JP5824474B2 - アデニル酸シクラーゼタンパク質またはその断片に挿入されたヒトパピローマウイルスエピトープを有する組換えタンパク質、およびその治療的使用 - Google Patents
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Description
哺乳動物、特にヒト患者から得られたT細胞を、本発明の組換えタンパク質にさらすこと、
T細胞の活性化の改変を検出すること
を含む。
ここで、CyaAは、先に開示されているアデニル酸シクラーゼまたはその断片であり、該方法は、
該キメラタンパク質を動物宿主に投与すること、
該宿主のT細胞応答、特にCTL応答を決定すること
を含む。
該組換えタンパク質を動物宿主(非ヒト)に投与すること、
該宿主のT細胞応答、特にCTL応答を決定すること
を含む。
実施例1
ここで、本発明者らは、HPV16のE7タンパク質の全長配列またはこのポリペプチドの亜断片(特に、H−2Db拘束性エピトープに対応するE7の残基49〜57およびHPV16−E7残基43〜98と1〜29を包含するペプチド)を含む、組換えCyaAを作成した。本発明者らは、C57BL/6マウスに注入した場合、これらのHPV16−E7組換えCyaAは、IFN−γの分泌により特徴づけられる特異的CTLおよびTh1応答を誘導できることを示した。さらに、治療的に試験した場合、これらの構造物は、TC−1細胞の皮下移植に対して100%以下の防御を提供できた。この研究は、初めて、インビボでの、ヒト腫瘍特異的抗原に対するCyaAにより媒介される抗腫瘍治療活性の実証を示した。
マウスおよび細胞系
特定の病原体を含まない6〜10週令の雌C57BL/6マウスを、CER Janvier(Le Gesnet St-Isle、フランス)またはチャールズリバー(L'Arbresle、フランス)から得た。C57BL/6バックグラウンドへと育成したTAP1−/−(18)、MHCクラスII−/−(19)およびCD40−/−(20)もこの研究に使用した。動物を、水と食料が自由にとれ、病原体の存在しない条件下で、パスツール研究所動物施設で飼った。動物の関与する実験は、動物の世話の施設ガイドラインにしたがって実施した。HPV16E6およびE7タンパク質を発現しているT細胞(21)およびマウス胸腺EL4細胞(17)を、ATCCから得た。細胞を、10%の熱不活性化FCS、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、0.4mg/mlのジェネティシン(TC−細胞に対してのみ)、および5×105Mの2−メルカプトエタノール(ギブコBRL、Cergy-Pointoise、フランス)を補充したグルタマックスを含むRPMI1640中に維持した。
HPV16−E7 H2−Db拘束性エピトープ(22)に対応する合成ペプチドE749〜57(RAHYNIVTF、一文字でアミノ酸をコード)並びにE749〜57CTLエピトープ(天然フランキング配列およびThエピトープ(太線)を含む)(23)に対応するE743〜77
を、Neosystem(ストラスブール、フランス)から購入した。CpG ODN1826は、PROLIGO(パリ、フランス)から購入した。
本文書で使用される組換えアデニル酸シクラーゼは、酵素的に不活性なCyaAをコードするプラスミドpTRACE5の誘導体(図1A)を使用することにより、E.coliにおいて発現させた(24)(25)。プラスミドpTRACE5は、酵素的に不活性で、それ故に細胞毒性であるB.pertussisCyaAの変種のための発現ベクターである。それはまた、CyaAの翻訳後のアシル化に必要とされるB.pertussisCyaCタンパク質も発現する。このプラスミドは、以前に記載されているpTRACGプラスミドの誘導体である(Gmiraら、2001、Res.Mic.152:889)。それは、cyaA DNA配列の5’部分内に位置するEcoRV部位へのヘキサヌクレオチドCTGCAGの挿入により得られた。これにより、触媒部位の不可欠な部位内のAsp188とIle189の間に、ジペプチドLeu−Glnが枠内に挿入された(Guermonprezら、2000、Meth.Enzymol.326:527)。
をアニーリングし、NheIおよびKpnIで消化したpTRACE5にライゲートした。CyaA−E7Fullは、HPV16−E7タンパク質の全配列、すなわち、酵素的に不活性なCyaAの同じ224位に挿入された98アミノ酸を含む。E7タンパク質をコードするDNA配列を、特異的プライマー
を使用して、HPV16 DNA(先のSeedorf Kら)から増幅した。得られたPCR産物をNheIおよびKpnIで消化し、NheIおよびKpnIで切り出したpTRACE5にライゲートした。アニーリングしたオリゴヌクレオチド並びにHPV16−E7の全配列に存在するSspI部位により、挿入変異体の迅速な同定が可能となった。CyaA−E7Δ30〜42は、CyaAのコドン319と320の間に挿入されたHPV16−E7の最初の29アミノ酸残基、並びに、CyaAのコドン224と235の間に挿入されたHPV16−E7の残基43〜98を含む。CyaA−E7Δ30〜42のための発現プラスミドは、2ステップで作成した。HPV16−E7(のアミノ酸残基1〜29)をコードする第一のDNA断片を、標的DNAとして合成HPV16−E7遺伝子(E.coliにおける産生に最適化され、GTP Technologyにより設計、Labege、フランス)およびプライマー
を使用してPCR増幅した。CyaAのコドン320〜372をコードする第二のDNA断片を、標的DNAとしてpTRACE5、および、プライマー
を使用してPCR増幅した。これらの2個のDNA断片(一部重複する)を精製し、3回目のPCRでプライマーBTP5およびBTP8と合わせ、294bp長のDNA断片を増幅した。この断片を、AgeIおよびBstBIにより消化し、pTRACE5の対応する部位の間に挿入して、プラスミドpTRACE5−E1〜29を得た。その後、HPV16−E7のアミノ酸残基43〜98をコードするDNA断片を、標的DNAとしての合成HPV16−E7遺伝子、および、プライマー
を使用してPCR増幅した。精製PCR断片をNheIおよびKpnIにより消化し、同じ制限酵素により消化したプラスミドpTRACE5−E71〜29にライゲートした。
