KR101495740B1 - 아데닐산 시클라아제 단백질 또는 그 단편에 삽입된 인유두종 바이러스 에피토프를 운반하는 재조합 단백질 및 그 치료 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하나 또는 여러 가지 HPV 항원의 하나 또는 여러 가지 에피토프(epitopes)를 가지는 하나 또는 여러 가지 폴리펩티드를 포함하는 재조합 단백질에 관한 것으로서, 상기 폴리펩티드는 아데닐산 시클라아제(CyaA) 단백질 또는 그 단편의 동일하거나 서로 다른 허용 부위에 삽입되고, 상기 CyaA 단편은 항원 제시 세포를 표적으로 하는 상기 아데닐산 시클라아제의 특성을 보유한다. 본 발명은 또한 그 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 재조합 단백질 또는 폴리뉴클레오티드는 HPV 감염 또는 그 악성 효과에 대항하는 치료 수단을 개발하기 위해 사용될 수 있다.

Description

아데닐산 시클라아제 단백질 또는 그 단편에 삽입된 인유두종 바이러스 에피토프를 운반하는 재조합 단백질 및 그 치료 용도{RECOMBINANT PROTEIN CARRYING HUMAN PAPILLOMAVIRUS EPITOPES INSERTED IN AN ADENYLATE CYCLASE PROTEIN OR FRAGMENT THEREOF, THERAPEUTIC USES THEREOF}

본 출원은 아데닐산 시클라아제(adenylate cyclase) 단백질 또는 그 단편에 삽입된 유두종 바이러스(papillomavirus) 에피토프를 운반하는 재조합 단백질에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 아데닐산 시클라아제(CyaA) 단백질이 유두종 바이러스 항원, 특히 인유두종 바이러스 항원에서 유래된 에피토프에 대항하여 면역 반응을 유발하기 위한 단백질 벡터로서 역할을 하는 재조합 단백질에 관한 것이다.

본 발명은 특히 에피토프를 진핵세포, 특히 포유류 세포, 및 특히 인간 세포에 전달하기 위해 획득된 단백질 벡터의 사용 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 그 뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 그 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 재조합 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 숙주에서 인유두종 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 위해 사용하는 방법 뿐만 아니라 숙주, 특히 포유류 숙주에서 인유두종 바이러스 감염에 의한 악성 효과의 치료 또는 예방을 위해 사용하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시 형태에서, 본 발명은 면역 요법, 특히 유두종 바이러스의 종양 특이 항원(tumor specific antigen)에 대한 면역 요법에 적절한 화합물을 계획하기 위해 유용한 수단을 제공한다.

여러 인유두종 바이러스(HPV) 형태 중에서, 위험성이 높은 HPV로 지정된 형태는 숙주에서 감염의 지속성으로 인한 상피성 악성 종양의 발생과 관련이 있다(1). 세계에 두 번째로 널리 퍼져 있는 부인과 암인 자궁 암종은 대부분(>99%) HPV16 및 HPV18 DNA의 검출과 연관이 있다(2). 이러한 바이러스의 암유발 가능성은 조기 유전자(early genes), 즉 바이러스의 복제 주기를 통해 그 발현이 검출되고 악성 형질 전환의 발병 및 유지를 위해 필요한 E6 및 E7 유전자의 발현에 의한 생성물이 원인이다. 그러나, 위험성이 높은 이러한 발암성 HPV 형태에 의한 항문성기(anogenital) 감염의 높은 빈도에도 불구하고 실질적으로 HPV-관련 악성 종양으로 발생하는 비율은 낮으며, 이는 면역 반응에 의해 위험성이 높은 HPV 감염이 조절되는 것을 의미한다(3). 대다수의 전암(前癌) 상태 증상의 자발적인 퇴화(1), CD4⁺ T 세포 및 대식 세포에 의한 퇴화하는 생식기 혹(genital warts)의 침투 뿐만 아니라 통상의 면역 반응이 억제되거나 면역이 결핍된 환자에서 발견되는 더 많은 수의 감염 개체(1)와 같은 여러 현상은 이러한 진술에 힘을 더한다. 또한, HPV16-E6 및/또는 E7 에피토프에 대한 CD4⁺ 및 CD8⁺ T-세포의 반응은 HPV16-연관 악성 종양의 진단을 받은 환자의 혈액(4-8) 뿐만 아니라 건강한 사람의 혈액(9, 10)에서도 검출되었다. 따라서, 이러한 것들은 HPV16의 E6 및/또는 E7 단백질을 표적으로 하는 면역 요법의 개발을 위한 강한 이론적 근거를 구성하였다.

H-2D^b HPV16-E7_49-57-제한 에피토프에 대한 면역 반응을 발생시킴으로써 C57BL/6 마우스에서 HPV16 -E6 및 -E7-양성 종양 발생 세포주의 종양 성장을 방지하기 위한 많은 백신들이 개발되었다. 이러한 백신은 플라스미드 DNA, 바이러스 또는 박테리아성 벡터, 키메라 바이러스 유사 입자, 합성 펩티드 및 재조합 단백질을 포함하였다(11). 유감스럽게도, 이러한 방법은 임상 치료 측면에서 단지 약간의 만족스러운 결과만을 산출하였다(3). 그러므로, 세포 매개 반응의 유발을 위해 HPV-에피토프를 면역 시스템에 표적화하는 새로운 수단을 평가하는 것이 관련 분야의 관심사항으로 남아 있다.

따라서, HPV 항원에 대항하여 숙주에서 체액성 및/또는 세포 매개 면역 반응을 유발하는 조건으로 표적 세포에 그 HPV 항원의 에피토프를 전달하기에 적절한 새로운 벡터에 대한 필요성이 존재한다. 본 발명자는 아데닐산 시클라아제 단백질이 이러한 벡터를 계획하기 위해 사용될 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명자는 백일해균(Bordetella pertussis)의 아데닐산 시클라아제를 사용하여, 이러한 단백질이 효과적인 벡터를 계획하기 위한 적절한 기초라는 결론을 내릴 수 있는 많은 관찰을 하였다.

백일해균의 아데닐산 시클라아제(CyaA)는 그 촉매 도메인을 진핵 세포의 시토졸로 전달하는 능력을 가진다(12). 따라서, CyaA의 촉매 부위에 삽입된 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포 에피토프는 항원 제시 세포(APC)의 표면에서 각각 MHC class II 및 I 에 의해 처리되고 제시된다(13). 또한, 최근에 CyaA는 α_Mβ₂ 인테그린(CD11b/CD18)에 특정적으로 결합하고(14, WO 02/22169), 이러한 T-세포 에피토프를 CD11b⁺ 수지상 세포 소집단에 표적화하는 것으로 밝혀졌다(15). 적절한 에피토프를 품고 있는 재조합 CyaA로 마우스를 면역화하는 것은 강한 CTL 반응, 치명적인 바이러스 공격에 대한 완전한 보호 및 효율적인 예방과 치료적인 항종양 면역을 유도하였다(16,17). 아데닐산 시클라아제(CyaA) 단백질은 특히 WO 93/21324 또는 WO 02/22169에서 그 특성이 기술되었고 재조합 DNA 기술에 의한 그 제조 방법이 공개되었다. WO 02/22169에서, 잔기 373 내지 1706을 포함하는 CyaA 단편은 CD11b/CD18 수용체와 상호 작용을 위해 본질적으로 필요한 구조를 포함하는 것으로 기술되었다.

구체적으로, 아미노산 잔기 1166에서 아미노산 잔기 1281까지 신장하는 아미노산 서열이 CD11b/CD18 수용체와의 상호 작용을 위한 결정 인자를 포함하고, 더 구체적으로 잔기 1208에서 잔기 1243까지 신장하는 아미노산 서열이 CD11b/CD18과 독소의 상호 작용을 위해 결정적이라는 것이 후에 기술되었다(EP 03291486.3 및 45).

본 발명자는 HPV 항원의 에피토프를 품고 있으며, 즉 포함하며 그 에피토프를 표적 세포, 특히 HPV에 감염되고 악성 형질 전환을 겪고 있는 숙주를 포함하여 숙주의 항원 제시 세포(APC)에 전달할 수 있는 재조합 CyaA 단백질의 구성을 위한 조건을 측정하고 평가하였다.

따라서, 본 발명은 특히 하나 또는 여러 가지 HPV 항원의 하나 또는 여러 가지 에피토프를 품고 있는 하나 또는 여러 가지 폴리펩티드를 포함하는 재조합 단백질에 관한 것으로, 그 폴리펩티드는 아데닐산 시클라아제(CyaA) 단백질 또는 그 단편의 동일하거나 서로 다른 허용 부위(permissive sites)에 삽입되고 그 CyaA 단편은 수지상 세포와 같은 APC와 같은 CyaA의 표적 세포, 특히 CD11b/CD18 세포를 표적으로 하는 상기 아데닐산 시클라아제의 특성을 보유한다. 특정 실시 형태에서, 이러한 단편은 또한 표적 세포의 시토졸로, 삽입되어 있는 에피토프 또는 그 에피토프를 포함하는 폴리펩티드의 전위(translocation)를 허용하는 CyaA의 특성을 보유한다. 표적 세포의 시토졸로의 에피토프 또는 그 에피토프를 포함하는 폴리펩티드의 전위는 만약 CyaA 단편이 그 촉매 도메인의 전위를 허용하는 단백질의 도메인을 보유하고 있다면 허용될 수 있다.

본 발명의 재조합 단백질은 재조합 기술에 의지하여 제조될 수 있다. 그 재조합 단백질은 또한 합성, 특히 화학 합성에 의해 획득될 수 있다. 따라서, "재조합 단백질"이라는 용어는 단백질의 키메라 형태를 언급한다.

CD11b/CD18 세포를 표적으로 하는 재조합 단백질의 능력은 특히 EP 03291486.3 및 (45) 또는 WO 02/22169에 개시된 방법에 따라 평가될 수 있다. 또한, 에피토프 또는 그 에피토프를 포함하는 폴리펩티드를 표적 세포의 시토졸로 전위시키는 재조합 단백질의 능력은 WO 02/22169에 개시된 방법을 적용함으로써 평가될 수 있다.

특정 실시 형태에서, CyaA의 단편은 CyaA에서 자연적으로 인접하지 않는 CyaA의 서로 다른 두 부분으로 구성될 수 있다. 일 예로서, CyaA의 촉매 도메인, 즉 CyaA의 N-말단부의 400 아미노산 잔기 및 CD11b/CD18 항원 제시 세포의 표적화를 위해 필요한 아미노산 잔기 1208 내지 1243을 포함하는 단편을 인용할 수 있다.

상기 정의에서, "폴리펩티드"라는 표현은 번역후 수식(post-translational modification)을 수행하는 아미노산 서열을 포함하여 어떤 아미노산, 특히 적어도 여섯 개의 아미노산 잔기를 가진 아미노산 서열 및 만일 적어도 하나의 에피토프를 포함한다면 특히 5 내지 500 잔기 또는 약 5 내지 약 100 잔기, 또는 약 5 내지 200 잔기 또는 약 10 내지 약 50 잔기, 또는 약 30 또는 50 내지 200 또는 약 100 내지 약 210 잔기 또는 약 100 내지 약 200 잔기를 가진 아미노산 서열을 포함하는 어떤 아미노산을 말한다. 즉, 면역 반응은 그 아미노산 서열을 표적 세포, 바람직하게는 숙주, 특히 포유류 숙주 세포에 전달한 후에 획득될 수 있다. 따라서, 이러한 정의에 따른 폴리펩티드는 에피토프, 심지어 독특한 에피토프에 제한되거나 또는 여러 가지 서로 다른 또는 동일한 에피토프를 포함할 수 있으며 또는 병원체, 즉 인유두종 바이러스로부터 전체 길이의 항원을 포함할 수도 있다. 본 발명의 에피토프는 특히 T 세포 면역 반응에서 체액성 면역 반응 및/또는 세포 매개 면역 반응에 연관된 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명의 재조합 분자의 폴리펩티드에서 에피토프는 숙주에서 APC(항원 제시 세포)에 의해 처리되는 에피토프, 특히 표적 세포가 CD8⁺ T 림프구인 에피토프와 같은 class I MHC(주조직적합복합체) 분자와 연관되어 인식되는 에피토프 또는 표적 세포가 CD4⁺ T 림프구 세포인 에피토프와 같은 class II MHC 분자와 연관되어 인식되는 에피토프를 포함한다.

특정 실시 형태에서, 에피토프를 가지는 폴리펩티드는 여러 항원, 특히 서로 다른 HPV 균주의 일 형태의 항원 형태 또는 서로 다른 HPV 균주의 여러 형태의 항원에서 유래된 여러 가지 에피토프를 포함한다. 따라서, HPV 항원에서 유래된 폴리펩티드는 예를 들어 여러 항원에 대하여 면역 반응을 일으킬 수 있는 다가(multivalent), 특히 이가(bivalent) 또는 삼가(trivalent)일 수 있다.

본 발명에 따르면, 하나 또는 여러 가지 에피토프를 가지는 폴리펩티드가 계획될 수 있는 HPV 항원은 바람직하게는 HPV 감염에 이은 악성 효과의 개시 및/또는 유지와 연관된 단백질에서 유도될 수 있는 항원이고 소위 종양 항원, 즉 HPV 감염에 연관된 종양 발생과 관련이 있는 항원을 포함하며 숙주 세포에서 면역 반응을 유도할 수 있고 항체 또는 T-세포와 특정적으로 반응할 수 있다.

본 발명에 따른 에피토프를 가지는 폴리펩티드는 특히 재조합 분자에서 CyaA 단백질과 결합할 때 숙주에서 면역 반응을 유도하거나 유발하는 능력을 향상시키기 위하여, 전체 항원을 사용하거나 또는 단편, 특히 항원성 단편, 특히 전체 단백질보다는 상기 항원의 에피토프를 선택함으로써, 또는 상기 항원 또는 선택된 항원성 부위 또는 에피토프를 변형함으로써 HPV의 순수한 또는 성숙한 항원에서 유도될 수 있다. 따라서, 이러한 에피토프의 여러 가능한 변형을 설명하기 위하여, 이러한 폴리펩티드는 그것들이 유도되는 항원의 자연적인 또는 비자연적인 측면 서열에 의해 측면에 위치되는 에피토프를 포함하고, 또한 면역 특성을 향상시키기 위하여 화학적으로 변형된 에피토프 또는 그런 에피토프를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 변형은 CyaA 단백질과 관련하여 획득된 폴리펩티드의 효율을 향상시키기에 바람직할 수 있다.

특히, 부가적인 양으로 대전된 아미노산 잔기의 삽입에 의해 폴리펩티드의 전하에 변화가 생기는 일부 특정 변형은 이하의 실시예에서 공개된다.

따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 또한 반합성 또는 합성 폴리펩티드를 포함한다.

특정 실시 형태에 따르면, HPV 항원에서 유래된 폴리펩티드는 약 5 내지 약 500, 또는 약 5 내지 약 100, 또는 약 5 내지 약 200, 예를 들어 약 10 내지 약 50 아미노산 잔기 또는 약 30 또는 약 50 내지 약 200 아미노산 잔기 또는 약 100 내지 약 210 또는 약 100 내지 약 200 아미노산 잔기를 각각 또는 함께 포함한다.

폴리펩티드(들)는 본 발명의 재조합 단백질에 재결합될 때 특히 항원-특정 반응을 유발할 수 있도록 선택된다.

본 발명의 재조합 단백질은 특히 하나의 폴리펩티드 또는 붕괴된(disrupted) 순수 HPV 항원으로 구성된 여러 가지 폴리펩티드들을 포함하도록 계획될 수 있고, 그 붕괴(disruption)는 상기 HPV 항원의 산성 부위에서 하나 또는 여러 가지 아미노산 잔기의 결실 및/또는 아데닐산 시클라아제의 적어도 두 허용 부위에서 상기 HPV 항원의 적어도 두 폴리펩티드 단편의 삽입으로 구성된다.

이러한 정의에 포함되는 특정의 붕괴는 아데닐산 시클라아제의 적어도 두 허용 부위에 순수한 HPV 항원의 적어도 두 단편의 삽입에 의해 획득되고, 이러한 적어도 두 단편은 순수한 항원에서의 자연스러운 위치가 역전된다. 즉, 순수한 항원에서 N-말단인 단편은 CyaA 단백질 또는 그 단편에 삽입되었을 때 C-말단이 되고 순수한 항원에서 C-말단인 단편은 CyaA 단백질 또는 그 단편에 삽입되었을 때 N-말단이 된다.

아미노-말단 및 카르복시-말단 단편의 역전은 E7_△ 단편(즉, E7 항원의 단편)에 대하여 설명된 것처럼, 특히 암 면역 요법에서 강하고 오래 지속되는 보호 면역성의 유발에 더 효과적일 수 있다는 것이 관찰되었다.

본 발명에 따르면, 아데닐산 시클라아제(CyaA)는 상기한 것처럼, 전체 길이 단백질 또는 그 단편으로 사용된다.

바람직하게는, CyaA 단백질 또는 그 단편은 세포, 특히 재조합 세포에서 cyaA 및 cyaC 유전자 둘 모두의 공동 발현의 결과인 단백질 또는 단편이다. 표적 세포에 대한 침투 특성을 가지기 위하여, CyaA는 cyaA 및 cyaC 유전자 둘 모두의 발현에 의해 가능한 번역후 수식(post-translational modification)을 수행해야 한다고 밝혀졌다(WO 93/21324).

본 발명의 특정 실시 형태에서, CyaA 단백질의 단편은 적어도 약 30 아미노산 잔기를 가지는 단편이고 약 1300, 특히 약 500 아미노산 잔기, 바람직하게는 약 50 내지 약 150 아미노산 잔기까지 가질 수 있으며; 상기 단편은 특정 실시 형태에서 CD11b/CD18 표적 세포와 상호 작용을 위한 CyaA의 아미노산 잔기 1166 내지 1281 또는 CyaA의 아미노산 잔기 1208 내지 1243을 포함한다. 따라서, 특정 단편은 그 일부가 표적 세포막 및/또는 CD11b/CD18 수용체에 대한 단백질의 결합 및 폴리펩티드(들)에 포함된 에피토프(들)의 세포 시토졸로의 연속적인 전달에 책임이 있는 순수한 단백질의 C-말단부의 전부 또는 일부를 포함한다(12). 본 발명에 따른 CyaA 단백질의 특정 단편은 CyaA 단백질의 아미노산 잔기 372 내지 1706을 포함한다. 다른 특정의 단편은 아미노산 잔기 225 내지 234가 결실된, 따라서 아미노산 잔기 1 내지 224 및 235 내지 1706을 포함하는 CyaA를 제공하는 CyaA 단백질에 대응하는 단편이다.

본 발명의 특정 실시 형태에서, 아데닐산 시클라아제 단백질은 박테리아 단백질이다. 바람직한 실시 형태에서, CyaA 단백질은 보르데텔라 종(Bordetella species)에서 유도된다

본 발명에 따른 흥미있는 보르데텔라 종(Bordetella species) 중 하나는 백일해균(Bordetella pertussis)이다. 다른 흥미있는 보르데텔라 균주는 보르데텔라 파라백일해균(Bordetella parapertussis) 또는 보르데텔라 기관지패혈증균(Bordetella bronchiseptica)이다. 보르데텔라 파라백일해균(B. parapertussis)의 CyaA의 서열은 수납 번호 NC 002928.3(1740 아미노산 서열) 및 Parkhill J. 등(Nat. Genet. DOl, 10(2003))으로 공지되어 있고 보르데텔라 기관지패혈증균(B. bronchiseptica)에 대해서는 Betsou F. 등(Gene 1995, 8, 30; 162(1):165-6)에 공지되어 있다.

