WO2021125349A1 - 非ヒト霊長類アルツハイマー病モデル動物及びその製造方法 - Google Patents

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WO2021125349A1
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alzheimer
marmoset
talen
psen1
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えりか 佐々木
賢哉 佐藤
和歌子 汲田
弘貴 笹栗
隆臣 西道
永田　健一
山本　卓
哲史 佐久間
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国立研究開発法人理化学研究所
公益財団法人実験動物中央研究所
国立大学法人広島大学
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    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein

Definitions

  • the present invention relates to a non-human primate Alzheimer's disease model animal and a method for producing the same.
  • AD Alzheimer's disease
  • the number of patients is said to reach 50 million worldwide, but effective preventive and therapeutic methods have been established.
  • one of the causes is that there is no useful animal model. Although multiple models using mice have been established, there are many parts that do not reflect the pathophysiology of human AD due to biological differences from primates.
  • An object of the present invention is to provide the world's first non-human primate AD model.
  • the inventors conducted various studies to solve the above-mentioned problems.
  • the 3'-splice site of exon 9 of the PSEN1 gene was used.
  • the present invention was completed by finding that a mutant PSEN1 marmoset individual obtained by deleting a part or all of (3'splice site, acceptor site) reproduces the pathological pattern observed in human AD patients. That is, the present invention is as follows.
  • a non-human primate model of Alzheimer's disease that contains at least the 5'or 3'splice site of exon 9 of the PSEN1 gene and lacks the site related to the exon 9 splice.
  • Alzheimer's disease model non-human primates including a step of deleting at least the 5'or 3'splice site of exon 9 of the PSEN1 gene and the site related to the exon 9 splice using genome editing technology. Manufacturing method.
  • the present invention is as follows.
  • a method for producing a non-human primate model of Alzheimer's disease which comprises a step of deleting an exon 9 acceptor site of the PSEN1 gene using genome editing technology.
  • the pathological condition of human AD can be reproduced.
  • FIG. 6 is a schematic diagram conceptually showing an example of a highly active TALEN (Platinum TALEN) targeting the 3'-splice site of exon 9 of a marmoset that can be used in the present invention.
  • the part surrounded by a square frame is the exon of the PSEN1 gene of the TALEN target site and marmoset, and the number means the exon number.
  • the 3'-splice site (“AG”) of exon 9 is located upstream of exon 9.
  • FIG. 2a shows the results of the surveyor assay of fertilized marmoset eggs after TALEN injection (PC in the left three columns and right column indicates positive control and NC indicates negative control) in the example.
  • FIG. 2b is a schematic diagram showing an outline of TALEN injection and subsequent PSEN1 mRNA analysis performed in the example
  • FIG. 2c is a schematic diagram of the fertilized egg after TALEN injection performed in the example. It is the result of PCR.
  • FIG. 3a is a photograph of a newborn baby of the marmoset AD model according to the present invention obtained in Examples
  • FIG. 3B is a surveyor targeting genomic DNA extracted from the cord blood of the newborn baby. The results of the assay are shown
  • c in FIG. 3 shows the results of PCR performed on RNA extracted from the hair roots of the newborn and wild marmosets.
  • FIG. 3a is a photograph of a newborn baby of the marmoset AD model according to the present invention obtained in Examples
  • FIG. 3B is a surveyor targeting genomic DNA extracted from the cord blood of the newborn baby. The results of the assay are shown
  • c in FIG. 3 shows the results of PCR performed on RNA extracted from the hair roots of the newborn and wild marmos
  • FIG. 5a is a photograph of a newborn baby of the Marmoset AD model according to the present invention obtained in Example 4
  • FIG. 5b is a survey of genomic DNA extracted from the cord blood of the newborn baby. The results of the Yar assay are shown, where c in FIG. 5 shows the sequence around the 3'-splice site of exon 9 in the wild-type and mutant neonatal genomes.
  • FIG. 6a shows the results of Western blot analysis of fibroblast lysates using antibodies against PS1 protein (left: N-terminal fragment (PS1 NTF), right: C-terminal fragment (PS1 CTF)).
  • B shows the results of measuring the amounts of two types of amyloid ⁇ proteins in the fibroblasts collected from the ear tissue of the mutant marmoset (8 months old) obtained in the example. It was collected from the ear tissue of the mutant marmoset (8 months old) obtained in Example 4.
  • the present invention relates to a non-human primate AD model.
  • the non-human primate is not particularly limited as long as it is a primate capable of suffering from Alzheimer's disease.
  • primates include strepsirrhinis (fox monkeys, loris, galagos, etc.) and haplorhini (tarsier monkeys, spider monkeys, omax monkeys, marmosets, old world monkeys, colobus, apes, etc.).
  • strepsirrhinis fox monkeys, loris, galagos, etc.
  • haplorhini tarsier monkeys, spider monkeys, omax monkeys, marmosets, old world monkeys, colobus, apes, etc.
  • it is not limited to these.
  • non-human primates are Old World monkeys (Rhesus monkeys, Cynomolgus monkeys, etc.), Marmosets (Common marmosets, Black-tufted marmosets, etc.).
  • the marmoset AD model of this aspect is suitable for studying AD.
  • Reasons include human-like genetic background and brain structure, human-like cognitive behavior associated with the prefrontal cortex, visual and auditory communication, and a small body size (eg 350-500 g). ), With a relatively short gestation period (145 days), effective reproduction (40 to 80 newborns per female) and a relatively long lifespan (10 to 13 years in captivity). .. Another reason is that the accumulation of amyloid ⁇ protein is observed with aging starting from about 7 years of age, and the sequence of amyloid ⁇ protein is the same as that of humans.
  • the marmoset AD model according to the present invention is characterized in that the exon 9 splice site of the PSEN1 gene is disrupted.
  • the disruption may be carried out using a genome editing technique known per se, for example, it can be carried out using a CRISPR-Cas9 system or TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease).
  • TALEN Transcription Activator-Like Effector Nuclease
  • FIG. 1 conceptually shows a highly active TALEN (Platinum TALEN) that targets the 3'-splice site of exon 9 of the marmoset PSEN1 gene.
  • TALEN_AS_L shown on the left and TALEN_AS_R shown on the right can be constructed by a method known per se, for example, using a Platinum Gate TALEN kit.
  • TALEN_AS_L and TALEN_AS_R are TALEN target sites, the squared sequence is the exon of the marmoset PSEN1 gene, and the bold "AG" adjacent upstream of exon 9 is the 3'-splice site of exon 9. Also, the 5'-splice site is the "GT” (not shown) adjacent downstream of the exon 9.
