KR101642779B1 - 다중 이황화 결합 펩티드의 재조합 발현 시스템 개발 - Google Patents
다중 이황화 결합 펩티드의 재조합 발현 시스템 개발 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 짧은 막관통 단백질의 C-말단에 복수의 분자내 이황화결합을 갖는 단백질이 연결된 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된, 재조합 발현벡터를 제공한다.
Description
본 발명은 다중 이황화 결합 펩티드의 재조합 발현 시스템 개발에 관한 것으로서, 더 상세하게는 짧은 막관통 단백질을 이용한 다중 이황화 결합 항균 펩티드의 재조합 발현 시스템 개발에 관한 것이다.
대장균(E. coli)은 빠른 증식과 저비용으로 인해 재조합 단백질을 생산하는데 자주 사용된다(Burrowes et al., J. Biomed. Biotechnol.,(4):374-384. 2005). 그러나 재조합 방법은 정확한 형태의 자연 단백질(native proteins)을 제공한다는 관점에서 문제가 발생하는데 예를 들어, 활성을 결정하는 이황화 결합(disulfide bons)을 포함하는 특정 항균 펩티드 중에는 그 자체 크기가 작고 높은 양이온 함량(high cationic content)으로 인해 단백질 분해능력 저하되고 결국 대장균에서 직접 발현하는데 장애를 초래하는 경우가 있다.(Sorensen et al., J. Biotechnol., 115 (2):113-128. 2005). 상기 문제를 해결하기 위해 융합 발현(fusion expression)을 가능하게 하는 캐리어 단백질을 사용하는데 일반적으로 thioredoxin(Trx), GST 및 유비퀴틴화(small ubiquitin-related modifier, SUMO)를 포함한 캐리어 단백질들이 알려져 있고 그 중 일부는 상업적 용도로 이미 개발되어 사용되고 있다. 그러나 캐리어 단백질에 의한 세포질 발현이 높음에도 일부는 봉입체(inclusion bodies)가 형성되고 정확한 이황화 결합을 형성한 단백질(펩티드)을 생합성 하는데 어려움이 있다(Malik et al., Protein Expr. Purif., 47 (2):662-671, 2006).
대한민국 공개특허 제2008-0030551은 융합 단백질의 자가단백질 분해성 절단에 의한 재조합 단백질 생산방법을 개시하고 있다.
그러나 상기 선행기술의 경우, 자가단백질분해 활성으로 융합 단백질을 절단하는 방식은 단백질 생산 수율, 분리 및 정제하는데 한계가 존재한다.
상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 미생물 내에 존재하는 원형질막을 관통하는 것으로 알려진 막 단백질 중 짧은 막관통 단백질을 활용하여 단백질 생산 수율과 올바른 단백질 폴딩(folding)을 증가시키는 최적의 생합성 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 짧은 막관통 단백질의 C-말단에 복수의 분자내 이황화결합을 갖는 단백질이 연결된 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된, 재조합 발현벡터가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 재조합 발현벡터를 포함하는, 재조합 미생물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 재조합 미생물을 배양하는 재조합 미생물 배양단계; 및 상기 배양된 재조합 미생물로부터 상기 융합단백질을 분리ㅇ정제하는 융합단백질 회수단계를 포함하는, 복수의 분자내 이황화결합을 갖는 단백질의 생산방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 짧은 막관통 단백질 YoaJ 및 YkgR을 융합시켜 원형질막에서 효율적인 재조합 베타-디펜신의 생산을 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 단백질의 대장균(E. coli) 내 위치(A)와 발현 벡터의 구조(B)를 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 TEV 분할 부위와 결합한 YoaJ-ASPA의 주변 세포질 발현(A)과 정제(B)를 나타낸 겔 전기영동 겔 사진이고 ESI-질량 스펙트럼(C)을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 Factor Xα 분할 부위를 포함하는 YoaJ-ASPA의 주변 세포질 발현(A)을 나타낸 겔 사진이고 정제(B)를 나타낸 그래프이며 순수한 ASPA의 RP-HPLC 크로마토그래피 결과를 나타낸 그래프(C)이고 정제된 ASPA의 질량 스펙트럼(D)을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 YoaJ-BD 및 순수한 BD의 주변 세포질 발현(A)과 정제(B)를 나타낸 겔 사진이고 정제된 YoaJ-BD의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼(C)을 나타낸 그래프이며 YoaJ-BD의 RP-HPLC 크로마토그래피 결과를 나타낸 그래프(D)이고 MALDI-TOF MS 분석에 의한 BD 단백질의 예상 분자량(E)을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 ASPA-YoaJ 융합 단백질의 주변 세포질 발현(A)과 정제(B)를 나타낸 겔 전기영동 겔 사진이고 MALDI-TOF 질량 