JPH11146743A - アルツハイマー病モデル動物 - Google Patents
アルツハイマー病モデル動物Info
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- JPH11146743A JPH11146743A JP9315346A JP31534697A JPH11146743A JP H11146743 A JPH11146743 A JP H11146743A JP 9315346 A JP9315346 A JP 9315346A JP 31534697 A JP31534697 A JP 31534697A JP H11146743 A JPH11146743 A JP H11146743A
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規なＡＤモデル動物として、ヒトＰＳ２遺
伝子を保有するトランスジェニック動物とこの動物から
単離した細胞、並びにをこれらを用いた各種試験方法を
提供する。 【解決手段】 ヒト・プレセニリン２遺伝子またはその
変異遺伝子を導入した全能性細胞を個体発生して得られ
る哺乳動物およびその子孫動物であって、体細胞染色体
中に上記導入遺伝子を保有することを特徴とするアルツ
ハイマー病モデル動物と、このモデル動物から単離され
た細胞、並びにこれらのモデル動物または細胞を用いて
アルツハイマー病原因物質または治療薬を特定する試験
方法。
伝子を保有するトランスジェニック動物とこの動物から
単離した細胞、並びにをこれらを用いた各種試験方法を
提供する。 【解決手段】 ヒト・プレセニリン２遺伝子またはその
変異遺伝子を導入した全能性細胞を個体発生して得られ
る哺乳動物およびその子孫動物であって、体細胞染色体
中に上記導入遺伝子を保有することを特徴とするアルツ
ハイマー病モデル動物と、このモデル動物から単離され
た細胞、並びにこれらのモデル動物または細胞を用いて
アルツハイマー病原因物質または治療薬を特定する試験
方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この出願の発明は、アルツハ
イマー病モデル動物に関するものである。さらに詳しく
は、この出願の発明は、アルツハイマー病の原因遺伝子
の一つであるヒト・プレセリン２遺伝子（以下、ＰＳ２
と記載することがある）を体細胞染色体中に保有するト
ランスジェニック動物であって、アルツハイマー病の原
因解明およびその診断法並びに治療法の開発に有用なモ
デル動物、この動物の細胞培養、およびこれらを用いた
各種試験方法に関するものである。
イマー病モデル動物に関するものである。さらに詳しく
は、この出願の発明は、アルツハイマー病の原因遺伝子
の一つであるヒト・プレセリン２遺伝子（以下、ＰＳ２
と記載することがある）を体細胞染色体中に保有するト
ランスジェニック動物であって、アルツハイマー病の原
因解明およびその診断法並びに治療法の開発に有用なモ
デル動物、この動物の細胞培養、およびこれらを用いた
各種試験方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】アルツハイマー病（Alzheimer's Diseas
e : ＡＤ）は、中年以降に発病し、短期間の間に記銘
力、記憶力の低下、人格障害などを生じる進行性の痴呆
疾患であり、脳内における老人斑の存在と細胞内の神経
原線維変化を大きな特徴としている。脳血管性痴呆と並
んで老年期痴呆の中核ともいえる重要疾患であり、我が
国では痴呆患者の約３分の１、米国では４０〜６０％が
ＡＤと言われている。
e : ＡＤ）は、中年以降に発病し、短期間の間に記銘
力、記憶力の低下、人格障害などを生じる進行性の痴呆
疾患であり、脳内における老人斑の存在と細胞内の神経
原線維変化を大きな特徴としている。脳血管性痴呆と並
んで老年期痴呆の中核ともいえる重要疾患であり、我が
国では痴呆患者の約３分の１、米国では４０〜６０％が
ＡＤと言われている。
【０００３】また、ＡＤの約１割は常染色体優性遺伝を
示す家族性ＡＤであり、その原因遺伝子の一つとして、
１９９１年にアミロイドβタンパク前駆体（βＡＰＰ）
遺伝子の変異が同定されている（Nature, 349: 704-70
6, 1991）。このβＡＰＰ遺伝子の変異は、第２１番染
色体に連鎖する家系のＡＤ発症に関与しており、その
後、第１４番染色体に連鎖する家系ではプレセニリン１
（ＰＳ１）の遺伝子変異（Nature375: 754-760, 1995）
が、第１番染色体に連鎖する家系ではプレセニリン２
（ＰＳ２）の遺伝子変異（Science 269: 973-977, 199