  • the term "exon 9 3'-splice site of the PSEN1 gene” refers to 2 nucleotides present at the 3'end of intron 8 for exon 8 and exon 9 splicing. Point. "Deficiency of the 3'-splice site of exon 9 of the PSEN1 gene” means a functional deficiency of the 3'-splice site.
  • the deletion is caused by a deletion of one or both of the above two nucleotides (nucleotides A only, nucleotide G only, or both nucleotides AG) (see FIGS. 2 and 3).
  • the "deletion of a site containing at least the 3'-splice site of exon 9 of the PSEN1 gene (related to the exon 9 splice)" is due to the essential deletion.
  • the above-mentioned deletion is a partial deletion of the 3'end of intron 8 (including the above nucleotides AG) and the 5'end of exon 9; a partial deletion of the 3'end of intron 8 (including the above nucleotides AG or nucleotide A).
  • the overall length of the deletion that results in the deletion is arbitrary as long as the deletion contains one or both of the above two nucleotides and does not affect the splicing of exons other than exon 9.
  • the defect may be caused by a deletion of the 5'-splice site of exon 9 of the PSEN1 gene.
  • the meaning of the above deficiency in the other embodiment is understood by replacing the following points in the description of the immediately preceding two paragraphs. 1. 1. Replace “3'-splice site” with “5'-splice site”. 2. Replace “exon 8 and exon 9" with “exxon 9 and exon 10". 3. 3. Replace "3'end of intron 8" with "5'end of intron 9". 4. Replace "5'end of exon 9" with "3'end of exon 9”. 5. Replace "nucleotide A" with "nucleotide G", replace “nucleotide G” with "nucleotide T", and replace "nucleotides AG" with "nucleotides GT”.
  • "deficiency of a site containing at least a 5'-splice site or a 3'-splice site of exon 9 of the PSEN1 gene (related to the exon 9 splice)” is an intron. It can be caused by a deletion of the branch site present in. Introns can be introns 8, introns 9, or both introns 8 and 9 of the PSEN1 gene. It is known that the branch site is often near the 3'end in the intron, and the polypyrimidine base region (repetition of Py) continues downstream of the site.
  • the branch site can be a site containing nucleotide A 20-40 nucleotides (referred to as 21-34 nucleotides) upstream of the 3'-splice site. Deletion of the branch site means that at least the above nucleotide A is deleted.
  • the above-mentioned three different deletions may be present at the same time, or any two of the three deletions may be present at the same time.
  • An example of a method for manufacturing a marmoset AD model according to the present invention is as follows. Introduce TALEN mRNA into the nucleus of fertilized marmoset eggs, targeting the 3'-splice site of exon 9 of the marmoset PSEN1 gene. Surveyor assays and sequencing analysis may be performed after subcloning, or only embryos with defects at the target site containing the 3'-splice site may be removed. For example, it is possible to cause a defect with a high probability of 2 out of 3. After the introduction of TALEN, RT-PCR and cDNA sequencing can be performed to confirm the elimination of exon 9 in PSEN1 mRNA. According to this method, RNA extracted from a fertilized egg or a single blastomere in the 4-cell stage does not have a wild-type sequence, and a deletion of the 3'-splice site can occur in the allele. it can.
  • TALEN mRNA into the egg and lead to fertilization.
  • the fertilized egg can be grown to a 6-cell stage or higher and transplanted into a surrogate mother.
  • the introduction of TALEN does not cause any obvious side effects during pregnancy or subsequent development.
  • a marmoset containing a heterozygous 3'-splice site eg, with a 6 bp deficiency, can be obtained.
  • Exon 9 exclusion can be confirmed by performing RT-PCR and subsequent cDNA sequencing on the resulting marmoset AD model mRNA (eg, mRNA extracted from marmoset hair root samples).
  • the ratio of amyloid ⁇ proteins A ⁇ 42 and A ⁇ 40 abundance A ⁇ 42 / A ⁇ 40 is higher than that of the wild-type marmoset, as shown in Examples described later.
  • the value of A ⁇ 42 / A ⁇ 40 is 1.4 times or more, 1.6 times or more, 1.8 times or more, or twice or more as compared with the wild type.
  • TALEN plasmid was prepared using the Platinum Gate TALEN Kit (Addgene) by the method described in SCIENTIFIC REPORTS 2013, Nov 29; 3: 3379. Doi: 10.1038 / srep03379. The brief is as follows. A platinum TALEN containing a homodimer-type FokI nuclease domain was constructed by a two-step Golden Gate assembly method using the Platinum Gate TALEN kit (Addgene; cat # 1000000043). The assembled repeating array was subsequently introduced into the final destination vector, ptCMV-153 / 47-VR.
  • TALEN mRNA was prepared using "mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Transcription Kit” (Thermo Fisher Scientific, AM1345). Transcript mRNA (Transcribed mRNA) was purified using the "MEGA clear Transcription Clean-Up Kit” (Thermo Fisher Scientific, AM 1908). The full-length sequence of the prepared plasmid is shown in SEQ ID NO: 1 (Left_TALEN) and SEQ ID NO: 2 (Right_TALEN) in the sequence listing.
  • Eggs injected with mature culture and in vitro fertilization TALEN were added with deactivated FBS (final concentration 5%), hFSH (Fuji Pharma, final concentration 0.15 IU / mL), hCG (ASKA Pharmaceutical, final concentration 10 IU / mL).
  • Eggs matured in the MI (Metaphase I) stage or higher were selected by maturation culture in POM medium (Functional Peptide Research Institute / IFP1010P) for 24 hours or longer.
  • Pollm used for fertilization were collected from wild-type male marmosets and subjected to in vitro fertilization (IVF) using TYH medium (LSI Rulece / DR01031). The next day (approximately 16 hours after the start of IVF), IVF was released, the success or failure of fertilization was judged based on the presence or absence of pronuclear cells, and the acquired fertilized eggs were selected.
  • Embryo transfer and pregnancy management Fertilized eggs were subjected to initial in vitro culture using Sequencial Cleav. (Origio / 83040010A), and embryos that had developed into the 4-cell stage or higher were selected 2-3 days after the start of culture. Late in vitro culture was performed using a medium containing Sequencial Blast (Origio / 83060010A) deactivated FBS (final concentration 10%) and L-glutamine (final concentration 2 mM), and one week after the injection of TALEN, the foster parents It was transplanted into the uterus using non-invasive catheter surgery.
  • Sequencial Cleav. Origio / 83040010A
  • FBS final concentration 10%
  • L-glutamine final concentration 2 mM
  • Genomic DNA analysis Genomic DNA was recovered using the QIAamp DNA micro kit (Qiagen / 56304) from the umbilical cord blood obtained during the hair or cesarean section of the offspring.
