CN101171031A

CN101171031A - 防止和治疗阿尔茨海默病的肽偶联物组合物和方法

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Publication number: CN101171031A
Application number: CNA2006800153890A
Authority: CN
Inventors: V·M·加斯基; J·G·乔斯; P·M·克勒; G·金尼; 梁小平; J·W·希弗
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 2005-05-05
Filing date: 2006-05-01
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2026-05-01
Also published as: RU2007145052A; CA2607868A1; JP2008540417A; ATE535252T1; KR20080005260A; EP1879613A2; EP1879613B1; EP2269633A1; NO20076239L; CN101171031B; IL186793A0; ZA200708635B; WO2006121656A3; US20090098155A1; RU2406529C2; MX2007013825A; US7850973B2; BRPI0610093A2; AU2006246382A1; WO2006121656A2

Abstract

本发明提供了治疗与患者脑中Aβ淀粉样蛋白沉积有关的疾病如阿尔茨海默病的组合物和方法。这些方法需要给予Aβ的免疫原性片段，所述Aβ的免疫原性片段缺乏T细胞表位、能以针对Aβ的抗体形式诱导有益免疫应答。另一方面，Aβ的免疫原性片段能够升高血浆Aβ水平。该免疫原性片段包括Aβ的线性或多价肽。药物组合物包含化学上连接至可与佐剂一起给药的载体分子的免疫原性片段。

Description

防止和治疗阿尔茨海默病的肽偶联物组合物和方法

发明领域

本发明涉及防止和治疗淀粉样形成(amyloidogenic)疾病，尤其是阿尔茨海默病的组合物和方法。

发明背景

阿尔茨海默病(AD)以进行性的记忆受损和认知衰退为特征。其标志性的病理损伤为特定脑区域的淀粉样蛋白沉积(老年斑)、神经原纤维缠结和神经元丧失。该淀粉样蛋白沉积由40至43个氨基酸残基的淀粉样β肽(Aβ)构成，它们为淀粉样前体蛋白(APP)的蛋白酶解产物。神经原纤维缠结为细胞内高度磷酸化的tau蛋白的丝状聚集物(Selkoe，Science，275：630-631，1997)。

AD的发病机理并没有完全清楚，但预期是多因素事件。Aβ在脑组织中的积累和聚集被认为在疾病过程中起关键作用，也称为淀粉样蛋白级联假说(Golde，Brain Pathol.，15：84-87，1995)。根据该假说，Aβ尤其是Aβ₄₂倾向于形成多种形式的聚集体，从小的寡聚体至大的伸长的纤维蛋白原结构。这些聚集体为神经毒性的并且引起与该疾病早期阶段的记忆丧失和认知衰退有关的突触病理学(Klein et al.，Neurobiol.Aging，25：569-580，2004)。最近的出版物指出在多重转基因小鼠模型中Aβ的减少也防止细胞内tau沉积(Oddo et al.，Proc.Neuron，43：321-332，2004)。这个发现提示细胞外的淀粉样蛋白沉积可能引起随后的神经原纤维缠结形成，而其反过来可导致神经元丢失。

用Aβ抗原免疫APP转基因小鼠可减少脑部Aβ沉积并缓解疾病进展。这首先由Shenk et al.，Nature，400：173-177，1999报道，现在已为大量的涉及不同转基因动物模型、多种活性疫苗以及用Aβ特异的单克隆抗体进行被动免疫的研究所确证(Bard et al.，Nature Med，6：916-919，2000；Janus et al.，Nature，408：979-982，2000；Morgan et al.，Nature，408：982-985，2000；DeMattos et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，98：8850-8855，2001；Bacskai et al.，J.Neurosci.，22：7873-7878，2002；Wilcock et al.，J. Neurosci.，23：3745-3751，2003)。与这些动物数据一致，三份发表的对生前接受了聚集前Aβ(1-42)免疫原(AN1792，Betabloc)主动免疫的患者死后人脑组织的评估显示了局部老年斑的清除(Nicoll et al.，Nature Med.，9：448-452，2003；Ferrer et al.，Brain Pathol.，14：11-20，2004；Masliah et al.，Neurology，64：129-131，2005)。这些数据共同表明有效引起针对Aβ抗原的抗体应答的疫苗对AD中发现的病理性老年斑有效。但是，疫苗或抗体有效性的机制仍不明确。

公众域内最先进的基于免疫治疗的AD计划曾为采用AN1792(Betabloc)的主动免疫II期疫苗试验，其中AN1792为由聚集前Aβ(1-42)组成的与佐剂QS-21^TM(Antigenics，New York，NY)共给药的疫苗。在2002年1月，当有4名患者显示与脑膜脑炎一致的症状时，这项研究被终止(Senior，Lancet Neurol.，1：3，2002)。最后，298名经治疗的患者有18名出现了脑膜脑炎迹象(Orgogozo et al.，Neurology，61：46-54，2003)。在脑炎和抗体滴度之间没有相关性，曾有报导称这种作用的很可能的引发机制为针对自身免疫原，尤其是针对Aβ₄₂肽的中间和羧基端部分的T细胞的活化(Monsonego et al.，J.Clin.Invest.，112：415-422，2003)。作为对这种结论的支持，对出现脑炎的两名疫苗接受者脑组织的死后检查显示，在一名患者中有大量的CD4+T细胞的脑膜渗透(Nicoll et al.，Nature Med.，9：448-452，2003)，而在另一名患者中则有大量的CD4⁺、CD8⁺、CD3⁺、CD5⁺、CD7⁺T细胞的脑膜渗透(Ferrer et al.，Brain Pathol.，14：11-20，2004)。

目前的证据提示在被动或主动免疫后血浆Aβ水平的增加反映出外周渗透(peripheral sink)的启动可作为后来脑Aβ降低的前兆。外周渗透指脑和血浆Aβ储库平衡的变化，该变化导致中枢Aβ净外流至外周(参见，例如Deane et al.，J.Neurosci.，25：11495-11503，2005；DeMattos et al.，Pro.Natl.Acad.Sci.USA，98：8931-8932，2001)。其它的研究提示在抗Aβ免疫治疗后观察到血浆Aβ的这种升高是实现随后中枢Aβ降低所必须的(Cribbs et al.，7th International Conference on AD/PD，Sorrento，Italy，2005)。因此，当Aβ内的两个氨基酸被置换(例如出现在Dutch和Iowa突变中的那些)时，该肽就不再能穿过中枢到达外周区室(Davis et al.，Neurobiol.Aging，出版中，2005年8月18日可在网络上获得)。当表达这种突变体形式的Aβ和Swedish突变的小鼠被免疫时，没有发现血浆Aβ的升高并且没有观察到随后脑Aβ的降低。与此相反，表达野生型人Aβ序列加上Swedish突变的小鼠应答主动免疫，伴有血浆Aβ的升高和随后中枢Aβ的降低(Cribbs et al.，7th International Conference on AD/PD，Sorrento，Italy，2005)。因此，预计能够产生导致血浆Aβ水平升高的免疫应答的任何活性疫苗免疫原可用于治疗阿尔茨海默病以及以升高的脑Aβ水平为特征的相关疾病。

本发明申请人出人意料地发现去除了T细胞表位以避免自身T细胞应答的抗原具有免疫原性并可升高血浆Aβ水平。这代表了产生安全有效的AD疫苗的潜在手段。本发明的申请人提供了这种抗原以及用作AD疫苗的制剂。

发明内容

在一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，包含Aβ的免疫原性片段，所述Aβ的免疫原性片段缺乏T细胞表位，能以针对Aβ的抗体形式诱导免疫应答。在一方面，这种组合物包含Aβ的线性8氨基酸肽(8-mer)。在另一方面，这种组合物包含散布有至少一个间隔物的多价线性8-mer或多价分枝的多抗原肽(MAP)。所述药物组合物可用作AD和相关的淀粉样蛋白病的疫苗。

在本发明的另一实施方案中，所述药物组合物为Aβ血浆升高剂，包含Aβ的免疫原性片段，所述免疫原性片段缺乏T细胞表位，能以针对升高血浆Aβ水平的Aβ的抗体形式诱导免疫应答。该药物组合物可用作AD和相关的以升高的脑Aβ水平为特征的淀粉样蛋白病的疫苗。

在本发明的另一实施方案中，所述药物组合物连接至载体分子以形成偶联物，其中该载体协助引起包括针对Aβ片段的抗体的免疫应答。在本发明优选的实施方案中，该载体为脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitides)的外膜蛋白复合物(OMPC)。

在本发明其它的实施方案中，所述药物组合物与药物可接受的佐剂一起给药。在优选的实施方案中，该佐剂为氧化铝佐剂(Merck明矾佐剂，MAA)或基于皂甙的佐剂(

CSL Ltd.，Parkville，Australia)。

在另一实施方案中，本发明提供了防止或治疗与患者脑中Aβ的淀粉样沉积有关的疾病的方法。这些疾病包括阿尔茨海默病、唐氏综合征、认知受损或其它形式的老年性痴呆。该方法包括给予Aβ的免疫原性片段，所述Aβ的免疫原性片段缺乏T细胞表位，选自线性8氨基酸肽(8-mer)、散布有至少一个间隔物的多价线性肽和多价分枝的多抗原肽(MAP)。在优选的实施方案中，该免疫原性片段包含具有聚乙二醇(PEG)间隔物的多价线性肽。在更优选的实施方案中，该免疫原性片段包含偶联至OMPC的多价分枝的MAP，Aβ(3-10)/(21-28)偶联物，构建体No.12，图6A。