5）が同定されている。
示す家族性ＡＤであり、その原因遺伝子の一つとして、
１９９１年にアミロイドβタンパク前駆体（βＡＰＰ）
遺伝子の変異が同定されている（Nature, 349: 704-70
6, 1991）。このβＡＰＰ遺伝子の変異は、第２１番染
色体に連鎖する家系のＡＤ発症に関与しており、その
後、第１４番染色体に連鎖する家系ではプレセニリン１
（ＰＳ１）の遺伝子変異（Nature375: 754-760, 1995）
が、第１番染色体に連鎖する家系ではプレセニリン２
（ＰＳ２）の遺伝子変異（Science 269: 973-977, 199
5）が同定されている。
【０００４】そして、βＡＰＰについては、この変異タ
ンパク質を発現するトランスジェニックマウスの作成が
試みられ、１９９５年には、Games らによりＡＤの病態
変化を再現したβトランスジェニックマウスが報告され
（Nature 373:523-527, 1995）、このようなモデル動物
を用いたＡＤの病態の解析や治療薬剤の開発が期待され
ている。
ンパク質を発現するトランスジェニックマウスの作成が
試みられ、１９９５年には、Games らによりＡＤの病態
変化を再現したβトランスジェニックマウスが報告され
（Nature 373:523-527, 1995）、このようなモデル動物
を用いたＡＤの病態の解析や治療薬剤の開発が期待され
ている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ＡＤは
上記のとおりの複数の遺伝子異常によって引き起こされ
る多因子疾患であること考えられることから、βＡＰＰ
に関係するトランスジェニックマウスだけでは、ＡＤの
病因、病態の解析および治療薬剤の開発のために十分と
は言えない。
上記のとおりの複数の遺伝子異常によって引き起こされ
る多因子疾患であること考えられることから、βＡＰＰ
に関係するトランスジェニックマウスだけでは、ＡＤの
病因、病態の解析および治療薬剤の開発のために十分と
は言えない。
【０００６】特に、老人斑の主要成分であるアミロイド
βタンパク質（Ａβ）は、Ｃ末端の長さにによってＡβ
４２とＡβ４０の２種類に分けられるが、このうち、Ａ
β４２が老人斑の形成に重要な役割を果たしていること
が知られている（例えば、Neuron 13:45-53, 1994; An
n.Neurol. 37: 294-299, 1995; Biochemistry 32: 4693
-4697, 1993; Science 264: 1336-1340, 1994; Neurolo
gy 48: 741-745, 1997）。そして、このＡβ４２の生産
には、ＰＳ１およびＰＳ２遺伝子の変異が等分に関与し
ていることも知られている（Nature Med. 2: 864-870,
1996; Nature 383: 710-713, 1996; Neuron 17: 1005-1
013, 1996; Nature Med. 3:67-72, 1996）。
βタンパク質（Ａβ）は、Ｃ末端の長さにによってＡβ
４２とＡβ４０の２種類に分けられるが、このうち、Ａ
β４２が老人斑の形成に重要な役割を果たしていること
が知られている（例えば、Neuron 13:45-53, 1994; An
n.Neurol. 37: 294-299, 1995; Biochemistry 32: 4693
-4697, 1993; Science 264: 1336-1340, 1994; Neurolo
gy 48: 741-745, 1997）。そして、このＡβ４２の生産
には、ＰＳ１およびＰＳ２遺伝子の変異が等分に関与し
ていることも知られている（Nature Med. 2: 864-870,
1996; Nature 383: 710-713, 1996; Neuron 17: 1005-1
013, 1996; Nature Med. 3:67-72, 1996）。
【０００７】従って、ＡＤの病態解析および治療薬剤の
開発等のためには、ＡＤの特徴である老人斑の形成に重
要な役割を果たすＡβ４２の生産に関係する遺伝子ＰＳ
１またはＰＳ２遺伝子を導入したトランスジェニック動
物が不可欠である。この出願の発明は、以上のとおりの
事情に鑑みてなされたものであって、新規なＡＤモデル
動物として、ヒトＰＳ２遺伝子またはその変異遺伝子を
保有するトランスジェニック動物を提供することを目的
としている。
開発等のためには、ＡＤの特徴である老人斑の形成に重
要な役割を果たすＡβ４２の生産に関係する遺伝子ＰＳ
１またはＰＳ２遺伝子を導入したトランスジェニック動
物が不可欠である。この出願の発明は、以上のとおりの