스펙트럼(C)을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 TEV 분할 부위와 결합한 YoaJ-ASPA의 주변 세포질 발현(A)과 정제(B)를 나타낸 겔 전기영동 겔 사진이고 ESI-질량 스펙트럼(C)을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 Factor Xα 분할 부위를 포함하는 YoaJ-ASPA의 주변 세포질 발현(A)을 나타낸 겔 사진이고 정제(B)를 나타낸 그래프이며 순수한 ASPA의 RP-HPLC 크로마토그래피 결과를 나타낸 그래프(C)이고 정제된 ASPA의 질량 스펙트럼(D)을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 YoaJ-BD 및 순수한 BD의 주변 세포질 발현(A)과 정제(B)를 나타낸 겔 사진이고 정제된 YoaJ-BD의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼(C)을 나타낸 그래프이며 YoaJ-BD의 RP-HPLC 크로마토그래피 결과를 나타낸 그래프(D)이고 MALDI-TOF MS 분석에 의한 BD 단백질의 예상 분자량(E)을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 ASPA-YoaJ 융합 단백질의 주변 세포질 발현(A)과 정제(B)를 나타낸 겔 전기영동 겔 사진이고 MALDI-TOF 질량 스펙트럼(C)을 나타낸 그래프이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "이황화 결합(disulfide bonds)"은 두 개의 유황 원소(-S-S-) 사이의 단일 공유결합으로 생화학에서는 두 단백질사이의 시스틴잔기 사이나 혹은 한 단백질 내의 두 시스틴잔기 사이에 형성되는 유황원소 결합을 지칭하며, 단백질의 제2차, 제3차 구조를 결정하는 데 중요한 역할을 한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "짧은 막관통 단백질(short transmembrane protein)"은 미생물의 세포막이나 세포소기관의 지질막을 관통해서 존재하는 막 단백질로 유전체의 상당부분을 차지하고 있다. 지질막을 관통하는 부분은 대부분 알파 나선의 구조를 가지며 베타 면의 구조를 갖는 것도 일부 존재한다. 막관통 단백질은 계면활성제, 비극성 용매등을 사용하여야 막으로부터 분리해 낼 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "YoaJ"은 대장균 유래의 짧은 막관통 단백질(transmembrane protein)로서(UniProtKB No. C1P603), 스트레스에 대한 반응과 관련되었다는 것을 제외하고는 그 기능이 명확하게 밝혀지지 않은 단백질이다(Hemm, M.R. et al., J. Bacteriol. 192:46-58, 2010).
본 문서에서 사용되는 용어 "YkgR"은 YoaJ와 같은 대장균 유래의 짧은 막관통 단백질(transmembrane protein)로서(UniProtKB NO. C1P5Z8) 막전이 부위(transmembrane segment)를 포함하고 있고 정지기 보다 성장기에 더 높게 발현된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "복수의 분자내 이황화결합을 갖는 단백질"은 해면 Asteropus sp.로부터 분리한 아스테롭신 A(ASPA)와 넙치(Paralichthys olivaceus)로부터 분리한 베타-디펜신(β-defensin,BD)인 외래단백질로 분자내 이황화결합이 제대로 이루어지지 않으면 단백질의 활성이 나타나지 않는다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 짧은 막관통 단백질의 C-말단에 복수의 분자내 이황화결합을 갖는 단백질이 연결된 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된, 재조합 발현벡터가 제공된다.
상기 재조합 벡터에 있어서, 상기 짧은 막관통 단백질은 YoaJ 또는 YkgR일 수 있다. 상기 YoaJ는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성될 수 있고 상기 YkgR은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
상기 복수의 분자내 이황화결합을 갖는 단백질은 아스테롭신 A(ASPA) 또는 베타-디펜신(BD)일 수 있다. 상기 아스테롭신 A는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 구성될 수 있고 상기 베타-디펜신은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
상기 재조합 벡터에 있어서, 상기 융합단백질은 분리-정제를 위한 태그 펩티드(tag peptide)를 추가로 포함할 수 있고 상기 태그 펩티드는 친화성 태그(affinity tag) 또는 에피토프 태그(epitope tag)일 수 있다.
상기 친화성 태그(affinity Tag)는 히스티틴 태그(histidine tag), 글루타치온 전이효소(glutathione s transferase, GST), 인테인(Intein) 또는 말토스 결합단백질(maltose binding protein, MBP)일 수 있고 상기 에피토프 태그(epitope tag)는 플래그 태그(FLAG tag), Myc, V5 또는 HA일 수 있다.
상기 재조합 벡터에 있어서, 상기 복수의 분자내 이황화결합을 갖는 단백질과 상기 짧은 막관통 단백질 사이에 효소에 의한 절단부위가 추가로 삽입될 수 있다.