リクエストにより入手可能なHPV16−E7タンパク質(GTP technology)のDNA配列をコードするE.coli最適化cDNAを、pIVEX2.4bベクター(ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ、Meylan、フランス)のNcoIとXhoI制限部位の間にサブクローニングした。その後、得られたプラスミドを、E.coli株BL21λDE3(ノバゲン)に形質転換した。0.5mMのイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(Euromedex、Souffelweyersheim、フランス)で誘導するとHis−Tag−HPV16−E7タンパク質が発現され、Ni−NTAアガロース(キアゲン、ヒルデン、ドイツ)を用いて製造業者の指示にしたがって精製した。LPS混入を除去するために、記載の通りに(27)イソプロパノールによる洗浄を使用した。
タンパク質をSDS−PAGEにより分離し、マウスモノクローナル抗HPV16E7抗体(Zymed、CA州サンフランシスコ)またはC57BL/6マウスにおいて調製したポリクローナル抗E.coli BLR血清でプローブした、ニトロセルロース膜(0.45μ、バイオラッド、Marnes la Coquette、フランス)にエレクトロトランスファーした。アルカリホスファターゼにコンジュゲートさせたヤギ抗マウス免疫グロブリン(Chemicon、Temecuka、CA)を用いて免疫複合体が検出され、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスフェート/ニトロブルーテトラゾリウム(BCIP/NBT)(シグマ、MO州セントルイス)を用いて明確にした。
動物を、PBS(ギブコBRL)に希釈した50μgの対照もしくはHPV16−E7組換えCyaAを1回静注するか、または、2回(各回10μg)皮内注射することにより免疫化した。皮内注射は、耳真皮に行なった(47)。インビトロでの解析のために、長期の応答の解析を除いて(このためにこの手順は、注射の3ヶ月後に行なった)、注射の7日後に、麻酔した動物(CO2)の脾摘除を行なった。腫瘍拒絶実験のために、マウスは、皮下に5×104個のTC−1細胞を投与され、腫瘍接種の1日後、5日後、または10日後にHPV16−E7組換えCyaAにより処置した。TC−1腫瘍増殖を、キャリパーを使用してモニタリングし、式V=(L×w2)/2(L:長さ、w:幅)を使用して立方ミリメートルで表現した(48)。
免疫化マウスの脾臓細胞を、インビトロで、同系の照射し無処置の脾臓細胞の存在下で、完全培地(10%の熱で不活性化されたFCS、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、および5×10−5Mの2−メルカプトエタノールを補充したグルタマックスを含むRPMI1640)中で、5日間、1μg/mlのE749〜57またはE743〜77ペプチドで刺激した。これらのエフェクター細胞の細胞毒性活性を、TC−1細胞の5時間の51Cr放出アッセイで試験した。放射標識を以下のように行なった:7.5%CO2雰囲気中37℃で培養した指数関数的に増殖しているTC−1細胞を、素早くトリプシン処理し(トリプシン−EDTA、ギブコBRL)、100μCiの51Crと共に37℃で1時間インキュベートした。様々なE:T比を使用し、全てのアッセイを二重に行なった。各ウェルの上清に放出された放射能を測定した。特異的溶解率は、100×(実験的放出−自発的放出)/(最大放出−自発的放出)として計算した。最大放出は、10%トリトンX−405を標的細胞に加えることにより得、自発的放出は、完全培地のみの中でインキュベートした標的細胞を用いて得られた。最も高いE:T比で少なくとも20%の特異的溶解が観察された場合にマウスをレスポンダーと判断した。結果は、1群あたりのレスポンダーマウスの中間値±四分位範囲として表現した。
マルチスクリーンろ過プレート(96ウェル;ミリポア、Molshein、フランス)を、1mlあたり4μgのラット抗マウスγインターフェロン(IFN−γ)抗体(クローンR4−6A2;ファーミンゲン、CA州サンディエゴ)を用いて室温で一晩かけて被覆した。その後、プレートを洗浄し、完全培地で遮断した。免疫化マウスの脾臓細胞の連続2倍希釈液を、5×105個のγ照射された(2,500rad)同系支持細胞と共に加えた。細胞を、1μg/mlのE749〜57ペプチドと共にまたはその非存在下で36時間インキュベートした。十分に洗浄した後、プレートを、1mlあたり5μgのビオチニル化ラット抗マウスIFN−γ抗体(クローンXMG1.2;ファーミンゲン)と共にインキュベートし、その後、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ(ファーミンゲン)と共にインキュベートすることにより明確にした。最後に、基質としてBCIP/NBTを使用してスポットを明確にした。IFN−γ産生細胞の数を、各ウェルにおけるスポット形成細胞(SFC)の数を計測することにより決定し(Bioreader、Karben、ドイツ)、結果を、脾臓1個あたりのSFCの全数として表現した(17)。
空のベクターCyaAE5により皮内免疫化したマウスから、30または90日後に採血し、個々のマウス血清を、ELISAにより抗体応答について試験した。マイクロプレート(Nunc、Roskilde、デンマーク)を、PBS中の空のベクターCyaAE5(3μg/ml)を用いて一晩かけて被覆した。PBS−tween20(0.1%)中で洗浄した後、希釈した血清を、ウェルに加え、37℃で1時間インキュベートした。PBS−tween20中で洗浄した後、プレートを、ヤギ抗マウスIgGペルオキシダーゼコンジュゲート(シグマ)と共に37℃で1時間インキュベートした。プレートを、o−フェニレンジアミンおよび過酸化水素(シグマ)を使用して展開した。硫酸を用いて反応を停止し、プレートを、ELISA読取機(Dynatech、Marnes la Coquette、フランス)を用いて492nmで解析した。結果は、希釈とA492をプロットした線形回帰分析により計算した抗体力価として表現した。力価は、1/100に希釈されたプール対照血清の吸光度の2倍をもたらす最も高い希釈度のlog10であると計算された。