事情に鑑みてなされたものであって、新規なＡＤモデル
動物として、ヒトＰＳ２遺伝子またはその変異遺伝子を
保有するトランスジェニック動物を提供することを目的
としている。
【０００８】また、この出願の発明は、このモデル動物
または動物から単離した細胞を用いた各種試験方法を提
供することを目的としてもいる。
または動物から単離した細胞を用いた各種試験方法を提
供することを目的としてもいる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】この出願の発明は、上記
の課題を解決するものとして、ヒト・プレセニリン２遺
伝子またはその変異遺伝子を導入した全能性細胞を個体
発生して得られる哺乳動物およびその子孫動物であっ
て、体細胞染色体中に上記導入遺伝子を保有することを
特徴とするアルツハイマー病モデル動物を提供する。
の課題を解決するものとして、ヒト・プレセニリン２遺
伝子またはその変異遺伝子を導入した全能性細胞を個体
発生して得られる哺乳動物およびその子孫動物であっ
て、体細胞染色体中に上記導入遺伝子を保有することを
特徴とするアルツハイマー病モデル動物を提供する。
【００１０】この発明のモデル動物においては、上記哺
乳動物が、マウスであることを好ましい態様の一つとし
ている。また、ヒト・プレセニリン２遺伝子が、当該ゲ
ノム遺伝子のＲＮＡより調製したｃＤＮＡであること、
ヒト・プレセニリン２の変異遺伝子が、当該ゲノム遺伝
子のＲＮＡより調製したｃＤＮＡにおける第１４１番目
アスパラギン残基がイソロイシン残基に置換した変異ｃ
ＤＮＡまたは第２３９番目メチオニン残基がバリン残基
に置換した変異ｃＤＮＡであることを別の好ましい態様
としてもいる。
乳動物が、マウスであることを好ましい態様の一つとし
ている。また、ヒト・プレセニリン２遺伝子が、当該ゲ
ノム遺伝子のＲＮＡより調製したｃＤＮＡであること、
ヒト・プレセニリン２の変異遺伝子が、当該ゲノム遺伝
子のＲＮＡより調製したｃＤＮＡにおける第１４１番目
アスパラギン残基がイソロイシン残基に置換した変異ｃ
ＤＮＡまたは第２３９番目メチオニン残基がバリン残基
に置換した変異ｃＤＮＡであることを別の好ましい態様
としてもいる。
【００１１】この出願の発明は、また、上記のモデル動
物から単離された細胞を提供する。さらにまた、この出
願の発明は、上記モデル動物または細胞を用いて、アル
ツハイマー病原因物質または治療薬を特定する試験方法
を提供する。以下、上記の各発明について実施の形態を
詳しく説明する。
物から単離された細胞を提供する。さらにまた、この出
願の発明は、上記モデル動物または細胞を用いて、アル
ツハイマー病原因物質または治療薬を特定する試験方法
を提供する。以下、上記の各発明について実施の形態を
詳しく説明する。
【００１２】
【発明の実施の形態】この発明のＡＤモデル動物は、ヒ
トＰＳ２遺伝子またはその変異遺伝子を導入した全能性
細胞を個体発生して得られる哺乳動物およびその子孫動
物であって、体細胞染色体中に上記導入遺伝子を保有す
ることを特徴とするトランスジェニック動物である。
トＰＳ２遺伝子またはその変異遺伝子を導入した全能性
細胞を個体発生して得られる哺乳動物およびその子孫動
物であって、体細胞染色体中に上記導入遺伝子を保有す
ることを特徴とするトランスジェニック動物である。
【００１３】導入遺伝子の一つであるヒトＰＳ２遺伝子
（野生型ＰＳ２）は、例えば、ヒトの脳から抽出したＲ
ＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作成し、公知のＰＳ２
配列（Nature 376:775-778, 1995; Science 269:970-97
7, 1995 ）に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプロ
ーブを用いてライブラリーをスクリーニングすることに
より得ることができる。また、公知のＰＳ２配列の両端
に相当する合成オリゴヌクレオチドをプライマーとする
ＰＣＲ法によっても目的とするｃＤＮＡを得ることがで
きる。
（野生型ＰＳ２）は、例えば、ヒトの脳から抽出したＲ
ＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作成し、公知のＰＳ２
配列（Nature 376:775-778, 1995; Science 269:970-97
7, 1995 ）に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプロ
ーブを用いてライブラリーをスクリーニングすることに
より得ることができる。また、公知のＰＳ２配列の両端