상기 효소는 트롬빈, TEV(tobacco etch virus) 프로테아제, 프리시션(PreScission) 프로테아제, Factor Xα 또는 엔테로키나아제(Enterokinase)일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 재조합 벡터를 포함하는, 재조합 미생물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 재조합 미생물을 배양하는 재조합 미생물 배양단계; 및 상기 배양된 재조합 미생물로부터 상기 융합단백질을 분리ㅇ정제하는 융합단백질 회수단계를 포함하는, 복수의 분자내 이황화결합을 갖는 단백질의 생산방법이 제공된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 시약 및 재료
본 발명에 사용된 발현 벡터 pQE30 및 대장균 균주 M15(pREP4)는 큐아젠(Qiagen, 네덜란드)으로부터 구매하였고 Paralichthys olivacesu 베타-디펜신 유전자를 포함하는 플라스미드는 남보혜 박사(국립수산과학원, 한국)로부터 제공되었다. 분자 클로닝 실험에 사용된 제한효소를 포함한 다른 효소는 엔지노믹스(Enzynomics, 한국)로부터 구매하였고 그 외, 연구에 사용된 재료와 시약은 시그마(한국)로부터 구매하였다. 본 발명의 플라스미드는 E. coli JM109로부터 분리하였고 DNA 서열분석(Macrogen, 한국)을 통해 확인하였다.
실시예 2: 발현 벡터의 구축
본 발명의 일 실시예에 따른 외래단백질로는 Asteropus sp.(Li et al., Biochim. Biophys. Acta., 1830 (3):2591-2599, 2013)부터 수득한 asteropsin A(ASPA, PDB No. 3Q8J_A)와 Paralichthys olivaceus(Nam et al., Fish Shellfish Immunol, 28(2): 267-274, 2010)로부터 수득한 β-defensin(BD, GenBank No. ADA84144.1)으로 대장균(E. coli) 내 발현을 위해 선택하였다(표 1). PCR-기반 유전자 합성(Withers-Martinez et al., Protein Eng., 12 (12):1113-1120, 1999)을 이용하여 ASPA 유전자(최적화된 코돈)의 인공 cDNA 서열을 합성하였고 pQE30 E. coli 벡터로 서브 클로닝 하였으며 프라이머는 33 에서 60 mer 범위의(Macrogen, Korea, 표 2)일부 올리고머를 사용하였다. PCR 조건은 변성단계(94℃ 30초), 어닐링단계(52℃ 30초) 및 확장단계(72℃ 4분)의 조건에서 25 사이클로 증폭을 실시하였고 내막(inner membrane)에 ASPA 단백질을 위치시키기 위하여 짧은 막관통 단백질(short transmembrane protein) YoaJ(UniProtKB/Swiss-Prot No.: C1P603.1)를 ASPA의 N-말단에 태그로 추가하였다. 그 후, pQE30-ASPA 플라스미드에서 ASPA의 5' 말단으로 YoaJ cDNA를 삽입하기 위하여 두 프라이머를 디자인하였다.
Ni 레진-베이스 단백질 정제를 위한 6 히스티딘 잔기와 절단 부위(TEV : ENLYFQ 또는/및 Factor Xα: IEGR)가 포함된 pQE30-YoaJ-ASPA 플라스미드는 YoaJ와 ASPA 사이에 존재하고 ASPA의 주변세포질 발현을 위해 제조되었다(도 1). 아울러 BD 벡터 제조를 위해, BD의 인서트(insert)를 클로닝하여 BD 벡터에 도입하였고 6개의 히스티딘 태그를 pQE30-YoaJ-BD 벡터의 5' 말단에 연결하였다. 그 후 형질전환 세포인 JM109를 이용, 37℃조건에서 100 ㎍/ml 엠피실린 아가(agar) 플레이트에 도말하고 증식을 위해 배양하였다. 상기 실험에 사용된 단백질의 아미노산 서열과 프라이머의 핵산서열을 하기 표 1과 2에 표시하였다.