백일해균(Bordetella pertussis)은 백일 기침(whooping cough)의 원인 물질이고 잘 알려진 백일해 독소(PT) 및 박테리아의 중요한 독성 인자이고 백일해균 감염에 대항하는 항원 보호제 중 하나인 아데닐산 시클라아제 독소(CyaA)를 포함하여 서로 다른 여러 독소를 분비한다.

백일해균의 아데닐산 시클라아제 단백질은 400 아미노산 잔기의 N-말단 촉매 도메인 및 표적 세포막에 독소의 결합 및 촉매 모이어티의 세포질로의 전달에 책임이 있는 1306 잔기의 C-말단부를 포함하는 1706 잔기의 양기능(bifunctional) 단백질로서 기술되는 독소이다(12).

CyaA 단백질은 두 내부 리신 잔기(리신 860 및 983)의 번역후 팔미토일화(palmitoyation)에 의해 활성 독소로 전환되는 비활성 프로톡신으로서 합성된다. 이러한 번역후 수식(post-translational modification)은 보조 유전자, 즉 백일해균 염색체 상에 cyaA 근처에 위치하는 cyaC의 cyaA 유전자의 발현을 필요로 한다.

백일해균의 cyaA는 Glaser, P. 등에 의해 1988, 분자 생물학(Molecular Microbiology) 2(1), 19-30에 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열로서 기술되었다. 따라서, 백일해균의 CyaA 단백질의 아미노산 잔기 또는 서열 또는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 서열이 본 발명에서 인용될 때, 그 위치는 Glasser 등의 상기 간행물(1988)에 공개된 서열에 대하여 주어진다.

본 발명에 따른 재조합 단백질에서, 하나 또는 여러 가지 HPV 항원의 하나 또는 여러 가지 에피토프를 가지는 폴리펩티드는 CyaA 단백질의 하나 또는 여러 허용 부위에 삽입된다.

본 발명에서, "허용 부위(permissive site)"는 폴리펩티드가 CyaA 단백질의 기능성에 실질적인 영향을 미치지 않고, 특히 세포의 표적화, 특히 CyaA에 의한 APC의 표적화에 실질적인 영향을 미치지 않으며, CD11b-CD18 수용체에 대한 특정 결합에 영향을 미치지 않고 바람직하게는 표적 세포에 에피토프(들)의 전위 과정에 관계된 단백질의 도메인에 실질적인 영향을 미치지 않으면서 삽입될 수 있는 CyaA 단백질의 서열 부위이다.

CyaA 촉매 도메인의 전위(translocation) 및 삽입되어 있는 에피토프의 전위를 허용하는 백일해균 아데닐산 시클라아제의 허용 부위는 제한적이지는 않지만, 잔기 137-138(Val-Ala), 잔기 224-225(Arg-Ala), 잔기 228-229(Glu-Ala), 잔기 235-236(Arg-Glu) 및 잔기 317-318(Ser-Ala)를 포함한다((44) Sebo 등, 1995). 다음의 부가 허용 부위: 잔기 107-108(Gly-His), 잔기 132-133(Met-Ala), 잔기 232-233(Gly-Leu) 및 잔기 335-336(Gly-Gln) 및 336-337 역시 본 발명의 실시 형태에 포함된다(43).

다른 보데텔라(Bordetella)종에서 대응하는 허용 부위는 서열 비교 및 대응하는 잔기의 결정에 의해 한정될 수 있다.

다른 실시 형태에 따르면, 폴리펩티드는 CyaA 단백질 또는 그 단편의 일 말단 및/또는 다른 말단에 선택적으로 삽입될 수 있다.

본 발명의 목적을 위해 사용하기 위한 CyaA 단백질의 특정 단편은 1300 아미노산까지, 또는 약 30 내지 약 500 아미노산 잔기, 바람직하게는 특히 순수 CyaA 단백질의 1166 내지 1281 아미노산 잔기, 바람직하게는 순수 CyaA 단백질의 1208 내지 1243 아미노산 잔기를 포함하는 그러한 단편인 약 50 내지 약 150 아미노산 잔기를 포함한다.

따라서, 본 발명에 따르면, 소위 "하이브리드 단백질"로 언급되는 재조합 단백질을 제공하기 위한 CyaA 단백질에 폴리펩티드의 "삽입(insertion)"은 유용한 DNA 기술에 의한 유전적인 삽입을 포함한다. 선택적으로, "삽입"은 또한 예를 들어 CyaA 또는 그 단편의 말단에서 실행되는 공유 결합 또는 비공유 결합과 같은 화학적 삽입을 포함하는 비유전적 삽입을 의미한다. 비유전적 삽입은 특히 삽입될 폴리펩티드가 합성 또는 반합성일 때 중요하다. 약제를 폴리펩티드에 연결하는 방법은 관련 분야에 잘 알려져 있으며 예를 들어 N-피리딜 설포닐-활성 설프하이드릴(N-pyridyl sulfonyl-activated sufhydryl)을 사용하는 디설파이드(disulfide) 연결을 포함한다.

특히, APC와 같은 Cya의 표적 세포, 예를 들어 CD11b/CD18 세포 및 특히 상기 세포의 시토졸에 대한 생체 내(in vivo) 표적화를 위해 화학적 연결 또는 유전적 삽입에 의해 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 분자를 CyaA에 이식하는 것이 가능하다. 사실상, 디설파이드(disulfide) 결합 또는 유전적 삽입에 의해, 정해진 CD8⁺ T-세포 에피토프에 대응하는 분자를 독소가 제거된 CyaA의 촉매 도메인에 결합할 때, 변형된 분자는 생체 내(in vivo) 특정 CTL 반응을 유도할 수 있고, 이로 인해 상기 CD8⁺ T-세포 에피토프는 CD11b-발현 세포의 시토졸로 전위된다는 것이 발견되었다.

특정 실시 형태에서, 단백질성 벡터의 제조를 위해 사용되는 재조합 아데닐시클라아제(adenylcyclase)는 하나 또는 여러 가지 분자(들)를 포함하는 시스테인 잔기의 삽입에 의해 변형된 CyaA 및 그 단편이며, 특히 디설파이드(disulfide) 결합을 수단으로 상기 아데닐시클라아제의 촉매 도메인 내에 위치한 유전적으로 삽입된 시스테인 잔기(들)에 화학적으로 연결된 본 발명의 폴리펩티드를 포함한다.

사실상, 특히 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 복합 분자는 촉매 도메인 내 서로 다른 허용 부위에 위치한 서로 다른 시스테인 잔기에 대한 디설파이드(disulfide) 결합을 수단으로 아데닐시클라아제에 화학적으로 결합될 수 있다.

면역 반응, 특히 숙주에서 세포 매개 면역 반응을 유발할 수 있는 능력을 가진 생성물을 계획하기에 적절한 재조합 단백질을 제안하기 위하여, 특히 HPV에 감염된 숙주에서 관찰되는 악성 효과에 대항하는 면역 반응을 유발할 수 있는 그러한 생성물을 계획하기 위하여, 본 발명자는 암유발성이 높은 HPV 균주, 특히 HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV45, HPV52 또는 HPV58 중에서 선택된 균주로부터의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드를 유도하는 것을 제안하였다.

이러한 균주 중에서, HPV18 및 HPV16이 특히 흥미롭다. HPV16은 포유류 숙주, 특히 인간의 자궁암 발생과 연관이 있기 때문에, HPV에 감염된 숙주의 치료를 위한 특정의 표적이다.

이러한 HPV 균주로부터 시작하여, 본 발명자는 L1, L2, E1, E2, E4 및 E5 단백질 중에서 선택된 항원으로부터의 에피토프를 가지는 폴리펩티드를 유도하는 것을 제안한다.

선택적으로 또는 조합으로, 본 발명자는 또한 HPV의 E6 또는 E7 단백질로부터의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드를 유도하는 것을 제안한다.

본 발명의 특정 실시 형태에서, HPV16의 E6 또는 E7 단백질 또는 HPV18의 E6 또는 E7 단백질은 에피토프를 가지는 폴리펩티드의 구상을 위해 사용된다.

HPV 항원에서 유래된 폴리펩티드를 계획하기 위해 언급될 수 있는 특정의 HPV 단백질은 HPV, 특히 HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질이다. 본 발명의 실시 형태에 따르면, 그 폴리펩티드는 서로 다른 HPV 균주, 특히 HPV16 및 HPV18의 여러 가지 E7 단백질로부터 유도된다. 예를 들어, 그 폴리펩티드는 HPV16 및 HPV18의 전체 길이 E7 단백질이거나 다합체(multimers), 특히 이합체(dimers)를 포함하는 HPV16 또는 HPV18의 각각의 E7 단백질의 하나 또는 여러 가지 단편이다.

이러한 HPV 단백질 및 그 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 HPV16에 대하여Seedorf, K 등(인유두종 바이러스 타입 16 DNA 서열. 바이러스학(Virology), 145:181-185, 1985) 및 Cole S.T., Danos O.(인유두종 바이러스 타입 18 게놈의 뉴클레오티드 서열 및 비교 분석. E6 및 E7 유전 물질의 반복 구조 및 유두종 바이러스의 계통발생(phylogeny). J.Mol.Biol. 193:599-606(1987)) 또는 Fernando GJ 등(인유두종 바이러스 18(HPV18)과 연관된 자궁암의 E7 변형 단백질의 T-헬퍼 에피토프. Virus Res. 1995년 3월. 36(1):1-13))에 의해 기술되었다.

E6 및 E7 단백질은 바이러스의 복제 주기를 통해서 HPV16 또는 HPV18에 의해 발현되는 암 발생 단백질이고, HPV 균주의 감염에 이은 숙주 세포의 악성 형질 변환의 개시 및 유지를 위해 필요하다. 따라서, 이러한 종양 특이적인 항원 둘 다는 채택성 CTL-매개 면역 요법을 위한 가능성이 있는 목표로서 고려된다.

본 발명의 특정 실시 형태에 따르면, 재조합 단백질은 복합 폴리펩티드(multiple polypeptide)를 포함하고, 이러한 폴리펩티드 각각은 하나 또는 여러 가지 HPV 항원의 하나 또는 여러 가지 에피토프를 품고 있다.

예를 들어, 이러한 복합 폴리펩티드는 HPV 균주, 특히 HPV16 또는 HPV18의 E6 및 E7 단백질로부터 유도될 수 있다. 다른 실시 형태에 따르면, 이러한 복합 폴리펩티드는 HPV16 및 HPV18 둘 모두의 E6 또는 E7으로부터 유래된 에피토프를 포함할 수 있다.

복합 폴리펩티드는 또한 하나의 단백질, 예를 들어 E7 또는 E6 단백질의 단편을 포함하는 서로 다른 에피토프로 구성될 수 있고, 이런 에피토프는 CyaA 단백질의 서로 다른 허용 부위에 삽입된다.

상기 정의에 따른 다른 특정의 재조합 단백질은 에피토프를 가지는 복합 폴리펩티드가 HPV16의 E7 단백질의 잔기 1 내지 29를 포함하는 단편 또는 잔기 1 내지 29로 구성된 단편 또는 잔기 42 내지 98을 포함하는 단편, 또는 잔기 42 내지 98로 구성된 단편을 포함하거나 또는 복합 폴리펩티드가 CyaA 단백질의 서로 다른 허용 부위에 삽입된 양쪽의 단편으로 구성되거나 포함하는 CyaA 재조합 단백질이다.

본 발명에 따른 다른 재조합 단백질은 복합 폴리펩티드가 아미노산 서열

(E7_49-57) 및/또는

(E7_43-77)를 가지는 단편을 포함하는 단백질이다.

CyaA 단백질의 허용 부위에 삽입되는 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 수는 전체 길이 항원, 특히 HPV의 전체 길이 E6 또는 E7 단백질로 구성된 폴리펩티드가 CyaA 단백질 또는 그 단편에 삽입될 수 있게 하는 정도이다.

본 발명의 특정 실시 형태에 따르면, 재조합 CyaA에 포함된 폴리펩티드는 E7 단백질, 특히 CyaA의 코돈 224와 235 사이 또는 CyaA의 코돈 319와 320 사이에 삽입된 HPV16의 E7 단백질이다.

다른 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 단백질은 복합 폴리펩티드를 포함하고, 그 복합 폴리펩티드 중 일부는 하나 또는 여러 가지 HPV의 하나 또는 여러 가지 에피토프를 포함하며, 나머지 복합 폴리펩티드는 다른 병원체의 에피토프를 포함한다.

다른 특정 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 단백질은 서로 다른 병원체에서 기원하는 하나 또는 여러 가지 에피토프를 더 포함한다. HPV에서 기원한 에피토프와 함께 클라미디아(Chlamydia) 또는 HIV 레트로바이러스 또는 HPV, HBV, HCV, 아데노바이러스 EBV, 헤르페스바이러스, HTLV1 바이러스 및 CMV에서 기원한 에피토프의 연합은 특히 관심이 있다.

본 발명의 다른 특정 실시 형태에 따르면, 에피토프를 가지는 폴리펩티드는 예를 들어 서열 내에서 음으로 대전된 아미노산 잔기의 수를 감소시키기 위하여 그 순수 아미노산 서열에 대해 변형되었다. 이러한 변형은 음으로 대전된 아미노산 잔기의 일부를 제거하거나 또는 특히 에피토프의 측면 잔기로서 양으로 대전된 아미노산 잔기 일부를 첨가함으로써 획득될 수 있다. 따라서, 음으로 대전된 잔기를 거의 포함하지 않는 폴리펩티드는 표적 세포의 세포질로의 CyaA 단백질의 촉매 도메인의 전위에 호의적일 수 있다.

에피토프를 가지는 폴리펩티드는 CyaA에 삽입될 때 펼쳐지도록 계획될 수 있으며, 이는 표적 세포에 대한 재조합 CyaA 단백질의 내재화의 효율을 개선한다. 아미노산 함량의 결과로서 접혀지는 폴리펩티드에서 이러한 펼쳐짐(unfolding)은 예를 들어 폴리펩티드의 접힘과 연관이 있는 디설파이드(disulfide) 결합의 형성을 방지하기 위하여 시스테인 잔기를 제거하거나 치환함으로써 달성될 수 있다. 어떤 경우에, 생체 내에서 재접힘을 방지할 수 있는 환원제의 존재하에 폴리펩티드를 제조함으로써 그 폴리펩티드의 접힘을 방지하는 것이 가능하다.

특정 실시 형태에서, 에피토프를 가지는 폴리펩티드는 잠재(cryptic) 에피토프일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에서, 본 발명자는 (i) 상기한 정의에 따른 아데닐산 시클라아제(CyaA) 또는 그 단편 및 (ii) 하나 또는 여러 가지 항원의 하나 또는 여러 가지 항원성 단편을 보유하는 폴리펩티드를 포함하는 재조합 단백질로 만들어진 키메라 단백질 구조체가 상기 항원의 잠재 에피토프가 재조합 구조체에서 그 제시의 결과로서 면역원성이 될 수 있게 한다는 것을 측정하였다. 특히, 본 발명에서 정의된 것과 같은 CyaA 또는 단편 및 특히 예방 접종을 포함하여 치료 관점에서 관심이 있는 항원으로부터 유도된 폴리펩티드를 포함하는 상기 키메라 구조체는 면역원성이 되게 하고 특히 숙주에서 T-세포 반응, 특히 CTL 반응을 유발하게 하는 항원의 잠재 에피토프를 포함할 수 있다.

따라서, 본 발명은 하나 또는 여러 가지 항원의 하나 또는 여러 가지 에피토프를 가지는 하나 또는 여러 가지 폴리펩티드를 포함하는 재조합 단백질에 관한 것으로, 상기 폴리펩티드(들)는 아데닐산 시클라아제(CyaA) 단백질 또는 그 단편의 동일하거나 서로 다른 허용 부위에 삽입되고, 상기 CyaA 단편은 항원 제시 세포를 표적으로 하는 아데닐산 시클라아제의 특성을 보유하며, 상기 적어도 하나의 에피토프(들)는 서브도미넌트(subdominant) 잠재 T-세포 에피토프이고 상기 재조합 단백질은 상기 폴리펩티드(들)에 대하여 항원-특정 반응을 유발할 수 있다.

특히, 잠재 에피토프는 HPV 항원, 특히 HPV16 및/또는 HPV18 항원, 특히 E7 항원 내에 포함된다.

따라서, 정의된 재조합 단백질은 HPV18 E7 단백질에서 유도된 펩티드, 즉 아미노산 서열

을 포함한다.

특정 실시 형태에 따르면, 잠재 에피토프는 예를 들어 첫 번째 두 위치에서 치환이 일어남으로써 변형될 수 있고 예를 들어 서열

을 가질 수 있다.

본 발명은 특히 펩티드

에 관한 것이다.

본 발명은 또한 서열, 특히 1 및/또는 2 위치에 치환된 펩티드, 특히 서열

을 가지는 펩티드에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 펩티드가 면역원성 특성, 특히 CTL 반응에서 T-세포를 유발할 수 있는 면역원성 특성을 가질 정도의 변이체를 포함한다.

바람직하게는, 본 발명의 재조합 단백질을 제조하기 위하여, CyaA 단백질의 효소 활성, 즉 ATP를 cAMP로 전환하는 능력은 비활성화되었다. 이러한 비활성화는 유전적인 비활성화의 결과로서 달성될 수 있다. 일 예로서, 유전적인 비활성화는 촉매 부위(예를 들어 188과 189 사이) 부분인 CyaA의 아미노산 서열 부위에 디펩티드의 도입의 결과로서 획득될 수 있다. 이러한 비활성화된 CyaA 단백질은 이하의 실시예에서 설명된다.

본 발명의 재조합 단백질은 바람직하게는 세포 매개 면역 반응을 유발할 수 있다. 그 면역 반응은 CTL 및 Th, 특히 CD4⁺ T 세포 반응 및/또는 CD8⁺ T 세포 반응을 포함하여 Th1 반응을 포함한다.

이러한 세포 매개 면역 반응을 유발하는 재조합 단백질의 능력은 생체 내에서 종양 성장을 억제하거나 심지어 동물에서 종양을 퇴화시킬 수 있을 정도로 충분하다.

본 발명은 또한 상기한 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 재조합 단백질의 발현을 위해 적절한 재조합 발현 벡터를 제공하기 위하여 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 이러한 발현 벡터는 플라스미드, 코스미드, 파지미드(phagemids), 바이러스 벡터를 포함한다.

재조합 벡터는 원핵세포(prokaryotic cell), 특히 박테리아에서 발현을 위해 적절한 벡터이거나 또는 진핵세포(eukaryotic cell), 특히 포유류 세포, 바람직하게는 사람 세포에서 발현을 위해 적절한 발현 벡터일 수 있다.

본 발명은 특히: 수납번호 CNCM I-3191로 2004년, 3월 18일 CNCM(파리, 프랑스)에 기탁된 pTRACE5-HPV16E7_FULL(또는 CyaAE5-HPV16E7_FULL); CNCM I-3190으로 2004년, 3월 18일 CNCM(파리, 프랑스)에 기탁된 pTRACE5-HPV16E7_△30-42(또는 CyaAE5-HPV16E7_△30-42) 또는 구조체 pTRACE5-HPV16E7_49-57와 같은 본 발명에 따른 재조합 단백질을 암호화하는 플라스미드로 구성된 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 특히 원핵세포 또는 진핵세포, 예를 들어 인간 세포를 포함하여 포유류 세포를 포함한다.