这些方法需要向需要这种治疗的患者给予有效剂量的缺乏T细胞表位的Aβ免疫原性片段，这将以针对Aβ的抗体形式诱导免疫应答。所述抗体应答能够升高血浆Aβ水平。在该实施方案的另一方面，该待给药的免疫原性片段被连接到载体分子。在该实施方案的另一方面，该免疫原性片段与佐剂一起给药。

附图简要说明

图1显示了衍生自Aβ(1-42)(SEQ ID NO：1)的合成的8氨基酸肽(8-mer)(SEQ ID NO：2-36)，从中选择肽进行线性肽扫描以鉴定Aβ的表位。

图2显示了所选的用于偶联至KLH(图2A)和OMPC(图2B)的8-mer。

图3显示了图2中描述的所选的Aβ偶联物在第一次(PD1)、第二次(PD2)和第三次(PD3)给药后的免疫原性。

图4显示了从之前用Aβ(3-10)-KLH偶联物(SEQ ID NO：40)免疫的豚鼠提取的血清与人AD脑组织的交叉反应性。图4A显示抗Aβ单克隆抗体6F3D(它识别Aβ的氨基酸8-17)的免疫反应性。染色模式揭示在该人脑中的广泛的淀粉样蛋白沉积病理学。图4B证实该同一脑与来自经免疫的豚鼠在免疫接种前的免疫前血清之间缺乏免疫反应性。图4C显示来自经免疫的豚鼠的血清的免疫反应性。

图5显示代表性的多价线性8-mer肽，它们是基于豚鼠实验中(实施例3)各8-mer的免疫原性选出的。这些偶联物按所述的方法合成并偶联至OMPC(实施例1.J和1.K)。

图6显示代表性的多价分枝的MAP偶联物，它们是基于豚鼠实验中(实施例3)各8-mer的免疫原性选出的。图6A显示代表性的二价MAP，图6B显示代表性的溴乙酰基半胱氨酸MAP。这些偶联物按所述的方法合成并偶联至OMPC(实施例2)。

图7显示在用偶联至OMPC的Aβ(1-18)肽注射1(PD1)或2(PD2)次后从恒河侯收集的血清的抗Aβ₄₀滴度，其中所述Aβ(1-18)肽被配制在作为佐剂的单独的Merck明矾中或Merck明矾加上IMX(

CSL，Ltd.，Parkville，Australia)中。

图8显示在给予Aβ偶联物后血浆Aβ水平的升高。图8A显示，与给予单体构建体Aβ(3-10)(SEQ ID NO：69)和Aβ(21-28)(SEQ ID NO：73)后相比，在给予包含偶联至OMPC的Aβ(3-10)/(21-28)(构建体No.12，图6A)后超过三倍的升高(□，构建体No.12，图6A；●，Aβ(3-10)(SEQ IDNO 69)，▲，Aβ(21-28)(SEQ ID NO：73)。图8B显示血浆水平与滴度水平无关(□，构建体No.12，图6A；●，Aβ(3-10)(SEQ ID NO 69)，▲，Aβ(21-28)(SEQ ID NO：73)。

定义

术语“8-mer”指8氨基酸肽，它对应于Aβ片段、天然Aβ肽的类似物或肽模拟物。一个或多个8-mer可以与至少一个间隔物结合以形成多价线性肽或形成多价分枝的MAP。

术语“Aβ偶联物”指的是，通过化学或生物学方式与载体例如钥孔血蓝蛋白或膜炎奈瑟球菌(Nesseria meningitidies)外膜蛋白复合物(OMPC)连接的Aβ的8-mer或免疫原性片段。

术语“Aβ肽”指本文描述的任何Aβ肽，包括但不限于线性8-mer、具有至少一个间隔物的多价线性肽以及多价分枝的多抗原肽(MAP)。

术语“表位”指B和/或T细胞应答的抗原上的位点。B细胞表位可由连续氨基酸或通过蛋白三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。从连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时仍保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丧失。T细胞表位由能够与宿主MHC分子形成复合物的肽组成。用于人I类MHC分子的T细胞表位负责诱导CD8⁺T细胞应答，通常包含9至11个氨基酸残基，而用于人II类MHC分子的表位负责CD4⁺T细胞应答，通常包含12个或更多个氨基酸残基(Bjorkman et al.Nature 329：506-512，1987；Madden et al.Cell75：693-708；Batalia and Collins；Engelhard Annu Rev Immunol.，12：181-207-622.1995；Madden，Annu Rev Immunol.，13：587-622.1995)。与T细胞不同，B细胞能够识别少至长4个氨基酸的肽。正是T细胞受体识别的T细胞表位/MHC复合物导致T细胞活化。

用在本文时，术语“Aβ的免疫原性片段”或“缺乏T细胞应答的Aβ免疫原性片段”指能够诱导针对Aβ的抗体的形式的免疫应答，但该应答不包括针对自身抗原Aβ的T细胞应答的8-mer或Aβ片段。

术语“免疫学的”或“免疫”或“免疫原性”应答指针对脊椎动物中的抗原的体液(抗体介导的)和/或细胞(通过抗原特异性T细胞或它们的分泌产物介导的)应答。这种应答可为通过给予免疫原诱导的主动免疫或通过给予抗体诱导的被动免疫。

术语“多价肽”指具有多于1个抗原决定簇的肽。

术语“药物组合物”指适合向哺乳动物个体给药的化学或生物组合物。用在本文时，它指包含本发明描述的Aβ的8-mer、免疫原性片段和Aβ偶联物的组合物，任选地与或不与佐剂一起给药。

发明详细说明

如之前所述，临床前研究提示，引起抗Aβ多克隆抗体应答的主动免疫对转基因小鼠(过表达淀粉样前体蛋白)中AD相关的病理和认知症状具有效力(Bard et al.，Nature Med.，6：916-919，2000；Janus et al.，Nature，408：979-982，2000；Morgan et al.，Nature，408：982-985，2000；DeMattos et al.，Proc Natl.Acad.Sci.，98：8850-8855，200l；Bacskai et al.，J.Neurosci.，22：7873-7878，2002；Wilcoc，et al.，J.Neurosci.，23：3745-3751，2003)。这些临床前研究得到一项临床试验的支持，其中聚集体形式的Aβ42被用作主动免疫原。这项研究的初步证据表明，在治疗后有病理(Nicoll et al.，Nature Med.，9：448-452，2003；Ferrer et al.，Brain Pathol.，14：11-20，2004；Masliah et al.，Neurology，64：129-131，2005)和认知改善(Gilman et al.，Neurology，64(9)：1553-1562，2005)。尽管这些研究结果是鼓舞人心的，并且与临床前研究一致，但该治疗被证明是不安全的，并在大约6％的经治疗患者中出现脑膜脑炎后终止(Orgogozo et al.，Neurology，61：46-54，2003)。因此，亟需能够激发有效免疫应答并避免不利安全问题的主动免疫方法。

在了解该临床前试验中不利事件的性质方面已有些进展。几位研究人员现在已在死后评估中报道了存在CD4⁺和CD8⁺阳性脑膜渗透物(Nicoll，et al.，Nature Med.，9：448-452，2003；Ferrer et al.，Brain Pathol.，14：11-20，2004)，暗示存在针对自身肽Aβ42的T细胞应答。但是，尽管本领域技术人员意识到在保持合适的抗体应答(B细胞介导的)时需要避免针对自身的T细胞应答，但还未知生产具有这种性质的试剂的方法。这个问题由于缺乏预测性的动物模型或其它能对这些活性有效预测的临床前测定法而变得复杂。

为此，本发明的申请人采用了T和B细胞表位的不同性质来设计用于本发明的表位。通过将线性肽大小限制至8氨基酸，并且如果需要，还移除任何潜在的C末端T细胞锚定残基，来设计疫苗构建体。

因而，本方面的一个方面是鉴别有免疫原性但缺乏T细胞表位的Aβ片段，以用作AD疫苗。在本申请之前，还不是明确知道Aβ肽的哪些氨基酸片段会产生免疫原性应答，同时也缺乏T细胞表位。本领域技术人员会意识到本领域中以前的教导没有预测到例如8-mer会产生免疫原性应答以及没有将有用的片段与Aβ肽的不同区域区分开。参见，例如美国专利No.6,808,712和6,787,144。

