KR101574204B1 - 코돈 최적화된 인간 상피세포 성장인자를 발현하는 형질전환 조류 및 이의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 코돈 최적화된 인간 상피세포 성장인자를 발현하는 형질전환 조류 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 인간 상피세포 성장인자를 발현하는 형질전환된 조류는 인간 상피세포 성장인자가 난관 특이적으로 발현되어 난백 내에 축적됨으로써 효율적으로 상피세포 성장인자를 생산할 수 있다.
Description
본 발명은 코돈 최적화된 인간 상피세포 성장인자를 발현하는 형질전환 조류 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
상피세포 성장인자 (epidermal growth factor, EGF)는 유로가스트론 (urogastrone)으로 알려진, 53개의 아미노산과 3개의 이황화 결합을 갖는 분자량 6,045 Da의 폴리펩타이드로서, 상피세포와 간엽세포를 포함한 각종 세포들에 대해 유사분열 촉진, 세포성장 촉진 및 위산분비 억제 등의 활성이 있어, 피부 또는 각막의 상처 치료제 또는 위궤양 치료제로 사용할 수 있다. 상기 상피세포 성장인자는 바이오소재 중 하나로서, 생명체에서 생산량이 매우 적거나, 특히 인간 유래 단백질의 경우에는 생산량뿐 아니라 윤리적 문제로 인하여 생산이 매우 한정적이다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 대장균에서 재조합 형태로 생산할 수 있으나, 대장균에서 생성되는 단백질은 당쇄화와 같은 유전자 암호번역 이 후의 단백질 변형 과정에 많은 문제가 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 유전자를 발현하는 형질전환 가축으로부터 직접 단백질을 수확할 수 있다.
현재까지 형질전환 가축의 생산에 관한 연구의 대부분은 주로 소, 돼지, 양, 토끼 및 염소 등의 포유류를 대상으로 이루어졌다. 이들의 경우 시간과 비용의 방대한 투자에도 불구하고 경제적인 측면에서 성공적인 형질전환 가축의 생산에 관한 보고는 미미한 실정이다. 이러한 현상은 대부분 포유류들의 긴 세대 간격, 복잡한 생리적 형태적 특징 및 연구에 드는 천문학적인 비용에 기인한다.
한편, 형질전환 조류는 포유류에 비해 성숙기간과 세대 간격이 짧으며 포유류에 비해 번식능력이 대단히 높기 때문에 형질전환된 가금의 계통성립이 용이하고 비교적 적은 노력과 비용으로 많은 개체를 대상으로 하는 실험이 가능하다는 장점이 있다. 그러나, 조류의 경우 포유류와는 달리 수정 시 일어나는 일반적인 다정자침입(polyspermy) 현상(Perry, 1987,J. Anat. 150: 99-109)이나, 수정 후부터 산란 직후까지의 배발생으로 인하여 배발달 X기(stage X, Eyal-Giladi et al., 1976, Dev. Biol. 49: 321-337)에 해당하는 갓 산란한 계란의 배에는 이미 약 60,000여 개의 분화전능(pluoripotent)한 세포들이 존재한다(Petitte and Mozdziak, 2002, in: Transgenic Animal Technology (edited by C.A. Pinkert, Chapter 11, Academic Press, San Diego)). 이러한 형태적, 발생적 특징으로 인해 가금에 있어 포유류의 경우와 동일한 방법으로 외래 유전자를 도입하는 것은 매우 어렵다. 또한 조류의 수란관에서 초기 수정란을 채취하기가 기술적으로 지극히 어려울 뿐만 아니라 산란된 난(卵)의 배는 두꺼운 난각으로 둘러싸여 있기 때문에 포유류에 사용되고 있는 유전자 이식 기술의 적용이 불가능하다.