본 발명은 특히 수납번호 No. CNCM I-3190 및 수납번호 No. CNCM I-3191로 CNCM에 기탁된 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명은 또한 활성 성분으로서, 상기한 재조합 단백질 또는 상기한 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 상기 면역원성 조성물의 활성 성분은 숙주에 투여하기에 적절한 생리학적 수용체, 매개체, 첨가제, 운반체 또는 희석제 또는 그것들의 조합물과 함께 제제될 수 있다.

면역원성 조성물은 바람직하게는 포유류 숙주에서 세포-매개 면역 반응, 특히 T-세포 매개 면역 반응을 유발하도록 계획된다. 바람직하게는, 면역원성 조성물은 세포-매개 세포 용해 면역 반응 CTL, 특히 CD8⁺과의 면역 반응을 유발할 수 있다.

본 발명에 따른 다른 면역원성 조성물은 체액성 면역 반응을 유발할 수 있는 조성물이다.

면역 반응을 유발하는 본 발명의 면역원성 조성물의 능력을 향상시키기 위하여, 활성 성분을 보조제 및/또는 계면 활성제 및/또는 (시토카인 또는 케모카인과 같은)면역 조절 물질과 혼합하는 것이 바람직하다.

보조제는 예를 들어 일반적으로 수상을 가진 에멀젼 형태로 사용되는 프로인트(Freund)형 보조제와 같은 유상의 리포솜, 또는 수산화알루미늄, 황산아연, 콜로이드성 수산화철, 인산칼슘 또는 염화칼슘과 같은 불수용성 무기염을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 면역원성 조성물은 바람직하게는 특히 면역 요법을 위해, 숙주에서 면역 반응을 준비시키거나 및/또는 증가시킴으로써 그 면역 반응을 유발하기 위해 사용된다. 특히, 본 발명의 면역원성 조성물은 숙주의 HPV 감염으로 인한 악성 혈질 전환의 개시 또는 유지에 대한 예방 또는 HPV 감염, 특히 HPV-16 또는 HPV-18 감염으로 인한 악성 형질 전환에 걸린 환자의 치료를 위해 사용될 수 있다.

이러한 면역치료 조성물은 숙주에서 종양을 유발하는 제어되지 않은 세포 증식 치료를 위해, 특히 HPV 감염과 연관된 자궁암 면역요법을 위한 암 면역 요법을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 면역치료 조성물은 종양 상태를 포함하여 종양 바이러스 감염으로 인한 악성 상태의 치료를 위해 특히 적절한 치료 백신의 개발을 위한 수단을 제공한다.

본 발명에서, "치료" 또는 "치료 처리"와 같은 용어는 치료를 받은 환자에게 유익한 효과를 초래하는 본 발명에서 개시된 화합물의 효과를 포함하며, 이러한 효과는 치료의 결과로서 환자 상태의 개선 또는 완화 상태, 또는 건강 상태의 회복을 포함하여 세포 수준에서 관찰되거나 또는 임상 수준에서 관찰된다. 치료되는 악성 상태가 제어되지 않은 세포 증식 또는 종양 발생 또는 지속일 때, 유익한 효과는 안정화 또는 바람직하게는 제어되지 않은 종양의 증식 방지, 멈춤 또는 반전 또는 종양의 퇴화를 포함할 수 있다.

상기한 것처럼 악성 상태를 치료하기 위한 조성물은 바람직하게는 재조합 단백질 약 1 내지 약 1000 ㎍, 바람직하게는 약 10 내지 약 500 ㎍ 분량인 활성 성분 투여량을 포함할 수 있다. 그 조성물이 활성 성분으로서 본 발명의 재조합 단백질을 포함할 때, 투여량은 재조합 단백질 약 0.05 내지 약 10 ㎍, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 1 ㎍을 포함할 수 있다.

치료될 환자의 상태에 따라, 조성물은 증상의 수준에서 국지적으로 한 번 또는 여러 번, 예를 들어 몇 일 간격, 예를 들어 5 내지 10일 간격으로 일정하게 투여될 수 있다. 또는, 그 조성물은 온몸 전체에 투여될 수 있다.

본 발명은 또한 세포 매개 면역 반응 및/또는 체액성 반응을 포함하여 면역 반응을 유발하기 위하여 특히 포유류 숙주, 바람직하게는 인간에게 투여하기 위해 제제된, 상기한 재조합 단백질 또는 상기한 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 적절하다면 약제학적으로 수용할 수 있는 매개체를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 HPV 감염을 예방하거나 치료하기 위해, 본 발명의 재조합 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터, 및 약제학적으로 수용할 수 있는 매개체를 포함하는 약제 조성물에 관한 것이다.

다른 실시 형태에 따르면, 약제 조성물은 숙주에서 HPV 감염으로 인한 악성형질 전환의 개시 또는 유지의 예방 또는 치료하기 위해, 본 발명에 따른 재조합 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터, 및 약제학적으로 수용할 수 있는 매개체를 포함한다.

약제 조성물은 암 면역 요법을 위해 재조합 단백질 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 벡터 및 약제학적으로 수용할 수 있는 매개체를 포함한다.

본 발명은 또한 면역 반응, 즉 숙주에서 체액성 및/또는 세포 매개 면역 반응을 유발하기 위한 벡터로서 사용하기에 적절한 박테리아 단백질, 특히 박테리아 독소(바람직하게는 톡소이드 형태) 또는 그 단편을 포함하는 재조합 단백질을 환자에게 사용하는 방법에 관한 것으로, 그 단백질 또는 단편은 종양 바이러스 감염의 치료를 위한 하나 또는 여러 가지 종양 바이러스의 하나 또는 여러 가지 항원의 하나 또는 여러 가지 에피토프의 삽입에 의해 변형된다. 이러한 재조합 단백질은 특히 악성 효과, 특히 이러한 종양 바이러스의 감염에 의해 유발된 종양을 치료하기 위해 제안된다.

종양 바이러스의 항원의 에피토프를 운반하기 위한 벡터로서 적절한 박테리아 단백질의 예로는 klebsiella로부터 OmpA 또는 β 서브 유닛을 포함하는 다음의 시가(Shiga) 독소(Haicher N 등, J. Immunol. 2000, 165: 3301-8), 탄저 독소(Anthrax toxin)(Goletz Tj 등, PNAS USA 1997, 94:12059-64), 디프테리아 독소(Diphteria Toxin)(Stenmark H 등, J. Cell. Biol. 1991, 113:1028-32) 또는 녹농균 외독소(Psudomonas Exotoxin) A(Donnelly JJ. 등, PNAS USA 1993, 90: 9530-4)이다. 그 항원이 박테리아 단백질에 삽입을 위한 폴리펩티드의 제조를 위해 에피토프를 제공하는 종양 바이러스는 HPV, HBV, HCV, 아데노바이러스 EBV, 헤르페스바이러스, HTLV.1 바이러스 및 CMV를 포함한다.

활성 물질로서 사용되는 CyaA 재조합 단백질에 대해 상기에서 제공한 설명은 다른 박테리아 단백질 및 종양 바이러스 항원에 적합할 수 있다.

본 발명은 또한 HPV 감염을 진단하거나 또는 이러한 감염의 면역 모니터링을 하기 위한 키트(kit)에 관한 것으로, 본 발명에 따른 재조합 단백질, 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 상기 재조합 단백질, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 환자의 HPV 감염의 예방 또는 치료를 위해 사용하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 상기한 재조합 단백질, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 환자의 HPV 감염으로 인한 악성 형질 전환의 개시 또는 유지에 대한 면역 요법을 위해 사용하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한:

- 포유류, 특히 환자로부터 획득한 T 세포를 본 발명의 재조합 단백질에 노출시키는 단계,

- T 세포의 활성의 변화를 검출하는 단계로 구성되는, HPV로 인한 감염의 생체 밖(in vitro) 진단 또는 면역 모니터링을 위한 방법에 관한 것이다.

특정 실시 형태에서, 재조합 단백질은 HPV에 의한 감염의 예방 또는 이러한 감염으로 인한 종양을 가지고 있는 숙주를 포함하여 HPV에 감염된 숙주의 치료를 위해 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 키메라 CyaA-폴리펩티드 단백질에 포함된 폴리펩티드에서 비공지된 또는 서브 도미넌트(subdominant) 잠재 T-세포 에피토프를 선별하는 방법에 관한 것으로, CyaA는 상기한 것처럼 아데닐산 시클라아제 또는 그 단편이고,

- 상기 키메라 단백질을 동물 숙주에 투여하는 단계,

- 상기 숙주의 T-세포 반응, 특히 CTL 반응을 검출하는 단계를 포함한다.

본 발명은 특히 본 발명에서 정의된 재조합 단백질에 포함된 HPV-항원(들)의 폴리펩티드(들)에서 비공지된 또는 서브 도미넌트(subdominant) 잠재 T-세포 에피토프(특히, CD8⁺ T-세포 에피토프)를 선별하는 방법에 관한 것으로,

- 상기 재조합 단백질을 동물 숙주(인간이 아님)에 투여하는 단계,

- 상기 숙주에서 T-세포 반응, 특히 CTL 반응을 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 특징들은 도면을 참조하여 이하의 실시예에서 더욱 더 상세히 설명될 것이다.

도 1은 HPV16-E7 재조합 CyaAs의 구성 및 정제에 대하여 도시한 도면;
도 2는 재조합 HPV16-E7 CyaAs에 의한 T 세포 반응의 유도에 대하여 도시한 도면;
도 3은 재조합 HPV16-E7 CyaAs가 HPV16 E7-특정 Th1 반응을 유도함을 나타내는 도면;
도 4는 재조합 HPV16-E7 CyaAs로의 치료 예방 접종이 형성된 종양을 박멸함을 나타내는 도면;
도 5는 재조합 HPV16-E7 CyaAs로의 치료 예방 접종이 생존을 연장함을 나타내는 도면;
도 6은 최근에 성장하는 종양에서 외식(外植)된 TC-1 종양 세포가 H-2D^b 분자의 발현을 상실시킴을 나타내는 도면;
도 7은 재조합 HPV16-E7 CyaAs로 처리된 마우스에서 HPV16-E7_49-57 특정 CD8⁺ T-세포의 지속성을 나타내는 도면;
도 8은 재조합 HPV16-E7 CyaAs에 의해 유발된 TC-1 종양 성장에 대한 장기간의 보호를 나타내는 도면;
도 9는 CpG-ODN 1826-보조 HPV16 E7_43-77의 치료 활성에 대한 CyaA-E7_△30-42 치료 활성의 비교를 나타내는 도면;
도 10은 TC-1 종양 거부 반응을 유발하는 CyaA-E7_△30-42의 능력에 대한 CyaA의 예비 면역의 효과 분석을 나타내는 도면;
도 11은 CyaA-HPV16E7_△30-42에 의한 HDD 마우스에서 CTL 반응의 유도를 나타내는 도면;
도 12는 CyaA-HPV18E7_△32-42에 의한 HDD 마우스에서 CTL 반응의 유도를 나타내는 도면;
도 13은 pTRACE5-E7HPV18의 구성을 나타내는 도면;
도 14는 pTRACE5-E7△HPV16+10의 구성을 나타내는 도면;
도 15는 CyaA-HPV18E7_FULL, CyaA-HPV18E7_△32-42, CyaA-HPV16+18E7_FULL, CyaA-HPV16+18E7_△를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 맵을 나타내는 도면;
도 16은 C57BL/6 마우스에서 HPV18E7을 운반하는 재조합 CyaAs에 의한 CTL의 유도를 나타내는 도면; 및
도 17은 C57BL/6 마우스에서 HPV18E7을 운반하는 재조합 CyaAs에 의한 CTL의 유도를 나타내는 도면이다.

도 1. HPV16-E7 재조합 CyaAs의 구성 및 정제

(A) 관련된 제한 부위 및 삽입 서열이 지시되어 있는 pTRACE5의 개략적인 맵. (B) 효소 활성을 억제하기 위한 디펩티드 LQ의 삽입 위치를 보여주는 CyaA의 개략적인 대표도. HPV16-E7 단백질 삽입물의 위치 역시 도시된다. HPV16-E7 H-2^b 제한 에피토프는 밑줄이 그어져 있다. (C) HPV16-E7 재조합 CyaAs의 SDS-페이지. 정제된 단백질 5 마이크로그램을 4-15% SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 분리하고 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 염색하였다. 레인 1: 야생형 CyaA; 레인 2: CyaA-E7_49-57; 레인 3: CyaA-E7_FULL; 레인 4: CyaA-E7_△30-42. (D) HPV16-E7 재조합 CyaAs의 웨스턴 블롯(Western blot) 분석. SDS-페이지에 이어, 정제된 단백질을 마우스 단클론 항-HPV16-E7 항체로 엄밀히 조사되는 니트로셀룰로오스 막에 전기 이동시켰다. 레인 1, 2: 야생형 CyaA(각각, 2 및 0.4 ㎍); 레인 3, 4 및 5: CyaA-E7_49-57, CyaA-E7_FULL 및 CyaA-E7_△30-42(각각, 각 단백질 0.4 ㎍).

도 2. 재조합 HPV16-E7 CyaAs에 의한 T 세포 반응의 유도.

(A) C57BL/6(a, b, c), TAP1^-/-(d), MHC class Ⅱ^-/-(e) 및 CD40^-/-(f) 마우스를 0일에 CyaA-E7_49-57;(a), CyaA-E7_FULL;(b), 또는 CyaA-E7_△30-42(c, d, e 및 f) 각각 50 ㎍으로 정맥 내로(i.v.) 면역화시켰다. 7일 후, 그 마우스를 안락사시켰고, 비장 림프구를 방사선이 조사된 동계의(syngeneic) 비장 림프구 존재시에 HPV16-E7_43-77 펩티드 1 ㎍/㎖로 5일 동안 생체 밖(in vitro)에서 재자극하였고, TC-1 표적 세포(플레인(plain) 사각형) 또는 EL4(오픈(open) 사각형)에 대한 작동자(effector)로서 사용하였다. 비연관 에피토프 OVA_257-264를 운반하는 CyaAE5-cysOVA로 처리되고 방사선이 조사된 동계의 비장 림프구 존재시에 HPV16-E7_43-77 펩티드 1 ㎍/㎖로 5일 동안 시험관 내에서 재자극된 비장 림프구는 또한 표시된다(a, 플레인(plain) 삼각형). 표적 용해를 ⁵¹Cr 방출로 평가하였다. 데이타는 특정 용해값(n=동물의 수는 각 그래프에 기재된다)의 중간 백분율 및 사분위 범위(interquartile ranges)를 나타낸다. (B) 재조합 HPV16-E7 CyaAs로 면역화 후 HPV16-E7 특정 IFN-γ-생산 세포의 검출. C57BL/6 마우스를 A에서처럼 CyaAE5-cysOVA(원), CyaA-E7_49-57(사각형), CyaA-E7_FULL(삼각형), 또는 CyaA-E7_△30-42(다이아몬드)로 면역화시켰다. 7일 후, 면역화된 마우스로부터 분리된 비장 세포를 자극 없이(즉, 펩티드가 없음, 오픈(open) 기호) 또는 동계의 비장 림프구 존재시에 E7_49-57 펩티드(플레인(plain) 기호) 1 ㎍/㎖로 36 시간 동안 생체 밖(in vitro)에서 배양하였다. 데이타는 비장에 대한 SFC의 수(number)로서 표현되었고 세 번의 독립적인 실험의 각 마우스에 대한 결과는 각 그룹을 대표한다. 수평 막대는 각 그룹의 중간 반응을 나타낸다.

도 3. 재조합 HPV16-E7 CyaAs는 HPV16 E7-특정 Th1 반응을 유도한다.

(A) C57BL/6 마우스를 처리하지 않거나(좌측 사각형), 또는 CyaAE5-cysOVA(원), CyaA-E7_49-57(삼각형), CyaA-E7_FULL(역전된 삼각형), 또는 CyaA-E7_△30-42(다이아몬드) 50 ㎍으로 정맥 내로(i.v.)로 주입하였다. 7일 후, 비장 세포를 His-Tag-HPV16-E7 단백질 10 ㎍/㎖로 생체 밖(in vitro)에서 자극하였고, 상청액을 72 시간 후 IFN-γ 함량에 대하여 시험하였다. 4개의 독립적인 실험의 각각의 마우스의 결과는 이중 웰의 상청액에서 방출된 IFN-γ의 농도로서 대표되고 표현되었다. 재자극되지 않은 비장 림프구로 획득된 배경은 생략하였다. 삽입 사각형: E7_43-77 펩티드 1 ㎍/㎖로 생체 밖 자극. 수평 막대는 각 그룹의 중간 반응을 나타낸다. (B) 상청액을 IL-5 함량에 대하여 테스트한 것을 제외하고 (A)와 동일하다. 두 번의 독립적인 실험의 각 마우스에 대한 결과는 이중 웰의 상청액에서 방출된 IL-5의 농도로서 대표되고 표현되었다.

도 4. 재조합 HPV16-E7 CyaAs로의 치료 예방 접종은 형성된 종양을 박멸한다.

(실험. A) 0일에 C57BL/6 마우스에 5×10⁴ TC-1 종양 세포를 이식하였다. 10일에, 마우스를 CyaA-E7_49-57(C), CyaA-E7_FULL(D) 또는 CyaA-E7_△30-42(E)로 정맥 내로(i.v.) 주입하여 처리하였다. 비처리된 마우스(A) 또는 CyaAE5-cysOVA가 주입된 마우스(B)를 대조구로 이용하였다. 마우스의 불필요한 고통을 방지하기 위하여 종양 크기가 1000 ㎣ 또는 동물의 위생 상태가 요구할 때(괴사한 종량, 빠른 체중 감소>20%)는 언제나 마우스를 안락사시켰다. 진행성 종양(*)이 발생한 CyaA-E7_FULL로 처리한 두 마리 마우스를 더 조사하기 위하여 안락사시켰다(도 6 참조).

(실험. B) 실험 설정을 (실험.A)처럼 하였다. 치료 예방 접종은 귀 진피에 +10 및 +17일에 CyaAE5-cysOVA(실선) 10 ㎍ 또는 CyaA-E7_△30-42(b) 10 ㎍로 실행되었다. 각 그래프는 단일 동물에서 종양 성장을 나타낸다. 두 마리의 처리되지 않은 마우스가 포함된다(점선). 각 사분면(a, b)의 오른쪽 상부에는 희생된 동물의 수 대(vs) 포함된 전체 동물의 수를 나타낸다. 이러한 마우스의 생존 그래프는 (c)에 도시된다. 비처리된 경우(오픈(open) 삼각형), CyaAE5-cysOVA로 모방 처리된 경우(닫힌 삼각형), CyaA-E7_△30-42(원)로 처리된 경우를 나타낸다.

도 5. 재조합 HPV16-E7 CyaAs로의 치료 예방 접종은 생존을 연장한다.