本发明的其它方面包括鉴别Aβ血浆升高剂，它包含Aβ的缺乏T细胞表位的免疫原性片段，以针对Aβ的抗体的形式诱导免疫应答并提高血浆Aβ水平。这类试剂可用作AD疫苗，并用于以升高的脑Aβ水平为特征的相关淀粉样蛋白病。在申请人的发明之前，尚不清楚或者说无法预测Aβ的哪些免疫原性片段会导致血浆Aβ水平升高。不希望被任何理论所束缚，但据信本文描述的Aβ血浆升高剂起以针对Aβ的抗体形式诱导免疫应答的作用，根据Aβ清除的外周渗透理论，所述免疫应答产生升高水平的血浆Aβ，从而导致随后脑Aβ的降低。另外，尽管各个Aβ的8-mer或免疫原性片段可能能够诱导免疫应答，从而使得血浆Aβ水平升高，但申请人发现偶联至OMPC的多价分枝的MAP，Aβ(3-10)/(21-28)(构建体No.12，图6A)，相对于其组成部分的单体构建体Aβ(3-10)(SEQ ID NO：69)或Aβ(21-28)(SEQ ID NO：73)来说，在升高血浆Aβ水平方面尤其有效。

淀粉样蛋白病

本发明提供了预防和治疗以淀粉样蛋白沉积的积累为特征的疾病的组合物和方法。淀粉样蛋白沉积包含聚集成不溶物的肽。该肽的性质在不同的疾病中有变化，但是在大多数情况下，该聚集物具有β片层结构且可用刚果红染色。以淀粉样沉积为特征的疾病包括晚期或早期发作的阿尔茨海默病(AD)。在两种疾病中，淀粉样沉积包括称为淀粉样蛋白β(Aβ)的肽，它在患病个体的脑中积累。因此，术语“淀粉样蛋白病”也指以升高的脑Aβ水平为特征的疾病。

治疗剂

用在本发明中的治疗剂以针对Aβ的抗体形式诱导免疫应答。免疫应答的诱导可以是主动的，如当给予免疫原以在个体中诱导与Aβ有反应性的抗体或T细胞时；也可以是被动的，如当给予本身结合个体中的Aβ的抗体时。

用于防止或治疗诸如AD的淀粉样蛋白病的治疗剂包括Aβ的肽片段，它可为任何天然存在的形式(即Aβ39、Aβ40、Aβ42、Aβ42或Aβ43)。这些序列在现有技术中是已知的，例如，参见Hardy et al.，TINS 20：155-158，1997。

当用在本文时，在优选的实施方案中，治疗剂为免疫原性片段，它缺乏T细胞表位，但能以针对Aβ的抗体形式诱导免疫应答。Aβ的免疫原性片段可以是8-mer、具有至少一个PEG间隔物的多价线性Aβ偶联物或多价分枝的MAP Aβ偶联物的形式。治疗剂可以药物组合物的形式给药。在另一实施方案中，治疗剂为Aβ血浆升高剂，其能以针对Aβ的抗体形式诱导免疫应答，并且在个体中升高血浆Aβ水平。这类试剂可包括天然存在的肽片段或可以包括一个或多个置换、添加或缺失，以及可以包括合成或非天然存在的氨基酸。可在本文实施例描述的测定法中筛选有预防和治疗效果的片段和构建体。

尽管在优选的实施方案中，所述治疗剂包含Aβ的肽片段，但是，这些试剂也可以包括不必与Aβ有显著氨基酸序列相似性，然而可用作Aβ模拟物且诱导类似免疫应答的肽和其它化合物。例如，可筛选适用于本发明的形成β折叠片层的肽和蛋白。类似地，可筛选适用于本发明的组合库和其它化合物。

这类鉴别得到的治疗剂可在化学或生物学上被连接至载体以有利于它们用作免疫原。这类载体包括血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白(KLH)、免疫球蛋白分子、卵清蛋白、破伤风类毒素蛋白，或来自其它诸如白喉、大肠杆菌、霍乱或幽门螺旋杆菌(H.pylori)等病原菌的类毒素，或减毒的毒素衍生物。在本发明优选的实施方案中，所述载体为膜炎奈瑟球菌外膜蛋白复合物(OMPC)。

本发明也关注这类治疗剂在药物组合物中的用途，该药物组合物包含任选地与佐剂一起给药的Aβ的8-mer或免疫原性片段，它们可以被连接到载体。适合的佐剂包括铝盐(明矾)、诸如3 De-O-酰化单磷酰脂A(MPL)的脂质，或基于皂甙的佐剂。在优选的实施方案中，所述佐剂为铝佐剂(Merck明矾佐剂，MAA)或基于皂甙的佐剂(

CSLLtd，Parkville，Australia。

治疗方案

本发明用于预防或治疗AD和其它淀粉样蛋白病的组合物的有效剂量将随很多因素而变化，这些因素包括但不限于给药方式、靶位点、患者的生理状态、所给予的其它药物以及处理是治疗性的(即在疾病症状出现后)还是预防性的(即防止疾病症状出现)。在优选的实施方案中，患者为人，并且治疗剂通过注射给药。

免疫原或治疗剂的使用量也将依赖于佐剂是同时给药还是序贯给药，在没有佐剂时使用较高的剂量。

免疫原或治疗剂的给药量会有变化，但每次注射0.5-50μg肽(基于Aβ肽含量)的量被考虑用于人用。本领域技术人员会知道如何配制包含本文描述类型的抗原的组合物。

给药方案由初级免疫及随后的设定间隔的加强注射构成。初级免疫和加强免疫之间的间隔、加强注射之间的间隔以及加强免疫的次数将取决于抗体滴度和疫苗诱导的时长。它也将取决于抗体应答的功能有效性，即防止AD出现或在AD患者中表现出治疗效果所需的抗体滴度水平。典型的方案由原始设定的在1、2和6个月时的注射组成。另一方案由在1和2个月时的初始注射组成。对于任一种方案，加强注射将每6个月或每年进行一次，这取决于抗体滴度和持续时间。给药方案也可以是基于需要，如通过监测患者体内的免疫应答来确定。

鉴别AD疫苗表位

为了确定Aβ肽的哪些8氨基酸片段(“8-mer”)足以产生免疫原性应答，申请人系统性地用小的(8氨基酸)交叠合成肽(SEQ ID NO：2-37)扫描了全长Aβ₄₂，该小的交叠合成肽衍生自显示在图1的天然存在的Aβ序列(SEQ ID NO.1)。合成用作抗原、跨越全长Aβ₄₂的29个交叠的8氨基酸肽(图2A)。为了改善溶解性，通过加入三联赖氨酸(SEQ ID NO：52、53、54、56、59、60、62、64和65)或谷氨酰胺(EEE)(SEQ ID NO：50、51和61)残基或使用聚乙二醇(PEG)(SEQ ID NO：55和63)间隔物对几种肽进行修饰。为此，将跨越对应于残基(11-18)和(13-20)的Aβ序列的肽制备成多种形式，第一种形式在N末端具有6-氨基己酸(Aha)间隔物和用于化学交联的官能团，而其它形式在C末端具有Aha和官能团。作为对照，申请人包括进了较长肽，Aβ(1-18)。

用在本文时，免疫原性肽可以是衍生自天然存在的即野生型的或合成的Aβ(SEQ ID NO：1)或其任何突变体或变体的8-mer肽(8个氨基酸残基)。这种突变体或变体可通过本领域普通技术人员已知的合成或重组方法产生。这种变体的一个实例为EV底物(EVEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA)(SEQID NO：66)，为对应于Aβ(1-42)的肽，其中野生型Aβ的位置1和2被改变。

用在疫苗制剂中的Aβ偶联物

对用于配制疫苗的Aβ偶联物的选择是基于8-mer的免疫原性。为了确定物种中带有与人Aβ序列相同的序列的8-mer的免疫原性，将29种肽(图2A)偶联至KLH以形成Aβ偶联物并在豚鼠中测试(图3)。作为对照免疫原，将Aβ(1-18)-KLH(SEQ ID NO：37)包括在该分析中。

如实施例3.B中所描述的，用配制在明矾和50μg

(CSL，Ltd.，Parkville，Australia)中的偶联的免疫原免疫豚鼠。为了区分免疫原性的和非免疫原性的Aβ₄₂片段，将豚鼠以4周的间隔期免疫三次。在免疫后三周，收集血样并通过ELISA测试针对Aβ₄₀肽的抗体滴度。这些滴度显示在图3中，分别为给药1次后(PD1)、给药2次后(PD2)和给药3次后(PD3)。

在首次注射后(PD1)，如所述18-mer对照一样，一些肽区域引起了显著的抗体滴度。具体地，对应于Aβ氨基酸1-8、2-9、3-10、17-24、21-28和33-40的Aβ偶联物都产生了超过1∶800的滴度。在第二次注射后(PD2)，Aβ偶联物中的15个引起超过1∶1000的抗体滴度。对给药3次后(PD3)的分析进一步证实，Aβ的某些区域相对于其它区域有更高的免疫原性。11区域表现超过1∶6000的滴度。这些包括对应于Aβ氨基酸1-8、3-10、7-14、11-18、13-20、15-22、19-26、21-28、23-30、27-34和29-36的区域。这些区域中，5个区域为高免疫原性的(＞1∶10000)，包括：区域1-8、15-22、21-28、23-30和29-36。该数据提示Aβ的某些8氨基酸区域为高免疫原性的，而其它区域(例如5-12、25-32、31-38和35-42)为非免疫原性的(滴度＜1∶300)。这些结果也证实，尽管Aβ偶联物能够引起Aβ₄₀肽特异的抗体应答，但不是所有的Aβ片段具有同等的免疫原性。