に相当する合成オリゴヌクレオチドをプライマーとする
ＰＣＲ法によっても目的とするｃＤＮＡを得ることがで
きる。
【００１４】ヒトＰＳ２変異遺伝子（変異型ＰＳ２）
は、上記のとおりの方法によって得た野生型ＰＳ２のｃ
ＤＮＡに、公知の方法で変異誘導することによって容易
に作成することができる。すなわち、変異型ＰＳ２は、
野生型ＰＳ２ｃＤＮＡの第１４１番目アスパラギン残基
がイソロイシン残基に置換した変異（Ｎ１４１Ｉ）と、
第２３９番目メチオニン残基がバリン残基に置換した変
異（Ｍ２３９Ｖ）の２種類であり（Neuron 18: 687-69
0, 1997）、この発明ではいずれの変異型ＰＳ２をも対
象とすることができる。
は、上記のとおりの方法によって得た野生型ＰＳ２のｃ
ＤＮＡに、公知の方法で変異誘導することによって容易
に作成することができる。すなわち、変異型ＰＳ２は、
野生型ＰＳ２ｃＤＮＡの第１４１番目アスパラギン残基
がイソロイシン残基に置換した変異（Ｎ１４１Ｉ）と、
第２３９番目メチオニン残基がバリン残基に置換した変
異（Ｍ２３９Ｖ）の２種類であり（Neuron 18: 687-69
0, 1997）、この発明ではいずれの変異型ＰＳ２をも対
象とすることができる。
【００１５】また、これらの導入遺伝子には、その発現
を制御するためのプロモーター配列やエンハンサー配列
を連結する。これらの配列については特に制限はなく、
通常用いられている配列を適宜に組み合わせて使用する
ことができる。ただし、導入遺伝子を脳で特異的に発現
させるためには、β−アクチンプロモーター等の使用が
好ましい。
を制御するためのプロモーター配列やエンハンサー配列
を連結する。これらの配列については特に制限はなく、
通常用いられている配列を適宜に組み合わせて使用する
ことができる。ただし、導入遺伝子を脳で特異的に発現
させるためには、β−アクチンプロモーター等の使用が
好ましい。
【００１６】トランスジェニック動物の作成は公知の方
法（例えば、Pro.Natl.Acad.Sci.USA 77:7380-7384, 19
80）に従って、上記導入遺伝子を哺乳動物の全能性細胞
に導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞のゲノ
ム中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別することに
よって作成することができる。哺乳動物としては、技術
的には全ての動物種を対象とすることが可能であるが、
特に近交系が多数作出されており、しかも受精卵の培
養、体外受精等の技術が整っているマウスが最適であ
る。遺伝子を導入する全能性細胞としては、マウスの場
合、受精卵や初期胚のほか、多分化能を有するＥＳ細胞
のような培養細胞を対象とすることができる。また、こ
のような培養細胞への遺伝子導入法としては、公知の静
電パルス法、リポソーム法、リン酸カルシウム法等も利
用できるが、トランスジェニック動物個体の産出効率や
次代への導入遺伝子の伝達効率を勘案した場合、受精卵
へのＤＮＡ溶液の物理的注入（マイクロインジェクショ
ン）法が好ましい。
法（例えば、Pro.Natl.Acad.Sci.USA 77:7380-7384, 19
80）に従って、上記導入遺伝子を哺乳動物の全能性細胞
に導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞のゲノ
ム中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別することに
よって作成することができる。哺乳動物としては、技術
的には全ての動物種を対象とすることが可能であるが、
特に近交系が多数作出されており、しかも受精卵の培
養、体外受精等の技術が整っているマウスが最適であ
る。遺伝子を導入する全能性細胞としては、マウスの場
合、受精卵や初期胚のほか、多分化能を有するＥＳ細胞
のような培養細胞を対象とすることができる。また、こ
のような培養細胞への遺伝子導入法としては、公知の静
電パルス法、リポソーム法、リン酸カルシウム法等も利
用できるが、トランスジェニック動物個体の産出効率や
次代への導入遺伝子の伝達効率を勘案した場合、受精卵
へのＤＮＡ溶液の物理的注入（マイクロインジェクショ
ン）法が好ましい。
【００１７】遺伝子を注した全能性細胞は、次に仮親の
卵管に移植し、個体まで発生し、出生した動物を里親に
つけて飼育させたのち、体の一部（例えば尾部先端）か
らＤＮＡを抽出し、サザンブロット分析やＰＣＲアッセ
イ等により導入遺伝子の存在を確認する。導入遺伝子の
存在が確認された個体を初代（Founder ）とすれば、導