  • the PCR reaction for analyzing the PSEN1 gene was performed using KOD plus neo (TOYOBO / 401), two primers Psen1_Ex9_up1 (ACCCGCGACTCCCTATTATT: SEQ ID NO: 3), and Psen1_Ex9_dn1 (TGCCTTGACTGTATTGTTGG: SEQ ID NO: 4), and the reaction conditions were 94 ° C.
  • the PCR reaction for confirming the exon 9 deficiency of the PSEN1 gene was KOD plus neo and two primer sets designed on the nearby exons: Pn1_on_Ex7_up1 (TACCTCCCTGAATGGACTGC: SEQ ID NO: 5) and Pn1_on_Ex11_dn2 (TGGTTGTGTTCCAGTCTCCA: SEQ ID NO: 6); And using either Pn1_on_Ex8_up1 (GGTCCACTTCGTATGCTGGT: SEQ ID NO: 7) or Pn1_on_Ex11_dn1 (GGCTGTTGCTGAGGCTTTAC: SEQ ID NO: 8), the reaction conditions were 94 ° C for 2 minutes, 98 ° C for 10 seconds, 60 ° C for 10 seconds, 68 ° C 30.
  • Tissue pieces were attached to a cell culture dish and cultured in a D-MEM (Thermo fisher scientific / 10566016) with 10% deactivated FBS added at 37 ° C. in a 5% CO 2 environment.
  • D-MEM Thermo fisher scientific / 10566016
  • TALEN mRNA targeting the 3'-splice site of exon 9 of the marmoset PSEN1 gene was introduced into the nucleus of a fertilized marmoset egg, and after subcloning, a surveyor assay and a sequencing assay were performed. As shown in FIG. 2a, two of the three fertilized eggs were found to be defective at the target site containing the sequence of the 3'-splice site, as expected. Next, after injecting TALEN into fertilized marmosets, RT-PCR and cDNA sequencing were performed to confirm the elimination of exon 9 in PSEN1 mRNA. As shown in b of FIG.
  • PS1 protein is a catalytic subunit of the ⁇ -secretase complex whose substrate is a type 1 transmembrane protein containing amyloid precursor protein (APP) and Notch.
  • exon 9 results in loss of ⁇ -secretase function, as the region encoded by exon 9 is present at the endoproteolysis site, which requires cleavage for ⁇ -secretase maturation. Bring. Homozygous deletion of marmoset PSEN1 exon 9 causes embryonic lethality by disruption of Notch signaling.
  • Example 2 Based on the results obtained in the fertilized egg, TALEN mRNA was introduced into the egg as described above, and an attempt was made to lead to fertilization. After fertilization, the fertilized egg was grown to the morula stage and transplanted to a surrogate mother. TALEN infusion did not cause any obvious side effects during pregnancy or subsequent development. In this way, an F0 marmoset (PSEN1- ⁇ E9) with a 6 bp deletion containing a heterozygous 3'-splice site was obtained (photograph of the newborn is shown in a of FIG. 3). A surveyor assay was performed on genomic DNA extracted from cord blood. The results are shown in b of FIG. In FIG.
  • FIG. 3b the left two columns are surveyor assays using neonatal genomic DNA (genomic DNA extracted from neonatal umbilical cord blood in FIG. 3a) as a template (lane 1: in FIG. 3a).
  • the results of a mixture of neonatal genomic DNA and wild-type control blood (CB) samples, Lane 2: neonatal genomic DNA only) are shown.
  • the two columns on the right show experimental controls (+ for positive controls,-for negative controls).
  • FIG. 3c shows the results of PCR performed on RNA extracted from the hair roots of the obtained mutant marmosets and wild-type marmosets.
  • the two right columns show negative PCR data for the same RNA sample that reacted without RT. As shown in c of FIG.
  • Example 3 A ⁇ in cultures of wild-type and PSEN1- ⁇ E9 (I774gmF) marmosets primary fibroblasts was measured by ELISA (Wako, 294-62501, 290-62601). The results are shown in FIG. A ⁇ 40 decrease, A ⁇ 42 increase, and A ⁇ 42 / A ⁇ 40 ratio increase were observed in PSEN1- ⁇ E9 marmoset fibroblasts, indicating that the PSEN1- ⁇ E9 mutation is pathogenic (pathogenic). Was done.
  • the method of causing exon skipping by introducing a mutation at the 3'-splice site is compared with the method of cutting and deleting both ends of the exon by genome editing or the knock-in method, on the genomic DNA. Since it can be achieved by inducing DNA double-strand breaks in one place, it seems to be highly efficient and useful.
  • a method of creating a disease model that reproduces the pathological condition of a disease (Alzheimer's disease) by introducing mutations into such a splicing-related sequence by genome editing is considered to be a useful method.
  • a method of performing genome editing on an egg and then fertilizing it is useful for avoiding embryonic lethality. It was considered a means.
  • Example 4 Two PSEN1- ⁇ E9 neonates (I943 gmM and I949 gmM) were further obtained according to the same procedure as in Example 2 (a in FIG. 5). A surveyor assay was performed on genomic DNA extracted from umbilical cord blood for three individuals including I774gmF. The results are shown in b of FIG. The symbols shown at the bottom of b in FIG. 5 are CB: genome extracted from newborn umbilical cord blood, HR: genome extracted from newborn hair root, M: marker, + N: Normal Genome added, + And-: Reagent control, respectively. In addition, as shown in c of FIG.
  • I774 gmF and I943 gmM have a deletion of 6 bp containing the 3'-splice site in the heterozygous state
  • I949 gmM has a deletion of 9 bp containing the 3'-splice site in the heterozygous state. It had a deletion in the PSEN1 gene.
  • PS1 proteins in membrane fractions obtained from wild-type (I774gmF) and PSEN1- ⁇ E9 (I943gmM and I949gmM) marmosets fibroblasts were analyzed by Western blot. The results are shown in a of FIG.
  • the left panel shows the results of using an antibody against the N-terminal fragment (NTF) of PS1 protein.
  • the right panel shows the results of using an antibody against the C-terminal fragment (CTF) of PS1 protein.
  • the arrowhead points to the NTF and CTF produced by the endoproteolysis of PS1, and the arrow points to the full-length PS1 protein.
  • Sodium-potassium ATPase was used as a load control for the membrane fraction.
  • a ⁇ in the culture medium of the primary fibroblasts was quantified by sandwich ELISA (Wako, 294-62501, 290-62601).
  • the non-human primate AD model of the present invention is extremely useful for the development of diagnostic and therapeutic methods for Alzheimer's disease.