Aβ肽-KLH偶联物的免疫反应性

为了证实在用Aβ肽-KLH偶联物免疫后的豚鼠中生成的免疫血清与人AD有关，进行了研究以评估来自用Aβ(3-10)-KLH(SEQ ID NO：40)偶联物免疫的豚鼠的多克隆血清的免疫反应性。通过免疫组织化学测试在第二次注射Aβ(3-10)-KLH(SEQ ID NO：40)偶联物后4周时从豚鼠收集的血清样品与人AD脑组织的反应性(实施例4)。

如图4所示，Aβ(3-10)-KLH(SEQ ID NO：40)偶联物产生的免疫原性应答产生抗体应答，其直接针对人AD脑组织。图4A显示单克隆抗Aβ抗体6F3D(Vector Laboratories)的免疫反应性。如所显示的，该脑具有广泛的Aβ沉积，其具有预期的人AD的典型方式。图4B显示免疫前的豚鼠血清缺乏免疫反应性。图4C显示在两次注射Aβ(3-10)-KLH(SEQID NO：40)偶联物之后该相同豚鼠血清的阳性免疫反应性。总之，该数据证实通过ELISA监测的免疫原性包含针对该AD组织中发现的人Aβ的显著免疫应答。这些结果确认并将Aβ特定区域赋予不同免疫原性的惊人发现扩展至证实这种应答以与治疗应用一致的方式被控制。

生成OMPC偶联物和多抗原性偶联物

基于豚鼠中的免疫原性、Aβ42氨基酸序列内肽片段的相对位置、Aβ片段的溶解性和采用OMPC作为载体蛋白的可行性，申请人选择了7种8-mer(图2B)用于OMPC偶联。这些肽片段对应于Aβ的以下氨基酸区域：1-8、2-9、3-10、7-14、17-24、21-28和33-40。

本文描述的发明包括多价肽偶联物，如那些显示在图5、6A和6B中的。多价分枝的MAP-OMPC偶联物(图6A和6B)通过采用基于赖氨酸的骨架来生成，而多价线性8-mer-OMPC偶联物(图5)则采用PEG接头来制备。本领域技术人员会理解，与也可用在本发明中的常规氨基酸接头相比，PEG接头具有免疫原性较低和肽溶解性较大的优点。在本发明优选的实施方案中，免疫原性片段为偶联至OMPC的多价MAP。本领域技术人员应理解的是，这种偶联物并非是肽与载体是1∶1比例。相反，多个肽以球形方式附着到每个OMPC分子。本领域技术人员还应理解的是，多价线性构建体和MAP的使用将增强溶解性、制剂稳定性、免疫原性和多克隆应答的多样性。

OMPC偶联物疫苗的免疫原性

为了评估Aβ肽-OMPC偶联物的免疫原性并进一步评估佐剂对这种疫苗构建体的好处，申请人着手在恒河猴中的研究。用Aβ(1-18)-OMPC(剂量基于Aβ肽含量)偶联物接种恒河猴，该偶联物配制在Merck明矾佐剂(MAA)或MAA和

(CSL，Ltd.，Parkville，Australia)中。收集血样并用于确定针对Aβ₄₀的抗体滴度。对该进行中的研究的中间分析证实在第一次给药后(PD1)，接受含5μg疫苗的明矾的猴没有出现任何可检测的滴度，而那些接受含30μg疫苗的明矾的猴出现了低的Aβ₄₀特异滴度。接受明矾和制剂的所有猴都出现了显著的抗体滴度。在给药2次后(PD2)，在仅有明矾中的两种剂量的Aβ偶联物产生类似的滴度水平，而接受明矾和

的组出现了相对于仅有明矾组高10倍的抗体滴度。这项研究的结果证实Aβ-OMPC偶联物在非人灵长类中有免疫原性。该数据还证明这种偶联物疫苗的有效性被基于皂甙的佐剂如

显著增强。

实施例

实施例1

制备Aβ偶联物

本实施例描述Aβ肽片段的制备，所述Aβ肽片段随后用于Aβ偶联物以针对Aβ的抗体形式诱导免疫应答。

A.制备Aβ(8-mer)肽(SEQ ID NO：37-65；图2A)

合成打算偶联至马来酰亚胺衍生的载体蛋白的肽，在羧基末端具有半胱氨酸残基。在原始肽序列和羧基末端半胱氨酸之间并入间隔物Aha(6-氨基己酸)作为结构元件，以在偶联过程中最小化对载体蛋白的空间可及性。此外，以EEE、KKK或PEG为代表的增溶残基被引入序列14、15、16、17、18、19、20、23、24、25、26、27、28、29中的C末端。PEG单元作为O-(N-Fmoc-2-氨乙基)-O′-(2-羧乙基)-十一二醇[Fmoc-NHCH₂CH₂O(CH₂CH₂O)₁₀CH₂CH₂OCH₂CH₂CO₂H]引入。

从Rink Amide MBHA树脂开始，采用制造商(Applied Biosystems，Foster City，CA)提供的Fmoc化学操作在自动肽合成仪上通过固相合成来制备Aβ肽。在组装之后，结合树脂的肽被脱保护并采用94.5％三氟乙酸、2.5％1，2-乙二硫醇(ethanedithiol)、1％三异丙基硅烷(triisopropylsilane)和2.5％H₂O的混合物从树脂切下。在处理两小时后，过滤反应物、浓缩并用乙醚研磨得到的油状物。将固体产物过滤，溶于50％乙酸/H₂O中并冷冻干燥。通过在C-18支持物上采用0.1％TFA/H₂O/乙腈梯度通过RPHPLC实现对半纯产物的纯化。通过分析HPLC评估级分。合并纯级分(＞98％)并冷冻干燥。通过氨基酸分析和质谱分析证实同一性。

B.制备Aβ肽-KLH偶联物(SEQ ID NO：37-65；图2A)

为了制备KLH偶联物，将2mg的具有C末端半胱氨酸的Aβ肽(8-mer)悬浮在1ml商品化的马来酰亚胺偶联缓冲液(83mM磷酸钠、0.1M EDTA、0.9M NaCl、0.02％叠氮钠，pH 7.2)(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)中。将2mg商品化的马来酰亚胺活化的KLH(PierceBiotechnology，Rockford，IL)样品加至肽，并使其在25℃反应4小时。通过采用100,000Da透析袋的彻底的PBS缓冲液透析从未反应的肽和试剂中分离出偶联物。在70小时酸水解后通过氨基酸分析评估引入偶联物中的肽的量。肽浓度被确定为在0.24和0.03mg/ml之间。

C.合成溴乙酰化的Aβ肽(SEQ ID NO：67-77；图2B)

通过标准的t-Boc固相合成，采用引入氨基酸的双偶联法在AppliedBiosystems 430A型自动分析仪上来制备溴乙酰化的肽。从对甲基二苯甲胺树脂开始，引入羧基末端氨基酸t-Boc-Lys(Fmoc)-OH，随后引入序列中后面的氨基酸。将Aha作为间隔物引入到所有这些序列，将PEG单元引入序列3 5和37以帮助水溶。将PEG单元作为O-(N-Boc-2-氨乙基)-O′-(N-二羟乙酰基-2-氨乙基)己二醇[Boc-NHCH₂CH₂O(CH₂CH₂O)₆CH₂CH₂NHCOCH₂OCH₂CO₂H]引入。氨基末端通过偶联乙酸来加帽。在组装原始序列之后，通过用哌啶处理移除羧基末端赖氨酸ε氨基的Fmoc保护基团。之后，使N^ε氨基基团与溴乙酸酐在作为溶剂的二氯甲烷中反应30分钟。通过用液体氢氟酸和作为清除剂的10％茴香醚处理，完成肽的脱保护和从树脂支持物移除肽。采用0.1％TFA/乙腈梯度在反相C-18硅胶柱上通过制备HPLC纯化所述肽。通过分析HPLC和质谱分析证实了肽的同一性和均一性。

D.合成溴乙酰化的二价MAP，构建体No.8，图6A

溴乙酰化的多抗原肽(MAP)的合成类似于实施例1.C中所描述的合成方法。在将羧基末端的Fmoc-Lys(ivDde)-OH[ivDde＝1，(4，4-二甲基-2，6-二氧-亚环己基)-3-甲基-丁基]偶联至MBHA树脂后，采用哌啶移除α氨基Fmoc保护基团并通过引入t-Boc-Lys(Fmoc)-OH继续合成。在t-Boc基团脱保护后，用以下的t-Boc保护的氨基酸延伸序列：Aha、Y、G、S、D、H、R、F、E，并通过在ABI合成仪上偶联乙酸来给氨基末端加帽。用哌啶除去侧链赖氨酸Fmoc保护基团，并通过引入以下被保护的基团在ABI合成仪上延伸赖氨酸的N^ε臂：Aha、H、H、V、E、Y、G、S、D，并通过偶联乙酸给氨基末端加帽。通过用含5％酰肼的二甲基甲酰胺处理5分钟移除ivDde保护基团，以提供羧基末端赖氨酸上未阻断的N^ε氨基基团，如实施例1.C所述，所述N^ε氨基基团被溴乙酸酐进一步处理。从树脂切下肽。它随后的纯化和表征如实施例1.C所述。