| 단백질 | 아미노산 서열 | 서열번호 |
| YoaJ | MKKTTIIMMGVAIIVVLGTELGWW | 1 |
| YkgR | MKENKVQQISHKLINIVVFVAIVEYAYLFLHFY | 2 |
| 아스테롭신 A(ASPA) | GCAFEGESCNVQFYPCCPGLGLTCIPGNPDGTCYYL | 3 |
| 베타-디펜신(BD) | DRPKADCSTIQGVCKDSCLSTEFSIGALGCSAESSTVCCVTKPKL | 4 |
| YoaJ-ASPA (TEV) | MKKTTIIMMGVAIIVVLGTELGWWRGSHHHHHH ENLYFQGCAFEGESCNVQFYPCCPGLGLTCIPGNPDGTCYYL | 5 |
| YoaJ-ASPA (Factor Xα) | MKKTTIIMMGVAIIVVLGTELGWWRGSHHHHHH ENLYFQGTIEGREGCAFEGESCNVQFYPCCPGLGLTCIPGNPDGTCYYL | 6 |
| YkgR-ASPA (Factor Xα) | MKENKVQQISHKLINIVVFVAIVEYAYLFLHFYWWRGSHHHHHH ENLYFQGTIEGREGCAFEGESCNVQFYPCCPGLGLTCIPGNPDGTCYYL | 7 |
| YoaJ-BD | MHHHHHHGSMKKTTIIMMGVAIIVVLGTELGWWRGSVDRGSENLYFQGTIEGRDRPKPDRPKADCSTIQGVCKDSCLSTEFSIGALGCSAESSTVCCVTKPKL | 8 |
| ASPA-YoaJ | MRGSHHHHHHGKKRTIEGREGCAFEGESCNVQFYPCCPGLGLTCIPGNPDGTCYYLIEGRGSMKKTTIIMMGVAIIVVLGTELGWWRGSHHHHHH | 9 |
| 프라이머 | 핵산 서열(5' -> 3') | 서열번호 |
| YoaJ-ASPA-1 | TGTAAGCTTGGTAATCCTGATGGCACCTGCTACTACCTTTAGCTGAGCTTGGACTCCTGTTGATTGAAGCTTACAACTCTCACCTTCGAATGCACATCCGTGAAAAATACAGGTTTTCGTG | 10 |
| YoaJ-ASPA-2 | TGCCCGGGTCTTGGTCTTACTTGTATTCCTGGTAATCCTGATGGCACCTGCTACAAGACCCGGGCAACAAGGATAGAATTGAACATTACAACTCTCACCTTCGAATGC | 11 |
| YoaJ-ASPA-3 | GTGGTACCCGGCACTGAGCTGGGATGGTGGCATCACCATCACCATCACGCCGGGTACCACAATAATCGCCACACCCATCATAATAATCGTTGTTTTTTTCATAGTTAATTTCTCCTCTTTAATGAA | 12 |
| ASPA-YoaJ-1 | GGGGCCGGATCCATGAAAAAAACAACGATTATTAAAGGGGAGCTCCTAGTGATGGTGATGGTGATGCGA | 13 |
| ASPA-YoaJ-2 | AAATTTGAGCTCTAGAAGCTTAATTAGCTGAGCTTGGACAAATTTGGATCCTCGACCTTCTATAAGGTAGTAGCAGGTGCCATC | 14 |
| BD-1 | AAAAAAGCTTTAGCTGAGCTTGGACTCCAAAAAAGTCGACCGATCCTCTCCACCATCC | 15 |
| BD-2 | AGGAAAGTCGACGAAAACCTGTATTTTCAAAAAAGAGCGGTCGACCATGCCTCTTACAGTTCTTC | 16 |
실시예 3: 발현 및 정제
본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 벡터를 포함하고 있는 E. coli M15(pREP4)의 단일 콜로니는 37℃조건으로 100 ㎍/ml 암피실린이 포함된 LB 배지에서 증식하였고 180 rpm에서 배양하였다. 상기 세포의 밀도(optical density)가 0.4에 도달했을 때 1 mM IPTG를 이용하여 단백질의 발현을 유도하였고 32℃에서 4시간 동안 배양하였다. 그 후 상기 세포를 4℃, 5000 g의 조건으로 10분 동안 원심분리를 수행하고 용해(lysis) 완충액(Tris-HCl buffer 20 mM, pH 7.4, 0.2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1% Triton X-100)에서 음파처리(7 W의 6 사이클, 각 30초간, 사이클 간에 2분 동안 휴지기) 후 얼음상(on ice)에서 추출하였다. 상기 용해물은 정제된 가용성 분획(S)을 포함하는 상층액으로부터 수득한 펠렛으로 입자분획(P)을 분리하기 위해 4℃에서 30분 동안 100,000??ㅧg의 조건으로 원심분리하였고 분획을 Ni2+-컬럼에 로딩하여 400 mM 이미다졸(imidazole)을 포함한 용출완충액(elution buffer)을 이용하여 정제된 단백질을 수득하였다.
상기 용출액은 TEV 또는 Factor Xα에 의해 효소 분해작용에 적합한 버퍼 상태로 조정하기 위해 투석(dialysis)을 실시하고 분해작용(digestion)은 제조업자에 의해 제공된 절차에 따라 수행하였다. 그 후, 상기 단백질을 C18 컬럼(250 x 4.6 mm)을 이용하여 역위상 고성능 액체 색채분석(reversed phase high-performance liquid chromatography, RP-HPLC)으로 정제하고 0-72%의 아세토니트릴 선형 구배를 수행하였다.
