen har for første gang en av de mest viktige kjennetegn for neurodegenerative sykdommer, hvilket er tidlig tap av neuroner.

De viser videre de andre karakteristiske kjennetegn som vanligvis beskrives for disse patologiske tilstander. Dyrene har akselerert avsetning av amyloide plakk, tydelig synlig fra 2 måneders alder og utpregede fra 6 måneders alder.

De har også et forhold med ctP42 formen og totalt Ap, AP42/AP, som e r større omtrent 0,9, fra 2'/2 måneders alder. Et slikt forhold er svært høyt sammenliknet med det beskrevet i litteraturen for andre transgene mus.

Det neuronale tapet, som allerede er tydelig ved 6-månedersalderen, er meget uttalt ved 10 måneders alder.

PKR (dobbelttrådet RNA-avhengig protein kinase) er en stressaktivert kinase som fosforyler eIF2, involvert i apotose.

PKR påvises i hippocampus (strukturen der det neuronale tapet finner sted) på 10 måneders gamle APPxPSlKl-mus ifølge oppfinnelsen. Det er ikke påvist i hippocampus hos 12 måneders gamle APPxPS1M1M146L transgene mus der ikke noe neuronal tap observeres.

De nye egenskapene ved dyrene ifølge oppfinnelsen gjør disse til studiemodeller som er mer fullstendige og representative for forstyrrelsene observert hos pasienter som lider av Alzheimers sykdom enn de dyremodeller som tidligere er beskrevet. Disse dyrene er derfor godt egnet for å vise nervebeskyttende egenskaper til forbindelser tilsiktet behandling av neurogenerative sykdommer, fortrinnsvis Alzheimers sykdom.

Fortrinnsvis har dyrene ifølge oppfinnelsen de mutante alleler av psi i homozygous tilstand og de av APP i heterosygous tilstand. De samme egenskapene til nevnte dyr kan imidlertid beskrives hos et dyr med en eller to muterte psi-alleler i heteroszygous tilstand og de av APP i heterozygous tilstand, imidlertid med en fenotype som er mindre markert eller som opptrer senere.

En annen fordel med dyrene ifølge oppfinnelsen er at mengden mutert PSI-protein uttrykkt av disse transgene mus er ekvivalent med mengden endogen PSI-protein som normalt uttrykkes av en normal (ikke-transgen) mus, som uttrykker et ikke-mutert PSI. Denne egenskap gjør det til en foretrukken studiemodell - uten overekspresjon av OSI-proteinet, for å vise virkning av forbindelser tilsiktet behandling av neurodegenerative sykdommer.

Disse forbindelser kan i seg selv være forbindelser som har en effekt på regulering av PSl-genet på transkripsjonsnivå, post-transskripsjonsnivå, translasjonsnivå eller post-translasjonsnivå, eller på PSl-proteinet selv ved å modifisere eller regulere en eller flere av dens egenskaper, eller som har en tilsvarende virkning på de interagerende partnere eller mål for PSl-proteinet, eller forbindelser som har en effekt på regulering av APP og, i bredere forstand, et hvilket som helst molekyl nedstrøms for signalene initiert av OSI og APP under den neurodegenerative prosess.

Innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse er dyrene fortrinnsvis pattedyr, slik som gnagere. I særdeleshet er de mus, rotte eller kanin.

Musene og konstruksjonene for å oppnå disse er frembrakt ved fremgangsmåte kjent for fagpersoner innen teknikken.

De kan oppnås ifølge konvensjonelle transgene teknikker. For å illustrere en av fremgangsmåtene for transgenene, skal det nevnes en fremgangsmåte for elektroporering av en genkonstruksjon inneholdende de modifiserte gener inn i muse- embronale stamceller, og etter seleksjon, overføring av cellene som bærer den ønskede genetiske hendelse inn i en mottaker blastocyste, slik det beskrives i eksemplene., I denne sammenheng oppnås de mutede PSI-dyrene ifølge oppfinnelsen ved elektroporering av en ekspresjonskassett omfattende en nukleinsyre. Fortrinnsvis er denne nukleinsyren et DNA som kan være et genomisk DNA (gDNA) eller et komplementært DnA (cDNA).

Modifiseringen av genomet kan være resultat av en endring eller en modifisering av en eller flere gener ved "knock-in". Denne modifisering kan være forårsaket av effekten av konvensjonell endring eller mutagene stoffer eller for øvrig utført ved sete-dirigert mutagenese. Ifølge foreliggende oppfinnelse, hva angår det muterte psi-gen, involverer dette fortrinnsvis en homolog rekombinasjon med en målvektor som bærer det på forhånd muterte transgene ved sete-dirigert mutagenese som beskrevet i eksemplene som følger.

Dyrene som uttrykker det muterte APP-protein oppnås ved mikroinjeksjon av en genkonstruksjon inn i en kjerne av en zygote.

Det doble transgene dyret oppnås ved å krysse muterte psi-dyr og muterte APP-dyr.