E.合成溴乙酰化的MAP，构建体No.11和12，图6A

MAP构建体No.11和12的制备如同实施例1.D中所描述的。

F.合成半胱氨酸多价MAP，构建体No.9，图6A

从MBHA树脂开始，在ABI自动合成仪上组装以下的t-Boc保护的氨基酸：C、Lys(Fmoc)、Aha、Y、G、S、D、H、R、F、E，然后用乙酸偶联。除去赖氨酸的N^ε氨基Fmoc保护基团，并通过引入以下的t-Boc保护的氨基酸然后偶联乙酸来继续合成：Aha、H、H、V、E、Y、G、S、D。树脂结合肽的分离、纯化和表征如实施例1.C。注意：在HF切割中，不是使用实施例1.C的10％茴香醚而是对甲酚：对硫代甲酚的1∶1混合物作为清除剂。

G.合成半胱氨酸二价MAP，构建体No.10、13和14，图6A

如实施例6.F所述制备二价MAP，构建体No.10、13和14，图6A。将PEG单元作为O-(N-Boc-2-氨乙基)-O′-(N-二羟乙酰基-2-氨乙基)己二醇[Boc-NHCH₂CH₂O(CH₂CH₂O)₆CH₂CH₂NHCOCH₂OCH₂CO₂H]引入。

H.合成溴乙酰化的多价MAP，构建体No.16，图6B

采用ABJ自动合成仪，使Fmoc-Lys(t-Boc)-OH偶联至MBHA树脂。在除去赖氨酸N^ε氨基的t-Boc保护基团后，通过引入以下的t-Boc保护的氨基酸延伸序列：Aha、Y、G、S、D、H、R、F、E，然后偶联乙酸。通过用哌啶手动处理除去赖氨酸的Nα Fmoc保护基团。通过引入Fmoc-Lys(t-Boc)-OH，然后引入以下的t-Boc保护的氨基酸(在ABI合成仪上)并偶联乙酸来进一步处理序列：Aha、H、H、V、E、Y、G、S、D。如之前所述除去赖氨酸Fmoc N^α氨基保护基团，并通过引入Fmoc-Lys(t-Boc)-OH，然后引入以下t-Boc保护的氨基酸并偶联乙酸来继续合成：Aha、K、N、S、G、V、D、E、A。除去赖氨酸上的N^αFmoc保护，并通过引入Fmoc-Lys(t-Boc)-OH，然后引入以下t-Boc保护的氨基酸并偶联乙酸来继续合成：Aha、V、V、G、G、V、M、L、G。在除去赖氨酸Nα Fmoc保护基团后，使树脂结合肽与溴乙酸酐反应，如实施例1.C所述。分离和表征终产物如同实施例1.C所述。

I.合成多价MAP，构建体No.15和17，图6B

如实施例1.F和1.H所述合成MAP Aβ偶联物，构建体No.15和17，图6B。

J.合成溴乙酰化的多价线性肽，构建体No.1，图5

从MBHA树脂开始，采用t-Boc化学在ABI自动合成仪上合成原始序列，如实施例6.A所述。采用BOP试剂作为偶联剂，中间的PEG单元被作为Fmoc-1-氨基-4，7，10-三噁烷13-十三胺琥珀酸[Fmoc-NHCH₂CH₂CH₂O(CH₂CH₂O)₂CH₂CH₂CH₂NHCOCH₂CH₂CO₂H]引入。哌啶被用于使Fmoc基团脱保护。氨基末端的溴乙酰化如实施例1.C所述。分离和表征期望的产物如实施例1.C所述。

K.合成多价线性Aβ肽，构建体No.2、5、6和7，图5

如实施例1.J所述合成多价线性Aβ肽，构建体No.2、5、6和7。

实施例2

Aβ肽化学偶联至OMPC

本实施例介绍将来源于人Aβ₄₂的肽化学偶联至纯化的膜炎奈瑟球菌B型外膜蛋白复合物(OMPC)。该偶联的化学性质为卤乙酰基衍生的肽和巯基衍生的膜复合物蛋白之间的反应。如上所述合成淀粉样肽，溴乙酰基官能团在二价线性表位肽的N末端，或者在单价线性和分枝的MAP形式的C末端或通过赖氨酸残基的ε氨基连接。通过由6-氨基己酸(Aha)组成的间隔物分开BrAc基团和成熟肽。参见以上描述的序列。将描述代表性肽Aβ(3-10)的偶联。按照标准的无菌操作，在层流环境中进行含OMPC溶液的所有操作。

A.OMPC的硫醇化

从例如Fu的用于生产

和肺炎球菌偶联疫苗的美国专利No.5,494,808中描述的方法获得纯化的无菌OMPC，采用试剂N-乙酰基高半胱氨酸硫代内酯(NAHT，Aldrich，St.Louis，MO)在其表面易接近的赖氨酸残基的一部分上硫醇化。在4℃下，水中的117mg OMPC通过289,000xg离心60分钟而沉淀，弃去上清。将鼓泡通入N2的活化溶液(0.11M硼酸钠，pH 11)加入离心管，以玻璃搅拌棒取出沉淀。将悬浮液转移至玻璃Dounce匀浆器，以30次抽动使其重悬。洗涤离心管，并将洗涤液用Dounce匀浆器30次抽动来洗涤。将重悬的沉淀和洗涤液合并在清洁的容器中，得到10mg/mL浓度的OMPC。将固体DTT和EDTA溶解在鼓泡通入N2的活化溶液中，并以0.106mg DTT/mg OMPC和0.57mg EDTA/mg OMPC的比例加入反应容器。在温和搅拌后，NAHT被溶解在鼓泡通入N2的水中，并以0.89mg NAHT/mg OMPC的比例加入至反应中。在环境温度下在N2罩中避光反应3小时。结束时，如上所述OMPC被沉淀并通过在鼓泡通入N2的偶联物缓冲液(25mM硼酸钠(pH8.5)、0.15M NaCl)中进行Dounce匀浆重悬为6mg/mL来洗涤沉淀。对于最后的重悬，将OMPC按以上方式沉淀并在鼓泡通入N2的偶联缓冲液中通过Dounce匀浆重悬为10mg/mL。取出等份试样用于通过Ellman测定确定游离巯基，大量的产物被避光存贮在冰上，直至使用。测量的巯基含量为0.2至0.3μmol/mL。

B.Aβ肽偶联至OMPC

肽的官能团BrAc含量被认为是1∶1(摩尔比)。称取足够的肽以使BrAc相对于总巯基摩尔过量1.6摩尔。用于每个偶联的总的目标OMPC蛋白为15mg。肽以2.6mg/mL被重悬在鼓泡通入N2的偶联缓冲液中，缓慢加入硫醇化的OMPC溶液。避光反应，在环境温度下孵育约22小时。在环境温度下用5倍摩尔过量的N-乙基马来酰亚胺将残留的游离OMPC巯基基团淬灭18小时。按照偶联操作平行进行仅有硫醇化OMPC的对照。完成淬灭后，将偶联物和对照转移至100,000Da分子量截止透析单元，并相对于至少更换5次偶联缓冲液彻底透析。完成透析后，将样品转移至15ml聚丙烯离心管并在4℃下以2,280xg离心5分钟除去任何聚集物。取出等份试样用于分析，大量产物被储存在4℃。

C.分析Aβ肽-OMPC偶联物

通过改进的Lowry测定确定总蛋白，通过定量氨基酸分析(AAA)来分析偶联物和对照样品。根据对酸水解新生的肽-OMPC键释放的独特残基S-羧甲基高半胱氨酸的定量，确定肽与OMPC摩尔比。由水解稳定残基确定OMPC特定浓度，所述水解稳定残基不存在于肽序列，因而是OMPC蛋白所独有的。假定对于每摩尔SCMHC为1摩尔的肽，则SCMHC/OMPC的比例就等于肽/OMPC含量。采用肽分子量和平均OMPC质量40,000,000Da，从该比例可计算肽的加载量。

偶联的共价性质通过采用4-20％Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)的SDS-PAGE分析来定性确定，其中观察到考马斯染色的偶联物条带相对于对照泳动性向上偏移。

对于所有偶联的BrAc肽，所计算的摩尔加载比例(mol肽/molOMPC)如下：

肽	肽Mw	肽/OMPC(mol/mol)
肽	肽Mw	肽/OMPC(mol/mol)	Aβ(3-10)-BrAcAb(7-14)-BrAcAb(21-28)-BrAcAb (17-24)-BrAcAb(33-40)-BrAcA-D-MAP-BrAcA-B-MAP-BrAcBrAc-线性-D-ABrAc-线性-B-AAb(1-8)-BrAcF-D-MAP-BrAcBrAc-线性-D-FF-G-A-D-MAP-BrAc	1,4121,3441,2221,8091,6012,4982,6222,6492,7731,3782,4632,6155,111	2,7932,2832,1261,7952,1392,1732,1472,2632,1782,7591,3181,812636