실시예 4: SDS-PAGE 겔 전기영동
본 발명의 일 실시예에 따라 정제한 단백질을 이용한 15% SDS-겔 전기영동에서 (Haider et al., Anal Bioanal Chem, 397 (2):655-664, 2010) 로딩 전, 샘플을 버퍼에서 90℃조건으로 10분간 변성하고 겔은 쿠마시 블루 G-250으로 염색하였다.
실시예 5: 분자량 결정(molecular mass determination)
본 발명의 일 실시예에 따라 정제한 단백질의 분자량은 전기분무이온화(electrospray ionization, ESI) 또는 Time of Flight(MALDI-TOF) 질량분석기(ultraflextreme, Bruker)의 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 시간을 통하여 결정하였다. 또한 MALDI-TOF MS 분석을 위해, 상기 샘플을 α-시아노-4-하이드로시신나믹산 매트릭스 수용액으로 희석하였고 MALDI 플레이트에 표시된 MS 데이터를 수득하였다.
실시예 6: ASPA 단백질의 생산 확인
본 발명의 일 실시예에 따라 ASPA의 주변세포질 생산을 위해 제조한 pQE30-YoaJ(YkgR)-rASPA 벡터의 YoaJ(YkgR) 및 ASPA를 암호화하는 서열을 발현 숙주인 E. coli M15(pREP4)을 사용하여 pQE30 발현 플라스미드를 합성하였고 Ni 레진 베이스 단백질 정제를 위한 6 히스티딘 잔기와 TEV 분할 부위의 9 잔기를 YoaJ(YkgR) 및 ASPA 사이에 추가하였다(도 1).
YoaJ 캐리어 단백질과 ASPA 펩티드로 구성된 융합단백질의 발현을 확인한 결과, 융합 단백질의 이론적 분자량은 8.4 kDa이고 이 분자량의 밴드는 IPTG 생산 후 형질전환된 추출액에서 관찰되었고(도 2A, 레인 1 및 2) 계면활성제로서 1% Triton X-100을 첨가한 추출 용해물을 추출하고 원심분리하여 수득한 재조합 융합 단백질은 오직 상층액 분획에서 관찰되었다(도 2A, 레인 3). 또한 분획물에 존재하는 융합단백질은 Ni-NTA 추출기로 정제하였고 주요 밴드는 배양 리터당(per liter of culture) 대략 25 mg 수율로 코마시 블루로 염색한 겔에서 관찰하였다(도 2B). 아울러 ESI-mass 분광분석법에 의한 상기 단백질의 분자량은 8372.5 Da로 측정되었고(도 2C) 전체-길이 YoaJ-ASPA(모든 아미노산 잔기에 의해 계산된)의 이론적 분자량은 8378.9 Da로 나타났는데 상기 6-Da 차이는 재조합 융합 단백질에서의 3개의 이황화 결합이 형성되었음을 나타낸다.
TEV 프로테아제(protease)로 상기 융합단백질을 분할하려 했으나 버퍼 내의 트리톤 X-100의 존재로 실패하였다. 따라서 이에 대한 대안으로 pQE30-YoaJ-Factor Xα-ASPA 발현 벡터를 다시 제조하였고 상기 벡터를 이용하여 Factor Xα, YoaJ 및 ASPA 펩타이드 사이, 사이트-특이적 프로테아제를 위한 인식 서열과 함께 융합단백질을 생산하였다. 재조합 융합 단백질인 YoaJ-ASPA 및 Factor Xα는 Ni2+컬럼을 이용하여 정제하였고 9121.25 Da의 이론적 분자량과 비교하여 MALDI-TOF MS에 의해 9115.0 Da 분자량에서 모노등방성 이온 피크(monoisotropic ion peak)를 나타내었다(도 3B). 상기와 같은 결과는 재조합 융합 단백질 형성에서 3개의 이황화 결합이 형성되었음을 나타낸다. 재조합 단백질과 Factor Xα 프로테아제 사이의 분할 반응 후(37℃에서 4시간 동안 배양), 9-Da에서 주요 융합 단백질 밴드는 점차 사라졌고 4 및 5 Da에서 두 단백질 밴드가 나타났다(도 3A). 그러나 이온교환 컬럼(ion exchange column)을 사용한 상기 펩티드와 YoaJ 태그 분리는 실패하였다. 이러한 두 생성물은 RP-HPLC에 의해 분리되었고 질량분석법에 의해 펩티드 ASPA로 확인된 단일 피크가 26%(v/v) 아세토니트릴 수용액에서 약 37분에 관찰되었다(수율 배양 리터당 ~5 mg)(도 3C). 상기 용출된 단백질의 이론적 분자량(3919.6 Da)과 MALDI-TOF MS에 의한 3913.241 Da의 측정된 분자량 간에 6-da 차이를 통해 3개의 이황화 결합이 형성되었음을 확인했다.