免疫化マウスの脾臓細胞を、インビトロで、完全培地中で、10μg/mlのHisTag−HPV16−E7タンパク質または1μg/mlのE743〜77ペプチドを用いて72時間かけて刺激した。IFN−γおよびIL−5産生は、培養上清中で、前記のように(28)、サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により決定された。全てのアッセイは、対応する組換えネズミサイトカイン(ファーミンゲン)を用いて標準化した。
TC−1細胞は、特異的なFITC−コンジュゲートモノクローナル抗体(クローンKH95、ファーミンゲン、Le Pont de Claix、フランス)を使用するフローサイトメトリーによるMHCクラスI分子H−2Dbの発現レベルの解析についていずれかに記載されているように(29)処理した。
様々な試料の量が少ないことを考慮して、ソフトウェアStatXact4(Cytel社、MA州ケンブリッジ)を使用するノンパラメトリック統計試験(30)を適用した。生存曲線を、Prismソフトウェア(GraphPadソフトウェア社、CA)を使用してプロットし、ソフトウェアのビルトインのlogランク検定を用いて比較した。データは、p<0.05で有意差があると判断した。
HPV16−E7エピトープを有する組換えアデノウイルスシクラーゼの作成および特徴づけ
CyaAのHPV16−E7特異的T細胞応答誘導能を試験するために、本発明者らは、3個の異なる組換え分子を作成した。CyaA−E749〜57は、酵素的に不活性な(したがって無毒性な)CyaAのコドン224と235の間に挿入された、以前に記載されたH−2Db拘束性CTLエピトープ(22)に対応する、9アミノ酸長のポリペプチド配列(RAHYNIVTF)を含む。CyaA−E7FUllは、酵素的に不活性なCyaAの同じ224位に挿入されたHPV16−E7タンパク質の全配列(98アミノ酸)を含む。CyaA−E7Δ30〜42は、酵素的に不活性なCyaAのコドン319と320の間に挿入されたHPV16−E7の最初の29アミノ酸残基、並びに、コドン224と235の間に挿入されたHPV16−E7の残基43〜98を含む。インビトロおよびインビボでのアッセイを可能とするために、CyaA構造物が産生され、精製されてほぼ均一とした(図1B)。LPS排除手順を精製プロトコル(26)に導入し、50μgあたり100単位未満の内毒素を含む組換えタンパク質を得た。CyaA−E7FullおよびCyaA−E7Δ30〜42におけるE7タンパク質の存在は、特異的なモノクローナル抗体(Zymed)を使用してウェスタンブロットにより確認された(図1C)。これに対し、H−2Db拘束性エピトープのみを含むCyaA−E749〜57は、抗HPV16−E7抗体により認識されなかった。3個の組換えCyaAの全体的な生化学的特性は、改変されておらず、これらの分子は、野生型アデニル酸シクラーゼと類似した溶血特性を示した(17)。
CyaAが、HPV16−E7エピトープに対するCTL応答を誘導できるかを試験するために、C57BL/6マウスに、50μgの様々なHPV16−E7組換えCyaAを1回静注することにより免疫化した。脾臓細胞を収集し、インビトロで、1μg/mlのE743〜77ペプチドで刺激した。TC−1細胞を溶解する能力を、5日後に、51Cr放出アッセイを使用して決定した。図2Aに示されているように、C57BL/6マウスにHPV16−E7組換えCyaAを1回静注して免疫化することにより、TC−1細胞に対する強力で特異的なCTL応答が誘導された。完全なHPV16−E7タンパク質(図2A、b)を含むCyaAまたはその欠失形態であるCyaA−E7Δ30〜42(図2A、c)で免疫化することにより、最小のH−2Db拘束性エピトープ(図2A、a)のみを含むCyaA−E749〜57により誘導されるものと比べてより高い最大CTL活性が得られたが、本発明者らは、本発明者らのデータから統計学的有意性を実証できなかった。ペプチドE749〜57をインビトロでの再刺激に使用した場合にも、類似の結果が得られた(データは示さず)。関連性のないエピトープ(OVA257〜264)を有する組換えCyaAでワクチン接種し、インビトロで、1μg/mlのE743〜77ペプチドで再刺激したマウスの脾臓細胞には、弱く非特異的なTC−1細胞溶解しか認められなかった(図2A、a)。インビボで、CyaAにより、OVA CD8+細胞エピトープ(SIINFEKL)をMHCクラスI分子に送達することは、TAP1機能に依存していることが以前に示されている(15)。本発明者らは、これがCyaA−E7Δ30〜42を使用しても当てはまるかどうかを試験した。図2A、dに示されているように、静注によりワクチン接種されたTAP1−/−マウスに由来するインビトロで刺激された脾臓細胞は、TC−1細胞を溶解できなかった。本発明者らはまた、インビボでのHPV16E7含有組換えCyaAによる、CTL応答の刺激における、CD4+T細胞による支持の必要性を試験した。以前の観察と一致して(15)、本発明者らは、CyaA−E7Δ30〜42を使用したMHCクラスII−/−マウスの静注ワクチン接種により、TC−1細胞に対する高いレベルの特異的CTL応答が誘導されることを観察した(図2A、e)。これに対し、本発明者らは、このモデルにおいて、CD40−/−マウスにおけるTC−1細胞に対するCTL応答のレベルが低いことを観察したので(図2A、f)、CD40シグナル伝達への幾分の依存性を観察した。
Th1応答は、細胞内病原体および腫瘍発達に対する防御において重要な役割を果たす(32、33)。それ故、本発明者らは、HPV16−E7組換えCyaAにより誘導されるT細胞応答のタイプを特徴づけた。C57BL/6マウスに、50μgの3種の異なるHPV16−E7組換えCyaAを1回静注することにより免疫化し、インビトロで脾臓細胞を10μg/mlの精製His−TagHPV16−E7タンパク質で刺激した後に、サイトカインの合成を決定した。図3に示されているように、完全なHPV16−E7タンパク質またはその欠失形態を有するCyaAでの免疫化により、高いレベルのIFN−γの産生および検出可能なレベルのIL−5が存在しないことにより特徴づけられる、Th1に似たプロファイルが得られた。この応答は特異的であった。なぜなら、CyaA−E7FUllまたはCyaA−E7Δ30〜42で免疫化した後に得られたIFN−γレベルは、CyaAE5−CysOVAでニセ免疫化したマウスで得られたものよりも有意に高かったからである(p<0.05)。しかし、これは、CyaA−E749〜57で免疫化したマウスの脾臓細胞には当てはまらなかった。1μg/mlのE743〜77ペプチドを用いて再刺激した場合に、類似の結果が得られた(図3A、挿入図)。