치료 예방 접종은 도 4에 기술된 것처럼 실행되었다. TC-1 종양 세포를 주입하자 마자, 마우스(그룹 당 5 내지 10마리)를 그래프에 도시된 것처럼 +1, +5 또는 +10 일에 HPV16-E7 재조합 CyaAs로 면역화시켰다. 마우스를 처리하지 않거나(플레인(plain) 사각형, 실선), CyaAE5-cysOVA(오픈(open) 사각형, 점선), CyaA-E7_49-57(오픈(open) 삼각형), CyaA-E7_FULL(오픈(open) 원) 또는 CyaA-E7_△30-42(오픈(open) 다이아몬드)로 처리하였다. +5일 치료 실험에서, CyaA-E7_FULL 및 CyaA-E7_△30-42로 처리된 동물의 생존 그래프는 완전히 겹쳐졌다는 것을 알 수 있다. 모든 경우에, 재조합 HPV16-E7 CyaAs 처리된 동물의 생존률은 비처리되거나 또는 모방 처리된 마우스(p<0.05)의 생존률보다 훨씬 더 증가하였다.

도 6. 최근에 성장하는 종양에서 외식(外植)된 TC-1 종양 세포는 H-2D ^b 분자의 발현을 상실시킨다.

종양 거부 반응 실험에서, CyaA-E7_FULL로 예방 접종된 일부 동물에게는 실험 시간이 경과함에 따라 종양이 발생하였다(도 4, *). 종양을 외식하기 위하여 두 마리의 마우스를 안락사시켰다. 이러한 종양 세포, TC-1 A1 및 A2 뿐만 아니라 순수한 TC-1 세포를 H-2D^b 분자의 발현 수준에 대하여 FACS®에 의해 분석하였다(굵은 선). 중간 형광 강도(MedFi)를 표시하였다. 개별형(isotype) 대조구로 획득된 결과를 도시하였다(회색 음영 처리된 부분).

도 7. 재조합 HPV16-E7 CyaAs로 처리된 마우스에서 HPV16-E7 _49-57 특정 CD8 ⁺ T-세포의 지속성.

CyaA-E7_49-57(A), CyaA-E7_FULL(B), 또는 CyaA-E7_△30-42(C)로 면역화되고 일련의 치료 실험에서 TC-1 이식으로부터 생존한 C57BL/6 마우스를 안락사시켰고 비장 림프구를 방사선이 조사된 동계의(syngeneic) 비장 림프구 존재시에 HPV16-E7_43-77 펩티드 1 ㎍/㎖로 5일 동안 생체 밖(in vitro)에서 재자극하였다. 표적 용해(TC-1, 플레인(plain) 사각형; EL4, 오픈(open) 사각형)를 ⁵¹Cr 방출로 평가하였다. 데이타는 특정 용해값(n=각 그룹에서 6)의 중간값 및 사분위 범위(interquartile range)를 나타낸다. 최대 결정자(effector)/표적 비율에서 특정 용해≥20%에 의해 측정된 대응하는 동물의 수는 4분면의 오른쪽 상부에 기재되었다.

도 8. 재조합 HPV16-E7 CyaAs에 의해 유발된 TC-1 종양 성장에 대한 장기간의 보호.

일련의 치료 실험에서 TC-1 이식으로부터 생존한 C57BL/6 마우스를 100일에 5×10⁴ TC-1 세포로 피하에(s.c.) 재이식하였다. 나이가 맞게 비처리된 마우스를 대조구(A)로 삼았다. CyaA-E7_49-57, CyaA-E7_FULL, 및 CyaA-E7_△30-42로 처음에 면역화된 마우스에서 종양의 성장을 표시하였다(각각 B, C 및 D). 종양의 크기가 1000 ㎣에 달할때 또는 동물의 위생 상태가 요구할 때 마우스를 안락사시켰다. (E) 동물의 생존 그래프(비처리됨, 오픈(open) 사각형; 또는 CyaA-E7_49-57로 면역화됨, 오픈(open) 삼각형; CyaA-E7_FULL로 면역화됨, 오픈(open) 원; 또는 CyaA-E7_△30-42로 면역화됨, (오픈(open) 다이아몬드) 및 TC-1 세포로 재이식됨(0일). 모든 경우에, 재조합 HPV16-E7 CyaAs-처리된 동물의 생존률은 비처리되거나 모방 처리된 마우스(p<0.05)의 생존률과 비교했을 때 상당히 증가하였다.

도 9. CpG-ODN 1826-보조 HPV16 E7 _43-77 의 치료 활성에 대한 CyaA-E7 _△30-42 치료 활성의 비교.

0일에 피하 경로로(s.c.) C57BL/6 마우스에 5×10⁴ TC-1 종양 세포를 이식하였다. 마우스를 +10 일 및 +17일에 HPV16-E7_43-77(n=5, 삼각형) 10 ㎍, CpG-ODN 1826(n=5, 사각형) 1 ㎍, HPV16-E7_43-77 10 ㎍ + CpG-ODN 1826(n=5, 다이아몬드) 1 ㎍, CyaA-CysOVA(n=3, 역전된 삼각형) 10 ㎍, 또는 CyaA-E7_△30-42(n=7, 원) 10 ㎍을 피내로(i.d.) 주입하였다. 종양의 크기가 1000 ㎣가 되거나 또는 동물의 위생 상태가 요구할 때 마우스를 안락사시켰다.

도 10. TC-1 종양 거부 반응을 유발하는 CyaA-E7 _△30-42 의 능력에 대한 CyaA의 예비 면역의 효과 분석.

(A) C57BL/6 마우스를 처리하지 않거나 또는 90일 또는 30일에 7일 간격으로 CyaAE5 10 ㎍을 피내로(i.d.)로 두 번 주입하여 면역화시켰다. 1일에, 마우스에서 피를 뽑아 혈청에서 항-CyaAE5 IgGs의 존재에 대하여 ELISA로 개별적으로 분석하였다. 결과는 A₄₉₂에 대한 선형 후퇴 분석 블롯팅 희석에 의해 계산된 각 항체가(antibody titers)로서 표현되었다. 수평 막대는 각 그룹의 중간 반응을 나타낸다. (B) 비처리(a, b), 30일에 CyaAE5-면역화(c, d), 및 90일 CyaAE5-면역화(e, f)된 동물에게 0일에 5×10⁴ TC-1 종양 세포를 피하로(s.c.)로 이식하였고, +10일 및 +17일에 CyaAE5-cysOVA(a, c, e) 10㎍, 또는 CyaA-E7_△30-42(b, d, f) 10㎍을 주입하여 처리하였다. 삽입된 그래프(b, d, f)는 모든 동물이 예방 접종이 주어진 시간에 명백한 종양을 가진다는 것을 보여주는 0-35일 기간의 클로즈-업이다. 각 그래프는 단일 동물에서 종양 성장을 나타낸다. 종양의 크기가 1000 ㎣에 이르거나 또는 동물의 위생 상태가 요구할 때 마우스를 안락사시켰다. 각 사분위면의 오른쪽 상부에는 희생된 동물의 수 대(vs) 포함된 동물의 전체 수를 나타낸다.

도 11. CyaA-HPV16E7 _△30-42 에 의한 HDD 마우스에서 CTL 반응의 유도.

EL4-HDD 세포의 펩티드 로딩(loading)은 각 그래프의 상부에 지시된다. 아래의 표에서 컬럼 헤드 Vacc 하에서 주입된(HPV16E7 또는 HPV18E7과 연관된) CyaA의 형태 및 컬럼 헤드 Stim 하에서 생체 밖에서(in vitro) 재자극을 위해 사용된 펩티드를 나타낸다. CyaA-HPV16E7_△30-42 면역화에 이어서, 펩티드 #253만에 대하여 CTL 특정 반응을 유발할 수 있다(오른쪽 패널). 이러한 CTL 활성은 펩티드 #255로 생체 밖에서 재자극된 비장 림프구가 펩티드 #253-코팅된 EL4-HHD 세포에 대해 세포 독성이지 않기 때문에 특정적이었다(오른쪽 패널). 두 개의 다른 HLA-A2 제한 펩티드에 대한 CTL-특정 반응의 부재는 서로 다른 현상 때문이다: (ⅰ) 펩티드 #253의 면역 우세, (ⅱ) EL4-HDD 세포의 프로테오솜에 의한 펩티드 #255 및 #258의 처리의 부재, (ⅲ) 세포에 독성일 수 있는 아세토니트릴(50%)을 사용해야 하는 펩티드 #258의 낮은 용해도. 가장 흥미롭게도, CyaA-HPV18E7_△32-42의 공동 주입은 CyaA-HPV16E7_△30-42의 CTL 유발 능력을 간섭하지 않았다(오른쪽 패널).

도 12. CyaA-HPV18E7 _△32-42 에 의한 HDD 마우스에서 CTL 반응의 유도.

EL4-HDD 세포의 펩티드 로딩(loading)은 각 그래프 상부에 지시된다. 아래의 표에서 컬럼 헤드 Vacc 하에서 주입된(HPV16E7 또는 HPV18E7과 연관된) CyaA의 형태 및 컬럼 헤드 Stim 하에서 생체 밖 재자극을 위해 사용된 펩티드를 나타낸다. CyaA-HPV18E7_△32-42 면역화에 이어, 펩티드 #251만을 위한 CTL 특정 반응을 유발할 수 있다(왼쪽 패널). 이러한 CTL 활성은 펩티드 #257로 시험관 내에서 재자극된 비장 림프구가 펩티드 #251-코팅된 EL4-HHD 세포에 대하여 세포 독성이지 않기 때문에 특정적이었다(왼쪽 패널). HPV16E7 HLA-A2 제한 펩티드 때문에, HPV18E7 #257 HLA-A2 제한 펩티드에 대한 CTL-특정 반응의 부재는 서로 다른 현상 때문이다: (ⅰ) 펩티드 #251의 면역 우세, (ⅱ) EL4-HDD 세포의 프로테오솜에 의한 펩티드 #257의 처리의 부재, (ⅲ) 세포에 독성일 수 있는 아세토니트릴(50%)을 사용해야 하는 펩티드 #257의 낮은 용해도. 가장 흥미롭게도, CyaA-HPV16E7_△30-42의 공동 주입은 CyaA-HPV18E7_△32-42의 CTL 유발 능력을 간섭하지 않았다(왼쪽 패널).

도 13. pTRACE5-E7HPV18 구성.

도 14. pTRACE5-E7△HPV16+10의 구성.

플라스미드 제조를 위한 3 단계가 공개된다.

도 15.

CyaA-HPV18E7 _FULL

CyaA-HPV18E7 _△32-42

CyaA-HPV16+18E7 _FULL

CyaA-HPV16+18E7 _△ :를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 맵.

도 16 : C57BL/6 마우스에서 HPV18E7을 운반하는 재조합 CyaAs에 의한 CTL의 유도.

도 17 : C57BL/6 마우스에서 HPV18E7을 운반하는 재조합 CyaAs에 의한 CTL의 유도.

기탁한 물질(I-3190 및 I-3191)은 E. coli 균주 BLR에 포함되고 Luria Broth(LB) 매질에서 성장할 수 있으며, 암피실린(Ampicillin) 100 ㎍/㎖이 포함된 LB에 이식되고, 공기 중에서 175 rpm으로 흔들고 빛을 조사하면서 30℃에서 배양될 수 있다. 7-10% DMSO에서 LB로 밤새 보존이 가능하다.

실험예

실험예 1

본 발명자는 HPV16의 E7 단백질의 전체 길이 서열 또는 그 폴리펩티드의 서브단편을 포함하는 재조합 CyaA를 제조하였다(특히, H-2D^b 제한 에피토프에 대응하는 E7의 49-57 잔기 및 HPV16-E7 잔기 43-98 더하기 1-29를 포함하는 펩티드). 본 발명자는 이러한 HPV16-E7-재조합 CyaAs가 C57BL/6 마우스에 주입되었을 때 IFN-γ 분비를 특징으로 하는 CTL 및 Th1 반응을 유도할 수 있다는 것을 밝혔다. 또한, 치료적으로 테스트 했을 때, 이러한 구성은 TC-1 세포의 피하 이식에 대항하여 100% 보호를 제공할 수 있었다. 이러한 연구는 인간 종양 특정 항원에 대해 CyaA에 의해 매개되는 생체 내(in vivo) 항-종양 치료 활성의 첫 번째 설명을 나타낸다.

물질 및 방법

마우스 및 세포주. 특정의 병원체가 없는 6-10 주된 암컷 C57BL/6 마우스를 CER Janvier(Le Gesnet St-Isle, 프랑스) 또는 Charles River(L'Arbresle, 프랑스)로부터 획득하였다. C57BL/6 배경에 길러진 TAP1^-/-(18), MHC Class Ⅱ^-/-(19) 및 CD40^-/-(20)은 또한 본 연구에 사용되었다. 동물들은 물과 음식물을 마음대로 먹을 수 있도록 하면서 병원체가 없는 환경하에서 파스퇴르 연구소 동물 시설에 유지되었다. 동물 관련 실험은 동물 보호를 위한 실험실 가이드 라인에 따라 실행되었다.

TC-1 세포 발현 HPV16 E6 및 E7 단백질(21) 및 마우스 흉선종(thymoma) EL4 세포(17)를 ATCC로부터 획득하였다. 세포들을 10%의 열로 비활성화된 FCS, 페니실린 100 U/㎖, 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖, 제네티신(geneticin) 0.4 ㎎/㎖(TC-1 세포만을 위함) 및 2-메르캅토에탄올 5.10^-5M(Gibco BRL, Cergy-Pontoise, 프랑스)가 보충된 글루타맥스(Glutamax)를 가진 RPMI 1640에 유지되었다.

펩티드. HPV16-E7 H2-D^b-제한 에피토프(22)에 대응하는 합성 펩티드 E7_49-57(

, 아미노산의 일 문자 코드) 및 천연의 측면 서열 및 Th 에피토프(굵은 글씨체)(23)를 가진 E7_49-57 CTL 에피토프에 대응하는 E7_43-77(

)은 네오시스템(Neosystem)(Strasbourg, 프랑스)에서 구입하였다. CpG ODN 1826은 프롤리고(PROLIGO)(파리, 프랑스)에서 구입하였다.

HPV16-E7 에피토프를 운반하는 재조합 백일해균 아데닐산 시클라아제의 구성 및 정제.

여기서 사용되는 재조합 아데닐산 시클라아제는 효소적으로 불활성인 CyaA(24)(25)를 암호화하는 플라스미드 pTRACE5(도 1A)의 유도체를 사용함으로써 대장균(E. coli)에서 발현되었다. 플라스미드 pTRACE5는 효소적으로 불활성인, 그래서 세포 독성인 백일해균 CyaA의 변형체를 위한 발현 벡터이다. 또한, 그 플라스미드는 CyaA의 번역 후 아실화(acylation)를 위해 필요한 백일해균 CyaC 단백질을 발현한다. 이러한 플라스미드는 이미 기술된 pTRACG 플라스미드의 유도체이다(Gmira 등, 2001, Res. Mic. 152:889). 그것은 cyaA DNA 서열의 5' 부분 내에 위치한 EcoRV 부위에 헥사뉴클레오티드

의 삽입에 의해 획득되었다. 이는 촉매 부위의 필수 부분 내 CyaA의 Asp188과 Ile189 사이에 디펩티드 Leu-Gln의 골조로 완성된 삽입의 결과이다(Guermonprez 등, 2000, Meth. Enzymol. 326:527).

플라스미드 pTRACE5는 ColE1 복제 기원 및 암피실린 저항 마커를 품고 있다. 이러한 플라스미드에서, cyaC 및 변형된 cyaA 유전자는 λ 파지 Pr 프로모터의 제어하에 동일한 전사 유닛에 위치한다. pTRCAG 플라스미드는 또한 32℃ 이하의 온도에서 λ Pr 프로모터에서 유전자의 전사를 강하게 막는 열에 민감한 λ 억제자(repressor) cl⁸⁵⁷을 암호화 한다.

대장균(E. coli) 균주 XL1-Blue(Stratagene, La Jolla, Ca)는 표준 프로토콜(Maniatis 등)에 따라 실행되는 모든 DNA 조작을 위해 사용되었다.

CyaA-E7_49-57은 CyaA의 코돈 224와 코돈 235 사이에 삽입된 9-아미노산 길이 폴리펩티드 서열(

)을 포함한다. CyaA-E7_49-57을 위한 발현 플라스미드는 다음처럼 구성되었다. 두 합성 올리고뉴클레오티드(MWG, Courtaboeuf, 프랑스), BTP1(

코딩 가닥) 및 BTP2(

비코딩 가닥)은 Nhel 및 Kpnl로 소화된 pTRACE5로 어닐링되고 결합되었다. CyaA-E7_FULL은 효소적으로 비활성화된 CyaA의 동일한 224 위치에 삽입된 HPV16-E7 단백질 전체 서열, 즉 98 아미노산을 포함한다. E7 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 특정 프라이머(primer) BTP3, (

) 및 BTP4(

)를 사용하여 HPV16 DNA(Seedorf K 등)로부터 증폭되었다. 결과로 생기는 PCR 생성물은 Nhel 및 Kpnl에 의해 소화되고 Nhel 및 Kpnl에 의해 절개된 pTRACE5에 결합된다. 어닐링된 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라 HPV 16-E7의 전체 서열에 존재하는 Sspl 부위는 삽입 돌연변이의 빠른 확인을 허용한다. CyaA-E7_△30-42는 우선 CyaA의 코돈 319와 320 사이에 삽입된 HPV16-E7의 29 아미노산 잔기 뿐만 아니라 CyaA의 코돈 224와 235 사이에 삽입된 HPV16-E7의 43 내지 98 잔기를 포함한다. CyaA-E7_△30-42를 위한 발현 플라스미드는 두 단계로 구성된다. HPV16-E7을 암호화하는 처음 DNA 단편(아미노산 1 내지 29)은 표적 DNA로서 합성 HPV16-E7 유전자(E. coli의 생산을 위해 최적화됨, GTP Technology로 계획됨, Labege, 프랑스), 프라이머 BTP5(

), 및 BTP6(

)를 사용하여 PCR 증폭되었다. 두 번째, CyaA의 코돈 320 내지 372를 암호화하는 DNA 단편은 표적 DNA로서 pTRACE5 및 프라이머 BTP7(

) 및 BTP8(

)를 사용하여 PCR 증폭되었다. 이러한 두 DNA 단편(부분적으로 겹침)은 정제되었고 294 bp 길이 DNA 단편을 증식시키기 위하여 세 번째 PCR에서 프라이머 BTP5 및 BTP8과 결합되었다. 이러한 단편은 Agel 및 BstBl에 의해 소화되고 플라스미드 pTRACE5-E7_1-29를 생산하기 위하여 pTRACE5의 대응하는 자리 사이에 삽입되었다. 또한, HPV16-E7의 아미노산 잔기 43 내지 98을 암호화하는 DNA 단편은 표적 DNA로서 합성 HPV16-E7 및 프라이머 BTP9(

) 및 BTP10

)를 사용하여 PCR 증폭되었다. 정제된 PCR 단편은 Nhel 및 Kpnl에 의해 소화되었고 동일한 제한 효소에 의해 소화된 플라스미드 pTRACE5-E7_1-29에 결합되었다.

모든 재조합 아데닐산 시클라아제는 이미 기술된 것처럼(26) 대장균(Escherichia coli) 균주 BLR(Novagen, Madison, WI)에서 제조되었다. 재조합 단백질은 이미 기술된 것처럼(26) DEAE-세파로오스(Sepharose) 및 페닐-세파로오스(phenyl-Sepharose) 크로마토그래피를 포함하는 두 단계의 과정에 의해 포함체(inclusion body)로부터 동질성(도 1B)에 가깝게 정제되었다. pH 7.5, 20 mM Hepes-Na에서 60% 이소프로판올을 사용하는 부가 세척 단계는 대부분의 오염 LPS를 제거하기 위하여 페닐-세파로오스 크로마토그래피에 부가되었다. LPS 함량은 키트 QCL-1000(Biowhittaker, Walkersville, MD)를 사용하여 측정하였다. 정제된 재조합 단백질을 SDS-겔 분석으로 분석하였다. 단백질 농도는 142,000 M^-1.㎝^-1의 분자 여기 계수를 사용하여 280 ㎚에서 흡수로부터 분광학적으로 측정되었다.