入遺伝子はその子孫の５０％に伝達され、野生型ＰＳ２
または変異型ＰＳ２を染色体の一部に安定的に組み込ん
だ動物を効率よく作出することができる。
卵管に移植し、個体まで発生し、出生した動物を里親に
つけて飼育させたのち、体の一部（例えば尾部先端）か
らＤＮＡを抽出し、サザンブロット分析やＰＣＲアッセ
イ等により導入遺伝子の存在を確認する。導入遺伝子の
存在が確認された個体を初代（Founder ）とすれば、導
入遺伝子はその子孫の５０％に伝達され、野生型ＰＳ２
または変異型ＰＳ２を染色体の一部に安定的に組み込ん
だ動物を効率よく作出することができる。
【００１８】このようにして作出されたトランスジェニ
ック動物は、例えば変異型ＰＳ２を保有する動物の場合
には、後記する実施例にも示したようにＡβ４２を過剰
生産するため、その生産抑制作用または分解作用によっ
てＡＤ治療効果が期待される薬剤のスクリーニングに最
適のモデル動物となる。また、野生型ＰＳ２を保有する
トランスジェニック動物は、ＡＤの病因または自然発症
過程を調べるためのモデル動物として有用である。すな
わち、野生型ＰＳ２動物は、変異型ＰＳ２動物に比べて
Ａβ４２の生産量は少ないため、例えばＡＤの原因とな
る疑いのある物質を投与し、その生産量の増加の程度を
見ることによって、ＡＤ原因物質を特定することができ
る。あるいは、ＡＤ原因物質で予め処理し、ついでＡＤ
治療薬剤のスクリーニングに用いることもできる。
ック動物は、例えば変異型ＰＳ２を保有する動物の場合
には、後記する実施例にも示したようにＡβ４２を過剰
生産するため、その生産抑制作用または分解作用によっ
てＡＤ治療効果が期待される薬剤のスクリーニングに最
適のモデル動物となる。また、野生型ＰＳ２を保有する
トランスジェニック動物は、ＡＤの病因または自然発症
過程を調べるためのモデル動物として有用である。すな
わち、野生型ＰＳ２動物は、変異型ＰＳ２動物に比べて
Ａβ４２の生産量は少ないため、例えばＡＤの原因とな
る疑いのある物質を投与し、その生産量の増加の程度を
見ることによって、ＡＤ原因物質を特定することができ
る。あるいは、ＡＤ原因物質で予め処理し、ついでＡＤ
治療薬剤のスクリーニングに用いることもできる。
【００１９】さらにまた、この発明によって提供される
トランスジェニック動物は、全ての体細胞に導入遺伝子
を保有するため、この動物個体から単離した細胞もそれ
ぞれにヒトＡβ４２を生産する。このため、これらの細
胞の培養系を用いて、上記動物個体の場合と同様にＡＤ
原因物質や治療薬剤のスクリーニングを行うことができ
る。特に、このような細胞培養系は、動物実験代替とし
て、原因物質や薬剤の１次スクリーニングに有用であ
る。
トランスジェニック動物は、全ての体細胞に導入遺伝子
を保有するため、この動物個体から単離した細胞もそれ
ぞれにヒトＡβ４２を生産する。このため、これらの細
胞の培養系を用いて、上記動物個体の場合と同様にＡＤ
原因物質や治療薬剤のスクリーニングを行うことができ
る。特に、このような細胞培養系は、動物実験代替とし
て、原因物質や薬剤の１次スクリーニングに有用であ
る。
【００２０】以下、実施例を示してこの発明についてさ
らに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例
に限定されるものではない。
らに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例
に限定されるものではない。
【００２１】
（１）トランスジェニックマウスの作成 公知の方法（Anal.Biochem. 162: 120-129, 1987）に従
って健常老人の脳から全ＲＮＡを抽出し、公知の方法
（J.Neurochem. 67: 1235-1244, 1996）により逆転写し
てｃＤＮＡを作成した。次いで、これらのｃＤＮＡか
ら、ＰＣＲ増幅により野生型ＰＳ２のｃＤＮＡ（481-b
p）を調製した。ＰＣＲプライマーとしては、配列番号
１の合成オリゴヌクレオチド（フォワードプライマー）
および配列番号２の合成オリゴヌクレオチド（リバース
プライマー）を用いた。また、ＰＣＲ条件は、（94℃で
１分間：55℃で３分間：72℃で４分間）×３５サイクル
とした。
って健常老人の脳から全ＲＮＡを抽出し、公知の方法
（J.Neurochem. 67: 1235-1244, 1996）により逆転写し
てｃＤＮＡを作成した。次いで、これらのｃＤＮＡか
ら、ＰＣＲ増幅により野生型ＰＳ２のｃＤＮＡ（481-b
p）を調製した。ＰＣＲプライマーとしては、配列番号
１の合成オリゴヌクレオチド（フォワードプライマー）
および配列番号２の合成オリゴヌクレオチド（リバース