強い免疫応答が得られたことを考慮して、その後、本発明者らは、インビボにおいて、HPV16−E6およびE7タンパク質H−2b腫瘍原性細胞系(TC−1細胞)(これはC57BL/6マウスの皮下に注射される)からなる前臨床モデルにおいて、HPV16−E7CyaAの治療活性を評価した。このモデルにおいては、腫瘍拒絶は、排他的に、E749〜57特異的CD8+T細胞により媒介されることが以前に示された(21、22、34、35)。したがって、5×104個のTC−1細胞を、C57BL/6マウスの右側腹に皮下注射し、50μgのCyaAE5−HPV16−E749〜57、−E7full、または−E7Δ30〜42を、1、5、または10日後にマウスに静注した。図4は、腫瘍移植の10日後に治療処置したマウスにおける腫瘍増殖を示す。特に、これらの条件において、100%の動物が、ワクチン接種を行なう時点までに、触診可能な腫瘍を発達させた。不必要な苦しみを避けるために、腫瘍サイズが1000mm3に到達した場合には動物を屠殺した。全ての非処置動物並びにニセCyaAE−cysOVAで処置したマウスは、最大49日間以内に、そのサイズ(>1000mm3)の腫瘍を発達させた。極めて対照的には、HPV16−E7組換えCyaAで処置した動物の大半が、実験期間中を通じて腫瘍がない状態を維持した(図4、C、D、E)。図5は、TC−1細胞を移植し、3つの異なる治療プロトコル(組換えCyaAを、TC−1移植の1、5、または10日後に注射した)を行なった、動物の生存プロットを示す。非処置またはニセ処置動物の生存時間の中間値は、31〜40日間であった。これに対し、HPV16−E7抗原を有するCyaAでワクチン接種したマウスの生存は、対照動物よりも有意に優れていた(p<0.05)。様々な構造物の防御活性の差異は確立できたが、統計学的有意性は確立できなかった。なぜなら、様々な試料のサイズが小さいからであった。CyaA−E749〜57および−E7Fullにより付与される腫瘍減退率が、認められる程には区別できなくても、CyaA−E7Δ30〜42は、腫瘍減退および増殖阻害の点において明らかに優れていた。なぜなら、3つ全ての治療スキームにおいて、防御率は、常に、90%よりも高かったからである。
HPV16−E7組換えCyaAにより誘導される免疫応答の持続性を評価するために、3ヵ月後も治療実験にも関わらず生存しているマウスを屠殺し、その脾臓細胞を、インビトロで、1μg/mlのE743〜77ペプチドで5日間かけて刺激した。その後、TC−1細胞を溶解する能力を、51Cr放出アッセイにより決定した。図7に示されているように、HPV16−E743〜77ペプチドに対する特異的CTL応答が、依然として、3ヵ月前に免疫化した動物の脾臓細胞から実証された。30:1のエフェクター:標的の比での特異的溶解の最大パーセンテージに基づいて、免疫応答は、CyaA−E7Δ30〜42で処置した動物においてより強力であるようであるが、これらのデータから統計学的有意性は実証できなかった。このような長く続く免疫原性の生理的関連性を評価するために、残りの動物に、100日目に5×104個のTC−1細胞を用いて皮下に再攻撃した。このような条件下で、全ての未処置の年齢一致対照動物が腫瘍を発達させ、37.5日間という生存時間の中間値を示した(図8)。これに対し、HPV16−E7組換えCyaAで3ヶ月前に免疫化したマウスは、腫瘍発達から非常に有意に防御された。先に観察されているように、CyaAE−HPV16−E7Δ30〜42でワクチン接種した動物が、高いレベルの防御を示した。しかし、今回、最初のセットの治療実験で得られた結果の変動では、CyaA−E749〜57で処置した動物と、CyaA−E7FUllで処置した動物の間には顕著な防御の差異があり、後者の方が好ましいが、試料のサイズが少ないので、統計的有意性を明確に実証することはできなかった。これらの観察により、このモデルでは、完全なHPV16−E7タンパク質を有するCyaAにより提供されるT細胞の支持は、TC−1細胞に対する効果的で長期に持続する応答には重要であることが示唆された。
抗原送達システムとしてのCyaAの効力をより良く評価するために、本発明者らは、CyaA−E7Δ30〜42の治療効力を、CpG−ODN1826を補充したHPV16−E743〜77ペプチドの治療効力と比較した(37)。それ故、マウスに、5×104個のTC−1細胞を皮下注射し、10および17日後、皮内経路により、10μgのCyaA−E7Δ30〜42で、または、1μgのCpG−ODN1826と共に投与される10μgのHPV16−E743〜77ペプチドで、治療処置した。生存率は、これらの2つの群において類似していたが(図9)、CyaA−E7Δ30〜42で得られた結果は、CpG−ODN1826と混合されたHPV16−E743〜77ペプチドで得られた結果よりも僅かに良好であったが、統計学的に差異はなかった。特に、この結果は、モル基準で、CyaA−E7Δ30〜42に比べて50倍多いHPV16−E743〜77ペプチドを使用して得られた。単独で使用した場合、ペプチドHPV16−E743〜77は、TC−1腫瘍増殖に対して全く効果がなかった。