Dyrene ifølge foreliggende oppfinnelse kan med fordel anvendes for å demonstrere neurobeskyttende egenskaper av forbindelser tilsiktet for behandling av neurodegenerative sykdommer, og fortrinnsvis Alzheimers sykdom. Disse forbindelsene kan være kjemiske molekyler, peptider eller proteinmolekyler, antistoffer, kimære molekyler og også antisens RNA eller ribozymer. De demonstrerte forbindelsene kan anvendes som medisinske produkter, som de er eller i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bindemiddel for å oppnå en farmasøytisk sammensetning. De kan i særdeleshet være isotone, sterile saltløsninger (mononatrium eller dinatriumfosfat, natrium, kalium, kalsium eller magnesium klorid etc. eller blandinger av slike salter), eller tørre, i særdeles lyofiliserte, sammensetninger som, ved tilsetning der det er hensiktsmessig, av sterilt vann eller av fysiologisk saltvann gjør det mulig å danne injeserbare løsninger. Injeksjonene kan gis stereotaktisk, topisk, oralt, parenteralt, intranasalt, intravenøst, intramuskulært, subkutant, intraokulært, transdermalt etc.

En annen hensikt ifølge oppfinnelsen angår derfor en fremgangsmåte for administrering av testforbindelsen eller blanding av testforbindelser til dyr ifølge oppfinnelsen, og observere utvikling av en eller flere, som gjengir neuropatologien observert hos menneske.

En annen hensikt ifølge oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for å evaluere forbindelse til siktet behandling av neurodegenerative sykdommer, omfattende minst de følgende trinn: Bringe celler ekstrahert fra dyr ifølge oppfinnelsen i kontakt med en forbindelse eller blanding av forbindelser, og

måle effektene av forbindelsene på hele celler, i cellehomogenater eller på en subcelluær fraksjon.

En annen hensikt ifølge oppfinnelsen angår et hvilket som helst biologisk produkt avledet fra en av de to dyrene ifølge oppfinnelsen, og også deres anvendelse for å evaluere forbindelser tilsiktet behandling av neurodegenerative sykdommer, fortrinnsvis Alzheimers sykdom. Betegnelsen "biologisk produkt" betyr i særdeleshet celler, proteinekstrakter, DNA, RNA eller også antistoffer.

Et aspekt ifølge oppfinnelsen er derfor celler eller cellelinjer avledet fra et dyr beskrevet ovenfor, i særdeleshet embryonale stamceller.

En hensikt ifølge oppfinnelsen er også et muse-PSl-protein som bærer aminosyremutasj onen M til T, og L til P, henholdsvis posisjonene 233 og 235. Fortrinnsvis omfatter et slikt protein sekvensen SEQ ID nr. 2. Fortrinnsvis har den SEQ ID nr. 3.

En annen hensikt ifølge oppfinnelsen er en nukleinsyre som koder for muse PSI-protein som bærer aminosyremutasj onene M til T, og L til P, henholdsvis posisjonene 233 og 235.

Fortrinnsvis omfatter en slik nukleinsyre ifølge oppfinnelsen sekvensen SEQ ID nr. 1 eller sekvensen SEQ ID nr. 8.

En hensikt ifølge oppfinnelsen er også sekvensene komplementær med disse nukleinsyrene og vektorer omfattende disse nukleinsyrene eller sekvensene komplementære med disse.

Et annet aspekt ifølge oppfinnelsen angår anvendelse av disse proteiner for å evaluere de neurobeskyttende egenskaper og forbindelser tilsiktet behandling av neurdegenerative sykdommer.

Foreliggende oppfinnelse illustreres ved de følgende eksempler, uten at dette skal være begrensende til kun disse eksemplene.

I disse eksemplene viser de beskrevne resultatene fordelen ved PSI Kl-mus og støtter lydelig den foretrukne anvendelse av PSIKlxAPP-modellen ved terapeutiske strategier siden den har den fordel at den representerer hovedkjennetegnene for neurodegenertative sykdommer kjent fram til denne dato.