实施例3

Aβ偶联物的免疫原性

本实施例描述了能以针对Aβ的抗体形式诱导免疫应答的Aβ偶联物的配制和给药。

A.配制疫苗偶联物

将Aβ肽-KLH偶联物疫苗配制在

(CSL Ltd.，Parkville，Australia)中。所有的Aβ肽-OMPC偶联物疫苗配制在明矾中，无论有没有第二种佐剂如基于皂甙的佐剂

(CSL Ltd.，Parkville，Australia)均可。所有样品操作都在无菌条件下进行。

对于明矾制剂，偶联物以指定的肽浓度被1倍盐水稀释并与对应于制备在无菌盐水(150mM无菌氯化钠溶液)中的900μg/mLMerck明矾的两倍明矾(Merck，产品号39943)混合。因此，疫苗中的靶浓度为450μg/mL Merck明矾或一倍的Merck明矾。对于动物研究，靶肽(抗原)浓度如下：小鼠-12.1μg/mL(剂量0.1mL)；猴-10μg/mL或60μg/mL(剂量0.5mL)以及豚鼠-12.5μg/mL(剂量0.4mL)。将该混合物在室温下孵育两小时。为了获得该注射剂量，将明矾吸收的偶联物用一倍的明矾稀释以达到目标肽浓度。当需要第二种佐剂即

时，对于小鼠研究目标浓度为10μg/ML，对于猴研究，目标浓度为0、100或200μg/mL以及对于豚鼠为125μg/mL。

1.

的制备

采用盒式膜(Slide-A-

Dialysis Cassett，10K MWCO，Pierce，Rockford，IL)，将在2-8℃透析进无菌盐水溶液。在透析过程中无菌盐水溶液更换2-3次。完成透析后，采用注射器式滤器(0.22μM Millex-GV注射器式滤膜，Millipore，Billerica，MA)无菌过滤无菌的经透析的的浓度通过RP-HPLC确定。将

无菌保存在2-8℃，直至使用。

2.Aβ肽-OMPC偶联物和Merck明矾的制备

将Aβ肽-OMPC偶联物储备液稀释进无菌1X盐水溶液。然后将稀释的AD肽-OMPC偶联物储备液加至含2X Merck明矾的1X无菌盐水溶液中并在室温下在旋转轮上混合1小时。室温下使该混合物在工作台上静置15分钟，然后以1500rpm离心10分钟。小心倾出上清(对上清进行UV分析以确定结合到明矾的Aβ肽-OMPC偶联物％)，并将沉淀重悬在无菌1X盐水中。将混合物等分进无菌3mL管式玻璃瓶，然后保存在2-8℃直至最后与

配制。

3.Aβ肽-OMPC/明矾和

疫苗的配制

在最后与

配制前，通过静态光散射法确定Aβ肽-OMPC/明矾在盐水中的颗粒大小以证实结合并监测颗粒稳定性。在搅拌下，将无菌经透析的1X盐水中的

加至无菌的150mMNaCl中的Aβ肽-OMPC/明矾。给瓶加塞、加帽并压皱，直至完全密封。在注射前将疫苗保存在2-8℃。注射前，每种疫苗涡动3-5分钟。

B.在豚鼠中偶联物疫苗的免疫原性

从Harlan Inc.，Indianapolis，IA得到6至10周龄的雌性豚鼠并根据常规指导饲养在Merck研究实验室的动物房中。所有的动物实验都得到Merck Research Laboratories Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)的批准。将抗原制备在磷酸盐缓冲盐水中并配制在指定的佐剂中。

在40μg

存在下通过肌内注射400μl的偶联物疫苗用显示在图2A中的Aβ肽-KLH偶联物(8μg肽含量或50μg的总偶联物)免疫每组两只动物。以四周的间隔免疫三次。在首次免疫之前(pre-bleed)以及每次免疫三周之后收集血清样品并在抗体滴度测定前保存在4℃。采用Aβ40作为靶抗原按照以下方法通过ELISA测定抗体滴度。

该基于ELISA的分析如下：用每孔50μl在50mM碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)中浓度为4μg/ml的Aβ包被96孔板，4℃过夜。将板用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤并用含有0.05％Tween-20的PBS中3％脱脂乳(乳-PBST)封闭。测试样品在PBST中以4倍系列稀释。将100μl稀释的样品加入每孔，并将板在24℃孵育两小时，随后用PBST洗涤6次。每孔加入50μl在乳-PBST中1∶5000稀释的HRP-偶联第二抗体，并将板在24℃孵育1小时。将板洗涤三次，每孔加入100mM柠檬酸钠(pH 4.5)中的100μl 1mg/ml的邻苯二胺二盐酸盐。在24℃孵育30分钟后，通过每孔加入100μl的1N H₂SO₄终止反应，并采用ELISA读板仪在490nm处读数。抗体滴度被定义为给出OD490nm值高于均值加上偶联物对照孔两倍标准差的最高稀释度的倒数。

显示在图3中的该分析结果证明在第一次注射后(PD1)，一些肽区域引起显著的抗体滴度，如同18-mer对照。尤其是，对应于Aβ氨基酸1-8、2-9、3-10、17-24、21-28和33-40的Aβ肽片段都产生超过1∶800的滴度。在第二次注射后(PD2)，15种8-mer偶联物引起超过1∶1000的抗体滴度。对给药3次后(PD3)的分析进一步证实Aβ肽的某些区域相对于其它区域免疫原性更强。11个区域表现出大于1∶6000的滴度。这些区域包括对应于Aβ氨基酸1-8、3-10、7-14、11-18、13-20、15-22、19-26、21-28、23-30、27-34和29-36的区域。在这些区域中，五个区域是高免疫原性的(＞1∶10000)，包括：区域1-8、15-22、21-28、23-30和29-36。该结果证实8-mer偶联物能够引起Aβ₄₀特异性抗体应答。出人意料并且与以前的教导相反的是，并非Aβ的所有片段都有相等的免疫原性。实际上，这些数据表明某些8-mer为高免疫原性的，而其它的Aβ区域(例如5-12、25-32、31-38和35-42)则是无免疫原性的(滴度＜1∶300)。

C.偶联物疫苗在恒河侯中的免疫原性

在非人灵长类即恒河侯中进行了研究，与在豚鼠中进行的相似，以确定Aβ肽-OMPC偶联物和明矾以及

佐剂是否提供免疫应答。根据Merck Research Laboratories and New Iberia Research Center(The University of Louisiana at Lafayette，New Iberia，LA)的学会动物关怀计划饲养恒河侯(Macacamulatta)。

申请人采用偶联至OMPC的Aβ肽作为模型抗原，包括图2B中显示的8-mer：Aβ(1-8)(SEQ.ID NO：67)、Aβ(3-10)(SEQ.ID NO：69)、Aβ(7-14)(SEQ ID NO：70)、Aβ(17-24)(SEQ ID NO.72)、Aβ(21-28)(SEQ IDNO：73)和Aβ(33-40)(SEQ ID NO.74)；图5中显示的二价线性肽：Aβ(3-10)(7-14)(构建体No.1)、Aβ(3-10)(21-28)(构建体No.2)、Aβ(1-8)(2 1-28)(构建体No.5)；以及显示在图6A中的多价分枝的MAP：Aβ(3-10)(7-14)(构建体No.8)、Aβ(1-8)(21-28)(构建体No.11)、Aβ(3-10)(21-28)(构建体No.12)。

用配制在Merck明矾佐剂(MAA)中的5 μg每种疫苗加上100μg的

每4周免疫一次恒河侯(N＝3)。在每次注射四周后收集血清样品并通过ELISA确定Aβ特异的抗体应答。与来自豚鼠研究的结果一致，所有的偶联物发现在猴中有免疫原性。Aβ特异的抗体滴度在单次注射后就可检测，在随后的注射后进一步增强。通常，对于所测试的偶联物，在第二或第三次免疫之后达到峰值滴度，其中几何平均滴度在25,000至500,000的范围。这些结果证实本文描述的Aβ偶联物能够引起Aβ特异的抗体应答这一发现。

D.佐剂对恒河侯中偶联物疫苗免疫原性的影响

另一项研究在非人灵长类即恒河侯中进行，以确定Aβ肽-OMPC偶联物和基于皂甙的佐剂如

是否能提供改善的免疫应答。申请人采用偶联至OMPC的Aβ(1-18)肽作为模型抗原。根据MerckResearch Laboratories and New Iberia Research Center(The University ofLouisiana at Lafayette，New Iberia，LA)的学会动物关怀计划饲养恒河侯(Macaca mulatta)。