臨床の場面では、効果的な細胞性免疫応答を得るために、病変を有する患者に、複数回のブースター投与をおそらく行なわなければならない。それ故、CyaAベクターに対する予備免疫が、腫瘍拒絶を引き起こす能力を損なわないことを実証することが不可欠であった。そうするためには、本発明者らは、5×104個のTC−1細胞を皮下注射する90または30日前に、7日間間隔で2回10μgの空ベクターCyaAE5でマウスを皮内免疫化した。7日間間隔の2回の10μgのCyaA−E7Δ30〜42の注射による治療処置を10日目に設定した。抗体応答の解析により、空ベクターで免疫化されたマウスは、TC−1注射時にCyaAに対して免疫があることが示された(図10A)。その後、本発明者らは、年齢の一致した未処置動物およびCyaA免疫動物において腫瘍拒絶を誘導する、CyaA−E7Δ30〜42処置の能力を比較した。CyaAに対するその免疫状態はどうであれ、CyaA−E7Δ30〜42で処置したマウスの大半が、実験を通じて腫瘍がないままであった(図10B)。30日目の免疫マウス群の中で1匹のみ、90日目の免疫マウス群において2匹のみが、腫瘍を発達させた(図10Bb、d、f)。これに対し、ニセ感染動物の100%が腫瘍を発達させ、屠殺された(図10B、a、c、e)。本発明者らは、抗CyaA抗体力価レベルと、TC−1腫瘍の発達の間の相関は全く観察しなかった(データは示さず)。さらに、CyaA−E8Δ30〜42処置マウスの生存曲線(図10B、b、d、f)は、統計学的に差異はなかった(p=0.324)。
以前の研究により、Bordetella pertussisのアデニル酸シクラーゼは、インビボにおいて、CD4+およびCD8+T細胞エピトープを、樹状細胞のMHC−クラスIIおよびI提示経路に送達するための強力なツールであることが実証された。実験ネズミモデルにおいて、このシステムは、抗ウイルスおよび抗腫瘍防御をもたらす効果的なTh1およびCTL応答を引き起こすために使用されている(36)。HPV16関連の子宮頚部悪性疾患の処置のためのヒトにおけるCyaAの可能性ある適用の評価として、本発明者らは、このベクターが、インビボにおいて、HPV16のE7タンパク質のエピトープを効果的に送達することを実証し続けた。
目的は、ヒトにおけるHPV16およびHPV18関連の悪性疾患を処置するための、HPV16およびHPV18 E7タンパク質の両方に標的化した二価治療ワクチンを製造することであった。それ故、CyaAE5−HPV16E7Δ30〜42およびCyaAE5−HPV18E7Δ32〜42と呼ばれるワクチン候補を、設計し、作成し、産生し、精製した。HHDマウスは、H−2Dbのα3膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン(D)に連結したHLA*0201のα1(H)およびα2(H)ドメインを含むHHD導入遺伝子を発現しているH−2D−/−β2m−/−ダブルノックアウトマウスであった(α1ドメインは、ヒトβ2−ミクログロブリンに連結している)。したがって、HHDマウスにより発現されるMHCクラスI分子のみが、改変されたHLA*0201分子であった(Pascolo et Lemonnier)。
1 組換えCyaAが、HPV16およびHPV18E7タンパク質のHLA−A2拘束性エピトープを送達できること、
2 1個のHPV組換えcyaAが他を上回る免疫優性の現象はないこと
を実証することであった。
特定の病原体を含まないHHDマウスを、パスツール研究所で育成した。11匹の6〜10週令の雄を、この実験に使用した。
試薬および緩衝液
RPMI1640培地−グルタマックス(インビトロジェン・ギブコ、参照番号:6187010)
エタノール70゜(Prolabo、参照番号:MC311631)
ペニシリン−ストレプトマイシン(インビトロジェン・ギブコ、参照番号:15140122)
ウシ血清アルブミン(FBS)(PERBIO、参照番号:CH30160.03)
βメルカプトエタノール(バイオラッド、参照番号:161−0710)
熱分解水
ブルートリパン(シグマ、T−8154)
51Cr
Triluxシンチラント(Wallac)
5個の合成ペプチド(Neosystem、ストラスブール、フランス)を、51Cr放出アッセイの前の脾臓細胞のインビトロでの刺激に使用した:
HPV16−E7 HLA−A2拘束性エピトープ(1)に対応する、E711〜20(YMLDLQPETT、一文字でアミノ酸をコード、#253)、
HPV16−E7 HLA−A2拘束性エピトープ(1)に対応する、E782〜90(LLMGTLGIV、#258)、
HPV16−E7 HLA−A2拘束性エピトープ(1)に対応する、E786〜93(TLGIVCPI、#255)
SYFPEITHIソフトウェアにより予測されるHPV18−E7 HLA−A2拘束性エピトープに対応する、E77〜15(TLQDIVLHL、#251)、
HPV18−E7 HLA−A2拘束性エピトープ(2)に対応する、E786〜94(FQQLFLNTL、#257)。
2個のCyaAをこの実験において試験した:
CyaA−HPV16E7Δ30〜42
CyaA−HPV18E7Δ32〜42。
EL4−HHD細胞を、51CrCTLアッセイにおいて標的として使用した。これらの細胞を、完全培地中に維持した:10%熱不活性化FCS、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、および5×10−5Mのβ2−メルカプトエタノール(ギブコBRL、Cergy-Pontoise、フランス)を補充したグルタマックスを含むRPMI1640。
マウス免疫化
覚醒動物に、0.3mlのインスリンシリンジ(テルモ)を用いて、(200μl中50μgの)CyaAE5−HPV16E7Δ30〜42および/またはCyaAE5−HPV18E7Δ32〜42の1回の静脈内(眼窩後の)注射により免疫化した。
表1は、各群のマウスに投与するワクチン候補および処置を記載した。
免疫化により誘導される細胞性免疫応答をインビトロで評価するために、麻酔した動物(CO2)を、免疫化の7日後に脾摘除した。CTLアッセイの前に、各群の脾臓細胞をプールした。
−脾臓をサンプリングし、RPMI1640−グルタマックス1%Ab中でそれらを破粉した。
−デカント。
−1200rpmで10分間遠心分離。
−細胞を、2mlのRMPI1640−グルタマックス1%Ab−10%FCS−5.10−5M β−メルカプトエタノール(完全培地:CM)に再懸濁。
−各々のT25フラスコに、
10mlのCM
5×107個のエフェクター細胞
10μg/mlの最終濃度の関連ペプチド
を入れた。
フラスコを動かすことなく5日間インキュベート。
1)標的細胞:
−前日、標的細胞を3分の1または2分の1に希釈して、指数関数的な増殖期のそれらを収集。
−15mlのチューブに移す。
−1200rpmで10分間遠心分離。
−1mlのRPMI1640−1%Ab中に再懸濁。