Figurer

Figur 1 A: Skjematisk fremstilling av strukturen til det murine psi-genet og hovedrestriksjonssetene rundt villtype exon 7 (øvre linje) og målvektoren anvendt (midtre linje). Nuklutid baseendringene som genererer codonoperasjonene M233T og L235P, mutasjonene i exon 8 (<*>), er representert i de striplede rammene. Det muterte allelet PSI Kl inneholdende neomycin (neo)-restistens kassetten er representert i den nedre linjen. Posisjonen til 230 bp proben anvendt for å identifisere de nyfødte er også antydet. Figur 1 B: Southern blot som anvender 230 bp proben til å skille villtype WT-allelene (bånd ved 9,2 kb) og den heterozygoute PSI Kl (He, dobbeltbånd) og homosygoute PSI Kl (Ho bånd ved 7,4 kb)-allelene hos ulike mus. Figur 1 C: Immunblot av det C-terminale fragmentet av PSI som viser at nivåene for ekspresjon av PSl-proteinet ikke er endret ved tilstedeværelse av mutasjonene ei PSIKI-allelet. Figur 2 A, 2 B og 2 C: Kvantifisering av henholdsvis totalt Ap, Ap42 og av total Ap/Ap42-forholdet, ved 2,5, 4, 6 og 10 måneders alder. Figur 3: Akselerering av prosessen for deponering av AJ3-peptider hos APP751SLxPSlKI-Ho-mus. Figuren viser den regionale distribusjon av de ekstracellulære avsetningene av A|3-peptid i hjernen ved 6 måneder. Bildene viser A|3-immunmerking (Ab 4G8) hos 3 APP751SL-mus (fig. 3A, 3B og 3C) og 3 APP751SLxPSlKI-Ho-mus (fig. 3D, 3E og 3F). Immunmerkingen viser forekomst ved 6 måneder av de første avsetningene, som fortsatt er sjeldne, i cortex (Cx) og i hippocampus (Hp) hos APP751SL-mus. Til sammenlikning, hos APP751SLxOslKI-Ho-mus ved samme alder er antall avsetninger kraftig øket i disse regionene. Det skal bemerkes at, hos disse mus. Er avsetningene allerede til stede i tydelige mengder i thalamus (T). Figur 4: Utvikling med alder av prosessen for avsetning av AJ3-peptidene. Figuren illustrerer den regionale distribusjon av AJ3-avsetninger i hjernen ved 10 måneders alder. Bildene tilsvarer 2 APP751SL-mus (fig. 4A og 4B) og 2 APP751SLxPSlKI-Ho-mus (figur 4C og 4D). Hos APP751SL-musene, viser immunmerkingen en betydelig økning i antall og størrelse av avsetningene i cortex (Cx) og hippocampus (Hp) ved 10 måneders alder, sammenliknet med 6 måneders alder, og forekomsten av de første avsetningene i thalamus (se fig. 3). Tettheten og størrelsen på avsetningene er også større ved 10 måneders alder i cortex, hippocampus og thalamus hos APP751SSSLxPSlKI-Ho-mus. Det skal bemerkes at, hos disse musene, kan et mindre antall avsetninger påvises i striatum (St). Figur 5: Prosess for neuronal død i CA1 hos APP751SSLxPSlKI-Ho-mus. Figuren viser affiserte pyramidale neuroner i hippocampus hos 10 måneders gamle APP751SLxPSlKIHo-mus. Bildene viser kresylfiolettfarging, ved lav forstørrelse, i hippocampus hos 2 PSlKI-Ho-mus (fig. 5A og 5B), 2 APP751SL-mus (fig. 5C og 5D) og 2 APP751SLxPSlKI-Ho-mus (fig. 5E og 5F). Tettheten og tykkelsen på de pyrmidale cellelagene i hippocampus er kvalitativt sammenliknbare hos 10 måneders gamle APP751SL-mus og PSlKI-Ho-mus. På den annen side ved samme alder, er de tydelig redusert hos APP751SLxPSlKI-Ho-mus, i særdeleshet i lag 1 av Ammons horn (CA1). Det bør bemerkes at antallet av små celler som farget blått (glialtypeceller) synes å være økt i hippocampus hos APP751SLxPSlKI-Ho-mus. Figur 6: Prosess for neuronal død i CA1 hos APP751SLxPSlKI-Ho-mus. Figuren viser affiserte neuroner i CA1 ved 10 måneders alder ved anvendelse av andre neuronale markører, med tyllgrønt og BIP-immunmerking. Bildene representerer metylgrønnfarging, ved høy forstørrelse i CA1, i en ikke-transgen mus (fig. 6A), i en PKSlKI-Ho-mus (fig. 6B), i en APP751SL-mmus (fig. 6C), og en APP751SLxPSlKI-Ho-mus (fig. 6D). De representerer BIP-immunmerking ved høy forstørrelse i CA1, hos en PSlKI-Ho-mus (fig. 6E) og en APP751SLxPSlKI-Ho-mus (fig. 6F). Sammenliknet med de ikke-transgene, PSIKI-Ho og APP751SL-mus, er antall neuronale celler som farges med metylgrønt lydelig redusert i CA 1-regionen hos APP751SLxPSlKI-Ho-mus. Påvisning av et betydelig antall fargede glialtypecelle i det hippocampale parenkym hos denne doble transgene mus bør bemerkes. BIP-immunmerkingen bekrefter også det betydelige tap av pyramidale neuroner i CA1 ved 10 måneders alder hos APP751 SLxPS lKI-Ho-mus. Figur 7: Neuronal død hos CA1 og intracellulær avsetning av aP-peptid. Figuren illustrerer de to patologiske prosesser, affiserte neuroner og abnormal intracerebral akkumulering av aP-peptid ved 10 måneders alder. Bildene viser, ved høy forstørrelse i CA1, ap-immunfarging i 2 A00751-mus (fig. 7A og 7B) og 2 APP751SLxPSlKI-Ho-mus (figur 7E og 7 F). De representerer, ved høy forstørrelse i CA1, crsylfiolettfarging hos APP751-mus (fig. 7C og 7D), APP751SLxPSlKI-Ho-mus (fig. 7G og 7H) og 2 PSlKI-Ho-mus (fig. 71 og 7J). Ved 10 måneders alder, både hos enkle APP751SL-mus og hos doble APP751SLxPSlKI-HO-mus, observeres de ekstracellulære avsetningene av ap hovedsakelig på begge sider av neuronlagene i CAL På den annen side, i CA1 (kjennetegnet ved en uttalt effekt på neuroner langs laget i APP751 SLxPSlKI-Ho-mus, fig. 7C og 7D), fremkommer aP-immunmarkeringen med en granulær fremtoning (tilsvarende det abnormale intraneuronale akkumulering av ap-peptidet, se pilene) mer intens hos APP751SLxPSlKI-Ho-mus. Dette er også tilfellet ved 6 måneders alder (se fig. 8). Figur 8: Tidlig start på prosessen av neuronal død i CA1 hos APP751SLxxPSlKI-Ho-mus. Figuren viser CA1-regionen av hippocampus ved 6 måneders alder. Bildene viser, ved høy forstørrelse i CA1, aP-immunmerking i 3 APP751-mus (8Am 8B og 8C) og 3 APP751SLxPSlKIK-Ho-mus (fig. 8G, (H og 81). De representerer cresylfiolettfargingen i APP751-mus (fig. 8D, 8E og 8F) og APP751SLxPSlKI-Ho-mus (8J, 8K og 8L). Ved 6 måneders alderen, kjennetegnes CA1-regionen i hippocampus hos en APP751SLxPSlKI-Ho-mus, ved et allerede betydelig antall ekstracellulære avsetninger av ap (fig. 81), en intens intracellulær granulær merking av ap (se pilene) log et tap av neuroner farget med cresylfiolett assosiert med en økning i antall