재조합 HPV16-E7 단백질의 구성 및 정제. HPV16-E7 단백질(GTP 기술) DNA 서열을 암호화하는 대장균(E. coli)-최적화 cDNA는 Ncol과 Xhol 제한 부위 사이에 pIVEX2.4b 벡터(Roche Molecular Biochemicals, Meylan, 프랑스)에서 부차 클로닝되었다. 결과로 생긴 플라스미드는 대장균(E. coli) 균주 BL21λDE3(Novagen)로 형질 전환되었다. His-Tag-HPV16-E7 단백질은 0.5 mM 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(thiogalactopyranoside)(Euromedex, Souffelweyersheim, 프랑스)로 유도되어 발현되고 제조자의 지시에 따라 Ni-NTA 아가로스(Qiagen, Hilden, 독일)에서 정제되었다. LPS 오염을 제거하기 위하여 이미 기술된 것(27)처럼 이소프로판올 세척을 이용하였다.

면역블롯팅(Immunoblotting). 단백질을 SDS-PAGE로 분리한 다음 마우스 단클론 항 HPV16 E7 항체(Zymed, San Francisco, CA) 또는 C57BL/6 마우스에서 제조된 다클론 항-대장균(E. coli) BLR 혈청으로 탐침된 니트로셀룰로오스 막(0.45μ, BioRad, Marnes la Coquette, 프랑스)에 전기이동 시켰다. 면역 복합체는 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase)(Chemicon, Temeula, CA)에 접합된 염소 항-마우스 면역 글로블린으로 검출되고 5-브로모-4-클로로-3-인돌리포스페이트/니트로블루 테트라졸리움(BCIP/NBT)(Sigma, St. Louis, MO)로 밝혀졌다.

마우스 면역화 및 종양 거부 반응 실험. 동물들을 대조구 또는 PBS(Gibco BRL)에 희석된 HPV16-E7 재조합 CyaAs 50 ㎍의 한 번의 정맥 주입 또는 두 번의 피하 주입(각 10 ㎍)으로 면역화시켰다. 피하 주입은 귀 피부(47)에 실행되었다. 생체 밖(in vitro) 분석을 위하여, 안락사시킨 동물들(CO₂)을 주입 후 3달 후에 실행되는 오래 지속되는 반응 분석을 제외하고 주입 후 7일에 비장을 적출하였다. 종양 거부 반응 실험을 위하여, 마우스에 5×10⁴ TC-1 세포를 피하로 주입하였고 종양 접종 후 1일, 5일 또는 10일에 HPV16-E7 재조합 CyaAs로 처리하였다. TC-1 종양 성장은 캘리퍼(caliper)를 사용하여 검출하였고 식 V=(L×w²)/2(L:길이, w:너비)(48)를 사용하여 세제곱 밀리미터로 표현하였다.

생체 밖 (in vitro) 세포 독성 분석. 면역화된 마우스의 비장 림프구를 생체 밖 완전 매질(10% 열로 불활성화된 FCS, 페니실린 100 U/㎖, 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖ 및 5.10^-5 M 2-메르캅토에탄올로 보충된 글루타맥스(Glutamax)를 가진 RPMI 1640)에서 동계의 조사된 순수한 비장 세포 존재하에 5일 동안 E7_49-57 또는 E7_43-77 펩티드 1 ㎍/㎖로 자극하였다. 이러한 결정자 세포(effector cell)의 세포 독성 활성은 TC-1 세포에서 5-시간 ⁵¹Cr-방출 분석으로 시험하였다. 방사능 표지는 다음처럼 실행되었다: 37℃, 7.5% CO₂ 대기에서 배양된 폭발적으로 성장한 TC-1 세포를 재빨리 트립신 처리하였고(Trypsin-EDTA, GibcoBRL) 37℃에서 1시간 동안 ⁵¹Cr 100 μCi로 배양하였다. 여러 가지 E:T 비율이 사용되었고 모든 분석은 두 번씩 실행되었다. 각 웰의 상청액에서 방출된 방사능을 측정하였다. 특정 용해의 백분율은 100×(실험적인 방출-자발적인 방출)/(최대 방출-자발적인 방출)로서 계산되었다. 최대 방출은 표적 세포에 10% Triton X-405를 첨가함으로써 획득되었고 자발적인 방출은 완전 매질만으로 배양된 표적 세포로 획득되었다. 마우스는 적어도 20% 특정 용해가 가장 높은 E:T 비율에서 관찰될 때 반응자(responders)로 취급된다. 결과는 각 그룹마다 반응자의 평균 ± 사분위수 범위 (Interquartile Range)로서 표현되었다.

분비 세포를 위한 단일 IFN-γ 생산 세포 ELISPOT 분식법(enzyme-linked immunospot assay). 멀티 스크린 여과 플레이트(96 웰; Millipore, Molshein, 프랑스)를 ㎖ 당 쥐(rat) 항-마우스 감마 인터페론(IFN-γ) 항체(클론 R4-6A2; PharMingen, San Diego, CA) 4 ㎍으로 실온에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 그런 다음, 플레이트를 세척하고 완전 매질로 차단하였다. 면역화된 마우스로부터 일련의 두 배 희석된 비장 세포를 웰에 5×10⁵ γ-조사된(2,500 라드) 동계의 공급자 세포를 따라 첨가하였다. 그 세포를 E7_49-57 펩티드 1 ㎍/㎖가 존재하거나 그렇지 않은 상태로 36시간 동안 배양하였다. 과도하게 세척한 후, 플레이트는 스트렙타비딘-알칼라인 포스파타아제(PharMingen)로 배양된 ㎖ 당 비오티닐화된 쥐(rat) 항-마우스 감마 인터페론(IFN-γ) 항체(클론 XMG 1.2; PharMingen) 5㎍으로 배양함으로써 드러났다. 마지막으로, 스팟(spots)은 기질로서 BCIP/NBT를 사용함으로써 드러났다. IFN-γ 생산 세포의 수는 각 웰에서 스팟 형성 세포(SFC)의 수를 계수함으로써 측정되었고(Bioreader, Karben, 독일), 결과는 비장당 SFC의 전체 수로서 표현되었다(17).

효소면역측정법(Enzyme-linked immunosorbent:ELISA). 빈 벡터 CyaAE5로 피내로 면역화된 마우스를 30일 또는 90일 후 혈액을 추출하고 각 마우스 혈청을 ELISA로 항체 반응을 테스트 하였다. 마이크로플레이트(Nunc, Roskilde, 덴마크)를 하룻밤 동안 PBS에서 빈 벡터 CyaAE5(3 ㎍/㎖)로 코팅하였다. PBS-tween 20(0.1%)로 세척한 후, 희석된 혈청을 웰에 첨가하였고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서 PBS-tween 20로 세척하고, 플레이트를 염소 항-마우스 IgG 페록시다아제 접합체(시그마)로 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 o-페닐렌디아민 및 과산화수소(시그마)를 사용하여 발달시켰다. 반응을 황산으로 중지시키고 플레이트를 ELISA 판독기(Dynatech, Marnes la Coquette, 프랑스)로 492 ㎚에서 분석하였다. 결과는 A₄₉₂에 대한 선형 후퇴 분석 블롯팅 희석에 의해 계산된 항체가(antibody titers)로 표현되었다. 항체가는 1/100으로 희석된 대조 혈청의 흡광도에 두 배를 제공하는 log₁₀ 최고 희석이 되도록 계산되었다.

사이토킨 생산. 면역화된 마우스의 비장 세포를 생체 밖에서(in vitro) HisTag-HPV16-E7 단백질 10 ㎍/㎖ 또는 E7_43-77 펩티드 1 ㎍/㎖로 완전 매질에서 72시간 동안 자극하였다. IFN-γ 및 IL-5 생산량은 이미 기술된 것(28)처럼 샌드위치 ELISA로 배지 상청액에서 측정되었다. 모든 분석은 대응하는 재조합 쥐과 사이토킨(Pharmingen)으로 표준화되었다.

FACS ^® 분석. TC-1 세포를 특정 FITC-접합 단클론 항체(clone KH95, Pharmingen, Le Pont de Claix, 프랑스)를 사용하여 MHC class I 분자 H-2D^b의 발현 수준의 흐름 세포 측정(flow cytometry)에 의한 분석을 위하여 이미 기술된 것(29)처럼 처리하였다.

통계학적 분석. 서로 다른 샘플의 작은 크기를 고려할 때, 비-파라메트릭(non parametric) 통계 분석(30)은 소프트웨어 StatXact 4(Cytel corporation, Cambridge, MA)를 사용하여 적용되었다. 생존 그래프는 Prism 소프트웨어(GraphPad Software Inc., CA)를 사용하여 구성되었고 소프트웨어의 이미 형성된 로그랭크(logrank) 테스트를 사용하여 비교되었다. 데이타는 p<0.05에서 상당히 서로 다른 것으로 취급되었다.

결과

HPV16-E7 에피토프를 가지는 재조합 아데닐산 시클라아제의 구성 및 특징. HPV16-E7 특정 T 세포 반응을 유발하는 CyaA의 능력을 연구하기 위하여, 세 개의 서로 다른 재조합 분자를 만들었다. CyaA-E7_49-57은 이미 기술된 H-2D^b 제한 CTL 에피토프(22)에 대응하는 9-아미노산 길이 폴리펩티드 서열(

)를 포함하고, 그 에피토프는 효소적으로 비활성인(따라서 비독성인) CyaA의 코돈 224와 235 사이에 삽입되었다. CyaA-E7_FULL은 효소적으로 비활성인 CyaA의 동일한 224 위치에 삽입된 HPV16-E7 단백질의 전체 서열(98 아미노산)을 포함한다. CyaA-E7_△30-42는 우선 효소적으로 비활성인 CyaA의 코돈 319와 320 사이에 삽입된 HPV16-E7의 29 아미노산 잔기 뿐만 아니라 코돈 224 내지 235 사이에 삽입된 HPV16-E7의 43 내지 98 잔기를 포함한다. 생체 밖(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 분석을 위하여, CyaA 구성체는 균질성에 가깝게 제조되었고 정제되었다(도 1B). LPS 제거 공정은 50 ㎍ 당 내독소 100 유닛 이하로 포함하는 재조합 단백질을 획득하기 위하여 정제 프로토콜(26)에 주입되었다. CyaA-E7_FULL 및 CyaA-E7_△30-42에서 E7 단백질의 존재는 특정 단클론 항체(Zymed)를 사용하는 웨스턴 블롯팅(western blotting)으로 확인되었다(도 1C). 대조적으로, 단지 H-2D^b 제한 에피토프를 포함하는 CyaA-E7_49-57은 항-HPV16-E7 항체에 의해 인식되지 않았다. 세 개의 재조합 CyaAs의 전체적인 생물학적 특성은 변형되지 않았고 이러한 분자들은 야생형 아데닐산 시클라아제(17)의 용혈 활성과 유사한 용혈 활성을 나타내었다.

HPV16-E7 재조합 CyaAs로의 면역화는 E7-특정 CTL 반응을 유도한다. CyaA가 HPV16-E7 에피토프에 대한 CTL 반응을 유발할 수 있는지 여부를 테스트하기 위하여, C57BL/6 마우스를 다른 HPV16-E7 재조합 CyaAs 50 ㎍으로 정맥 내로 한 번 면역화시켰다. 비장 림프구를 수거하였고 생체 밖에서 E7_43-77 펩티드 1 ㎍/㎖로 자극하였다. 5일 후에 TC-1 세포를 용해하는 능력을 ⁵¹Cr 방출 분석으로 측정하였다. 도 2A에 도시된 것처럼, HPV16-E7 재조합 CyaAs로의 C57BL/6 마우스의 단일 정맥 내(i.v.) 면역화는 TC-1 세포에 대한 강하고 특정적인 CTL 반응을 유발하였다. 전체 HPV16-E7 단백질(도 2A, b) 또는 그 결여된 형태, CyaA-E7_△30-42(도 2A, c)를 포함하는 CyaA로의 면역화는 비록 본 발명자가 데이타로부터 통계적인 중요성을 기술하지는 않았지만, 단지 최소 H-2D^b 제한 에피토프를 포함하는 CyaA-E7_49-57(도 2A, a) 에 의해 유발된 것과 비교했을 때 더 높은 최대 CTL 활성을 초래하였다. 유사한 결과는 펩티드 E7_49-57이 생체 밖(in vitro)에서 재자극(데이타를 나타내지 않음)을 위해 사용되었을 때 획득되었다. 연관이 없는 에피토프(OVA_257-264)를 운반하는 재조합 CyaA로 예방 접종되고 생체 밖에서 E7_43-77 펩티드 1 ㎍/㎖로 재자극된 마우스의 비장 림프구는 단지 약한 비-특이적인 TC-1 세포 용해(도 2A, a)를 나타냈다. 생체 내에서 CyaA에 의한 OVA CD8⁺ 세포 에피토프(SIINFEKL)의 MHC class I 분자로의 전달은 TAP1 기능(15)에 의존한다는 것은 이미 알려져 있다. 본 발명자는 이러한 사실이 CyaA-E7_△30-42에도 해당하는지 시험하였다. 도 2A, d에 도시된 것처럼, 정맥 내(i.v.)로 예방 접종된 TAP1^-/- 마우스의 생체 밖에서 자극된 비장 림프구는 TC-1 세포를 용해할 수 없었다. 본 발명자는 또한 HPV16E7-포함하는 재조합 CyaA에 의한 CTL 반응의 생체 내 프라이밍(priming)에 도움이 되는 CD4⁺ T 세포의 필요 조건을 시험하였다. 처음 관찰에 일치하듯이(15), 본 발명자는 CyaA-E7_△30-42를 사용하는 MHC Class Ⅱ^-/- 마우스의 정맥 내(i.v.) 예방 접종이 TC-1 세포에 대한 높은 수준의 특정의 CTL 반응을 유발한다는 것을 관찰하였다(도 2A, e). 대조적으로, 본 발명자는 CD40^-/- 마우스에서 TC-1 세포에 대한 낮은 수준의 CTL 반응을 관찰한 것처럼, 이러한 모델에서 CD40 시그널링(signaling)에 대한 일부 의존성을 관찰하였다(도 2A, f).

재조합 CyaAs로 면역화된 마우스에서 HPV16-E7-특정 비장 림프구의 빈도를 생체 밖에서 측정하기 위하여, HPV16-E7_49-57 펩티드로의 생체 밖 자극에 반응하여 IFN-γ를 생산하는 세포의 수는 ELISPOT(enzyme-linked immunospots)을 사용하여 정량되었다. 도 2B는 CyaA-E7_49-57로 면역화된 마우스로부터 획득된 IFN-γ를 특정적으로 생산하는 IFN-γ-생산 비장 림프구의 수와 비교했을 때 CyaE5-CysOVA로 면역화된 마우스로부터 획득된 그 비장 림프구의 수에서 단지 약간의 차이가 있다는 것을 보여준다. 대조적으로, 획득된 IFN-γ-생산 비장 림프구의 수는 전체 HPV16-E7 단백질 또는 그 결여된 형태를 포함하는 HPV16-E7 재조합 CyaAs로 예방 접종된 마우스에서 훨씬 더 컸다(p<0.05). 관찰된 반응은 이러한 마우스의 비장 세포가 HPV16-E7_49-57 펩티드에 의한 자극이 없을 때 IFN-γ를 생산하지 않기 때문에 에피토프 특정적이었다(도 2B). 이러한 결과는 CyaA가 생체 내에서 강한 CTL 반응을 유발하기 위하여, HPV16-E7 단백질의 면역 우세 CD8⁺ H-2D^b 제한 T-세포 에피토프를 MHC class I 경로의 처리 및 제시를 위한 면역 우세 세포의 시토졸에 전달할 수 있다는 것을 보여준다. 이러한 관찰에 일치하게(25, 31), 본 발명자는 전체 HPV16-E7 단백질 또는 결여되고 역전 형태를 운반하는 CyaA가 강한 CTL 반응을 유발할 수 있는 것처럼, CyaA가 큰 폴리펩티드 단편의 삽입에 내성이 있다는 것을 확인하였다. 이러한 데이타는 이러한 전체 HPV16-E7 단백질 또는 결여되고 역전 형태가 마우스에서 HPV16-E7_49-57 보다도 상당히 더 높은 특정 반응을 유발하였다는 것을 보여준다.

HPV16-E7 재조합 CyaAs로의 면역화는 HPV16-E7 특정 Th1 반응을 유도한다. Th1 반응은 세포 내 병원체 및 종양 발생(32,33)에 대항하여 보호하는 중요한 역할을 한다. 따라서, 본 발명자는 HPV16-E7 재조합 CyaAs에 의해 유발된 T-세포 반응을 형태를 특징화 하였다. C57BL/6 마우스를 세 개의 서로 다른 HPV16-E7 재조합 CyaAs 50 ㎍으로 정맥 내(i.v.)로 면역시켰고, 비장 세포를 정제된 His-Tag HPV16-E7 단백질 10 ㎍/㎖로 생체 밖에서 자극한 후 사이토카인 합성을 측정하였다. 도 3에 도시된 것처럼, 전체 HPV16-E7 단백질 또는 그 결여된 형태의 단백질을 운반하는 CyaAs로의 면역화는 높은 수준의 IFN-γ의 생산 및 검출할 수 있는 수준의 IL-5의 결핍을 특징으로 하는 Th1과 유사한 특징을 초래하였다. 이러한 반응은 CyaA-E7_FULL 또는 CyaA-E7_△30-42로 면역화 후에 획득된 IFN-γ 수준이 CyaAE5-CysOVA(p<0.05)로 모방 면역화된 마우스에서 획득된 수준보다 훨씬 더 높다는 점에서 특정적이었다. 그러나, 이는 CyaA-E7_49-57로 면역화된 마우스의 비장 림프구의 경우에는 그렇지 않았다. 유사한 결과는 E7_43-77 펩티드 1 ㎍/㎖로 재자극이 실행되었을 때 달성되었다(도 3A, 삽입).

상기의 결과를 모두 고려할 때, 이러한 결과는 본 실험 조건에서 class Ⅱ H-2^b 제한 T 세포 에피토프를 포함하는 전체 HPV16-E7 단백질을 운반하는 CyaAs로 획득된 수치가 단지 class ⅠH-2b 제한 에피토프를 포함하는 CyaA-E7_49-57로 획득된 수치보다 훨씬 더 크기 때문에, CD4⁺ T 세포가 IFN-γ 분비에서 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.