−数を数えた。
−2個のチューブを準備:1個はペプチドを含み、1個はペプチドを含まない。
−150μl中に以下を再懸濁:
2個の中の1個のチューブにペプチド(50μモル)
3×106個の細胞につき100μCiの51Cr(50μl)。
150μlとするための培地。
−37℃の水浴中で1時間インキュベートし、15分毎に穏やかに振とう。
−約5mlの上清をパスツールピペットを用いて廃棄。
−ピペッティングにより細胞を完全に再懸濁。
−1200rpmで10分間遠心分離。
−1mlのCMに再懸濁。数を数えた。
−107個の細胞/mlに調整。
−次のエフェクター/標的比:200/1、100/1、50/1、25/1、12/1、6/1が得られるように希釈。
−100μl/U底マイクロタイタープレートのウェルで分配。
−標的細胞の調製を完成する間、37℃で7.5%CO2中でインキュベート。
−標的細胞を、10mlのRPMI1640−1%Abで洗浄。
−再度10mlのCMで洗浄。
−2mlのCMに再懸濁。
−数を数えた。
−105個の細胞/mlに調整。
−100μl/ウェルで分配。
−自発的放出のための6個のウェルを準備(CM中100μlに調整)。
−最大放出のための6個のウェルを準備(100μlの20%トリトンX−405を添加)
−37℃で7.5%CO2中で4〜5時間インキュベート。
−2000rpmで5〜10分間遠心分離。
−100μlのTriluxシンチラントを、フロッピーP96マイクロタイタープレートに入れた。
−50μlの上清をサンプリングし、それをフロッピープレートに移した。
−プレートを、プラスチックフィルムテープで封をした。
−wallacカウンターで次の日に計測した。
CyaA−HPV16E7Δ30〜42により誘導されるCTL応答を図11に示した。
CyaA−HPV18E7Δ32〜42により誘導されるCTL応答を図12に示した。
CyaA−HPV16E7Δ30〜42およびCyaA−HPV18E7Δ32〜42の両方が、このキメラHHDモデルにおいて、それぞれのHLA−A2拘束性ペプチドに対して特異的なCTLを誘導できた。
HPV18のE7タンパク質並びにHPV16およびHPV18のE7タンパク質を含む組換えアデニル酸シクラーゼの作成および免疫学的評価
肛門生殖管の癌は、女性における全ての癌の12%近くを占め、子宮頚部癌(CxCa)は世界中で二番目に最も頻繁に起こる婦人科の癌となっている。ヒトパピローマウイルス(HPV)感染がCxCaの原因である可能性があるという重要な観察は、その後、疫学的な研究により確認された。CxCaに関連する最も広まっているHPVのタイプは、HPV16およびHPV18である(それぞれ55%および12%の罹患率)(Clifford、2003)。より多くの人口を網羅するために、HPV16およびHPV18のE7を有する二価治療ワクチンを作成することが決定された。2つの可能性ある戦略が試験された:(i)第一の戦略は、一方はHPV16のE7を有する他方はHPV18のE7を有する、等モル量の2個の組換えCyaAを混合する;(ii)第二の戦略は、HPV16およびHPV18の両方のE7タンパク質を有する組換えCyaAを作成する。本リポートは、HPV18のE7または両方のウイルスのE7を有する組換えCyaAの作成を記載した。構造物の免疫原性は、CTLアッセイにおいて試験した。
HPV18E7のアミノ酸配列を、H−2bエピトープの探索中に、SYFPEITHI(www.syfpeithi.de)にかけた。このソフトウェアは、アルゴリズムを使用して、画定されたMHC分子に結合する可能性があるエピトープを予測する。ソフトウェアは、25のスコアで、H−2Db分子により拘束される推定エピトープを選出した。通常、本発明者らは、そのスコアが22を超えた場合にエピトープであると判断した。それ故、推定ペプチドのIDGVNHQHLが、Neosystemにより合成された。
CyaA−HPV18E7、CyaA−HPV18E7Δ32〜42、CyaA−HPV16+18E7、CyaA−HPV16+18ΔE7を産生するためにプラスミドの作成に使用された戦略を示したスキームを、図13および14に示した。
この実験の目標は、インビボにおいて、完全なHPV18E7タンパク質またはその断片並びにHPV16およびHPV18E7タンパク質の両方を有する、組換えCyaAによるCTLの誘導を実証することであった。標的化されたH−2Dbエピトープは、コンピューター予測ソフトウェアから得られたHPV18E741〜49(IDGVNHQHL)およびHPV16E749〜57であった。C57BL/6マウスに、50μgのCyaA−CysOVA、CyaA−HPV18E7、CyaA−HPV18E7Δ32〜42、CyaA−HPV16+18E7、またはCyaA−HPV16+18ΔE7(各群において2匹)を静注によりワクチン接種した。7日後、プールした脾臓細胞を、インビトロで、ペプチドHPV18E741〜49(10μg/ml)、OVA257〜264(1μg/ml)またはHPV16E743〜77(1μg/ml)で再刺激した。CTL活性は、51Cr放出を使用して5日後にアッセイした。標的細胞は、HPV18E741〜49ペプチド(8nmol)をのせたまたはのせていないEL4細胞、あるいは、TC−1細胞であった。図中の説明文は:ワクチン接種/再刺激を示す。例:OVA/OVAは、CyaAE5−CysOVAでワクチン接種し、OVAペプチドで再刺激したマウスを意味する。
−CyaA−HPV18E7Δ32〜42は、インビボにおいて、処理およびMHCクラスI経路への提示のために、コンピューターで予測したHPV18−E7タンパク質のCD8+H−2Db拘束性T細胞エピトープを、免疫担当細胞のサイトゾルへと送達でき、これにより強力なCTL応答を誘起できる。これは、HPV18E7タンパク質のエピトープが、H−2Dbの関連で記載された最初のケースであった。
−大きなポリペプチド断片(203までのアミノ酸)を有する組換えCyaAは、依然として免疫原性であった。
HPV16およびHPV18のE7を有する二価治療ワクチンを作成することが決定された。2つの可能性ある戦略が考えられた:(i)第一の戦略は、一方はHPV16のE7を有する他方はHPV18のE7を有する、等モル量の2個の組換えCyaAを混合する;(ii)第二の戦略は、HPV16およびHPV18の両方のE7タンパク質を有する組換えCyaAを作成する。本結果は、HPV18のE7または両方のウイルスのE7を有する組換えCyaAの作成を記載した。構造物の免疫原性は、CTLアッセイにおいて試験した。