실시예 7: BD(β-defensin) 단백질의 생산 확인
본 발명의 일 실시예에 따라 BD, Factor Xα 분할 부위와 결합한 pQE30-YoaJ-BD 벡터를 제조하기 위해 pQE30-YoaJ-ASPA 벡터를 기초로 하여 디자인하였고 6 히스티딘 잔기 태그는 벡터의 5'-말단에 도입하였다. 상기 벡터를 이용한 BD 단백질의 주변세포질 생산(periplasmic production)을 관찰한 결과, 상기 벡터는 E. coli M15(pREP4) 세포에서 재조합 형으로 발현되어 유도되지 않은 세포 샘플과 비교하여 상당히 진한 밴드가 IPTG-유도 세포 샘플에서 나타났다(도 4A). 상기 새로운 밴드의 예상된 분자량은 YoaJ-BD 융합 단백질의 이론적 분자량과 일치하는 ~11 kDa으로 나타났다. 음파처리(sonication) 후, 가용성 추출액을 Ni-NTA 컬럼 정제를 수행하여 11 kDa 생성물을 정제하였다(도 4B). 상기 융합 단백질의 분자량은 MS 분석을 통해 11215.8 Da으로 나타났고(도 4C). 총-길이 YoaJ-BD의 이론적 분자량은 11221.49 Da로 나타났다. 상기 6-Da 차이는 재조합 융합 단백질에서 삼 이황화 결합의 형성되었음을 나타낸다. 또한, 융합 단백질 투석 후에 Factor X 분해작용을 수행하고 상기 분해 생성물을 대상으로 Q 이온 교환 컬럼(mono Q ion exchange column)을 수행한 결과 대략 5 kDa의 두 주요 생성물로 구성된 YoaJ 단백질과 BD를 관찰하였다(도 4D). 상기 단백질을 나타내는 단일 피크가 관찰되었고 최종 수율은 대략 10 mg/l으로 나타났다. 또한 MALDI-TOF MS분석에 의한 BD 단백질의 예상 분자량은 이론적 분자량 5230.49 Da과 비교하여 5224.8 Da으로 확인되었다(도 4E). 따라서 삼 이황화 결합의 형성을 재조합 BD 융합단백질에서 확인하였고 상기 결과는 상기 벡터의 5'-말단에 존재하는 히스티딘-태그가 단백질 이황화 결합을 생산하는데 사용될 수 있음을 말해준다. 또한 pQE30-YkgR-BD 벡터를 제조하기 위해 pQE30-YkgR-ASPA 벡터를 기초로 하여 디자인하였고 6 히스티딘 잔기 태그는 벡터의 5'-말단에 도입하였다. pQE30-YoaJ-BD 벡터와 동일한 실험과정을 거쳐 상기 벡터를 이용한 BD 단백질의 주변세포질 생산(periplasmic production)을 관찰한 결과, 상기 벡터는 E. coli M15(pREP4) 세포에서 재조합 형으로 발현되어 유도되지 않은 세포 샘플과 비교하여 상당히 진한 밴드가 IPTG-유도 세포 샘플에서 나타났으며 이는 도 4A에 나타난 짧은 막 관통단백질(YoaJ)을 이용한 결과와 유사함을 알 수 있다(도 4F). 상기 융합단백질에 대한 캐리어의 크기와 펩타이드 수율을 하기 표 3에 표시하였다.
| 융합 단백질 | 캐리어 크기(kDa) | 펩타이드(mg/L) |
| YoaJ-ASPA | 2.69 | 5 |
| YoaJ-BD | 2.69 | 10 |
| Dsbc-beta-scorpion | 23.5 | ~0.3 |
| MBP-nanbodies | 42 | 2.2 |
| DsbC-Huwentoxin | 23.5 | ~0.7 |
| pelB-human growth hormone | 2.31 | 1.4 |
실시예 8: ASPA 단백질의 세포질 발현
본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 융합단백질의 발현에서 YoaJ 캐리어 단백질의 효과를 확인하기 위해, YoaJ를 pQE30-ASPA-YoaJ 벡터 C-말단에 도입하였다.