HPV16-E7 재조합 CyaAs로의 면역화는 형성된 HPV-발현 종양의 감퇴를 유발한다. 이미 획득된 확고한 면역학적 반응을 고려할 때, 본 발명자는 피하로 C57BL/6 마우스에 주입된 HPV16-E6 및 E7 단백질(TC-1 세포)을 발현하는 H-2^b 종양 형성 세포주로 구성된 잠복기 모델에서 HPV16-E7 CyaAs의 생체 내 치료 활성을 평가하였다. 이러한 모델에서, 종양 거부 반응은 오직 E7_49-57 특정 CD8⁺ T-세포에 의해 매개된다는 것이 이미 밝혀졌다(21,22,34,35). 따라서, 5×10⁴ TC-1 세포는 C57BL/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 피내로(s.c.) 주입되었고, 1일, 5일 및 10일 후에 CyaAE5-HPV16-E7_49-57, -E7_FULL 또는 -E_△30-42 50 ㎍은 마우스에 정맥 내로 주입하였다. 도 4는 종양 이식 후 10일간 치료를 받은 마우스에서 종양 성장을 나타낸다. 이러한 조건에서 동물의 100%는 백신이 주어질 때까지 감지할 수 있는 종양을 발생시켰다. 불필요한 고통을 피하기 위하여, 마우스를 종양 크기가 1000 ㎣에 달할 때 안락사시켰다. 모든 비처리된 동물 뿐만 아니라 모방 CyaAE5-cysOVA로 처리된 마우스는 49일 동안에 그 크기가 최대값(>1000 ㎣) 이내인 종양을 발생시켰다. 이와 대조적으로, HPV16-E7 재조합 CyaAs로 처리된 대부분의 동물들은 실험 내내 종양이 없었다(도 4, C, D, E). 도 5는 TC-1 세포가 이식되고 그 이식 후 1일, 5일 또는 10일에 재조합 CyaAs가 주입된 세 개의 서로 다른 치료 프로토콜을 받은 동물의 생존률을 나타낸다. 비처리되거나 모방 처리된 동물의 평균 생존 시간은 31 내지 40일이었다. 대조적으로, HPV16-E7 항원을 운반하는 CyaAs로 예방 접종된 마우스의 생존률은 대조 동물보다 훨씬 더 높았다(p<0.05). 여러 구성체의 보호 활성의 차이는 비록 서로 다른 샘플의 작은 크기 때문에 통계적으로 중요성이 떨어지긴 하지만 그 차이가 형성될 수 있었다. 만약 CyaA-E7_49-57 및 -E7_FULL에 의한 종양 감퇴율의 차이가 생기지 않는다면, CyaA-E7_△30-42는 세 개의 치료 계획에서 보호율이 항상 90% 보다 더 크기 때문에 종양 감퇴 및 성장 억제 측면에서 명백히 뛰어났다.

CyaA-E7_49-57 및 CyaA-E7_FULL로 예방 접종된 동물은 실험 과정에서 종양 형성이 천천히 이루어졌다(도 4 (*) 및 데이타는 도시하지 않음). 이러한 현상은 종양 도피(tumor escape) 현상을 반영할 수 있다는 것을 생각할 때, 본 발명자는 이러한 동물로부터 성장하는 종양을 외식하였고 H-2D^b 발현에 대해 FACS 분석으로 TC-1 A1 및 TC-1 A2로 명명된 이러한 세포주를 분석하였다. 도 6에 도시된 것처럼, 순수한 대상에 비교했을 때, 늦게 성장한 종양으로부터 외식된 TC-1 A1 및 A2는 H-2^b의 발현을 상실하였고, 따라서 그것들은 E7_49-57 특정 CD8⁺ T-세포에 검출할 수 없게 되었다. TC-1 세포는 선택을 위한 항생제 압력없이 생체 내 환경에서 성장하였기 때문에, 본 발명자는 또한 웨스턴 블롯으로 TC-1 A1 및 A2 세포에서 HPV16-E7의 발현을 검사하였다. 본 발명자는 TC-1과 TC-1 A1 및 A2 사이의 이러한 단백질의 발현에서의 어떠한 차이도 발견하지 못했다(데이타는 도시하지 않음).

이러한 모든 점을 고려할 때, 이러한 결과는 임상 모델에서 HPV16-발현 종양의 감퇴를 유발하기 위한 적절한 치료 백신으로서 아데닐산 시클라아제 벡터의 효율성을 설명한다.

본 발명자는 치료 측면에서 다른 주입 경로를 시험하였다. 따라서, CyaA-E7_△30-42를 TC-1 이식 후 10일부터 7일 간격으로 피내로(i.d.) 두 번 주입하였다. 흥미롭게도, 모든 비처리된 동물 및 모의 처리된 동물들은 종양을 발생시켰지만, CyaA-E7_△30-42로 처리된 모든 동물에서 종양 감퇴가 관찰되었다(도 4B, a, b). 이러한 치료 면역화는 90일에 CyaA-E7_△30-42 처리된 마우스의 100% 생존률을 초래한 반면, 비처리된 및 모의 처리된 동물의 평균 생존률은 각각 30 및 32일이었다(도 4, c).

CyaA 면역화에 의해 유발된 HPV16-E7 _49-57 특정 CD8 ⁺ T-세포의 장기 지속성. HPV16-E7 재조합 CyaAs에 의해 유발된 면역 반응의 지속성을 평가하기 위하여, 3달 후 치료 실험에서 생존한 마우스를 안락사시켰고 그 비장 림프구를 E7_43-77 펩티드 1 ㎍/㎖로 5일 동안 생체 밖에서 자극하였다. TC-1 세포를 용해하는 능력은 ⁵¹Cr 방출 분석으로 측정하였다. 도 7에 도시된 것처럼, HPV16-E7_43-77에 대한 특정 CTL 반응은 세 달 전에 면역화된 동물의 비장 림프구로부터 여전히 기술되었다. 결정자(effector):표적의 30:1 비율에서 특정 용해의 최대 백분율에 기초하여, 면역 반응은 비록 통계학적인 중요성이 이러한 데이타로부터 기술되지 않을 수도 있지만, CyaA-E7_△30-42로 처리된 동물에서 더욱 더 확실한 것으로 밝혀졌다. 이러한 장기간 지속되는 면역원성의 생리학적 관련성을 평가하기 위하여, 남아있는 동물들을 100일에 5×10⁴ TC-1 세포로 피부 내로(s.c.) 재공격을 받았다. 이러한 조건하에서, 모든 순수한 나이에 맞은 대조 동물들은 종양을 발생시켰고 37.5일의 평균 생존 기간을 나타냈다(도 8). 대조적으로, 세 달 전에 HPV16-E7 재조합 CyaAs로 면역화된 마우스는 종양 형성으로부터 상당히 보호되었다. 상기에서 관찰한 것처럼, CyaAE5-HPV16-E7_△30-42로 예방 접종된 동물은 상당히 높은 보호 수준을 나타냈다. 그러나, 첫 번째 치료 실험에서 획득된 결과와 다르게, 비록 샘플의 크기가 작아 통계학적인 중요성은 동등하게 기술하지는 않지만, CyaA-E7_49-57로 처리된 동물 및 CyaA-E7_FULL로 처리된 동물 사이의 상당한 차이가 존재한다. 이러한 관찰은 이러한 모델에서 전체 HPV16-E7 단백질을 운반하는 CyaA에 의해 제공되는 T-세포 도움이 TC-1 세포에 대항하여 오래 지속되는 반응을 위해 중요하다는 것을 제안한다.

상기의 것들을 고려할 때, 본 발명의 결과는 HPV16-E7 단백질의 헬퍼(helper) 에피토프(

)를 품고 있는 재조합 CyaAs 50 ㎍의 정맥 내(i.v.) 한 번 주입이 적어도 여섯 달 동안에 두 TC-1 종양 세포의 공격을 방어할 수 있는 장기 지속하는 E7_49-57 특정 CD8⁺ T 세포를 유발하기에 충분하다는 것을 말한다.

CyaA-E7 _△30-42 의 치료 효율은 CpG-ODN 1826와 투여된 펩티드의 효율과 호의적으로 비교된다. 항원 전달 시스템으로서 CyaA의 능력을 더 잘 평가하기 위하여, 본 발명자는 CyaA-E7_△30-42의 치료 효율을 CpG-ODN 1826이 보충된 HPV16-E7_43-77의 치료 효율과 비교하였다(37). 따라서, 마우스에 5×10⁴ TC-1 세포를 피내로(s.c.) 주입하였고 피내 경로를 통해 CyaA-E7_△30-42 10 ㎍ 또는 CpG-ODN 1826 1 ㎍과 함께 투여된 HVP16-E7_43-77 펩티드 10 ㎍으로 10일 및 17일 후 치료적으로 투여하였다. 생존률은 비록 CyaA-E7_△30-42 로 획득된 결과가 CpG-ODN 1826와 함께 투여된 HVP16-E7_43-77 펩티드로 획득된 결과보다 조금 낫지만, 이러한 두 그룹에서 획득된 결과는 통계학적으로 서로 다르지 않고 유사하다(도 9). 이러한 결과는 몰 단위로 CyaA-E7_△30-42보다 50배 더 많은 HVP16-E7_43-77를 사용하여 획득되었다. 단독으로 사용될 때, 펩티드 HVP16-E7_43-77는 TC-1 종양 성장에 어떠한 효과도 나타내지 않는다.

CyaA 벡터에 대한 예비 면역화는 CyaA-E7 _△30-42 의 효율에 별로 중요하지 않게 영향을 미친다. 치료 셋팅에서, 복합 부양책은 효율적인 세포성 면역 반응을 획득하기 위하여 장애를 가진 환자에게 적용될 필요가 있다. 따라서, CyaA 벡터에 대한 예비 면역화는 종양 거부 반응을 유발하는 그 능력을 손상하지 않는다는 것을 기술하는 것이 필수적이다. 이를 위하여, 본 발명자는 5×10⁴ TC-1 세포를 피내(s.c.) 주입하기 30일 또는 90일 전에 빈 벡터 CyaAE5 10 ㎍으로 7일 간격으로 두 번 마우스를 피내(i.d.) 면역시켰다. CyaA-E7_△30-42 10 ㎍의 7일 간격으로 두 번의 피내(i.d) 주입에 의한 치료 처리는 10일에 설정되었다. 항체 반응의 분석은 빈 벡터로 면역화된 마우스가 TC-1 주입의 시기에 CyaA에 면역성을 나타낸다는 것을 보여준다(도 10A). 본 발명자는 나이에 맞는 순수한 동물 및 CyaA 면역 동물에서 종양 거부 반응을 유발하는 CyaA-E7_△30-42 처리의 능력을 비교하였다. CyaA에 대한 면역 상태가 어떠하든지 간에, CyaA-E7_△30-42 처리된 대부분의 마우스는 실험 내내 종양이 없었다(도 10B). 단지 30일 면역 마우스 그룹에서 1마리 및 90일 면역 마우스 그룹에서 2마리만이 종양을 발생시켰다(도 10B. b, d, f). 대조적으로, 모의 처리된 동물 100%는 종양이 발생하였고 죽었다(도 10B, a, c, e). 본 발명자는 항-CyaA 항체가(antibody titers)의 정도와 TC-1 종양의 발생 사이의 어떤 관계를 관찰하지 못했다(데이타를 도시하지 않음). 또한, CyaA-E7_△30-42 처리된 마우스의 생존 그래프(도 10B, b, d, f)는 통계학적으로 서로 다르지 않았다(p=0.324).

따라서, 이러한 데이타는 CyaA에 대해 미리 존재하는 면역성의 효과가 외래의 주어진 항원에 대한 효율적인 반응을 유도하는 이러한 벡터의 능력에 대한 매우 제한된 영향을 가진다는 것을 나타낸다.

검토

상기 연구들은 백일해균의 아데닐산 시클라아제가 생체 내에서 수지상 세포의 MHC-class Ⅱ 및 I 제시 경로에 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포 에피토프를 전달하는 강력한 수단이라는 것을 진술한다. 마우스 모델 실험에서, 이러한 시스템은 항-바이러스 및 항-종양 보호성을 제공하는 효율적인 Th1 및 CTL 반응을 유발하기 위해 사용되었다(36). HPV16-연관된 자궁암의 치료를 위한 인간에 대한 CyaA의 적용 가능성의 평가로서, 본 발명자는 이러한 벡터가 HPV16의 E7 단백질의 에피토프를 생체 내로 효과적으로 전달한다는 것을 진술하였다.

본 발명자는 잔기 49-57에 대응하는 특정의 H-2D^b-제한 최소 CTL 에피토프를 포함하면서, HPV16의 전체 E7 단백질 또는 이러한 펩티드의 서브-단편을 포함하는 여러가지 HPV16 재조합 CyaAs를 구성하였다. 본 발명자는 이러한 서로 다른 재조합 단백질들이 C57BL/6 마우스에 주입되었을 때 특정의 강한 CTL 반응을 개시할 수 있다는 것을 밝혔다. 실험 데이타는 CyaA에 의한 CTL 에피토프의 전달이 TAP1^-/- 마우스에서 CyaA-E7_△30-42 의 주입에 대한 CTL을 개시할 수 없었던 것처럼, 완전한 기능성 Class I 제시 경로를 필요로 한다는 것을 확인시켜 준다(15). CyaA에 의해 매개되는 CTL 개시는 이전의 결과에 일치하듯이 MHC Class Ⅱ^-/- 마우스에서 획득된 효율적인 CTL 반응에 의해 지시된 것처럼 CD4⁺ T 세포의 존재에 독립적이었다(15). 백신 벡터로서의 CyaA의 이러한 특징은 변경된 수의 CD4⁺ T 세포를 제시하는 면역력이 저하되거나 또는 면역력이 결핍된 환자의 예방 접종을 고려할 때 매우 중요하다. 그러나, 낮은 CTL 반응이 CD40^-/- 마우스에서 획득되었고, 이는 CTL 개시가 부분적으로 CD40 신호화(signaling)에 의존한다는 것을 나타낸다. 이러한 관찰 결과는 HPV16-E7 재조합 CyaAs가 전형적인 APC의 직접적인 자극에 의해 MHC class I-제한 CTL을 직접적으로 유발한다는 것을 제안한다. CD40-CD40L 상호 작용은 그럼에도 불구하고 최적의 CTL 반응의 개시를 획득하기 위하여 필요하다.

본 발명자는 HPV16-E7의 최소 H-2D^b-제한 CTL 에피토프의 면역원성을 아마도 다른 것 중 기술된 헬퍼(helper) 에피토프

를 포함하는 전체 또는 △30-42 E7의 면역원성과 비교하였다(37). CTL 개시 뿐만 아니라 CyaA-E7_FULL 및 CyaAE-E7_△30-42에 의해 유발된 HPV16-E7-특정 비장 림프구의 빈도는 단지 CTL 에피토프 E_49-57만을 운반하는 CyaA-E7_49-57에 의해 유발된 것보다 뛰어났다. 이러한 관찰은 CyaA에 의한 CTL 및 Th 에피토프의 동시 전달이 더 강력한 CTL 반응을 초래하였다는 것을 지시한다. 이는 다른 모델의 임상(37) 및 치료 과정(38)에서 이미 공개된 데이타와 일치한다. 재조합 CyaAs에 의한 HPV16-E7 Th 에피토프의 전달은 재조합 HisTag-HPV16-E7 단백질 또는 E7_43-77 펩티드로 생체 밖에서 재자극된 HPV16-E7 특정의 비장 림프구에 의해 생산된 사이토카인의 분석에 의해 더욱 명백해진다. 사실상, 본 발명자는 Th 에피토프를 포함하는 재조합 HPV16-E7 CyaAs로 예방 접종된 마우스에서만 IFN-γ의 특정 합성을 관찰하였다. CyaA-E_FULL 및 CyaA-E7_△30-42로 정맥 내로(i.v.) 면역화 후 관찰한 IFN-γ의 높은 수치 및 IL-5의 무분비를 특징으로 하는 전형적인 Th1 특성은 종양 면역 요법을 위한 이러한 벡터의 강력한 중요성을 강조한다.

이는 피하(s.c.)-형성된 종양 형성 TC-1 세포에 기초한 종양 거부 반응 모델에서 시험되었다(21). HPV16-E7 재조합 CyaAs의 면역원성을 기술하는 본 발명자의 데이타에 일치하여, 본 발명자는 이러한 재조합 단백질이 형성된 TC-1 종양의 감퇴를 유발할 수 있다는 것을 관찰하였다. CyaA-E7_△30-42는 90일 간의 생존 기간 면에서 CyaA-E7_49-57 및 CyaAE5-HPV16-E7_FULL 보다 더 뛰어났다. 전체 및 △30-42 E7 단백질을 운반하는 CyaAs가 CTL 개시 능력, HPV16-E749-57 특정 비장 림프구의 빈도 및 IFN-γ의 생산 면에서 비교할 수 있는 결과를 초래함에 따라, 본 발명자는 CyaA-E7_FULL이 생존면에서 CyaA-E7_49-57 보다 더 뛰어나다는 것을 예상하였다. 더 많은 수의 동물을 실험하면 아마도 이러한 모순을 배제하는데 도움이 될 것이다. 그러나, CyaA의 생화학에 대한 두 관점이 여기서 검토되어야 한다. 첫째, CyaA의 224-235 부위에서 음으로 대전된 아미노산의 존재는 진핵 세포의 시토졸로 CyaA의 촉매 도메인의 전위를 억제하는 것으로 밝혀졌다(39). 이러한 점에서, 산성 E7 단백질(pKi=4.17)은 DC의 세포질로의 CyaA의 N-말단 도메인의 효율적인 전위를 방해할 수 있다. CyaA-E7_△30-42는 DC로 전달을 용이하게 하기 위하여 잔기 30 내지 42(

) 사이에 위치한 음으로 대전된 아미노산의 신장(stretch)을 제거하기 위하여 특정적으로 계획되었다(그리고 또한 두 개의 양으로 대전된 아미노산(KR)은 HPV16-E7의 삽입된 N-말단 도메인의 양측에 주입되었다). 두 번째로, Gmira 등(25)은 CyaA 내에 삽입된 이질 단백질의 펼쳐짐이 재조합 단백질의 표적 세포로의 내재화를 위하여 필수적이라는 것을 기술하였다. CyaA-E7_△30-42의 두 개의 서로 다른 허용 부위로의 E7 폴리펩티드의 서로 다른 두 단편의 삽입은 E7 재겹침을 방지하고 따라서 표적 세포로의 전위를 용이하게 한다.

종양 거부 반응 실험 과정에서, 일부 마우스는 이미 형성된 TC-1 종양을 거부한 후 최근에 HPV16 양성 종양을 키우기 시작했다. FACS^® 분석으로 이러한 종양의 세포가 H-2D^b 분자를 발현시키지 않는다는 것을 밝혔다. 이러한 관찰은 더욱 더 눈에 띄게 종양 세포를 제거하고 도피 경로를 통한 종양 재발을 방지하기 위하여 재조합 CyaA 예방 접종의 동질 부스팅(boosting)의 가능성을 고려하게 한다. 관련 분야의 다른 연구진의 데이타를 고려하여(37, 40, 41), 마우스에 주입된 재조합 HPV16-E7 CyaA의 전체량을 100 ㎍, 즉 0.56 nmoles로 상승시키는 CyaA 백신화를 증가시키는 것이 관련이 있다. 이러한 후자의 관찰을 시험하기 위한 실험 뿐만 아니라 CyaAs 투여의 서로 다른 방법을 테스트하기 위한 다른 시험은 실행된다.

TC-1 세포로 재공격 하자마자, HPV16-E7 재조합 CyaAs로 면역화된 생존하는 마우스는 선택적으로 보호되었다. 이는 이러한 동물들의 비장 림프구 중에서 HPV16-E7_49-57 CD8⁺ T-세포의 존재와 관련이 있다. 이러한 관찰은 도 4에서 관찰된 재발이 종양 도피 메카니즘 때문이지 E7 단백질에 대한 약해진 면역성 때문이 아니라는 사실을 강조한다. Th 에피토프를 포함하는 재조합 CyaAs로 면역화된 마우스의 더 나은 생존률은 같은 항원에 대한 T-세포 도움을 제공하는 것이 HPV16-E7_49-57 CD8⁺ T-세포의 효율적인 기억 현상을 야기한다는 것을 나타낸다. 이러한 점에서, CD40L이 결정자 CD8⁺ T 세포에 독특한 분자 서명을 각인하는 것을 통해서, CD4⁺ 세포는 향상된 세포 기능의 능력을 제공한다는 것을 제안한다(42).