gliatypeceller (fig 8L). For de andre to APP751SLxPSlKI-Ho-mus, synes av laget av CA 1-neuroner med crysilfiolett å nesten ikke være disorganisert (fig. 8J) eller ikke i det hele tatt. (fig. 8K). Det bør bemerkes at, for disse to mus, synes den intracellulære ct|3-immunmerkingen mindre intens og mer diffus (fig. 8G og 8H) enn hos den tredje musen (fig. 81).

Eksempler

Eksempel 1: Konstruksjon av målvektoren som bærer mutasjonene M233T og L235P.

Hensikten var å introdusere to mutasjoner inn i exon 7 i muse PSl-genet, hvilket fører til endringer i resten M233 til T og resten 235 til P. De to nye kodon tilsvarer mutasjonene identifisert ved tidlig start hos Alzheimers pasienter (FAD).

En linje av PSl-knock-in (PSlKI)-mus ble dannet ved anvendelse av en 2-trinns mutagenesstrategi tilsvarende den beskrevet av Kwok et all. (1997 Neuroreport 8; 157-542) og Champion et al. (1996, Neuroreport 7, 1582-4).

Strategien hadde til hensikt å konstruere en målvektor som bærer nukleinsyreendringene i codon 233 og 235 i muse PSl-genet (se fig. IA).

I korthet ble et 17 kb genomfragment fra mus PSl-genet isolert ved å screene et 129SvJ-musegenomisk DNA-bibliotek konstruert i en lambda-bakteriofag (Stratagene, catalouge # 946313). Analyse av spaltingen med restriksjonsenzymene, sekvensering og sammenlikning med den tilgjengelige partielle sekvensen fra det murine PSl-genet (Mitsuda et al. 1997, JBC 272, 23489-97) indikerte at dette fragmentet inneholdt regionen intron 5 til exon 11 av muse PSl-genet. Et 9,8 Kb BamHI-Hindlll-subfragment inneholdende en del av intron 5, exon 6, intron 6, exon 7 og en del av intron 7 ble subklonet inn i plasmid pGEM-1 lZf (+) (Promega, France) (fig. IA). Mutagenesen av de to codon ble utført ved anvendelse av Gene Editor kit (Promega) på DNA-fragmentet inneholdende exon 7 og ble bekreftet ved nukleotidsekfrensering.

Den lange (5') armen til den homologe rekombinasjonsvektoren ble oppnådd ved kloning av 7 Kb BamHI-Xbal-fragmentet inneholdende exon 6. Den korte (3') armen ble selv dannet ved subkloning av 1,8 Kb Xbail-EcoPJ-fragmentet inneholdende exon 7 som ble utsatt for mutagenese. En positiv seleksjonskassett (pMCI-Neo-kassett) ble introdusert inn i Xbal-setet lokalisert i intron 6 ved posisjon -470 bp, posisjonert 5' for exon 7 (se fig. IA).