그 결과, SDS-PAGE는 비-유도(non-induced) 세포 샘플과 비교하여 IPTG-유도(IPTG-induced) 세포 샘플에서 새로운 피크를 관찰하였다(도 5A). 가용성 분획으로 부터 분할된 재조합 융합 단백질은 원심분리 후 용해된 세포에 Triton X-100 처리 없이 음파처리를 하는 동안 펠렛 분획에 대해 분할된 재조합 융합 단백질인 YoaJ-ASPA의 분획과 매우 다르게 나타났다(도 5B). 또한, Ni2+ 친화성 컬럼을 사용하여 정제 후 MALDI-TOF MS분석을 수행한 융합 단백질 ASPA-YoaJ는 분자량(10599.1 Da)이 이론적 분자량(10599.16)과 일치하는 것을 확인하였다(도 5C). 상기와 같은 결과는 이황화 결합이 재조합 단백질에서 형성되지 않음을 말해주는 것이다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구 범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> Republic of Korea represented by National Fisheries Research & Development Institute
<120> Production of disulfide bond-rich peptides by recombinant
expression system
<130> PD14-5141
<160> 16
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YoaJ
<400> 1
Met Lys Lys Thr Thr Ile Ile Met Met Gly Val Ala Ile Ile Val Val
1 5 10 15
Leu Gly Thr Glu Leu Gly Trp Trp
20
<210> 2
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YkgR
<400> 2
Met Lys Glu Asn Lys Val Gln Gln Ile Ser His Lys Leu Ile Asn Ile
1 5 10 15
Val Val Phe Val Ala Ile Val Glu Tyr Ala Tyr Leu Phe Leu His Phe
20 25 30
Tyr
<210> 3
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASPA
<400> 3
Gly Cys Ala Phe Glu Gly Glu Ser Cys Asn Val Gln Phe Tyr Pro Cys
1 5 10 15
Cys Pro Gly Leu Gly Leu Thr Cys Ile Pro Gly Asn Pro Asp Gly Thr
20 25 30
Cys Tyr Tyr Leu
35
<210> 4
<211> 45
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BD
<400> 4
Asp Arg Pro Lys Ala Asp Cys Ser Thr Ile Gln Gly Val Cys Lys Asp
1 5 10 15
Ser Cys Leu Ser Thr Glu Phe Ser Ile Gly Ala Leu Gly Cys Ser Ala
20 25 30
Glu Ser Ser Thr Val Cys Cys Val Thr Lys Pro Lys Leu
35 40 45
<210> 5
<211> 75
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YoaJ ASPA
<400> 5
Met Lys Lys Thr Thr Ile Ile Met Met Gly Val Ala Ile Ile Val Val
1 5 10 15
Leu Gly Thr Glu Leu Gly Trp Trp Arg Gly Ser His His His His His
20 25 30
His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Cys Ala Phe Glu Gly Glu Ser Cys
35 40 45
Asn Val Gln Phe Tyr Pro Cys Cys Pro Gly Leu Gly Leu Thr Cys Ile
50 55 60
Pro Gly Asn Pro Asp Gly Thr Cys Tyr Tyr Leu
65 70 75
<210> 6
<211> 82
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YoaJ ASPA Factor Xa
<400> 6
Met Lys Lys Thr Thr Ile Ile Met Met Gly Val Ala Ile Ile Val Val
1 5 10 15
Leu Gly Thr Glu Leu Gly Trp Trp Arg Gly Ser His His His His His
20 25 30
His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Thr Ile Glu Gly Arg Glu Gly Cys
35 40 45
Ala Phe Glu Gly Glu Ser Cys Asn Val Gln Phe Tyr Pro Cys Cys Pro
50 55 60
Gly Leu Gly Leu Thr Cys Ile Pro Gly Asn Pro Asp Gly Thr Cys Tyr
65 70 75 80
Tyr Leu
<210> 7
<211> 93
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YkgR ASPA Factor Xa
<400> 7
Met Lys Glu Asn Lys Val Gln Gln Ile Ser His Lys Leu Ile Asn Ile
1 5 10 15
Val Val Phe Val Ala Ile Val Glu Tyr Ala Tyr Leu Phe Leu His Phe
20 25 30
Tyr Trp Trp Arg Gly Ser His His His His His His Glu Asn Leu Tyr
35 40 45
Phe Gln Gly Thr Ile Glu Gly Arg Glu Gly Cys Ala Phe Glu Gly Glu
50 55 60
Ser Cys Asn Val Gln Phe Tyr Pro Cys Cys Pro Gly Leu Gly Leu Thr
65 70 75 80
Cys Ile Pro Gly Asn Pro Asp Gly Thr Cys Tyr Tyr Leu
85 90
<210> 8
<211> 103
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YoaJ BD
<400> 8
Met His His His His His His Gly Ser Met Lys Lys Thr Thr Ile Ile
1 5 10 15
Met Met Gly Val Ala Ile Ile Val Val Leu Gly Thr Glu Leu Gly Trp
20 25 30
Trp Arg Gly Ser Val Asp Arg Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
35 40 45
Thr Ile Glu Gly Arg Asp Arg Pro Lys Pro Asp Arg Pro Lys Ala Asp
50 55 60
Cys Ser Thr Ile Gln Gly Val Cys Lys Asp Ser Cys Leu Ser Thr Glu
65 70 75 80
Phe Ser Ile Gly Ala Leu Gly Cys Ser Ala Glu Ser Ser Thr Val Cys
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Cys Val Thr Lys Pro Lys Leu
100
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<210> 10