  • Alzheimer's disease with spastic paraparesis and'cotton wool' plaques two pedigrees with PS-1 exon 9 deletions. Brain: a journal of neurology 126, 783-791 (2003). 14. Sato, K. et al. Generation of a Nonhuman Primate Model of Severe Combined Immunodeficiency Using Highly Efficient Genome Editing. Cell stem cell 19, 127-138, doi: 10.1016 / j.stem.2016.06.003 (2016). 15. Tomita, T. & Iwatsubo, T. Structural biology of presenilins and signal peptide peptidases.

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Abstract

ヒトADの病態を再現できる動物モデルを提供する。アルツハイマー病モデル非ヒト霊長類は、PSEN1遺伝子のエクソン9のスプライスに関連する部位を欠損している。

Description

非ヒト霊長類アルツハイマー病モデル動物及びその製造方法
　本発明は、非ヒト霊長類アルツハイマー病モデル動物及びその製造方法に関する。
　アルツハイマー病（Alzheimer’s disease, AD）は、認知症の主な原因疾患であり、患者数は世界的に5000万人にも達するとされているが、有効な予防手段、治療方法が確立されておらず、その原因の一つとして有用な動物モデルが存在しないことが挙げられている。マウスを用いたモデルも複数確立されているが、霊長類との生物学的差異から、ヒトADの病態を反映できていない部分も多い。
Sasaguri H. et al. APP mouse models for Alzheimer's disease preclinical studies. EMBO J 1;36(17):2473-2487, doi: 10.15252/embj.201797397 (2017). Saito T. et al. Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease. Nat Neurosci. 17(5):661-663. doi:10.1038/nn.3697 (2014). Oakley H et al. Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation. J Neurosci. 26(40):10129-10140. doi:10.1523/JNEUROSCI.1202-06. (2006).
　本発明は、世界初の非ヒト霊長類ADモデルの提供を目的とする。
　発明者らは、前記課題を解決するため種々検討したところ、マーモセット胚および個体において、Transcription Activator-Like Effector Nuclease (TALEN)を用いて、プレセニリン１（PSEN1）遺伝子のエクソン9の3’-スプライス部位（3’ splice site, acceptor site）を一部または全部欠失させることにより得られた変異PSEN1マーモセット個体がヒトAD患者でみられる病的パターンを再現することを見出し、本発明を完成させた。即ち本発明は、以下の通りである。
　［１］PSEN1遺伝子のエクソン9の5’または3’スプライス部位を少なくとも含みかつ当該エクソン9のスプライスに関連する部位が欠損した、アルツハイマー病モデル非ヒト霊長類。
　［２］非ヒト霊長類がマーモセットである、［１］記載の霊長類。
　［３］PSEN1遺伝子のエクソン9の5’または3’スプライス部位を少なくとも含みかつ当該エクソン9のスプライスに関連する部位を、ゲノム編集技術を用いて欠損させる工程を含む、アルツハイマー病モデル非ヒト霊長類の製造方法。
　［４］卵子においてPSEN1遺伝子のエクソン9の5’または3’スプライス部位を少なくとも含みかつ当該エクソン9のスプライスに関連する部位を欠損させることを特徴とする、［３］記載の方法。
　［５］非ヒト霊長類がマーモセットである、［３］または［４］記載の方法。
　また、別の一態様において、本発明は、以下の通りである。
　［６］PSEN1遺伝子のエクソン9のアクセプター部位が欠損したアルツハイマー病モデル非ヒト霊長類。
　［７］非ヒト霊長類がマーモセットである、［６］記載の霊長類。
　［８］PSEN1遺伝子のエクソン9のアクセプター部位を、ゲノム編集技術を用いて欠損させる工程を含む、アルツハイマー病モデル非ヒト霊長類の製造方法。
　［９］卵子においてPSEN1遺伝子のエクソン9のアクセプター部位を欠損させることを特徴とする、［８］記載の方法。
　本発明の一態様によれば、ヒトADの病態を再現できる。
本発明に利用可能なマーモセットのエクソン9の3’-スプライス部位を標的にする高活性型TALEN（Platinum TALEN）の一例を概念的に示す概略図である。図中、四角枠で囲まれる部分は、TALEN標的サイト及びマーモセットのPSEN1 遺伝子のエクソンであり、数字はエクソンの番号を意味する。またエクソン9の3’-スプライス部位（「AG」）は、エクソン9の上流側に位置する。 図２のａは、実施例で行った、TALEN注入後のマーモセット受精卵のサーベイヤーアッセイの結果（左の３列、右の列のPCはポジティブコントロール、NCはネガティブコントロールを示す）であり、図２のｂは、実施例で行った、TALEN注入及びその後のPSEN1 mRNA分析の概略を示す模式図であり、図２のｃは、実施例で行った、TALEN注入後の受精卵のRT-PCRの結果である。 図３のａは、実施例で得られた本発明に係るマーモセットADモデルの新生児の写真であり、図３のｂは、前記新生児の臍帯血から抽出されたゲノムDNAを対象にして、サーベイヤーアッセイを実施した結果を示し、図３のｃは、前記新生児及び野生型マーモセットの毛根から抽出されたRNAを対象にして実施したPCRの結果を示す。 図４は、実施例で得られた変異マーモセット（８ヶ月齢）の耳組織から採取した線維芽細胞中の２種類のアミロイドβタンパク質量を測定した結果を示す。 図５のａは、実施例４で得られた本発明に係るマーモセットADモデルの新生児の写真であり、図５のｂは、前記新生児の臍帯血から抽出されたゲノムDNAを対象にして、サーベイヤーアッセイを実施した結果を示し、図５のｃは、野生型および変異型の新生児ゲノムおけるエクソン9の3’-スプライス部位周辺の配列を示す。 図６のａは、PS1タンパク質（左：N末端断片（PS1 NTF）、右：C末端断片（PS1 CTF）に対する抗体を用いた、線維芽細胞溶解物のウェスタンブロット解析の結果を示し、図６のｂは、実施例で得られた変異マーモセット（８ヶ月齢）の耳組織から採取した線維芽細胞中の２種類のアミロイドβタンパク質量を測定した結果を示す。線維芽細胞はいずれも、実施例４で得られた変異マーモセット（８ヶ月齢）の耳組織から採取された。