HPV-연관 종양의 치료를 위한 새로운 면역 치료제의 테스팅을 위한 유효한 모델에서(21), 본 발명자는 CyaA가 형성된 종양의 감퇴를 유발하고 장기간 종양 형성의 공격에 대항하는 유효한 벡터라는 것을 기술하였다. 현재 개발중인 다른 해결책과 달리(11), CyaA-기초 면역 요법은 전체 단백질이 삽입될 수 있기 때문에 HLA 제한 에피토프를 선택할 필요가 없고, 바이러스성 벡터 및/또는 가능하게는 종양 형성 HPV DNA 서열의 필요성을 배제한다. 또한, 본 연구자는 CyaA의 두 개의 서로 다른 허용 부위에 삽입된 HPV-E7의 두 서브 단편을 포함하는 CyaA로 가장 좋은 결과를 획득하였다.

이러한 구성이 문헌(8, 46)에 기술된 모든 HPV16-E7 HLA class Ⅰ 및 class Ⅱ 에피토프를 포함한다는 사실은 백신 적용에서 CyaA-E7_△30-42의 선택에 힘을 부여한다.

본 발명에서 개시된 데이타에 기초하여, 본 연구자는 HPV 감염과 관련된 자궁 및 항문 형성 이상을 표적으로 하는 임상 시험에서 HPV16-E7을 포함하는 CyaA의 효율을 시험하기 위한 계획을 세웠다.

실험예 2

본 실험예의 목적은 인간의 HPV16 및 HPV18-연관 악성 종양을 치료하기 위하여 HPV16 및 HPV18 E7 단백질 둘 다를 목표로 하는 이가(bivalent) 치료 백신을 만드는 것이다. 따라서, CyaAE5-HPV16E7_△30-42 및 CyaAE5-HPV18E7_△32-42로 명명된 백신 후보가 계획되었고, 구성되었으며 제조되었고 정제되었다. HHD 마우스는 인간 β2-마이크로글로불린에 연결된 α1 도메인과 함께, α3 트랜스멤브레인 및 H-2D^b의 세포질 도메인에 연결된 HLA^*0201의 α1(H) 및 α2(H) 도메인을 포함하는 HHD 삽입유전자(transgene)을 발현시키는 H-2D^-/-β2m^-/- 더블 넉아웃(double-knockout) 마우스이다. 따라서, HDD 마우스에 의해 발현된 단지 MHC class I 분자는 변형된 HLA^*0201 분자(Pascolo 및 Lemonnier)이다.

본 실험의 목적은 이하를 설명하는 것이다:

1- 재조합 CyaA는 HPV16 및 HPV18 E7 단백질의 HLA-A2 제한 에피토프를 전달할 수 있다.

2- 다른 것을 압도하는 어느 하나의 HPV 재조합 cyaA의 면역 우세 현상은 없다.

이를 위하여, HDD 마우스를 정맥 내로(i.v.) CyaAE5-HPV16E7_△30-42(3마리) 50 ㎍, CyaAE5-HPV18E7_△32-42(3마리) 50 ㎍ 또는 CyaAE5-HPV16E7_△30-42 + CyaAE5-HPV18E7_△32-42 동일한(레트로-오비탈(retro-orbital)) 주입(200㎕에서 50 ㎍)(5마리)으로 예방 접종하였다. 7일 후, 비장 림프구를 문헌에 기술되거나 SYFPEITHI 소프트웨어로부터 추정된 HPV16E7 또는 HPV18E7의 HLA-A2 펩티드로 생체 밖에서 재자극하였다.

CTL 활성을 ⁵¹Cr 방출을 사용하여 5일 후에 측정하였다. 표적 세포는 서로 다른 관련 펩티드로 부과되거나 그렇지 않은 HDD-EL4 세포이었다.

결과는 CyaAE5-HPV16E7_△30-42 또는 CyaAE5-HPV18E7_△32-42로의 예방 접종은 생체 밖 재자극에서 자가 펩티드에 이어 HPV16E7 또는 HPV18E7 펩티드가 부과된 EL4-HDD 세포의 특정 용해를 유발하였다는 것을 보여준다.

이러한 결과는 또한 CyaAE5-HPV18E7_△32-42와 함께 CyaAE5-HPV16E7_△30-42의 공동 주입이 관련 펩티드에 대한 유사한 반응에서 관찰되는 것처럼 HPV 재조합 CyaA의 어떤 면역원성에 손상을 입히지 않았다는 것을 보여준다.

이러한 결과는 CyaAE5-HPV16E7_△30-42 및 CyaAE5-HPV18E7_△32-42가 각각의 E7 단백질의 인간 HLA-A2 제한 에피토프에 대한 생체 내 세포 독성 반응을 유발할 수 있다는 것을 설명한다.

- 마우스

특정의 병원체가 없는 HHD 마우스를 파스퇴르 연구소에서 사육하였다. 본 실험을 위하여 6-10주 된 11마리의 수컷을 사용하였다.

- 시료 및 생물학적 물질

- 시료 및 완충 용액

RPMI 1640 매질-글루타맥스(invitrogen GIBCO, 참조:6187010)

에탄올 70°(Prolabo, 참조:MC311631)

페니실린-스트렙토마이신(invitrogen GIBCO, 참조:15140122)

소태아혈청(FBS)(PERBIO, 참조:CH30160.03)

β 메르캅토-에탄올(BIO-RAD, 참조:161-0710)

열분해된(pyrolyzed) 물

블루 트립판(Blue trypan)(SIGMA, T-8154)

51Cr

트리룩스 신틸란트(Trilux Scintillant)(Wallac)

- 펩티드

⁵¹Cr 방출 분석 전에 비장 림프구의 생체 밖 자극을 위하여 다섯 가지 합성 펩티드(Neosystem, Strasbourg, 프랑스)를 사용하였다:

▶ HPV16-E7 HLA-A2-제한 에피토프(1)에 해당하는 E7 _11-20 (

, 문자 하나 하나는 아미노산을을 암호화한다, #253),

▶ HPV16-E7 HLA-A2-제한 에피토프(1)에 해당하는 E7 _82-90 (

, #258),

▶ HPV16-E7 HLA-A2-제한 에피토프(1)에 해당하는 E7 _86-93 (

, #255),

▶ SYFPEITHI 소프트웨어에 의해 예상되는 HPV18-E7 HLA-A2-제한 에피토프에 해당하는 E7 _7-15 (

, #251),

▶ HPV18-E7 HLA-A2-제한 에피토프(2)에 해당하는 E7 _86-94 (

, #257).

펩티드를 1 ㎎/㎖의 멸균된 비발열성 물에 희석하거나(#253, 255, 251) 또는 비발열성 물, 0.1 M NaHCO₃; 아세토니트릴(50/50)에 희석하였다(#257 및 258).

- 재조합 아데닐 시클라아제(CyaA)

두 CyaA가 본 실험에서 시험되었다:

- CyaA-HPV16E7_△30-42

- CyaA-HPV18E7_△32-42

이러한 CyaA는 효소적으로 비활성인 CyaA(CyaAE5)를 암호화하는 플라스미드 pTRACE5의 유도체를 사용함으로써 대장균(E. coli) 균주 BLR에서 발현되었다. 플라스미드의 구성, 모든 재조합 단백질의 생산 및 정제는 본 발명을 위해 사용된 에피토프를 가진채, HPV16-E7 에피토프를 운반하는 재조합 백일해균 아데닐산 시클라아제의 구성 및 정제에 관한 상기의 실험예 1에서처럼 만들어진다.

8M 요소에 각각 1.22 ㎎/㎖ 및 1.33 ㎎/㎖의 CyaA를 포함하는 원액(-20℃에서 저장됨)을 해동하고 마우스에 정맥 내로(i.v.) 주입하기 전에 PBS(Gibco BRL)로 250 ㎍/㎖로 희석하였다. 요소의 최종 농도는 각각 1.5과 1.6M 사이이다.

- 세포주

EL4-HHD 세포는 ⁵¹Cr CTL 분석에서 표적으로 사용되었다.

이러한 세포들은 완전 매질: 10% 열로 불활성화된 FCS, 100U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 5.10^-5M β2-메르캅토에탄올(Gibco BRL, Cergy-Pontoise, 프랑스)이 공급된 글루타맥스를 가진 RPMI 1640에서 유지되었다.

방법

마우스 면역화

각성(vigil) 동물을 0.3 ㎖ 인슐린 주사기(Terumo)로 CyaAE5-HPV16E7_△30-42 및/또는 CyaAE5-HPV18E7_△32-42의 한 번의 정맥 내(레트로-오비탈(retro-orbital)) 주입(200 ㎕에서 50 ㎍)으로 면역화시켰다.

실험 계획

표 1은 마우스의 각 그룹에 투여될 백신 후보 및 처리를 기술한다.

- CTL 분석

면역화에 의해 유발된 세포성 면역 반응의 생체 밖(in vitro) 평가를 위하여, 안락사한 동물(CO₂)에서 면역화 7일 후에 비장을 적출하였다. 각 그룹의 비장 림프구는 CTL 분석 전에 모아졌다.

- CTLs의 자극(각 비장마다 2개의 플라스크 T25를 준비한다)

- 샘플 비장을 RPMI 1640-Glutamax 1% Ab에서 분쇄한다.

- 위에 뜬 것을 가만히 따라 낸다(Decant).

- 1200 rpm에서 10분간 원심분리한다.

- 세포를 2 ㎖ RMPI 1640-글루타맥스(Glutamax) 1% Ab-10% FCS- 5.10^-5M β 메르캅토-에탄올(완전 매질:CM)에서 재분배한다

- 각 T25 플라스크에;

CM 10 ㎖,

결정자 세포 5.10⁷, 및

최종 농도가 10 ㎍/㎖인 관련 펩티드를 담고, 플라스크를 옮기지 않고 5일 동안 배양한다.

- 세포독성 분석

1/ 표적 세포:

- 하루 전날, 기하 급수적으로 성장한 표적 세포를 수거하기 위하여 그 표적 세포를 1/3 내지 1/2로 희석한다.

- 15 ㎖ 튜브로 옮긴다.

- 1200 rpm에서 10분간 원심분리한다.

- RPMI 1640-1% Ab 1㎖에서 재분배한다.

- 계수한다

- 두 개의 튜브를 준비한다: 하나는 펩티드를 가지고 있으며, 다른 하나는 펩티드가 없음.

- 150 ㎕에서 재분배한다:

두 튜브 중 하나에 펩티드(50 μmolar).

3 10⁶ 세포에 대한 ⁵¹Cr(50 ㎕)100 μCi

매질은 150 ㎕까지.

- 매 15분마다 부드럽게 흔들면서 37℃ 수욕조에서 1시간 동안 배양한다.

2/ 결정자(effector) 세포

- 파스퇴르 피펫으로 상청액 약 5㎖를 버린다.

- 피펫팅으로 세포들을 전체적으로 펼친다.

- 1200 rpm에서 10분간 원심분리한다.

- CM 1 ㎖에서 재분배한다. 계수한다.

- 10⁷ 세포/㎖로 조정한다.

- 결정자/표적 비율: 200/1, 100/1, 50/1, 25/1, 12/1, 6/1을 획득하기 위하여 희석한다.

- U-바닥 마이크로타이터판(microtiter plate)에 100 ㎕/웰로 분배한다.

- 표적 세포의 제조를 끝내는 동안 37℃, 7.5% CO₂에서 배양한다.

3/ 분석:

- 표적 세포를 RPMI 1640-1% Ab 10㎖로 세척한다.

- 다시 CM 10㎖로 세척한다.

- CM 2㎖로 재분배한다.

- 계수한다.

- 10⁵ 세포/㎖로 조정한다.

- 100 ㎕/웰로 분배한다.

- 자발적인 방출을 위해 여섯 개의 웰을 준비한다(CM에서 100㎕로 조절한다).

- 최대 방출을 위해 여섯 개의 웰을 준비한다(20% Triton X-405 100㎕를 첨가한다).

- 37℃, 7.5% CO₂에서 4 내지 5시간 동안 배양한다.

4/ 계수:

- 2000 rpm으로 5 내지 10분 원심분리한다.

- 플로피 P96 아미크로타이터판에 트리룩스 신틸란트(Trilux scintillant) 100 ㎕을 넣는다.

- 상청액 50 ㎕를 샘플링하고 플로피 플레이트에 옮긴다.

- 그 플레이트를 플라스틱 필름 테이프로 봉한다.

- wallac 카운터로 hte 다음날 계수한다.

- HPV16E7 CTL 특정 반응

CyaA-HPV16E7_△30-42로 유발된 CTL 반응은 도 11에 도시되어 있다.

- HPV18E7 CTL 특정 반응

CyaA-HPV18E7_△32-42로 유발된 CTL 반응은 도 12에 도시되어 있다.

- 결론

CyaA-HPV16E7_△30-42 및 CyaA-HPV18E7_△32-42 둘 다는 이러한 키메라 HHD 모델에서 각각의 HLA-A2 제한 펩티드에 대하여 특정 CTLs를 유발할 수 있다.

CyaA-HPV16E7_△30-42 및 CyaA-HPV18E7_△32-42의 공동 주입은 각각의 특정 HLA-A2 제한 펩티드에 대항하여 CTLs을 유발하는 각 개별의 CyaA의 능력을 간섭하지 않았다. 이는 다른 것에 대한 어느 한 구성의 면역 우세 현상이 없다는 것을 나타낸다. 이는 이가(bivalent) 백신을 만드는 전략에 대하여 결정적인 관찰을 구성한다.

실험예 3

HPV18의 E7 단백질 및 HPV16 및 HPV18의 E7 단백질을 포함하는 재조합 아데닐산 시클라아제의 구성 및 면역학적 평가

항문성기 도관의 암종은 여성의 모든 암 중 거의 12%를 차지하고, 자궁 암종(CxCa)은 세계에서 두 번째로 빈번한 부인과 암이다. 인유두종 바이러스(HPV)에 의한 감염이 CxCa의 원인일 수 있다는 임상 관찰은 역학 조사에 의해 확인되었다. CxCa와 연관된 가장 널리 알려진 HPV는 HPV16 및 HPV18(각각 55% 및 12%의 보급률){Clifford, 2003}이다. 더 많은 사람들에게 적용하기 위하여, HPV16 및 HPV18의 E7을 운반하는 이가(bivalent) 치료 백신을 구성하기로 결정하였다. 두 가지 가능한 전략이 시험되었다; (i) 우선, 한편으로 HPV16의 E7를 운반하고 다른 한편으로 HPV18의 E7을 운반하는 두 재조합 CyaAs를 동일 몰 분량으로 혼합하는 것; (ii) HPV16 및 HPV18의 두 E7 단백질 모두를 운반하는 재조합 CyaA를 구성하는 것. 본 리포터는 HPV18의 E7 또는 양 바이러스의 E7을 운반하는 재조합 CyaAs의 구성을 기술한다. 그 구성의 면역원성은 CTL 분석으로 평가되었다.

- 에피토프 확인

HPV18E7의 아미노산 서열은 H-2^b 에피토프를 찾는 동안 SYFPEITHI(www.syfpeithi.de)에 제출되었다. 그 소프트웨어는 한정된 MHC 분자에 결합할 수 있는 에피토프를 예상하는 알고리즘을 사용한다. 그 소프트웨어는 25점을 받은 H-2D^b 분자에 의해 제한된 추정 에피토프를 돌린다. 통상적으로 스코어가 22 이상일 때 에피토프라고 취급한다. 추정 펩티드,

은 따라서 네오시스템(Neosystem)에 의해 합성되었다.

- 재조합 CyaAs의 구성

CyaA-HPV18E7, CyaA-HPV18E7_△32-42, CyaA-HPV16+18E7, CyaA-HPV16+18△E7을 생산하기 위한 플라스미드를 구성하기 위해 사용되는 전략을 나타내는 계획도는 도 13 및 도 14에 도시된다.

- CTL 분석

본 실험의 목적은 전체 HPV18E7 단백질 또는 단편 뿐만 아니라 HPV16 및 HPV18E7 단백질 둘 다를 운반하는 재조합 CyaA에 의한 CTL의 생체 내 유도에 대하여 기술하는 것이다. 표적화된 H-2D^b 에피토프는 컴퓨터 예측 소프트웨어로 획득된 HPV18E7_41-49(

) 및 HPV16E7_49-57이다. C57BL/6 마우스를 CyaA-CysOVA, CyaA-HPV18E7, CyaA-HPV18E7_△32-42, CyaA-HPV16+18E7 또는 CyaA-HPV16+18△E7 50 ㎍으로 정맥 내로 예방 접종하였다(각 그룹에서 2). 7일 후, 모인 비장 림프구를 펩티드 HPV18E7_41-49(10 ㎍/㎖), OVA_257-264(1 ㎍/㎖) 또는 HPV16E7_43-77(1 ㎍/㎖)로 생체 밖에서 재자극하였다. CTL 활성은 5일 후에 ⁵¹Cr 방출을 사용하여 분석하였다. 표적 세포는 HPV18E7_41-49 펩티드(8 n㏖)가 부과되거나 그렇지 않은 EL4 세포 또는 TC-1 세포였다. 도면에서 설명은 다음을 나타낸다: 예방 접종/재자극. 예를 들어, OVA/OVA는 CyaAE5-CyaOVA로 예방 접종되고 OVA 펩티드로 재자극된 마우스를 언급한다.

이러한 결과(도 16)는 CyaA-HPV18E7_FULL에 대조적으로, CyaA-HPV18E7_△32-42가 생체 내에서 강한 CTL 반응을 유발하기 위하여, HPV18-E7 단백질의 컴퓨터가 예상한 CD8⁺ H-2D^b-제한 T-세포 에피토프를 MHC class I 경로에 처리 및 제시를 위해 면역적격세포(immunocompetent cell)의 시토졸에 전달할 수 있다는 것을 보여준다. CyaA-HPV18E7_△32-42는 펩티드 HPV18E7_41-49의 처음 두 아미노산이 부족하기 때문에, CyaA-HPV18E7_△32-42가 HPV18E7_41-49에 대항하는 CTL 반응을 개시할 수 있다는 것은 이상하다. 그러나, HPV18E7 단편 43 내지 105의 삽입 부위에서, 하나의 알라닌 및 하나의 세린이 있으며 그 결과 추정 펩티드는

대신에

이다. syfpeithi에 제출되었을 때, 이런 펩티드는 29점을 기록하였다(순수한 펩티드에 대해서는 25점). 따라서, 클로닝(cloning)에 의해 이러한 펩티드의 아미노산의 처음을 치환함으로써 그것을 잠재적인 것에서 면역원성으로 변화시켰다. HPV18E7 단백질을 위한 에피토프가 H-2D^b에 기술되는 것은 처음이다

비특이적인 배경의 높은 수치에도 불구하고, 이러한 결과는 또한 CyaA-HPV16+18E7_FULL 및 CyaA-HPV16+18E7_△가 생체 내에서 강한 CTL 반응을 유발하기 위하여, HPV16-E7 단백질의 H-2D^b-제한 T-세포 에피토프를 MHC class I 경로에 처리 및 제시를 위해 면역적격세포(immunocompetent cell)의 시토졸에 전달할 수 있다는 것을 보여준다. CyaA-HPV16+18E7_△는 CyaA-HPV16+18E7_FULL과 비교했을 때 더 높은 능력을 나타낸다. 이러한 데이타는 또한 큰 폴리펩티드 단편(203 아미노산)을 운반하는 CyaA가 여전히 면역원성이라는 것을 처음으로 나타낸다.