Eksempel 2: Produksjon av ES-celler omfattende PSI Kl

Målvektoren, beskrevet i eksempel 1, ble linearisert ved spalting med Noti og elektroporert inn i den embryonale stamcellelinjen (ES) XK35 skaffet av dr. Charles Babinet, Pasteur Institute, Paris, Frankrike.

Cellene ble dyrket som tidligere beskrevet (W. Wurtz og A. Joyner, Gene Targeting; A Practical Approach av Alexandra L. Joyner (redaktør). Oxford University Press; 2.utgave (15. februar 2000)). 430 cellulære kloner som bærer den homoløoge rekombinasjon le utvalgt i nærvære av G418. Genomisk DNA fra disse klonene ble analysert ved Southern blot som beskrevet tidligere (Sambrook, Fritsch og Maaniatis, Molecular Cloning; A Laboratory Press, 2.utgave, 1989) ved anvendelse av en PSI-proble lokalisert på utsiden av det langarmede rekombinasjonsdomene (fig. IA). Fire cellulære kloner som bar de ønskede mutasjonene i PSl-genet kunne følgelig identifiseres. Disse cellulære kloner ble anvendt for å etablere en PSlKI-transgen muselinje.

Eksempel 3: Konstruksjon av PSlKI-muselinjen

Klonen 18C5 ble injisert inn i blastocyster av C57Bl/6-mus.

Fem av de oppnådde kimære musene viste overføring av PSI mutante allelen til kimlinjen (og derfor til deres etterkommere).

Fra disse grunnleggere ble PSlKI-muselinjen etablert på en ren 129SV-genetisk bakgrunn og på en blandet 129SV-C57Bl/6-bakgrunn.

Tilstedeværelsen av det muterte PSIKI-allele i hetrozygousen (He) eller homozygous (Ho) tilstand ble bestemt ved Southern blot med den 230 pb psl-proben. (fig. IB). Den mutante musen var levedyktig og fertil.

Eksempel 4: Analysering av PSI i PS1KI-linjen

Etter eutanasi, ble hjernen til musen fjernet og veiet. En hemisfære ble konservert for immunhistokjemi (etter fiksering) og den andre ble frosset og deretter homogenisert individuelt på is ved anvendelse av en potter-homogenisator, i 2 ml av en bufferløsning;

0,32 M sukrose, 4mM trish-HCl, pH 7,4, inneholdende en blanding av protease inhibitorer(Complete™, Roche Diagnostics). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved BCA-metoden (Pierce). Homogenisatet ble konservert ved -80°C.

For påvisning av PSI, ble 25 fig hjerneproteinekstrakt inkubert ved 56°C i 20 min. i Laemmli-påsettingsbuffer inneholdende 8M urea og 50 mM ditioreitol. Proteinene ble fraksjonert ved NuPage 4-12% Bis-Tris polyakrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) i MES (2-(N-morfolin)etansulfonsyre) buffer. Etter overføring av proteinene til et nitrocellulosefilter (Amersham, Frankrike) ble filteret oppvarmet i PBS i 5 min. for å øke sensitiviteten, og umiddelbart mettet med 5% (vekt/volum) av skummetmelkpulver i PBST (0,05% PBS volum/volum) Tween 20) buffer i 1 time og inkubert over natten ved 4°C med primære antistoff i PBST-buffer alene. Binding av antistoffet ble påvist med et anti-IgG (antimus)-antistoff konjugert med pepperrot peroksidase (Amersham, Frankrike) en fortynning på 1/10 000 i PBST, etterfulgt av et system for påvisning av kjemiluminescens (Amersham, Frankrike) i henhold til produsentens retningslinjer. For deteksjon av PSI, ble det primære antistoff MAB 1563 (Chemicon, USA) anvendt med en 1/10 000 fortynning. For den semikvantitative analyse, ble lumeniscenssignalene digitalisert med et GeneGnome 16-bit CCD-kamera (Syngene, Cambridge, England) og analysert med genverktøys programvare (Syngene). Lineariteten til signalet ble verifisert ved hjelp av standardkurver etablert med prøvene på 2,5 til 10 ug homogenat per felt.

Denne immunblotanalysen gjorde det mulig å bestemme at ekspresjonsnivåene til det C-terminale fragmentet av mutert PSI forble normalt og var ikke øket hos PKI233&235-mus (fig. 1C).

Eksempel 5: Fremstilling av PSIKIxAPP-linjen ved å krysse PS1KI- og APP-linjene

PSlKI-mus (beskrevet i eksempel 1 til 4) ble krysset med en linje av transgene mus som overuttrykte den humane formen av APP75icDNA som bærer den svenske (mutasjon K670N; M671L) og London (V717I), FAD-mutasjonene, under kontroll av Thy-1-promoteren. Musene som overuttrykker den humane form av APP751-CDNA som bærer mutasjonene ble oppnådd som beskrevet i patentsøknad WP 01/20977.

I alle de følgende eksperimenter ble mus som hadde den samme genetiske bakgrunn anvendt for å minske en bæreeffekt som skyldes variasjon i genetisk bakgrunn.