　本発明は、非ヒト霊長類ADモデルに関する。非ヒト霊長類としては、アルツハイマー病を罹患し得る霊長類であれば特に限定されない。例えば、霊長類としては、曲鼻類（キツネザル類、ロリス類、ガラゴ類等）や直鼻類（メガネザル類、クモザル類、オマキザル類、マーモセット類、オナガザル類、コロブス類、類人猿等）があげられるが、これらに限定されない。好ましい態様において、非ヒト霊長類はオナガザル類（アカゲザル、カニクイザル等）、マーモセット類（コモンマーモセット、クロミミマーモセット等）である。本態様のマーモセットADモデルは、ADの研究に適する。理由としては、遺伝的背景と脳構造がヒトに類似し、前頭前野に関連する人間のような認知行動をし、視覚的および聴覚的コミュニケーションができること、また、小さいボディサイズ（例えば、３５０－５００ｇ）で、比較的短い妊娠期間（１４５日）で、効果的な生殖（雌1匹あたり４０から８０の新生児）ができ、比較的長い寿命（飼育下で１０～１３年）という特徴が挙げられる。また、７齢頃からはじまる老化に伴いアミロイドβタンパク質の蓄積が認められ、アミロイドβタンパク質の配列がヒトと同一であることも適する理由である。
　本発明に係るマーモセットADモデルは、PSEN1遺伝子のエクソン9のスプライス部位が破壊されていることを特徴とする。破壊は、自体公知のゲノム編集技術を用いて行えばよく、例えば、CRISPR-Cas9システムやTALEN（Transcription Activator-Like Effector Nuclease）を用いて実施することができる。一態様において、高活性型TALEN（Platinum TALEN）を用いるのが好ましい。なお、エクソン9を含む欠失変異またはPSEN1遺伝子のエクソン9のスプライス部位の点変異は、選択的スプライシングによるmRNAのエクソン9の排除を引き起こすことが報告されているが、実際に前記部位の破壊によって、非ヒト霊長類ADモデルの作製に成功したのは本発明者らが初めてである。
　図１に、マーモセットのPSEN1遺伝子のエクソン9の3’-スプライス部位を標的にする高活性型TALEN（Platinum TALEN）を概念的に示す。図中、左に示すTALEN_AS_L及び右に示すTALEN_AS_Rはそれぞれ、例えば、Platinum Gate TALEN キットを用いて、自体公知の方法で構築できる。TALEN_AS_L及びTALEN_AS_RがTALEN標的サイトであり、四角で囲んだ配列がマーモセットのPSEN1遺伝子のエクソンであり、エクソン9の上流に隣接する太字の「AG」がエクソン9の3’-スプライス部位である。また、5’-スプライス部位はエクソン9の下流に隣接する「GT」（図示せず）である。
　好ましい実施形態において、図１に示す通り、用語「PSEN1遺伝子のエクソン9の3’-スプライス部位」は、エクソン8およびエクソン9のスプライシングのために、イントロン8の3’末端に存在する２ヌクレオチドを指す。「PSEN1遺伝子のエクソン9の3’-スプライス部位の欠損（deficiency）」は、当該3’-スプライス部位の機能的な不完全性（deficiency）を意味する。上記欠損は、上記２ヌクレオチドのうち、一方または両方（nucleotide Aのみ、nucleotide Gのみ、または両方のnucleotides AG）の欠失（deletion）によって生じる（図２および３を参照）。当該実施形態において、「PSEN1遺伝子のエクソン9の3’-スプライス部位を少なくとも含む（当該エクソン9のスプライスに関連する）部位の欠損」は、上記欠失に必須に起因する。
　上記欠損は、イントロン8の3’末端（上記nucleotides AGを含む）およびエクソン9の5’末端の部分的な欠失；イントロン8の3’末端（上記nucleotides AGまたはnucleotide Aを含む）の部分的な欠失；ならびにnucleotide Gもしくはnucleotides AG、およびエクソン9の5’末端の部分的な欠失である。上記欠損を生じる欠失の全長は、当該欠失が、上記２ヌクレオチドのうち、一方または両方を含み、かつエクソン9以外のエクソンのスプライシングに影響しない限り、任意である。
　図１に示されている好ましい実施形態とは別の実施形態において、上記欠損は、PSEN1遺伝子のエクソン9の5’-スプライス部位の欠失によって生じてもよい。当該別の実施形態における上記欠損の意味は、直前の２段落の記載のうち、以下の点を置き換えることによって、理解される。
１．「3’-スプライス部位」を「5’-スプライス部位」に置き換える。
２．「エクソン8およびエクソン9」を「エクソン9およびエクソン10」に置き換える。
３．「イントロン8の3’末端」を「イントロン9の5’末端」に置き換える。
４．「エクソン9の5’末端」を「エクソン9の3’末端」に置き換える。
５．「nucleotide A」を「nucleotide G」に、「nucleotide G」を「nucleotide T」に、「nucleotides AG」を「nucleotides GT」に置き換える。
　上述した２つの実施形態と異なる実施形態において、「PSEN1遺伝子のエクソン9の5’-スプライス部位または3’-スプライス部位を少なくとも含む（当該エクソン9のスプライスに関連する）部位の欠損」は、イントロンに存在するブランチ部位の欠失によって生じ得る。イントロンは、PSEN1遺伝子のイントロン8、イントロン9、またはイントロン8および9の両方であり得る。ブランチ部位は、イントロン内の3'末端に近傍にあることが多く、当該部位の下流にポリピリミジン塩基領域（Pyの反復）が続くことが知られている。本発明の一態様において、ブランチ部位は、3’-スプライス部位の２０～４０ヌクレオチド（２１～３４ヌクレオチドと言われている）上流にあるnucleotide Aを含む部位であり得る。ブランチ部位の欠失は、上記nucleotide Aを少なくとも欠失していることを指す。
　なお、本発明に係るマーモセットADモデルのゲノムには、上述した異なる３つの欠失が同時に存在し得る、または３つの欠失のうち、任意の２つが同時に存在し得る。
　本発明に係るマーモセットADモデルの製造方法の一例は、以下の通りである。マーモセットの受精卵の核に、マーモセットのPSEN1 遺伝子のエクソン9の3’-スプライス部位をターゲットにするTALEN mRNAを導入する。サブクローニング後にサーベイヤーアッセイ及びシークエンシング分析を行ってもよいし、3’-スプライス部位を含むターゲットサイトに欠損が生じている胚のみを取り出してもよい。例えば、３個中２個といった高い確率で欠損を生じさせることができる。TALEN導入の後に、RT-PCR及びcDNAシークエンシングを行い、PSEN1の mRNAの中のエクソン9の排除を確認することができる。この方法によれば、４細胞期の受精卵又は単一割球から抽出されるRNAには、野生型のシークエンスは存在せず、3’-スプライス部位の欠損を対立遺伝子中に生じさせることができる。
　卵子にTALEN mRNAを導入し、受精に導くのが好ましい。受精後、受精卵は6細胞期胚以上まで成長させ、代理母に移植することができる。前記TALEN導入によっては、妊娠またはその後の発達中に明白な副作用は引き起こされない。この様にして、ヘテロ接合状態の3’-スプライス部位を含む、例えば、6 bpの欠損を持つマーモセットを得ることができる。得られたマーモセットADモデルのmRNA（例えば、マーモセットの毛根サンプルから抽出されたmRNA）について、RT-PCR及びそれに続くcDNAの配列決定を実施して、エクソン9の除外を確認できる。
　本発明のマーモセットADモデルは、後述する実施例に示す通り、アミロイドβタンパク質Aβ42及びAβ40の存在量の比率Aβ42／Aβ40が、野生型マーモセットと比較して高くなっている。例えば、本発明のマーモセットADモデルは、Aβ42/Aβ40の値が、野生型と比較して、1.4倍以上、1.6倍以上、1.8倍以上、又は2倍以上である。