또 다른 실험은 도 16에 도시된 것을 확인하기 위하여 실행되었다. 각 그룹에서 남아 있는 두 마리 마우스를 첫 번째 것부터 개별적으로 처리하였다. 실험 구성은 비슷하다. 결론은 CyaAE5-HPV18E7_△32-42 예방 접종된 마우스로부터의 CTLs에 의한 EL4 세포의 비특이적인 용해의 높은 수치가 플라스크에 남아 있는 다량의 HPV18E7_41-49 펩티드 때문일 것이라는 것만 제외하고는 도 16과 동일하다.

CyaA-HPV16+18△E7로 예방 접종된 마우스의 비장 림프구로 TC-1 세포의 용해가 있지만 CyaA-HPV16+18E7의 경우에는 그렇지 않았다. 본 실험에서, 비특이적인 배경은 피크는 40%에서 최고였다. 그럼에도 불구하고, 도 17로부터 알 수 있는 결론은 도 16에서 알 수 있는 것들을 확인시켜준다, 즉:

- CyaA-HPV18E7_△32-42는 생체 내에서 강한 CTL 반응을 유발하기 위하여, HPV18-E7 단백질의 컴퓨터가 예상한 CD8⁺ H-2D^b-제한 T-세포 에피토프를 MHC class I 경로에 처리 및 제시를 위해 면역적격세포(immunocompetent cell)의 시토졸에 전달할 수 있다. 이는 HPV18E7 단백질을 위한 에피토프가 H-2D^b 내용에 기술되기는 처음이다.

- 큰 폴리펩티드 단편(203 아미노산까지)을 운반하는 재조합 CyaA는 여전히 면역원성이다.

- 결론

HPV16 및 HPV18의 E7을 운반하는 이가(bivalent) 치료 백신을 구성하는 것이 결정되었다. 두 가지 가능한 전략이 고려되었다; (i) 우선, 한편으로 HPV16의 E7를 운반하고 다른 한편으로 HPV18의 E7을 운반하는 두 재조합 CyaAs를 동일 몰 분량으로 혼합하는 것; (ii) HPV16 및 HPV18의 두 E7 단백질을 운반하는 재조합 CyaA를 구성하는 것. 본 발명의 결과는 HPV18의 E7 또는 양 바이러스의 E7을 운반하는 재조합 CyaAs의 구성을 기술한다. 그 구성의 면역원성은 CTL 분석으로 평가되었다.

본 연구의 주요 결론은 두 가지 전략이 실행할 수 있다는 것이며, 이는 HPV18E7 서브 단편을 운반하는 재조합 CyaA가 처음에 HPV18E7의 서열 내에서 잠재적인 H-2D^b-제한 에피토프를 밝힘으로써 기능적이기 때문이다. 또한, HPV16 및 18 둘 모두의 바이러스의 E7 단백질(또는 서브-단편)을 운반하는 재조합 CyaAs는 TC-1 세포에 의해 자연적으로 제시되는 H-2D^b-제한 HPV16E7 에피토프에 대항하여 CTL 반응을 개시할 수 있기 때문에 여전히 그리고 가장 흥미롭게도 면역원성이었다.

COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES(CNCM) CNCMI-3190 20040318 COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES(CNCM) CNCMI-3191 20040318

SEQUENCE LISTING <110> INSTITUT PASTEUR GENTICEL INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE <120> RECOMBINANT PROTEIN CARRYING HUMAN PAPILLOMAVIRUS EPITOPES INSERTED IN AN ADENYLATE CYCLASE PROTEIN OR FRAGMENT THEREOF. THERAPEUTIC USES THEREOF <130> IP20132228FR <150> EP 04290741.0 <151> 2004-03-18 <160> 22 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fragment E7 49-57 <400> 1 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe 1 5 <210> 2 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fragment E7 43-77 <400> 2 Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys 1 5 10 15 Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val 20 25 30 Asp Ile Arg 35 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide derived from HPV18 E7 protein <400> 3 Ile Asp Gly Val Asn His Gln His Leu 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Cryptic epitope <400> 4 Ala Ser Gly Val Asn His Gln His Leu 1 5 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide BTP1 <400> 5 ctagccgtgc ccattacaat attgtaacct ttggtac 37 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide BTP2 <400> 6 caaaggttac aatattgtaa tgggcacgg 29 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer BTP3 <400> 7 gggcgctagc atgcatggag atacacctac 30 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer BTP4 <400> 8 gggcggtacc tggtttctga gaacagatgg g 31 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer BTP5 <400> 9 gggcaccggt aaacgtatgc acggcgatac tccg 34 <210> 10 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer BTP6 <400> 10 cgtgagcatc tggctttcac tagtacgttt gttcagctgc tcgtagca 48 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer BTP7 <400> 11 gggcactagt gaaagccaga tgctcacgcg cggg 34 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer BTP8 <400> 12 agtacatccg gcgagaac 18 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer BTP9 <400> 13 gggcgctagc ggtcaagcag aaccggac 28 <210> 14 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer BTP10 <400> 14 gggcggtacc aggtttttga gagcaaatcg gacaaacaat ccccagagta cccatc 56 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> OVA CD8+ cell epitope <400> 15 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Helper epitope of the HPV16-E7 protein <400> 16 Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe 1 5 10 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acids 30-42 <400> 17 Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala 1 5 10 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide E7 11-20 <400> 18 Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr 1 5 10 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide E7 82-90 <400> 19 Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val 1 5 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide E7 86-93 <400> 20 Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide E7 7-15 <400> 21 Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> E7 86-94 <400> 22 Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu 1 5

Claims (53)

1. - HPV16의 전체 길이 E7 폴리펩티드;
   - HPV18의 전체 길이 E7 폴리펩티드;
   - 아미노산 서열

   

   (E7_43-77)로 구성된 단편;
   - 아미노산 서열

   

   로 구성된 단편;
   - HPV16의 E7 폴리펩티드의 아미노산 잔기 1 내지 29로 구성된 단편;
   - HPV16의 E7 폴리펩티드의 아미노산 잔기 43 내지 98로 구성된 단편;
   - HPV18의 E7 폴리펩티드의 아미노산 잔기 1 내지 31로 구성된 단편; 및
   - HPV18의 E7 폴리펩티드의 아미노산 잔기 43 내지 105로 구성된 단편 중에서 선택된 하나 또는 여러 가지 면역원성 폴리펩티드를 포함하는 재조합 단백질로서,
   상기 면역원성 폴리펩티드는 백일해균(Bordetella pertussis) 아데닐산 시클라아제(CyaA) 단백질 또는 CyaA 단편의 동일하거나 서로 다른 허용 부위에 삽입되고,
   상기 CyaA 단편은 백일해균 CyaA의 아미노산 잔기 372 내지 1706으로 구성된 것이거나 또는 백일해균 CyaA의 아미노산 잔기 1 내지 224 및 235 내지 1706으로 구성되고,
   상기 허용 부위는 백일해균 CyaA의 아미노산 잔기 107-108, 아미노산 잔기 132-133, 아미노산 잔기 137-138, 아미노산 잔기 224-225, 아미노산 잔기 228-229, 아미노산 잔기 232-233, 아미노산 잔기 235-236, 아미노산 잔기 317-318, 아미노산 잔기 319-320, 아미노산 잔기 335-336, 아미노산 잔기 336-337 또는 아미노산 잔기 224-235 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질.
2. 제1항에 있어서,
   상기 면역원성 폴리펩티드에 대해 항원-특이적 반응을 유발할 수 있는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
3. 제1항에 있어서,
   상기 면역원성 폴리펩티드는 아미노산 서열

   

   (E7_43-77)로 구성된 단편인 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
4. 제1항에 있어서,
   HPV16 및 HPV18 모두의 E7 단백질로부터 유래된 여러 가지 면역원성 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
5. 제1항에 있어서,
   HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질의 복합 면역원성 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
6. 제5항에 있어서,
   상기 복합 면역원성 폴리펩티드는 백일해균 CyaA 단백질 또는 CyaA 단편의 서로 다른 허용 부위에 삽입된 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
7. 제6항에 있어서,
   상기 복합 면역원성 폴리펩티드는 HPV16의 E7 단백질의 잔기 1 내지 29로 구성된 단편, 또는 HPV16의 E7 단백질의 잔기 43 내지 98로 구성된 단편, 또는 상기 2개의 단편 모두를 포함하고,
   상기 폴리펩티드는 백일해균 CyaA 단백질의 서로 다른 허용 부위에 삽입된 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
8. 제5항에 있어서,
   상기 복합 면역원성 폴리펩티드의 각각은 HPV16 및 HPV18 중에서 선택된 하나의 HPV 유형으로부터 유래된 것이거나, 또는 HPV16 및 HPV18 중에서 선택된 서로 다른 HPV 유형으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
9. 제8항에 있어서,
   상기 복합 면역원성 폴리펩티드는 백일해균 CyaA 단백질 또는 CyaA 단편의 서로 다른 허용 부위에 삽입된 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
10. 제5항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 HPV16의 전체 길이 E7 폴리펩티드 및 HPV18의 전체 길이 E7 폴리펩티드이고,
    상기 폴리펩티드는 백일해균 CyaA 단백질의 서로 다른 허용 부위에 삽입된 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
11. 제1항에 있어서,
    상기 면역원성 폴리펩티드의 적어도 하나는 HPV16 또는 HPV18의 붕괴된(disrupted) 순수(native) E7 단백질로 구성되고,
    상기 붕괴는 (a) 상기 HPV E7 단백질의 산성 부위에서 하나 또는 여러 가지 아미노산 잔기의 결실, 또는 (b) 백일해균 CyaA의 2개 이상의 허용 부위에서 상기 HPV E7 단백질의 2개 이상의 폴리펩티드 단편의 삽입으로 구성되는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
12. 제1항에 있어서,
    상기 백일해균 CyaA 단백질 또는 상기 CyaA 단편의 효소 활성은 시클라아제 활성에 관계된 상기 백일해균 CyaA의 부위로 디펩티드의 삽입에 의해 유전적으로 비활성화된 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
13. 제12항에 있어서,
    상기 디펩티드는 백일해균 CyaA 또는 CyaA 단편의 아미노산 잔기 188과 189 사이에 삽입된 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
14. 제1항에 있어서,
    포유류 숙주에서 세포-매개 면역 반응을 유발할 수 있는 재조합 단백질.
15. 제1항에 있어서,
    포유류 숙주에서 체액성 면역 반응을 유발할 수 있는 재조합 단백질.
16. 제1항에 있어서,
    2004년 3월 18일에 번호 I-3191로 CNCM에 기탁된 pTRACE5-HPV16E7_FULL 또는 2004년 3월 18일에 번호 I-3190으로 CNCM에 기탁된 pTRACE5-HPV16E7_△30-42 중에서 선택된 플라스미드에 포함된 삽입물에 의해 암호화되는 재조합 단백질.
17. 제1항에 따른 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
18. 제17항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 2004년 3월 18일에 번호 I-3191로 CNCM에 기탁된 벡터 pTRACE5-HPV16E7_FULL 또는 2004년 3월 18일에 번호 I-3190으로 CNCM에 기탁된 벡터 pTRACE5-HPV16E7_△30-42에 포함되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
19. 제17항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터.
20. 제19항에 있어서,
    박테리아에서 상기 암호화된 재조합 단백질을 발현하는 재조합 발현 벡터.
21. 제19항에 있어서,
    진핵 세포에서 상기 암호화된 재조합 단백질을 발현하는 재조합 발현 벡터.
22. 제21항에 있어서,
    포유류 세포에서 상기 암호화된 재조합 단백질을 발현하는 재조합 발현 벡터.
23. 제20항에 있어서,
    2004년 3월 18일에 번호 I-3191로 CNCM에 기탁된 pTRACE5-HPV16E7_FULL 또는 2004년 3월 18일에 번호 I-3190으로 CNCM에 기탁된 pTRACE5-HPV16E7_△30-42 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
24. 제17항 또는 제18항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 숙주 세포.
25. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 재조합 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
26. 2004년 3월 18일에 번호 I-3191로 CNCM에 기탁된 벡터 pTRACE5-HPV16E7_FULL 또는 2004년 3월 18일에 번호 I-3190으로 CNCM에 기탁된 벡터 pTRACE5-HPV16E7_△30-42를 포함하는 대장균(E. coli) 세포인 것을 특징으로 하는, 재조합 숙주 세포.
27. 생리학적으로 수용할 수 있는 매개체, 첨가제, 운반체 및 희석제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분과 함께 하기를 포함하는 면역원성 조성물:
    (a) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 재조합 단백질,
    (b) 제17항 또는 제18항에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는
    (c) 제19항, 제21항 또는 제22항에 따른 재조합 발현 벡터.
28. 제27항에 있어서,
    포유류 숙주에서 세포-매개 면역 반응을 유발하는 면역원성 조성물.
29. 제27항에 있어서,
    세포-매개 세포용해 면역 반응을 유발하는 면역원성 조성물.
30. 제27항에 있어서,
    체액성 면역 반응을 유발하는 면역원성 조성물.
31. 제27항에 있어서,
    보조제(adjuvant), 계면 활성제 및 면역 조절 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
32. 제27항에 있어서,
    HPV 감염을 예방하거나 치료하기 위한 면역원성 조성물.
33. 제27항에 있어서,
    암 면역요법을 위한 면역원성 조성물.
34. 제27항에 있어서,
    숙주에서 HPV 감염으로 인한 악성 형질전환의 개시 또는 유지를 예방하거나 치료하기 위한 면역원성 조성물.
35. 하기를 포함하는, 숙주에서 세포-매개 면역 반응 또는 체액성 면역 반응을 유발하기 위한 백신 조성물:
    (a) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 재조합 단백질,
    (b) 제17항 또는 제18항에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는
    (c) 제19항, 제21항 또는 제22항에 따른 재조합 발현 벡터.
36. 하기를 포함하는, HPV 감염을 예방하거나 치료하기 위한 약제 조성물:
    (a) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 재조합 단백질,
    (b) 제17항 또는 제18항에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는
    (c) 제19항, 제21항 또는 제22항에 따른 재조합 발현 벡터.
37. 하기를 포함하는, 숙주에서 HPV 감염으로 인한 악성 형질전환의 개시 또는 유지를 예방하거나 치료하기 위한 약제 조성물:
    (a) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 재조합 단백질,
    (b) 제17항 또는 제18항에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는
    (c) 제19항, 제21항 또는 제22항에 따른 재조합 발현 벡터.
38. 하기를 포함하는, 암 면역요법을 위한 약제 조성물:
    (a) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 재조합 단백질,
    (b) 제17항 또는 제18항에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는
    (c) 제19항, 제21항 또는 제22항에 따른 재조합 발현 벡터.
39. 하기를 포함하는, HPV 감염의 진단 또는 HPV 감염의 면역 모니터링을 위한 키트:
    (a) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 재조합 단백질,
    (b) 제17항 또는 제18항에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는
    (c) 제19항, 제21항 또는 제22항에 따른 재조합 발현 벡터.
40. 하기 단계를 포함하는, HPV 감염의 생체 밖(in vitro) 진단 또는 면역 모니터링을 위한 방법:
    - 포유류로부터 획득한 T 세포를 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 재조합 단백질에 노출시키는 단계, 및
    - 상기 T 세포의 활성의 변화를 검출하는 단계.
41. 제40항에 있어서,
    상기 T 세포는 인간 환자로부터 획득한 것을 특징으로 하는 방법.
42. 키메라 백일해균 CyaA-폴리펩티드 단백질에 포함된, HPV16 또는 HPV18의 E7 단백질에서 비공지된(unknown) 또는 서브 도미넌트(subdominant) 잠재 T-세포 에피토프를 선별하는 방법으로서,
    상기 백일해균 CyaA는 제1항 내지 제3항 및 제13항 중 어느 한 항에 기재되어 있는 CyaA 단백질 또는 CyaA 단편이고,
    하기 단계를 포함하는 방법:
    - 상기 키메라 단백질을 비인간 동물 숙주에 투여하는 단계, 및
    - 상기 숙주의 T-세포 반응을 검출하는 단계.
43. 제42항에 있어서,
    상기 T-세포 반응은 CTL 반응인 것을 특징으로 하는 방법.
44. 하기를 포함하는 이가(bivalent) 치료 백신:
    (a) 제1항에 따른 재조합 단백질, 여기서 면역원성 폴리펩티드는 HPV16의 E7 단백질로부터 유래된 것임, 및
    (b) 제1항에 따른 재조합 단백질, 여기서 면역원성 폴리펩티드는 HPV18의 E7 단백질로부터 유래된 것임.
45. 제44항에 있어서,
    상기 (a)의 재조합 단백질은 백일해균 CyaA의 아미노산 잔기 319와 320 사이에 삽입된 HPV16의 E7 단백질의 아미노산 잔기 1 내지 29, 및 백일해균 CyaA의 아미노산 잔기 224와 235 사이에 삽입된 HPV16의 E7 단백질의 아미노산 잔기 43 내지 98을 포함하고,
    상기 (b)의 재조합 단백질은 백일해균 CyaA의 아미노산 잔기 319와 320 사이에 삽입된 HPV18의 E7 단백질의 아미노산 잔기 1 내지 31, 및 백일해균 CyaA의 아미노산 잔기 224와 235 사이에 삽입된 HPV18의 E7 단백질의 아미노산 잔기 43 내지 105를 포함하며,
    상기 백일해균 CyaA는 아미노산 잔기 Asp 188과 Ile 189 사이에 디펩티드 LQ의 삽입에 의해 효소적으로 비활성된 것을 특징으로 하는, 이가 치료 백신.
46. 제1항에 따른 재조합 단백질을 포함하는 이가 치료 백신으로서,
    상기 재조합 단백질은 복합 면역원성 폴리펩티드를 포함하고, 상기 복합 면역원성 폴리펩티드의 각각은 HPV16의 E7 단백질 및 HPV18의 E7 단백질로부터 유래된 것을 특징으로 하는 이가 치료 백신.
47. 제10항에 따른 재조합 단백질을 포함하는 이가 치료 백신으로서,
    HPV16 및 HPV18 모두의 E7 단백질로부터 유래된 복합 면역원성 폴리펩티드의 각각이 백일해균 CyaA의 서로 다른 허용 부위에 삽입된 것을 특징으로 하는 이가 치료 백신.
48. 제47항에 있어서,
    상기 재조합 단백질은
    (a) 백일해균 CyaA의 아미노산 잔기 224와 235 사이에 삽입된 HPV16의 E7 단백질의 아미노산 잔기 43 내지 98 및 그에 후속하여 HPV18의 E7 단백질의 아미노산 잔기 43 내지 105, 및
    (b) 백일해균 CyaA의 아미노산 잔기 319와 320 사이에 삽입된 HPV18의 E7 단백질의 아미노산 잔기 1 내지 31 및 그에 후속하여 HPV16의 E7 단백질의 아미노산 잔기 1 내지 29를 포함하고,
    상기 백일해균 CyaA는 아미노산 잔기 Asp 188과 Ile 189 사이에 디펩티드 LQ의 삽입에 의해 효소적으로 비활성된 것을 특징으로 하는, 이가 치료 백신.
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