Eksempel 6: Analysering av det totale Ap og A(342-amyloidpeptid ved immunelektrokj emiluniscense metoden

For å kvantifisere det totale lager av Ap i hjernen (løselige former og aggregerte eller uløselige former), ble alikvoter av hjernehomogenat behandlet med 2 volumer av en 9M-løsning av guanidin hydroklorid (GH) i 50 mM Tris, pH 7,4. Homogenatene ble blandet i 1 time, med 3 perioder av ultralydbehandling i 15 min., etterfulgt av sentrifugering med 50 000 g ved 4°C i 2 timer. Guanidinekstraktene ble fortynnet til 1/20 i 20 mM Tris-HCl-buffer, pH 7,6, inneholdende 150 nM NaCl, 0,5% BSA (vekt/volum) og 0,05% Tween 20 (vekt/volum). Konsentrasjonen av ctP-peptidet i fraksjonene ble deretter bestemt ved immunelektrokjemilumeniscense. Yang et al., 1984, Biotechnology (NY) 12(2), 193-194, ved anvendelse av 2 anti-ctp-peptid musemonoklonale antistoffer (4G8 og 6E19) og "origen M8 Arialyzer reader" (IGJEN Europe Inc. Oxford) i henhold til en protokoll modifisert etter Khorkova et al. (J. Neurosci. Methods 82,159-166 (1998)).

Det monoklonale antistoff 4G8 (Senetek PLC), som gjenkjenner epitopen av restene 17-24 av aP-peptidet, rutenyleres ved hjelp av TAG-NHS-eser ifølge produsentens retningslinjer (IGJEN Europe Inc., Oxford). Ru-4G og det biotinylerte antistoff 6E10, epitop 1-10 av ap-peptidet (Senetek PLC), bringes i kontakt med den løselige fraksjonen av hjernen og Ru-4G8/ap/6E10-biot tredelte kompleks og kvantifiseres ved hjelp av origenavleseren. Et område av det syntetiske peptidet ap (Bachem) anvendes for å kalibrerer hvert eksperiment. Mengden av aP-peptid beregnes i nanogram per g initial vekt av hjernevev.

For å spesifikt måle formene av Ap-peptid som ender ved posisjon 42 (Ap42) ble antistoffet 6E10 erstattet med det monoklonale antistoffet 22F9, som spesifikt binder til Ap42 sin C-terminale ende (Wirths et al., 2002, Brain Pathol. 12, 275-286).

Som konklusjon fører tilstedeværelse av psl-knock-in (PSl-KI)-genet til:

En akselerering i akkumulering av Ap (fig. 2A) og Ap42 (fig. 2B) i hjernen, med en mer uttalt effekt når PSIKI-allelet er til stede i homozygous tilstand (gen-doseeffekt). Effekten av PSlKI(Ho) er mer fremhevet enn med den transgene mus som overuttrykker PS1M146L tidligere beskrevet i søknad WO 01/20977.

En massiv økning i andelen av aP-peptid som viser en p42-ende, hvilket representerer hovedandelen av Ap når PSIKI-mutasjonen er i homozygous tilstand, som vist i figur 2C. (Ap42/totalt Ap forhold lik 0,92 ved 2 lA måneders alder, versus 0,25 i fravær av PSI Kl og en mellomliggende verdi 0,70 ved tilstedeværelse av kun et PSIKI-allell: gen-doseeffekt) Det er kjent fra litteraturen at typer Ap-peptid som avsluttes ved P42-enden representerer de mest patologiske formene av peptider. PSIKIxAPP-linjen representerer derfor en modell som er særlig anriket på patologiske former.

Eksempel 7: Analyser av Ap-peptidavsetninger ved immunhistokjemi

For de immunhistokjemiske/histologiske eksperimentene ble de halve hjernene, etter at de var fjernet og fiksert i 4% paraformalhyd, frysetørket over natten ved 4°C i en 0,2 M natriumfosfatbuffer (NaH2P04.2H20/Na2HP04.12H20, pH 7,4) inneholdende 20%

(P/V) sukrose. De fryses deretter i 1 min. i isopentan holdt ved en temperatur på -30°C i tørris. 35 um tykke snitt, kuttet med en kryostat med temperatur -30°C (LEICA CM3000), og til slutt plassert i en 0,02 M PBS buffer og deretter konservert ved 4°C.

Immunenzymatisk påvisning av Ap-peptid ble utført på disse snittene ved hjelp av påvisningssystem som involverer dannelse av avidin-biotin-peroksidasekomplelser (ABC) der pepperrot peroksidase koblet til avidin biotynileres. I korthet, etter inkubering i 30 min. i blokkeringsbuffer (normalt geiteserum (Chemicon) ved 10% PBS inneholdende 0,1% tri ton (Sigma)), ble hjernesnittene brakt i kontakt med en 0,03% H2O2løsning for å eliminere endoperoksidasene tilstede i vevet. Disse snittene ble deretter inkubert i den primære antistoffløsningen inneholdende 0,3% triton og 2% normalt serum (over natten ved 4°C). Det anti-Ap primære antistoff (4G8, Senetek)

(monoklonalt antistoff rettet mot restene 17-24 av Ap-peptidet) som anvendes biotyneleres. Etter skylling ble snittene derfor brakt direkte i kontakt med ABC-komplekset i 1 timer i samsvar med produsentens instruksjoner (Vectastin AABC Kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA). 3,3' diaminobenzidin ble anvendt som kromogen for peroksidasesystemet.