プライマー）を用いた。また、ＰＣＲ条件は、（94℃で
１分間：55℃で３分間：72℃で４分間）×３５サイクル
とした。
【００２２】変異型ＰＳ２のｃＤＮＡとしては、ＰＣＲ
変異誘導法により第１４１番目のアルギニン残基をイソ
ロイシン残基に置換したＮ１４１Ｉを作成した。これら
のｃＤＮＡは、次いで発現ベクターｐＣＡＧＧＳ（Gene
108: 192-200,1991 ）に挿入し、ＤＮＡシークエンサ
ーにより塩基配列を解析して、それぞれ野生型ＰＳ２ｃ
ＤＮＡおよび変異型ＰＳ２ｃＤＮＡ（Ｎ１４１Ｉ）であ
ることを確認した。
変異誘導法により第１４１番目のアルギニン残基をイソ
ロイシン残基に置換したＮ１４１Ｉを作成した。これら
のｃＤＮＡは、次いで発現ベクターｐＣＡＧＧＳ（Gene
108: 192-200,1991 ）に挿入し、ＤＮＡシークエンサ
ーにより塩基配列を解析して、それぞれ野生型ＰＳ２ｃ
ＤＮＡおよび変異型ＰＳ２ｃＤＮＡ（Ｎ１４１Ｉ）であ
ることを確認した。
【００２３】次に、組換えベクターｐＣＡＧＧＳのイン
サートに、ＣＭＶ−ＩＥエンハンサー配列、ニワトリβ
アクチン・プロモーターおよびウサギβグロビン・ポリ
アデニレーションシグナルを挿入結合し、導入遺伝子を
構築した。この導入遺伝子をベクターから切り出し、ゲ
ル電気泳動により精製したのち、マイクロインジェクシ
ョン法によってマウス胚に注入した。マウス胚は、Ｃ５
７ＢＬ／６（Ｂ６）ＪまたはＤＢＦ１（雌）とＢ６Ｎ
（雄）との交配によって得た。遺伝子導入胚は、定法に
従って仮親の卵管に移植し、個体へと発生させ、出生さ
せた。
サートに、ＣＭＶ−ＩＥエンハンサー配列、ニワトリβ
アクチン・プロモーターおよびウサギβグロビン・ポリ
アデニレーションシグナルを挿入結合し、導入遺伝子を
構築した。この導入遺伝子をベクターから切り出し、ゲ
ル電気泳動により精製したのち、マイクロインジェクシ
ョン法によってマウス胚に注入した。マウス胚は、Ｃ５
７ＢＬ／６（Ｂ６）ＪまたはＤＢＦ１（雌）とＢ６Ｎ
（雄）との交配によって得た。遺伝子導入胚は、定法に
従って仮親の卵管に移植し、個体へと発生させ、出生さ
せた。
【００２４】得られたマウス個体の尾部からＤＮＡを抽
出し、導入遺伝子断片の両端配列に基づき合成したオリ
ゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲアッセイによ
り、初代トランスジェニックマウスを選別した。その結
果、野生型ＰＳ２ｃＤＮＡを保有する初代トランスジェ
ニックマウスと、変異型ＰＳ２ｃＤＮＡを保有する初代
トランスジェニックマウスがそれぞれ１匹ずつ得られ
た。これらの初代トランスジェニックマウスをＣ５７Ｂ
Ｌ／６Ｊと戻交配し、ヒト野生型ＰＳ２ｃＤＮＡを保有
するトランスジェニックマウスの２系統（Ｗ１およびＷ
２）と、ヒト変異型ＰＳ２ｃＤＮＡを保有する２系統
（Ｍ１およびＭ２）を作成した。 （２）トランスジェニックマウスの遺伝子発現の検討 トランスジェニックマウスの脳内における導入遺伝子の
発現の程度を逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法に
より８ヶ月齢の時点で調べた。その結果、野生型マウス
の内在性マウスＰＳ２ｍＲＮＡの発現量は、検出可能で
はあるが極わずかであるのに対し、トランスジェニック
マウス４系統では、いずれも導入ＰＳ２ｍＲＮＡの発現
量の増大が確認された。また、その発現量は、野生型マ
ウスに比べて５倍（Ｍ２）から１５倍（Ｗ１）であっ
た。また、Ｗ２およびＭ１系統は、導入ＰＳ２ｍＲＮＡ
の発現レベルがほぼ同一であった。なお、導入遺伝子の
有無は内在性のマウスＰＳ１またはＰＳ２ｍＲＮＡのレ
ベルには影響を及していなかった。
出し、導入遺伝子断片の両端配列に基づき合成したオリ
ゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲアッセイによ
り、初代トランスジェニックマウスを選別した。その結
果、野生型ＰＳ２ｃＤＮＡを保有する初代トランスジェ
ニックマウスと、変異型ＰＳ２ｃＤＮＡを保有する初代
トランスジェニックマウスがそれぞれ１匹ずつ得られ
た。これらの初代トランスジェニックマウスをＣ５７Ｂ
Ｌ／６Ｊと戻交配し、ヒト野生型ＰＳ２ｃＤＮＡを保有
するトランスジェニックマウスの２系統（Ｗ１およびＷ
２）と、ヒト変異型ＰＳ２ｃＤＮＡを保有する２系統
（Ｍ１およびＭ２）を作成した。 （２）トランスジェニックマウスの遺伝子発現の検討 トランスジェニックマウスの脳内における導入遺伝子の
発現の程度を逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法に