　以下に実施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　以下の動物実験は、いずれも「動物の愛護及び管理に関する法律」「実験動物の飼養及び保管並びに苦痛の軽減に関する基準」「研究機関等における動物実験等の実施に関する基本指針（文部科学省告示）」に基づいて策定された公益財団法人実験動物中央研究所の「動物実験等に関する規程」に従って行った。
　［材料および方法］
　TALENプラスミドの作製
　TALENプラスミドは、Platinum Gate TALEN Kit（Addgene）を用いて、SCIENTIFIC REPORTS 2013, Nov 29; 3: 3379. Doi:10.1038/srep03379に記載されている通りの手法で作製した。簡潔には次の通りである。プラチナムゲートTALEN（Platinum Gate TALEN） キット(Addgene; cat#1000000043) を用いた２工程ゴールデンゲートアッセンブリ法（two-step Golden Gate assembly method）により、ホモダイマー型FokIヌクレアーゼドメインを含むプラチナムTALENを構築した。組み立てられた繰り返しアレイを、最終的なデスティネーションベクター（destination vector）であるptCMV-153/47-VRに引き続き導入した。TALEN mRNAは、「mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Transcription Kit」(Thermo Fisher Scientific, AM1345)を用いて作製した。転写mRNA（Transcribed mRNA）を「MEGAclear Transcription Clean-Up Kit」(Thermo Fisher Scientific, AM1908)を用いて精製した。作製したプラスミドの全長配列を配列表の配列番号1（Left_TALEN）、および配列番号2（Right_TALEN）に示す。
　［TALENベクター配列］
　［配列番号1］
AGAAGGGGCTCCCGCACGCGCCTGCATTGATTAAGCGGACCAACAGAAGGATCCCCGAGAGGACATCACATCGAGTGGCAGGTTCCCAACTCGTGAAGAGTGAACTTGAGGAGAAAAAGTCGGAGCTGCGGCACAAATTGAAATACGTACCGCATGAATACATCGAACTTATCGAAATTGCTAGGAACTCGACTCAAGACAGAATCCTTGAGATGAAGGTAATGGAGTTCTTTATGAAGGTTTATGGATACCGAGGGAAGCATCTCGGTGGATCACGAAAACCCGACGGAGCAATCTATACGGTGGGGAGCCCGATTGATTACGGAGTGATCGTCGACACGAAAGCCTACAGCGGTGGGTACAATCTTCCCATCGGGCAGGCAGATGAGATGCAACGTTATGTCGAAGAAAATCAGACCAGGAACAAACACATCAATCCAAATGAGTGGTGGAAAGTGTATCCTTCATCAGTGACCGAGTTTAAGTTTTTGTTTGTCTCTGGGCATTTCAAAGGCAACTATAAGGCCCAGCTCACACGGTTGAATCACATTACGAACTGCAATGGTGCGGTTTTGTCCGTAGAGGAACTGCTCATTGGTGGAGAAATGATCAAAGCGGGAACTCTGACACTGGAAGAAGTCAGACGCAAGTTTAACAATGGCGAGATCAATTTCCGCTCATAAAAAATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTTTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGCACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGCGCTGCGATGATACCGCGAGAACCACGCTCACCGGCTCCGGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATCGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATATTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGAACATTATCGCGAGCCCATTTATACCTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTACGCGCGCGTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGCCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAACTAAGCAGAAGGCCCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTCTGTGTTGTAAAACGACGGCCAGTCTTAAGCTCGGGCCCCCTGGGCGGTTCTGATAACGAGTAATCGTTAATCCGCAAATAACGTAAAAACCCGCTTCGGCGGGTTTTTTTATGGGGGGAGTTTAGGGAAAGAGCATTTGTCAGAATATTTAAGGGCGCCTGTCACTTTGCTTGATATATGAGAATTATTTAACCTTATAAATGAGAAAAAAGCAACGCACTTTAAATAAGATACGTTGCTTTTTCGATTGATGAACACCTATAATTAAACTATTCATCTATTATTTATGATTTTTTGTATATACAATATTTCTAGTTTGTTAAAGAGAATTAAGAAAATAAATCTCGAAAATAATAAAGGGAAAATCAGTTTTTGATATCAAAATT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　［配列番号2］
AGAAGGGGCTCCCGCACGCGCCTGCATTGATTAAGCGGACCAACAGAAGGATCCCCGAGAGGACATCACATCGAGTGGCAGGTTCCCAACTCGTGAAGAGTGAACTTGAGGAGAAAAAGTCGGAGCTGCGGCACAAATTGAAATACGTACCGCATGAATACATCGAACTTATCGAAATTGCTAGGAACTCGACTCAAGACAGAATCCTTGAGATGAAGGTAATGGAGTTCTTTATGAAGGTTTATGGATACCGAGGGAAGCATCTCGGTGGATCACGAAAACCCGACGGAGCAATCTATACGGTGGGGAGCCCGATTGATTACGGAGTGATCGTCGACACGAAAGCCTACAGCGGTGGGTACAATCTTCCCATCGGGCAGGCAGATGAGATGCAACGTTATGTCGAAGAAAATCAGACCAGGAACAAACACATCAATCCAAATGAGTGGTGGAAAGTGTATCCTTCATCAGTGACCGAGTTTAAGTTTTTGTTTGTCTCTGGGCATTTCAAAGGCAACTATAAGGCCCAGCTCACACGGTTGAATCACATTACGAACTGCAATGGTGCGGTTTTGTCCGTAGAGGAACTGCTCATTGGTGGAGAAATGATCAAAGCGGGAACTCTGACACTGGAAGAAGTCAGACGCAAGTTTAACAATGGCGAGATCAATTTCCGCTCATAAAAAATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTTTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGCACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGCGCTGCGATGATACCGCGAGAACCACGCTCACCGGCTCCGGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATCGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATATTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGAACATTATCGCGAGCCCATTTATACCTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTACGCGCGCGTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGCCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAACTAAGCAGAAGGCCCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTCTGTGTTGTAAAACGACGGCCAGTCTTAAGCTCGGGCCCCCTGGGCGGTTCTGATAACGAGTAATCGTTAATCCGCAAATAACGTAAAAACCCGCTTCGGCGGGTTTTTTTATGGGGGGAGTTTAGGGAAAGAGCATTTGTCAGAATATTTAAGGGCGCCTGTCACTTTGCTTGATATATGAGAATTATTTAACCTTATAAATGAGAAAAAAGCAACGCACTTTAAATAAGATACGTTGCTTTTTCGATTGATGAACACCTATAATTAAACTATTCATCTATTATTTATGATTTTTTGTATATACAATATTTCTAGTTTGTTAAAGAGAATTAAGAAAATAAATCTCGAAAATAATAAAGGGAAAATCAGTTTTTGATATCAAAATT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　成熟培養および体外受精
　TALENを注入した卵子は非働化したFBS（最終濃度5％）、hFSH(Fuji Pharma、最終濃度0.15IU/mL)、hCG(ASKA Pharmaceutical、最終濃度10 IU/mL)を添加したPOM培地(機能性ペプチド研究所/IFP1010P)中で24時間以上成熟培養し、MI（Metaphase I）期以上に成熟した卵子を選抜した。受精のために用いる精子は、野生型の雄のマーモセットより採取し、TYH medium（LSIメディエンス/DR01031）を用いて体外受精（in vitro fertilization: IVF）を行った。翌日（IVF開始からおよそ16 時間後）にIVFを解除し、前核細胞の有無を基準として受精の成否を判定し、獲得された受精卵を選抜した。
　胚移植と妊娠管理
　受精卵はSequencial Cleav. (Origio/83040010A) を用いて初期の体外培養を行い、培養開始から2-3日経過した時点で4細胞期以上へと発生した胚を選抜した。後期の体外培養はSequencial Blast (Origio/83060010A) に非働化したFBS（最終濃度10%）、L-glutamine（最終濃度2mM）を添加したメディウムを用いて行い、TALENの注入から一週間後に仮親の子宮へ非観血式のカテーテル手術を用いて移植した。胚移植後は、仮親の血中P4値の測定や超音波診断装置による子宮の観察によって妊娠判定を行い、妊娠が確定した個体については、週１回の定期健診によって胎子の心拍の状態・形態学的な異常の有無などを観察した。分娩は基本的に自然分娩を採用し、仮親や子の状態を鑑みて自然分娩が困難と判断された場合は帝王切開術によって産子を獲得した。
　ゲノムDNA解析
　産子の体毛または帝王切開を実施した際に得た臍帯血から、QIAamp DNA micro kit (Qiagen/ 56304) を用いてゲノムDNAを回収した。PSEN1遺伝子を解析するためのPCR反応はKOD plus neo (TOYOBO/401)と2つのプライマーPsen1_Ex9_up1 (ACCCGCGACTCCCTATTATT：配列番号３)、Psen1_Ex9_dn1 (TGCCTTGACTGTATTGTTGG：配列番号４) を用いて行い、反応条件は94℃ 2分の加熱後、98℃ 10秒、60℃ 10秒、68℃ 30秒を35サイクル実施し、反応終了後は一部をアガロースゲル上で電気泳動することで増幅の有無を確認した。一部の増幅産物は遺伝子改変を可視的に検出することが可能なサーベイヤーアッセイに供与し、他方はZero Blunt PCR Cloning Kit （Thermo fisher scientific / K275040）を用いてシークエンスベクターにクローニングし、大腸菌（DH5α株）にプラスミドを導入することで形質転換を行った。これにより得られたサブクローンからプラスミドを回収し、シークエンス解析を行った。
　cDNA解析
　産子の体毛または帝王切開を実施した際に得た臍帯血から、Nucleospin RNA plus XS (Takara/ U0990B) を用いてTotal RNAを回収した後、ReverTra Ace -α- (TOYOBO/ FSK-101)を用いてcDNAを合成した。PSEN1遺伝子のエクソン9欠損の確認を行うためのPCR反応はKOD plus neoと、近傍のエクソン上に設計した2つのプライマーセット：Pn1_on_Ex7_up1 (TACCTCCCTGAATGGACTGC：配列番号５)およびPn1_on_Ex11_dn2 (TGGTTGTGTTCCAGTCTCCA：配列番号６)；ならびにPn1_on_Ex8_up1 (GGTCCACTTCGTATGCTGGT：配列番号７)およびPn1_on_Ex11_dn1 (GGCTGTTGCTGAGGCTTTAC：配列番号８)のいずれかを用いて行い、反応条件は94℃ 2分の加熱後、98℃ 10秒、60℃ 10秒、68℃ 30秒を35サイクル実施した。反応を終えたサンプルは1.5%アガロースゲルにて電気泳動し、増幅産物のバンドシフトを捉えることでエクソン9の欠損を推定した。一部の増幅産物はZero Blunt PCR Cloning Kitを用いてシークエンスベクターにクローニングし、大腸菌（DH5α株）にプラスミドを導入することで形質転換を行った。これにより得られたサブクローンからプラスミドを回収し、シークエンス解析を行った。
　初代培養
　産子の耳朶組織を少量採取したものを細断した。組織片を細胞培養用ディッシュに貼り付け、10%非働化FBS添加済みのD-MEM (Thermo fisher scientific/ 10566016)を用いて37℃、5%CO2環境下にて培養した。
　［実施例１］