<211> 121
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YoaJ ASPA 1
<400> 10
tgtaagcttg gtaatcctga tggcacctgc tactaccttt agctgagctt ggactcctgt 60
tgattgaagc ttacaactct caccttcgaa tgcacatccg tgaaaaatac aggttttcgt 120
g 121
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<212> DNA
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<220>
<223> YoaJ ASPA 2
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tgcccgggtc ttggtcttac ttgtattcct ggtaatcctg atggcacctg ctacaagacc 60
cgggcaacaa ggatagaatt gaacattaca actctcacct tcgaatgc 108
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YoaJ ASPA 3
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gtggtacccg gcactgagct gggatggtgg catcaccatc accatcacgc cgggtaccac 60
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<210> 13
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASPA YoaJ 1
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gtgatgcga 69
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<212> DNA
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<220>
<223> ASPA YoaJ 2
<400> 14
aaatttgagc tctagaagct taattagctg agcttggaca aatttggatc ctcgaccttc 60
tataaggtag tagcaggtgc catc 84
<210> 15
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BD 1
<400> 15
aaaaaagctt tagctgagct tggactccaa aaaagtcgac cgatcctctc caccatcc 58
<210> 16
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BD 2
<400> 16
aggaaagtcg acgaaaacct gtattttcaa aaaagagcgg tcgaccatgc ctcttacagt 60
tcttc 65
Claims (16)
- 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 YoaJ의 C-말단에 복수의 분자내 이황화결합을 갖는 단백질이 연결된 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된, 재조합 발현벡터.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 복수의 분자내 이황화결합을 갖는 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 아스테롭신 A(ASPA)인, 재조합 발현벡터. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 복수의 분자내 이황화결합을 갖는 단백질은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 베타-디펜신인, 재조합 발현벡터. - 제1항에 있어서,
상기 융합단백질은 분리-정제를 위한 태그 펩티드(tag peptide)를 추가로 포함하는, 재조합 발현벡터. - 제8항에 있어서,
상기 태그 펩티드는 친화성 태그(affinity tag) 또는 에피토프 태그(epitope tag)인, 재조합 발현벡터. - 제9항에 있어서,
상기 친화성 태그(affinity Tag)는 히스티틴 태그(histidine tag), 글루타치온 전이효소(glutathione s transferase, GST), 인테인(Intein) 또는 말토스 결합단백질(maltose binding protein, MBP)인, 재조합 발현벡터. - 제9항에 있어서,
상기 에피토프 태그(epitope tag)는 플래그 태그(FLAG tag), Myc, V5 또는 HA인, 재조합 발현벡터. - 제1항에 있어서,
상기 복수의 분자내 이황화결합을 갖는 단백질과 상기 YoaJ 사이에 효소에 의한 절단부위가 추가로 삽입되는, 재조합 발현벡터. - 제12항에 있어서,
상기 효소는 트롬빈, TEV(tobacco etch virus) 프로테아제, 프리시션(PreScission) 프로테아제, Factor Xα 또는 엔테로키나아제(Enterokinase)인, 재조합 발현벡터. - 제1항, 제5항 및 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 포함하는, 재조합 미생물.
- 제14항의 재조합 미생물을 배양하는 재조합 미생물 배양단계; 및 상기 배양된 재조합 미생물로부터 상기 융합단백질을 분리·정제하는 융합단백질 회수단계를 포함하는, 복수의 분자내 이황화결합을 갖는 단백질의 생산방법.
- 제12항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 재조합 미생물 배양단계;
상기 배양된 재조합 미생물로부터 상기 융합단백질을 분리·정제하는 융합단백질 회수단계;
절단효소를 이용하여 상기 융합단백질을 절단하는 단계; 및
상기 복수의 분자내 이황화결합을 갖는 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 복수의 분자내 이황화결합을 갖는 단백질의 생산방법.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200098355A (ko) | 2019-02-10 | 2020-08-20 | 김수완 | 근거리통신 태그 위변조 방지 시스템 및 방법 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
2015
- 2015-03-25 KR KR1020150041376A patent/KR101642779B1/ko active IP Right Grant
- 2015-12-15 WO PCT/KR2015/013695 patent/WO2016153150A1/ko active Application Filing
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ario de Marco 등. Microbial Cell Factories. Vol. 8, No. 26, 페이지 1-18 (2009)* * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200098355A (ko) | 2019-02-10 | 2020-08-20 | 김수완 | 근거리통신 태그 위변조 방지 시스템 및 방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2016153150A1 (ko) | 2016-09-29 |
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