より８ヶ月齢の時点で調べた。その結果、野生型マウス
の内在性マウスＰＳ２ｍＲＮＡの発現量は、検出可能で
はあるが極わずかであるのに対し、トランスジェニック
マウス４系統では、いずれも導入ＰＳ２ｍＲＮＡの発現
量の増大が確認された。また、その発現量は、野生型マ
ウスに比べて５倍（Ｍ２）から１５倍（Ｗ１）であっ
た。また、Ｗ２およびＭ１系統は、導入ＰＳ２ｍＲＮＡ
の発現レベルがほぼ同一であった。なお、導入遺伝子の
有無は内在性のマウスＰＳ１またはＰＳ２ｍＲＮＡのレ
ベルには影響を及していなかった。
【００２５】以上の結果から、得られたトランスジェニ
ックマウスは、ヒト野生型ＰＳ２および変異型ＰＳ２を
それぞれ脳内で過剰生産していることが確認された。 （３）トランスジェニックマウスの脳内でのＡβ４０お
よびＡβ４２のレベルの検討 トランスジェニックマウスＷ２およびＭ１の２、５、お
よび８ヶ月齢の時点での脳可溶性画分におけるＡβ４０
およびＡβ４２レベルをイムノアッセイ（ＥＩＡ）法に
より調べた。結果は表１に示したとおりである。
ックマウスは、ヒト野生型ＰＳ２および変異型ＰＳ２を
それぞれ脳内で過剰生産していることが確認された。 （３）トランスジェニックマウスの脳内でのＡβ４０お
よびＡβ４２のレベルの検討 トランスジェニックマウスＷ２およびＭ１の２、５、お
よび８ヶ月齢の時点での脳可溶性画分におけるＡβ４０
およびＡβ４２レベルをイムノアッセイ（ＥＩＡ）法に
より調べた。結果は表１に示したとおりである。
【００２６】この表１の結果からも明らかなように、ヒ
ト変異型ＰＳ２トランスジェニックマウス（Ｍ１）は、
コントロール（野生型マウス：Non-Tg）およびヒト野生
型ＰＳ２トランスジェニックマウス（Ｗ２）に比べて脳
内Ａβ４２量が多いことが確認された。特に、Ｗ２にお
けるＡβ４２レベルは５ヶ月齢以降わずかに増加するの
に対し、Ｍ１におけるＡβ４２レベルは加齢にしたがっ
て顕著に増加した。これらのことから、ヒト変異型ＰＳ
２トランスジェニックマウス脳では、加齢に伴ってＡβ
４２量を増大させることが確認された。
ト変異型ＰＳ２トランスジェニックマウス（Ｍ１）は、
コントロール（野生型マウス：Non-Tg）およびヒト野生
型ＰＳ２トランスジェニックマウス（Ｗ２）に比べて脳
内Ａβ４２量が多いことが確認された。特に、Ｗ２にお
けるＡβ４２レベルは５ヶ月齢以降わずかに増加するの
に対し、Ｍ１におけるＡβ４２レベルは加齢にしたがっ
て顕著に増加した。これらのことから、ヒト変異型ＰＳ
２トランスジェニックマウス脳では、加齢に伴ってＡβ
４２量を増大させることが確認された。
【００２７】
【表１】
【００２８】
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
よって、ヒトＰＳ２遺伝子またはその変異遺伝子を保有
するトランスジェニック動物が提供される。これらの動
物によって、ＡＤの病因および病態解析、並びにその治
療薬剤等の開発が促進される。
よって、ヒトＰＳ２遺伝子またはその変異遺伝子を保有
するトランスジェニック動物が提供される。これらの動
物によって、ＡＤの病因および病態解析、並びにその治
療薬剤等の開発が促進される。
【００２９】
配列番号：１ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCCGCCGGAA TTCCAGAGGC AGGGCTATGC 30 配列番号：２ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCCGCCGAGA TTCAGATGTA GAGCTGATGG 30
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (10)
- 【請求項１】 ヒト・プレセニリン２遺伝子またはその
変異遺伝子を導入した全能性細胞を個体発生して得られ
る哺乳動物およびその子孫動物であって、体細胞染色体
中に上記導入遺伝子を保有することを特徴とするアルツ
ハイマー病モデル動物。 - 【請求項２】 哺乳動物が、マウスである請求項１のア
ルツハイマー病モデル動物。 - 【請求項３】 ヒト・プレセニリン２遺伝子が、当該ゲ
ノム遺伝子のＲＮＡより調製したｃＤＮＡである請求項
１または２のアルツハイマー病モデル動物。 - 【請求項４】 ヒト・プレセニリン２の変異遺伝子が、
当該ゲノム遺伝子のＲＮＡより調製したｃＤＮＡにおけ
る第１４１番目アスパラギン残基がイソロイシン残基に
置換した変異ｃＤＮＡである請求項１または２のアルツ
ハイマー病モデル動物。 - 【請求項５】 ヒト・プレセニリン２の変異遺伝子が、
当該ゲノム遺伝子のＲＮＡより調製したｃＤＮＡにおけ