Følgelig der ble akselerering av den unormale akkumulering av Ap-peptidet i hjernen hos APP751 SLxPSlKI Ho-dobbelt transgene mus, tidligere påvist ved biokjemiske analyser på homogenater av halve hjernen, bekreftet ved immunhistokjemi. I særdeleshet viste mikroskopisk analyse av AP-immunmerking oppnådd på et halvhjernesnitt tilstedeværelse av en akselerert prosess for avsetning av Ap-pepsidet i hjerneparenchym hos disse mus. Faktisk, mens de første avsetninger til syne i cortex og hippocampus rundt 6 måneders alderen hos APP751SL-mus (fig. 3), kan de påvises fra 2 måneders alder hos APP751SLxPSlKI dobbelt transgene mus i homozygous tilstand. Sammenliknet med de APP751S1 enkle transgene mus er tettheten av Ap-avsetninger tydeligere og større i hippocampus og i cortex hos 6 måneder gamle doble transgene (APP751SLxPAlKI Ho). I tillegg er avsetningene mer spredt fordelt, i særdeleshet er avsetningene allerede påvisbare i thalamus og også i pons (fig. 3).

Med alderen, spesielt hos 10 måneders gamle mus er tettheten og også størrelsen på avsetningene øket i hjernen hos APP751SL enkle transgene mus (fig. 4). Fordelingen av disse avsetningene er også bredere siden de er til stede i thalamus. Hos 10 måneder gamle APP751SLxPSlKI-Ho doble transgene mus, observeres en tilsvarende progresjon av prosessen med avsetning av Ap-peptid i hippocampus, cortex, thalamus og pons. De første avsetningene kan påvises i et begrenset antall i striatum (fig. 4). På den annen side forblir cerebellum spart for prosessen Ap-avsetning. Det bør bemerkes at, i hjernen hos 10 gamle PSlKI-Ho-mus (n = 4) ble ingen avsetninger av Ap-peptid påvist.

Eksempel 8: Analyse av neuronalt tap ved histologi og immunhistokjemi Tilstedeværelsen av en svært høy andel av patologisk Ap42-peptid førte til en analyse av om, i APP751SLxPSlKI-Ho-linjen, i tillegg til akselerering av avsetningsprosessen for Ap-peptidet, om det ble utviklet et neuronalt tap med økende alder. For dette ble 3 typer farging som gjør det mulig å visualisere at neuronale celler i hjernevevsnitt blir borte utført: a) histologi med cresylfiolett, som farger nissl bodies (cystoplasmisk organeller assosiert med ribosomer i det røde endoplasmatiske reticulum) og gjør det mulig å vise på hjernesnitt alle neuronale celler og glialceller; b) histologi med metylgrønt, som farger DNA i alle celler; c) immunhistokjemi med BIP, som viser ekspresjonen i cellene av et resident chaperon protein i det endoplasmatiske reticuluim.

For cresylfiolett fargingen monteres hjernevevs snitt på geleatiniserte objekts glass og inkuberes deretter i 10 min. i en løsning av cresylfiolett (Cl791, Sigma) ved 0,5% i destillert vann. Etter skylding i surt medium ble snittene til slutt dehydrert.

For metylgrønn farging ble snittene montert på gelatiniserte objekts glass, inkubert i 10 min. i en løsning av metylgrønt (M5015 fra Sigma) ved 1% i destillert vann, skyllet og deretter dehydrert.

For BIP-immunhistokjemien (polyklonal antistoff, SPA-826, stressgen), er protokollen identisk med den som anvendes for Ap-peptid immunhistokjemi (se ovenfor), med unntak av ytterligere inkubering (1 time, romtemperatur) av snittene i en løsning av biotynilert sekundært antistoff (anti-kanin IgG-antistoff frembrakt i geit, Vector) før de inkuberes i ABC-komplekset.