Claims (53)
- 発癌性HPV株に由来するE6タンパク質からの1個または数個のエピトープを有する1個または数個のポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、前記ポリペプチドは、ボルデテラ(Bordetella)種アデニル酸シクラーゼ(CyaA)タンパク質またはその断片の同じまたは異なる許容部位に挿入されており、前記CyaA断片は、抗原提示細胞を標的化するという前記アデニル酸シクラーゼタンパク質の特性を保持している、前記組換えタンパク質。
- CyaAタンパク質断片は、CD11b/CD18抗原提示細胞を標的化するという前記アデニル酸シクラーゼタンパク質の特性を保持している、請求項1に記載の組換えタンパク質。
- CyaAタンパク質断片は、標的化細胞のサイトゾルへの前記ポリペプチドのエピトープの転位または前記ポリペプチドの転位を可能とするというCyaAの特性を保持している、請求項1または2に記載の組換えタンパク質。
- 標的抗原提示細胞への前記アデニル酸シクラーゼタンパク質の特性を保持している前記CyaAタンパク質断片が、アミノ酸残基225〜234が欠失しているボルデテラ ペルツシス(Bordetella pertussis)のCyaAタンパク質に相当する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組換えタンパク質。
- CyaAタンパク質断片の同じまたは異なる許容部位に挿入されている1個または数個のHPV抗原の1個または数個のエピトープを有する1又は数個のポリペプチドを含む請求項1〜4のいずれかに記載の組換えタンパク質であって、前記断片は、30〜1300アミノ酸残基を含み、前記断片は、ボルデテラ ペルツシス(Bordetella pertussis)のCyaAタンパク質のアミノ酸残基1208〜1243またはボルデテラ ペルツシス(Bordetella pertussis)のCyaAタンパク質のアミノ酸残基1166〜1281を包含する、前記組換えタンパク質。
- 前記ポリペプチドおよび/または数個のポリペプチドが一緒になって、10〜50アミノ酸残基を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組換えタンパク質。
- 前記ポリペプチドおよび/または数個のポリペプチドが一緒になって、30もしくは50〜200アミノ酸残基を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組換えタンパク質。
- 前記ポリペプチドおよび/または数個のポリペプチドが一緒になって、100〜200又は100〜210アミノ酸残基を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組換えタンパク質。
- 前記ポリペプチドに対する抗原特異的応答を誘起することのできる、請求項6〜8のいずれか1項に記載の組換えタンパク質。
- 1個または数個のエピトープを有する少なくとも1個のポリペプチドが、高発癌性HPVに由来している、請求項1〜9のいずれか1項に記載の組換えタンパク質。
- 1個または数個のエピトープを有するポリペプチドが、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52、またはHPV58に由来している、請求項1〜10のいずれか1項に記載の組換えタンパク質。
- 1個または数個のエピトープを有するポリペプチドが、HPV16および/またはHPV18のE6タンパク質から選択されるHPV抗原に由来している、請求項1〜11のいずれか1項に記載の組換えタンパク質。
- 1個または数個のHPV抗原の1個または数個のエピトープを有する複数のポリペプチドを含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の組換えタンパク質。
- 1個または数個のエピトープを有するポリペプチドが、HPV16のE6タンパク質に由来している、請求項12〜13のいずれか1項に記載の組換えタンパク質。
- 1個または数個のエピトープを有するポリペプチドが、HPV18のE6タンパク質に由来している、請求項12〜13のいずれか1項に記載の組換えタンパク質。
- 前記ポリペプチドが、全長E6タンパク質である、請求項12〜14のいずれか1項に記載の組換えタンパク質。
- CyaA配列またはその断片の異なる許容部位に挿入されている複数のポリペプチドを含む、請求項14〜16のいずれか1項記載の組換えタンパク質。
- 前記ポリペプチドまたはポリペプチド群が、分断された天然HPV抗原に存在し、前記分断は、前記HPV抗原の酸性領域における1個または数個のアミノ酸残基の欠失、および/または、アデニル酸シクラーゼの少なくとも2箇所の許容部位への前記HPV抗原の少なくとも2個のポリペプチド断片の挿入からなる、請求項1〜17のいずれか1項に記載の組換えタンパク質。
- 前記分断された天然HPV抗原が、アデニル酸シクラーゼの少なくとも2箇所の許容部位への、天然HPV抗原の少なくとも2個の断片の挿入によって得られ、これらの少なくとも2個の断片は、天然抗原におけるその天然の位置と比べて逆であり、すなわち、天然抗原においてよりN末端側である断片は、CyaAタンパク質またはその断片に挿入されると、よりC末端側となり、その逆も同様である、請求項18に記載の組換えタンパク質。
- 1個または数個のHPV抗原の1個または数個のエピトープを有する少なくとも1個のポリペプチドが、得られる組換えタンパク質の免疫原性を高めるために抗原の天然又は非天然のフランキング配列の付加によってそのネイティブなアミノ酸配列に対して改変されている、請求項1〜15または17〜19のいずれか1項に記載の組換えタンパク質。
- CyaAタンパク質が、Bordetella pertussisに由来する、請求項1〜20のいずれか1項に記載の組換えタンパク質。
- CyaAタンパク質の酵素活性が不活性化されている、請求項1〜21のいずれか1項に記載の組換えタンパク質。