向五组猴(每组三只)给予以下的Aβ(1-18)-OMPC偶联物：(1)明矾中的5μg偶联物(基于肽含量)，(2)明矾中的5μg偶联物+100μg

(3)明矾中的5μg偶联物+50mg

(4)明矾中的30μg偶联物，(2)明矾中的30μg偶联物+100μg

通过在0、8和24周采用结核菌素注射器(Becton-Dickinson，Franklin Lakes，NJ)肌内注射0.5ml的等份试样进行免疫。从0周起(pre-bleed)以四周的间隔收集血清样品并通过ELISA测定针对Aβ40的抗体滴度，如在以上实施例中所描述的那样进行。

该进行中的研究的中间分析证明在PD1时，接受明矾中的5mcg偶联物疫苗的猴没有出现可检测的滴度，而那些接受明矾中的30μg偶联物疫苗的猴出现低的Aβ₄₀特异性滴度。接受明矾加制剂的所有猴都出现了显著的抗体滴度。在PD2时，在仅有明矾中的两个剂量产生类似的滴度水平，然而接受明矾加

的组出现了相对于仅有明矾条件高10倍的抗体滴度。这项研究的结果证实该Aβ肽-OMPC偶联物在非人灵长类中有免疫原性。该数据进一步证实这种偶联物疫苗的有效性被基于皂甙的佐剂如显著增强。

实施例4

豚鼠多克隆血清的免疫反应性

为了证明以上用8-mer KLH偶联物免疫后的豚鼠产生的免疫血清(实施例3.B)与人AD有关，进行了研究以评估用Aβ(3-10)-KLH免疫原免疫的豚鼠的多克隆血清的免疫反应性。在第二次注射该构建体后四周，根据以下的方法从代表性豚鼠收集血液。

在人AD脑切片(BioChain Institute，Inc.，Hayward，CA)上评估多克隆血清的反应性。通过以下方法制备人脑切片：在60℃孵育30分钟，随后在室温下用二甲苯洗涤两次，每次5分钟。随后将切片浸入100％EtOH中两次，每次5分钟，在每次之后在ddH₂O中浸泡5分钟。将切片浸在99％甲酸中3分钟，随后是在ddH₂O中的短暂洗涤以及在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中浸泡5分钟。随后将切片与过氧化物酶阻断剂一起孵育10分钟，接着是5分钟的PBS洗涤。通过暴露于10％山羊血清10分钟来封闭切片并随后用PBS洗涤5分钟。然后将切片与稀释的豚鼠血清在4℃孵育过夜或在室温下孵育1小时。在5分钟的PBS洗涤之后，将切片与稀释的生物素化的山羊抗豚鼠IgG或生物素化的马抗小鼠抗体(5mlPBS中一滴)一起孵育10分钟。在PBS中洗涤切片5分钟，随后与ABC溶液(Vectorstain ABC kit；Vector Laboratories，Inc.)一起孵育30分钟。用PBS洗涤切片5分钟。然后用DAB(DakoCytomation)对切片染色5分钟并用dd H₂O洗涤。接着，将切片在苏木精中复染30秒并在梯度EtOH和二甲苯(70％EtOH 5分钟，80％EtOH 5分钟，100％EtOH 5分钟以及二甲苯5分钟)中脱水。然后对切片加上盖玻片，通过光学显微镜评估。

通过Aβ(3-10)-KLH偶联物产生的免疫应答产生针对人AD脑组织的抗体应答。如图4所示，这个人脑切片具有广泛的Aβ沉积，沉积方式为人AD通常所预期的。尽管免疫前豚鼠血清被证实在暴露于该组织时缺乏免疫反应性，但在两次注射Aβ(3-10)-KLH构建体后，观察到来自同一只豚鼠的血清有阳性免疫反应性。这些数据证实，通过ELISA检测的并显示在图3中的免疫原性含有针对该AD组织中存在的人Aβ的显著抗体应答。因此，该结果将一些Aβ片段的不同免疫原性的惊人发现扩展至进一步证实该应答是与治疗应用一致的方式被控制的。

实施例5

鉴别缺乏T细胞表位的免疫原性片段

为了鉴定用于本发明的缺乏T细胞表位的免疫原性片段，以下的酶联免疫斑点(ELISpot)测定可被用作评价T细胞对特定抗原的应答。具有T细胞表位的免疫原片段通过在白色膜表面存在暗点来鉴别；每个点表明存在应答抗原(即免疫原性片段)而分泌干扰素γ(IFN-γ)的T细胞。疫苗和免疫学领域技术人员熟悉这种测定法，参见，例如Larsson et al.，AIDS 3：767-777，1999，and Mwau et al.，AIDS Research and Human Retroviruses 18：611-618，2002。最近的综述可参考A.E. Kalyuzhny，Methods Mol Biol.302：15-31，2005。

申请人使用来自恒河侯(New Iberia Research Center，The Universityof Louisiana at Lafayette，New Iberia，LA)的外周血单核细胞(PBMC)用于应答肽Aβ1-40(American Peptide Co.，Sunnyvale，CA)(氨基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV)(SEQ IDNO：78)和Aβ1-20(Synpep，Dublin，CA)(氨基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFF)(SEQ ID NO：79)。

纯化的多克隆小鼠抗猴IFN-γ(克隆MD-1，Cat No.CT 525，U-CyTech biosciences，Utrecht，The Netherlands)被稀释在含有1％青霉素和硫酸链霉素(GIBCO青霉素-链霉素，Cat.No.15140-122，Invitrogen，Carlsbad，CA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，然后加至96孔HTSIP无菌板(Cat.No.MSIPS4W10，Millipore，Billerica，MA)，并在4℃孵育超过12小时。洗板，并在37℃孵育至少2小时之前，加入R10[RPMI培养基1640(

Cat.No.11875-093)、10％胎牛血清(HyCloneSH30070.03，Logan，UT)、0.1％50mM 2-巯基乙醇(

Cat.No.21985-023)、1％1M HEPES缓冲液(

15630-080)、1％200mM左旋谷氨酰胺(

Cat.No.25030-081)、1％100mM MEM丙酮酸钠溶液(

Cat.No.11360-070)、1％青霉素-链霉素溶液(

Cat.No.15140-122)]。离心PBMC，在R10中重悬。在Z2库尔特计数仪(BeckmanCoulter，Fullerton，CA)上对PBMC计数。吸干的板的每孔接受0.4□μg ofAβ1-40、Aβ1-20、PHA(植物凝集素，Cat No.L-8902，Sigma，St.Louis，MO，阳性对照)或稀释的DMSO(Sigma，阴性对照)；然后向每孔加入400000PBMC。将板在37℃下在湿润的CO₂培养箱中孵育18-24小时。将板在含有5％FBS和0.005％Tween的PBS中洗涤；将生物素偶联的抗猴IFN-γ多克隆抗体(U-CyTech biosciences，Utrecht，The Netherlands)稀释在相同培养基中并添加至每板；然后将板在4℃孵育18-24小时。将抗生物素蛋白链霉素-AP(Cat.No.13043E，BD PharMingen，FranklinLakes，NJ)稀释在相同培养基中并添加至经洗涤的板；将板在室温下避光孵育2小时。添加过滤的1-Step NBT/BCIP底物(Pierce，Rockford，IL，Cat.No.34042)，并在室温下再避光孵育10分钟。洗涤后，在用CCD照相机成像前使板干燥，通过计算机自动对每孔内的斑点计数。

申请人确认每百万PBMC中的斑点形成细胞(SFC/10⁶ PBMC)必须超过55并且必须超过4倍阴性对照才被定义为阳性结果；没有达到以上两标准定义为阴性结果。用包含偶联至OMPC的Aβ(3-10)/(21-28)(构建体No.12，图6A)的MAP构建体，或用两种偶联至OMPC的单体构建体Aβ(3-10)(SEQ ID NO：69)和Aβ(21-28)(SEQ ID NO：73)接种猕猴。接种期间每月测定每只猕猴，持续三或四月；曾记录到的针对Aβ1-40或Aβ1-20的最强信号仅为18 SFC/10⁶ PBMC，显著低于55 SFC/10⁶PBMC的标准。因此，全都产生阴性分值，为所述疫苗不引起T细胞应答提供了可靠证据，因而不包括T细胞表位。

实施例6

升高血浆Aβ

用5μg的连接至作为载体的OMPC并配制在MAA中的MAP Aβ(3-10)/(21-28)偶联物(构建体No.12，图6A)或其单体成分偶联物Aβ(3-10)(SEQ ID NO：69)和Aβ(21-28)(SEQ ID NO：73)加上100μg

免疫非人灵长类猕猴(N＝3)。该猕猴灵长类每四周接受接种，在每次注射后四周收集血液并进行分析。确定了抗Aβ₄₀滴度和总的Aβ_1-40水平。

采用6E10/G210 ELISA在这些经免疫的动物中确定血浆Aβ_1-40水平。这种测定采用夹心ELISA测量Aβ_1-40，该ELISA包括N末端捕获抗体6E10(Aβ1-8)(Signet Laboratories，Dedham，MA)和偶联至碱性磷酸酶的C-末端Aβ₄₀新表位抗体(G210)(The Genetics Company，Inc.，Zurich，Switzerland)。将抗体6E10以5μg/ml的浓度包被各板。稀释的血浆样品(1∶3)以50μl/孔使用，重复三次。Aβ_1-40标准品在6E10免疫耗尽(immuno-depleted)的猕猴血浆基质中制备为400pM-3pM。该测定具有约5-20的信噪比。CDP-star碱性磷酸酶底物从Applied Biosystems，FosterCity，CA获得。预配制的封闭缓冲液