Mikroskopiske analyser viste, ved anvendelse av ulikehistologiske/immunhistokjemiske markører, en nedgang i tykkelsen av det pyramidale cellelag i hippocampus, i særdeleshet CA1, i hjernen hos APP751SLxPSlKI-Ho-mus (n = 3/3) (fig. 5 og 6). Denne nedgang antyder tilstedeværelse av en prosess for neuronal død som allerede er veletablert ved 10 måneders alderen. Ved 6 måneders alderen er den neuronale død til stede i hjernen hos 1 av 3 mus, hvilket antyder en tidlig start på en neurotoksisk prosess (fig. 8). Parallelle analyser i hippocampus, og i særdeleshet i CA1, av de 2 patologiske prosesser, nemlig unormal akkumulering av Ap-peptidet i hjernen og affiserte neuroner, antyder en mer sannsynlig rolle i den neurotoksiske prosess av den intracellulære akkumulering av Ap (fenomenene allerede beskrevet i Thy-lAPP751SSSLxPSl M146L-mus) enn av den akkumulering i ekstracellulære avsetninger (fig. 7). De neuronene som fortsatt er til stede i CA1 viser faktisk en unormal høy eksplosjon av Ap-peptidet. I tillegg er effekten på neuronene i CA1 tydelig til stede i områder som mangler ekstracellulære avsetninger. Eksistensen av en mulig gendose effekt i prosessen for neuronal død i CA1 bør bemerkes. En effekt på neuronene ble også funnet hos veldig gamle (> 15 måneder) APP751SLxPSlKI-mus som hadde kun et PSIKI-allel.

Claims (26)

1. Ikke-humant dyr,karakterisert vedat det har en nukleinsyresekvens som koder for et presenilin 1 protein som i homozygot tilstand bærer mutasjonene som tilsvarer mutasjonene M233T og L235P på muse PSl-proteinet.

2. Dyr ifølge krav 1,karakterisert vedat det også omfatter en nukleinsyresekvens som koder for hele eller deler av genet som koder for APP.

3. Dyr ifølge et hvilket som helst av kravene log2,karakterisert vedat det uttrykker en mengde mutert PSI sammenlignet med mengden endogent PSI hos et dyr som uttrykker et ikke-mutert PSI.

4. Dyr ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3,karakterisert vedat presenilin 1 proteinet som bærer mutasjonene M233T og L235P er av murin opprinnelse.

5. Dyr ifølge et hvilket som helst av kravene 2 til 4,karakterisert vedat APP -proteinet er APP751 og er av human opprinnelse.

6. Dyr ifølge et hvilket som helst av kravene 2 til 5,karakterisert vedat APP 751-proteinet er av human opprinnelse og utviser den Svenske mutasjonen og London mutasjonen.

7. Dyr ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6,karakterisert vedat det er en gnager.

8. Dyr ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til V,karakterisert vedat det er en mus, en rotte eller en kanin.

9. Dyr ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 8,karakterisert vedat det produserer et protein som omfatter sekvensen SEQ ID nr.

2.

10. Dyr ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9,karakterisert vedat det har i sitt genom nukleinsyresekvensen SEQ ID nr. 1.

11. Dyr ifølge et hvilket som helst av kravene 2 til 10,karakterisert vedat ekspresjonen av genet som koder for APP er under kontroll av en eksogen promoter.

12. Dyr ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 11,karakterisert vedat det viser et neuronalt tap.

13. Dyr ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 10,karakterisert vedat det utviser et Abeta42/total Abeta forhold større enn omtrent 0,9.

14. Dyr ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 13,karakterisert vedat det muterte presnilin 1-proteinet er endogent.

15. Celle eller cellelinje avledet fra et dyr ifølge et hvilket som helst kravene 1 til 14.

16. Celle eller cellelinje i følge krav 15,karakterisert vedat den omfatter en nukleinsyresekvens som koder for det murine presenilin 1-genet i en M233T og L235P-mutert form.

17. Embryonal stamcelle,karakterisert vedat den er avledet fra et dyr ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 14.

18. Muse PSI-protein som bærer aminosyremutasj onene M til T og L til P, henholdsvis ved posisjonene 233 og 235.

19. Protein ifølge krav 18,karakterisert vedat det omfatter sekvensen SEQ ID nr. 2.

20. Nukleinsyre som koder for muse PSl-proteinet som bærer aminosyremutasj onene M til T og L til P, henholdsvis ved posisjonene 233 og 235.

21. Nukleinsyre ifølge krav 20,karakterisert vedat det omfatter sekvensen SEQ ID nr. 1.

22. Vektor omfattende en nukleinsyre ifølge krav 21.

23. Anvendelse av et dyr ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 14, for å påvise forbindelser tilsiktet å behandle Alzheimers sykdom.

24. Fremgangsmåte for å påvise forbindelser tilsiktet behandling av neurodegenerative sykdommer,karakterisert vedat den omfatter følgende trinn: administrering av testforbindelsen eller en blanding av testforbindelser til et dyr ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 14, - observering av utviklingen av en eller flere karakteristiske markører, som gjengir neuropatologien observert hos mennesker.

25. Fremgangsmåte i følge krav 24,karakterisert vedat den omfatter de følgende trinn: - bringe celler ekstrahert fra et dyr ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 14 i kontakt med en forbindelse eller blanding av forbindelser, og - måling av effekten(e) av forbindelsene på hele celler, i cellehomogenater eller på en subcellulær fraksjon.

26. Anvendelse av et protein ifølge krav 18 og 19, for påvisning av forbindelser tilsiktet behandling av Alzheimers sykdom.