る第２３９番目メチオニン残基がバリン残基に置換した
変異ｃＤＮＡである請求項１または２のアルツハイマー
病モデル動物。 - 【請求項６】 請求項１から５のいずれかの動物から単
離された細胞。 - 【請求項７】 請求項１から５のいずれかの動物に、ア
ルツハイマー病の原因となる疑いのある物質を投与し、
動物細胞におけるアミロイドβタンパク質の生産量を指
標としてアルツハイマー病原因物質を特定する試験方
法。 - 【請求項８】 請求項６の細胞を、アルツハイマー病の
原因となる疑いのある物質を含有した培地で培養し、細
胞のアミロイドβタンパク質生産量を指標としてアルツ
ハイマー病原因物質を特定する試験方法。 - 【請求項９】 請求項１から５のいずれかの動物、また
はアルツハイマー病原因物質を投与したこの動物に、ア
ルツハイマー病の候補治療薬を投与し、動物細胞におけ
るアミロイドβタンパク質の生産量を指標としてアルツ
ハイマー病治療薬を特定する試験方法。 - 【請求項１０】 請求項６の細胞の培養培地中、または
アルツハイマー病原因物質を含有した培地で培養したこ
の細胞の培地中に、アルツハイマー病の候補治療薬を添
加して細胞を培養し、細胞のアミロイドβタンパク質生
産量を指標としてアルツハイマー病治療薬を特定する試
験方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9315346A JPH11146743A (ja) | 1997-11-17 | 1997-11-17 | アルツハイマー病モデル動物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9315346A JPH11146743A (ja) | 1997-11-17 | 1997-11-17 | アルツハイマー病モデル動物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11146743A true JPH11146743A (ja) | 1999-06-02 |
Family
ID=18064315
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9315346A Pending JPH11146743A (ja) | 1997-11-17 | 1997-11-17 | アルツハイマー病モデル動物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11146743A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001021786A1 (fr) * | 1999-09-17 | 2001-03-29 | Keio University | Procede de depistage d'un gene depresseur d'une affection |
| WO2012099279A1 (ja) | 2011-01-21 | 2012-07-26 | 独立行政法人理化学研究所 | 酸化ストレスインジケーター発現用核酸構築物とその使用 |
| CN105973856A (zh) * | 2016-06-08 | 2016-09-28 | 南京工业大学 | 一种用镧系荧光配合物检测及加速β淀粉样蛋白聚集的方法 |
-
1997
- 1997-11-17 JP JP9315346A patent/JPH11146743A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001021786A1 (fr) * | 1999-09-17 | 2001-03-29 | Keio University | Procede de depistage d'un gene depresseur d'une affection |
| US7410757B1 (en) | 1999-09-17 | 2008-08-12 | Keio University | Method of screening disease depressant gene |
| WO2012099279A1 (ja) | 2011-01-21 | 2012-07-26 | 独立行政法人理化学研究所 | 酸化ストレスインジケーター発現用核酸構築物とその使用 |
| CN105973856A (zh) * | 2016-06-08 | 2016-09-28 | 南京工业大学 | 一种用镧系荧光配合物检测及加速β淀粉样蛋白聚集的方法 |
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