　マーモセットのPSEN1遺伝子のエクソン9の3’-スプライス部位をターゲットとするTALEN mRNAを、マーモセット受精卵の核に導入した後、サブクローニング後に、サーベイヤーアッセイ及びシークエンシングアッセイを実施した。図２のａに示す通り、３つの受精卵のうち２つに、期待通り、3’-スプライス部位のシークエンスを含むターゲットサイトに欠損が認められた。次に、マーモセットの受精卵へのTALEN注入後、RT-PCR及びcDNAシークエンシングを行って、PSEN1 mRNA中のエクソン9の排除を確認した。図２のｂに示す通り、TALEN注入後、４細胞期になる受精卵又は単一割球からRNAを抽出した。図２のｃに示す通り、エクソン9の完全な排除が、２つの４細胞期受精卵及び２つの単一割球に認められた。これらの3’-スプライス部位が欠損した受精卵及び単一割球のいずれにも、野生型のシークエンスはなかった。このことから、3’-スプライス部位の欠損が、バイアレリック（biallelic）様式で生じていると考えられる。PS1タンパク質は、その基質が、アミロイド前駆体タンパク質（APP）とノッチ（Notch）を含むタイプ１膜貫通タンパク質である、γ-セクレターゼ複合体の触媒サブユニットである。エクソン9によってコードされている領域が、自己切断（endoproteolysis）部位に存在し、γ-セクレターゼの成熟にはこの部位での切断が必要であるため、エクソン9の排除はγ-セクレターゼの機能喪失をもたらす。マーモセットのPSEN1エクソン9のホモ接合性の欠失は、Notchシグナル伝達の破壊による胚致死を引き起こす。
　［実施例２］
　受精卵で得られた結果に基づいて、卵子に上記通りにTALEN mRNAを導入し、受精に導くことを試みた。受精後、受精卵を桑実胚期まで成長させ、代理母に移植した。TALEN注入は、妊娠またはその後の発達中に明白な副作用を引き起こさなかった。この様にして、ヘテロ接合状態の3’-スプライス部位を含む6 bpの欠失を持つF0マーモセット（PSEN1-ΔE9）が得られた（新生児の写真を図３のaに示す）。臍帯血から抽出されたゲノムDNAを対象にして、サーベイヤーアッセイを実施した。結果を図３のｂに示す。図３のｂ中、左の２列は、テンプレートとして、新生児ゲノムDNA（図３のａにおける新生児の臍帯血から抽出されたゲノムDNA）を用いたサーベイヤーアッセイ（レーン１：図３のａにおける新生児のゲノムDNAおよび野生型コントロール血液（CB）サンプルの混合物、レーン２：新生児ゲノムDNAのみ）の結果を示す。右の２列は、実験上のコントロール（+はポジティブコントロール、-はネガティブコントロール）を示す。図３のｃに、得られた変異マーモセット及び野生型マーモセットの毛根から抽出されたRNAを対象にして実施したPCRの結果を示す。２つの右の列は、同一RNAサンプルについて、RTを用いずに反応したネガティブPCRデータを示す。図３のｃに示す通り、エクソン9が排除されたPCR産物のバンドは315 bpに現れ、野生型のバンドは402 bpに現れた。なお、分析した受精卵ではいずれもシングルバンドのみを示したので、ヘテロ接合変異は生じなかったと考えられる。
　［実施例３］
　野生型およびPSEN1-ΔE9（I774gmF）マーモセットの初代線維芽細胞の培養液中のAβをELISA（Wako, 294-62501, 290-62601）にて測定した。結果を図４に示す。PSEN1-ΔE9マーモセット線維芽細胞において、Aβ40低下、Aβ42増加、Aβ42/Aβ40比増加が認められ、PSEN1-ΔE9変異が病原性を有している（病因をなしている）ことが示された。
　PSEN1の遺伝子改変が見られた2匹の個体では、ゲノムDNA解析およびcDNAの解析結果における正常型PSEN1とエクソン9欠損型PSEN1の出現割合はおよそ半数ずつとなっていたことから、ヒトの患者において見られるヘテロ型のPSEN1-ΔE9が再現できたことが強く示唆された。また、線維芽細胞培養液中のAβ定量の結果から、Aβ産生プロファイルの異常を再現しており、作出したPSEN1-ΔE9マーモセットはAD病態を再現していると考えられた。また、今回、3’-スプライス部位に変異を導入することでエクソンスキッピングを起こすという方法は、通常のエクソン両端をゲノム編集で切断して欠失させる方法やノックイン手法と比較して、ゲノムDNA上1か所にDNA二本鎖切断を誘導することで達成可能なことから、効率が高く、有用性が高いと思われる。このようなスプライシングに関連する配列に対しゲノム編集による変異導入を行うことで、疾患（アルツハイマー病）の病態を再現する疾患モデルを作製する方法は有用な方法と考えられる。更に、本発明のような、ホモ接合型では胎生致死になる可能性のある遺伝子変異を標的とした場合に、卵子でゲノム編集を行い、その後に受精させる方法は、胎生致死を回避する有用な手段と考えられた。
　［実施例４］
　実施例２と同様の手順にしたがって、２個体のPSEN1-ΔE9新生児（I943gmMおよびI949gmM）を、さらに得た（図５のａ）。I774gmFも加えた３個体について、臍帯血から抽出されたゲノムDNAを対象にして、サーベイヤーアッセイを実施した。結果を図５のｂに示す。図５のｂの下部に示されている記号は、CB：新生児の臍帯血から抽出されたゲノム、HR：新生児の毛根から抽出されたゲノム、M：マーカ、+N：Normal Genomeを添加、+および-：試薬コントロール、をそれぞれ表している。また、図５のｃに示す通り、I774gmFおよびI943gmMは、ヘテロ接合状態の3’-スプライス部位を含む6 bpの欠失を、I949gmMは、ヘテロ接合状態の3’-スプライス部位を含む9 bpの欠失を、PSEN1遺伝子に有していた。
　野生型（I774gmF）およびPSEN1-ΔE9（I943gmMおよびI949gmM）マーモセットの線維芽細胞から得られた膜画分における、PS1タンパク質をウェスタンブロットによって解析した。結果を図６のａに示す。左パネルは、PS1タンパク質のN末端断片（NTF）に対する抗体を用いた結果である。右パネルは、PS1タンパク質のC末端断片（CTF）に対する抗体を用いた結果である。矢頭は、PS1のエンドタンパク質分解によって生成されたNTFおよびCTFを、矢印は全長PS1タンパク質を指している。ナトリウム－カリウムATPaseを膜画分のロード量コントロールとして使用した。
　また、上記初代線維芽細胞の培養液中のAβを、サンドイッチELISA（Wako, 294-62501, 290-62601）によって定量した。結果を図６のｃに示す。図６のｃは、平均値±標準誤差（WT：n＝１５、ΔE9：n＝９）を表している。図６のｃにおける**P≦0.01、****P≦0.0001は、Student's two-tailed t-testにしたがって有意差があったことを示している。実施例３と同様に、Aβ40低下、Aβ42増加、Aβ42/Aβ40比増加が認められた。なお、Aβ43レベルは検出限界未満であったので、図示していない。
　本発明の非ヒト霊長類ADモデルは、アルツハイマー病の診断及び治療方法の開発に極めて有用である。
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Claims (5)

  1. 　PSEN1遺伝子のエクソン9の5’または3’スプライス部位を少なくとも含みかつ当該エクソン9のスプライスに関連する部位が欠損した、アルツハイマー病モデル非ヒト霊長類。
  2. 　非ヒト霊長類がマーモセットである、請求項１記載の霊長類。
  3. 　PSEN1遺伝子のエクソン9の5’または3’スプライス部位を少なくとも含みかつ当該エクソン9のスプライスに関連する部位を、ゲノム編集技術を用いて欠損させる工程を含む、アルツハイマー病モデル非ヒト霊長類の製造方法。
  4. 　卵子においてPSEN1遺伝子のエクソン9の5’または3’スプライス部位を少なくとも含みかつ当該エクソン9のスプライスに関連する部位を欠損させることを特徴とする、請求項３記載の方法。
  5. 　非ヒト霊長類がマーモセットである、請求項３または４記載の方法。
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