从Pierce Biotechnology，Rockford，IL(Cat#37515)获得。采用拟合标准品的三级样条函数，将各个样品计数(重复进行三次)转变为实际的分析物浓度。进行QC样品分析以评估板间信号变异性。

如图8A所示，这些分析的结果证实在用MAP Aβ(3-10)/(21-28)构建体(构建体No.12，图6A)免疫后在PD3时血浆Aβ₄₀有大于3倍的升高。血浆Aβ₄₀的这种升高没有在用单体Aβ偶联物/OMPC疫苗构建体免疫的动物中观察到。具体地，用Aβ(3-10)(SEQ ID NO：69)或Aβ(21-28)(SEQ ID NO：73)免疫对该量度不产生应答或产生显著较低的应答。值得注意的是，这些差异独立于显示在图8B中的滴度水平。

综上所述，这些数据证实一些构建体相对于其它免疫原性构建体在它们升高血浆Aβ水平的能力方面具有优势。本领域技术人员会理解，免疫原性片段的这种选择性，即升高血浆Aβ水平的能力，在本发明之前并未被揭示并且不能从现有技术预测得来。因此，对缺乏T细胞表位并在免疫后升高血浆Aβ的8-mer或MAP免疫原的鉴定提供了选择用于疫苗构建体的8-mer或MAP的方法。由于本发明，现有技术人员现在能够定性(即免疫原性)和定量地(即多克隆抗体应答的性质-升高血浆Aβ水平的能力)表征所述疫苗构建体。本领域技术人员还应理解的是，本发明不限于8氨基酸Aβ片段，而是包括任何能够在宿主生物体中产生与Aβ反应的多克隆抗体应答的抗原。

序列表

<110>Merck & Co.，Inc.

Garsky，Victor

Joyce，Joseph G.

Keller，Paul M.

Kinney，Gene

Liang，Xiaoping

Shiver，John W.

<120>防止和治疗阿尔茨海默病的肽偶联物组合物和方法

<130>21868Y-PCT

<150>60/677,886

<151>2005-05-05

<160>79

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>42

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>1

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala

35 40

<210>2

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>2

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser

1 5

<210>3

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>3

Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly

1 5

<210>4

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>4

Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr

1 5

<210>5

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>5

Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu

1 5

<210>6

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>6

Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val

l 5

<210>7

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>7

His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His

1 5

<210>8

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>8

Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His

1 5

<210>9

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>9

Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln

1 5

<210>10

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>10

Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5

<210>11

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>11

Tyr G1u Val His His Gln Lys Leu

1 5

<210>12

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>12

Glu Val His His Gln Lys Leu Val

1 5

<210>13

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>13

Val His His Gln Lys Leu Val Phe

1 5

<210>14

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>14

His His Gln Lys Leu Val Phe Phe

1 5

<210>15

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>15

His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala

1 5

<210>16

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>16

Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu

1 5

<210>17

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>17

Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp

1 5

<210>18

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>18

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val

1 5

<210>19

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>19

Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly

1 5

<210>20

<211>8

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400> 20

Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser

1 5

<210>21

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>21

Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Ash

1 5

<210>22

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>22

Ala Glu Asp Val Gly Ser Ash Lys

1 5

<210>23

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>23

Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly

1 5

<210>24

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>24

Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala

1 5

<210>25

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>25

Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile

1 5

<210>26

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>26

Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

1 5

<210>27

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>27

Ser Ash Lys Gly Ala Ile Ile G1y

1 5

<210>28

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>28

Ash Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu

1 5

<210>29

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>29

Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met

1 5

<210>30

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>30

Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val

1 5

<210>31

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>31

Ala Ile Ile G1y Leu Met Val Gly

1 5

<210>32

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>32

Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly

1 5

<210>33

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>33

Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val

1 5

<210>34

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>34

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val

1 5

<210>35

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>35

Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile

1 5

<210>36

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>36

Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala

1 5

<210>37

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>37

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val

<210>38

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>38

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser

1 5

<210>39

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>39

Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly

1 5

<210>40

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>40

Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr

1 5

<210>41

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>41

Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu

1 5

<210>42

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>42

Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val

1 5

<210>43

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>43

His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His

1 5

<210>44

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>44

Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His

1 5

<210>45

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>45

Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln

1 5

<210>46

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>46

Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5

<210>47

<21l>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>47

Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu

1 5

<210>48

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>48

Glu Val His His Gln Lys Leu Val

1 5

<210>49

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>49

His His Gln Lys Leu Val Phe Phe

1 5

<210>50

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>50

Glu Val His His Gln Lys Leu Val Glu Glu Glu

1 5 10

<210>51

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>51

His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Glu Glu Glu

1 5 10

<210>52

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>52

His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Lys Lys Lys

1 5 10

<210>53

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>53

Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Lys Lys Lys

1 5 10

<210>54

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>54

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Lys Lys Lys

1 5 10

<210>55

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>55

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val

1 5

<210>56

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>56

Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Lys Lys Lys

1 5 10

<210>57

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>57

Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys

1 5

<210>58

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>58

Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala

1 5

<210>59

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>59

Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Lys Lys Lys

1 5 10

<210>60

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>60

Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Lys Lys Lys

1 5 10

<210>61

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>61

Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Glu Glu Glu

1 5 10

<210>62

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>62

Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Lys Lys Lys

1 5 10

<210>63

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>63

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val

1 5

<210>64

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>64

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Lys Lys Lys

1 5 10

<210>65

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>65

Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Lys Lys Lys

1 5 10

<210>66

<211>42

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>66

Glu Val Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Ash Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala

35 40

<210>67

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>67

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser

1 5

<210>68

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>68

Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly

1 5

<210>69

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>69

Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr

1 5

<210>70

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>70

Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His

1 5

<210>71

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>71

Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln

1 5

<210>72

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>72

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val

1 5

<210>73

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>73

Ala Glu Asp Val Gly Set Asn kys

1 5

<210>74

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>74

Gly Leu Met gal Gly Gly Val Val

1 5

<210>75

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>75

Glu Val Glu Phe Arg His Asp Set Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val

<210>76

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>76

Glu Val Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr

1 5 10

<210>77

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>77

Glu Val Glu Phe Arg His Asp Ser

1 5

<210>78

<211>40

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>78

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val

35 40

<210>79

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>79

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe

20

Claims

1.一种药物组合物，包含Aβ免疫原性片段，所述Aβ免疫原性片段缺乏T细胞表位，能以针对所述Aβ片段的抗体形式诱导免疫应答。

2.权利要求1的免疫原性片段，其中所述免疫原性片段能够升高血浆Aβ水平。

3.权利要求2的组合物，其中所述免疫原性片段选自Aβ的线性8氨基酸肽(8-mer)、散布有至少一个间隔物的多价线性肽以及多价分枝的多抗原肽(MAP)。

4.权利要求3的药物组合物，还包含连接至所述组合物以形成偶联物的载体分子，其中所述载体促进包含针对所述Aβ片段的抗体的免疫应答。

5.权利要求4的药物组合物，其中所述载体分子选自血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、免疫球蛋白分子和脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidies)外膜蛋白复合物(OMPC)。

6.权利要求5的药物组合物，其中所述载体分子是OMPC。

7.权利要求4的药物组合物，还包含药物可接受的佐剂。

8.权利要求7的药物组合物，其中所述药物可接受的佐剂选自氢氧化铝和基于皂甙的佐剂。

9.权利要求9的药物组合物，其中所述药物可接受的佐剂为基于皂甙的佐剂。

10.防止或治疗患者脑中与Aβ的淀粉样蛋白沉积有关的疾病的方法，包括给予有效剂量的Aβ免疫原性片段，所述Aβ免疫原性片段缺乏T细胞表位，能以针对所述Aβ片段的抗体形式诱导免疫应答。

11.权利要求10的方法，其中所述免疫原性片段能够升高血浆Aβ水平。

12.权利要求11的方法，其中所述免疫原性片段选自Aβ的线性8氨基酸肽(8-mer)、散布有至少一个间隔物的多价线性肽以及多价分枝的多抗原肽(MAP)。

13.权利要求12的方法，其中所述免疫原性肽被连接至载体分子以形成偶联物并且其中所述载体促进包含针对所述Aβ片段的抗体的免疫应答。

14.权利要求13的方法，其中所述载体分子选自血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、免疫球蛋白分子和脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白复合物(OMPC)。

15.权利要求14的方法，其中所述载体分子为OMPC。

16.权利要求13的方法，其中所述偶联物与药物可接受的佐剂一起给药。

17.权利要求14的方法，其中所述药物可接受的佐剂选自氢氧化铝和基于皂甙的佐剂。

18.权利要求17的方法，其中所述药物可接受的佐剂为基于皂甙的佐剂。