- CyaAタンパク質の酵素活性が遺伝子的に不活性化されている、請求項1〜22のいずれか1項に記載の組換えタンパク質。
- CyaAタンパク質の酵素活性が、シクラーゼ活性に関与するCyaAのアミノ酸配列部位にジペプチドが挿入されている結果、不活性化されている、請求項1〜23のいずれか1項に記載の組換えタンパク質。
- CyaAタンパク質またはその断片の同じまたは異なる許容部位に挿入されている、様々なHPV抗原の1個または数個のエピトープを有する数個のポリペプチドを含む、請求項1〜24のいずれか1項に記載の組換えタンパク質。
- 前記ポリペプチドが、それぞれHPV16およびHPV18に由来する全長E6ポリペプチドであり、前記ポリペプチドは、CyaAタンパク質の異なる許容部位に挿入されている、請求項25に記載の組換えタンパク質。
- 1個または数個の抗原の1個または数個のエピトープを有する1個または数個のポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、前記ポリペプチドは、アデニル酸シクラーゼ(CyaA)タンパク質またはその断片の同じまたは異なる許容部位に挿入されており、前記CyaA断片は、抗原提示細胞を標的化するという前記アデニル酸シクラーゼタンパク質の特性を保持しており、前記エピトープの少なくとも1個は、HPVのE6タンパク質のサブドミナント潜在性T細胞エピトープであり、前記組換えタンパク質は、前記ポリペプチドに対する抗原特異的応答を誘起できる、請求項1〜26のいずれか1項に記載の組換えタンパク質。
- 組成物が、哺乳動物宿主に投与されることを特徴とする、哺乳動物宿主において細胞性免疫応答を誘起するための、請求項1〜27のいずれか1項に記載の組換えタンパク質。
- 組成物が、哺乳動物宿主に投与されることを特徴とする、哺乳動物宿主において体液性免疫応答を誘起するための、請求項1〜27のいずれか1項に記載の組換えタンパク質。
- 請求項1〜27のいずれか1項に記載の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項30に記載のポリヌクレオチドを含む、組換え発現ベクター。
- 細菌で発現させるのに適した、請求項31に記載の組換え発現ベクター。
- 真核細胞での発現に適した、請求項31に記載の組換え発現ベクター。
- 哺乳動物細胞での発現に適した、請求項33に記載の組換え発現ベクター。
- 請求項30に記載のポリヌクレオチドまたは請求項31〜34のいずれか1項に記載の組換え発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
- 生理的に許容されるビヒクル、賦形剤、担体、および/または希釈剤と共に、請求項1〜27のいずれか1項に記載の組換えタンパク質を含む、免疫原性組成物。
- アジュバントおよび/または界面活性剤および/または免疫調節物質をさらに含む、請求項36に記載の免疫原性組成物。
- 組成物が、哺乳動物宿主に投与されることを特徴とする、哺乳動物宿主において細胞性免疫応答を誘導するための、請求項36又は37に記載の免疫原性組成物。
- 細胞媒介免疫応答が、細胞媒介細胞溶解免疫応答を誘導する、請求項38に記載の免疫原性組成物。
- さらに体液性免疫応答を誘導する、請求項38に記載の免疫原性組成物。
- 組成物が、哺乳動物宿主に投与されることを特徴とする、HPV感染を予防または処置するための、請求項36又は37に記載の免疫原性組成物。
- 組成物が、哺乳動物宿主に投与されることを特徴とする、癌免疫療法のための請求項36又は37に記載の免疫原性組成物。
- 組成物が、哺乳動物宿主に投与されることを特徴とする、宿主におけるHPV感染に起因する悪性形質転換の発症または存続の予防または処置のための、請求項36又は37に記載の免疫原性組成物。
- 組換えタンパク質を患者に投与することを特徴とする、患者におけるHPV感染の処置または予防のための、請求項1〜27のいずれか1項に記載の組換えタンパク質。
- 組換えタンパク質を患者に投与することを特徴とする、患者におけるHPV感染に起因する悪性形質転換の発症または存続に対する免疫療法のための請求項1〜27のいずれか1項に記載の組換えタンパク質。
- ワクチン組成物を宿主に投与することを特徴とする、宿主において細胞性および/または体液性免疫応答を誘起するのに適した、請求項1〜27のいずれか1項に記載の組換えタンパク質を含む、ワクチン組成物。
- 薬物組成物を宿主に投与することを特徴とする、宿主におけるHPV感染を予防または処置するための、請求項1〜27のいずれか1項に記載の組換えタンパク質を含む、薬物組成物。
- 薬物組成物を宿主に投与することを特徴とする、宿主におけるHPV感染に起因する悪性形質転換の発症または存続の予防または処置のための、請求項1〜27のいずれか1項に記載の組換えタンパク質を含む、薬物組成物。
- 薬物組成物を宿主に投与することを特徴とする、癌免疫療法のための、請求項1〜27のいずれか1項に記載の組換えタンパク質を含む、薬物組成物。
- 請求項1〜27のいずれかに記載の組換えタンパク質または請求項30に記載のポリヌクレオチドまたは請求項31〜32のいずれかに記載のベクターを含む、HPV感染の診断キット、またはHPV感染を免疫モニタリングするためのキット。
- 哺乳動物から得られたT細胞を前記組換えタンパク質に暴露させ、T細胞の活性化における改変を検出することを特徴とする、インビトロでHPV感染を診断するためのか又はHPV感染を免疫モニタリングするための、請求項1〜27のいずれか1項に記載の組換えタンパク質。
- 前記T細胞が、ヒト患者から得られた、請求項51に記載の組換えタンパク質。
- キメラCyaA−ポリペプチドタンパク質に含まれるポリペプチド中の未知または亜優性潜在性T細胞エピトープのスクリーニング方法であって、
ここで、CyaAは、請求項1〜7及び21〜24のいずれかに開示されているアデニル酸シクラーゼまたはその断片であり、ポリペプチドは、HPV16及び/又はHPV18 E6タンパク質であり、この方法は、
−前記キメラタンパク質をヒトを除く動物宿主に投与すること、
−前記宿主のT細胞応答を決定すること
を含む、前記スクリーニング方法。
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