형질전환 조류의 생산에 있어서 외래유전자의 도입에 이용되는 표적 세포에는 난의 X기의 배반엽 세포(Rosenblum and Chen, 1995, Transgenic Res. 4: 192-198), 원시생식세포(primordial germ cell) (Li et al.,1995, Transgenic Res. 4: 26-29), 갓 수정된 난자(Sherman et al., 1998, Nat. Biotech. 16: 1050-1053), 태아 줄기 세포(embryonic stem cell; Pain et al., 1999, Cells Tissues Organs 165: 212-219) 및 정자 (Nakanishi and Iritani, 1993, Mol. Reprod. Dev. 36: 258-261) 등이 있으며, 외래 유전자의 전이를 위해 DNA를 표적세포에 직접 형질도입(transfection)시키는 물리 또는 화학적 방법(Muramatsu et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 230: 376-380)을 이용하거나 바이러스의 감염성을 이용하는 생물학적인 방법 (Thoraval et al., 1995, Transgenic Res. 4: 369-377)을 이용한다. 따라서, 형질전환 닭의 생산방법은 외래 유전자를 전이시키고자 하는 표적 세포와 유전자의 전이 방법에 따라 많은 방법이 있을 수 있는데 이 중에서 X기의 배반엽 세포에 레트로바이러스 벡터 시스템을 이용하는 방법이 가장 일반적으로 사용되고 있다. 이 방법의 가장 큰 장점은 유전자의 전이에 있어서 레트로바이러스 고유의 감염성을 이용하므로 기술적으로 가장 용이하다는 데에 있다. 이 방법을 이용하여 Salter 등(1987, Virology, 157: 236-240)은 닭의 배에 복제-가능 바이러스(replication-competent retrovirus vector)를 직접 주입하여 생식세포에서 외래 유전자의 전이가 확인된 최초의 형질전환 닭을 생산하였고, 그 후 Bosselman 등(1989, Science, 243: 533-535)은 복제-결핍 바이러스(replication-defective retrovirus vector)를 이용하여 형질전환 닭을 생산하였다. 또한, 최근에는 McGrew등 (2004, EMBO reports, 5: 728-733), Lillico 등 (2007, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104: 1771-1776), Harvey 등(2002, Nat. Biotech., 19: 396-399), Mozdziak 등(2003, Dev. Dyn. 226: 439-445) 및 Rapp 등 (2003, Transgenic Res. 12: 569-575)에 의해 성공적인 결과가 보고되었다. 그러나, 이들 연구들은 다음과 같은 단점을 가진다. 즉, 이들의 연구에서는 EIAV (equine infectious anemia virus) 와 HIV-1 (human immunodeficiency virus type 1)과 같은 렌티바이러스 벡터 시스템 혹은 ALV (avian leukosis virus), REV(reticuloendotheliosis virus) 혹은 SNV (spleen necrosis virus)와 같은 조류 레트로바이러스(avain retrovirus) 시스템을 이용하였는데, HIV로 대표되는 렌티바이러스 벡터의 경우는 태생적인 생물학적 안전성 문제가 있으며, 조류 레트로바이러스 벡터를 사용하는 경우는 전이된 바이러스 벡터와 닭의 세포에 내재되어 있는 내재성 레트로바이러스(endogenous retrovirus)가 서로 상동성 재조합(homologous recombination)됨으로써 복제가 가능한 바이러스가 생산되는 생물학적 위험 문제가 나타날 수 있다.
상기의 문제점을 해결할 수 있는 방법으로 줄기세포를 이용한 형질전환 조류를 생산하는 방법이 있다. 조류의 줄기세포는 크게 배반엽 세포로부터 유래되는 배아줄기세포 (ESCs: embryonic stem cell), 원시생식세포 (PGCs; primordial germ cell)에서 유래되는 배아생식선 줄기세포 (EGCs; Embryonic Germ cell) 및 정소세포에서 유래되는 생식선 줄기세포 (GSCs; Germline stem cell)가 있다. 이러한 줄기세포는 체외배양을 통해 증폭이 가능하며 세포 내로 유전자 도입을 통해 형질전환 조류의 생산을 가능하게 한다. 닭의 경우 정자와 난자가 난관의 누두부에서 수정이 되며 수정란은 암탉의 난관 내에서 분열 및 분화를 시작하여 산란 직후 4만∼6 만개 세포의 배반엽 세포단계까지 발생하게 된다. 공여체 배반엽 세포를 수용체 배아에 주입하여 체세포 및 생식선 키메라 생산이 가능함이 보고 되었으나 키메라 생산효율이 낮다는 단점을 나타내었다. 이에 따라 키메라 생산효율을 향상시키기 위하여 배반엽세포에 감마선 (gamma ray) 또는 배반엽 세포 부위 제거 방법 등의 연구가 진행되고 있다 (Carsience 등 1993). 또한 배반엽 세포의 체외배양을 통하여 배아줄기세포를 확립하고 키메라 생산효율이 향상된 형질전환 조류 생산을 위한 연구가 이루어졌다. Pain 등 (1996)은 배반엽세포의 장기 체외배양을 통하여 닭의 배아줄기세포를 확립하였다. 이러한 배아줄기세포는 줄기세포 특이항원을 발현 다양한 조직으로의 분화능력이 증명되었으나 배아줄기세포확립의 가장 중요한 요소인 생식선 키메라 생산은 성공하지 못하였다. 계대배양에 의하여 장기배양된 배아줄기세포를 이용하여 체세포 키메라는 생산이 되었으나 생식선 키메라는 생산하지 못하였으며 다만 7일간 체외배양된 세포를 이용한 경우 효율은 낮았지만 생식선 키메라 생산을 확인하였다. 또한 Zhu 등 (2005)은 배반엽세포를 이용하여 확립한 닭의 배아줄기세포에 인간 단일클론항체를 생산하는 유전자를 도입하여 난백에서 발현을 확인하였지만 유전자가 자손에게 전달되는 생식선 키메라는 보고하지 못하였다. 현재까지 배아줄기세포확립을 위한 연구로 배반엽세포 이전단계 세포 (preblastodermal cell)의 체외배양을 위한 조건이 확립되었으며 (Park 등 2006), 배반엽세포가 생식세포로 분화가 가능함이 보고되었다 (Kim 등 2006). 상기와 같이, 배아줄기세포는 확립과 유지 및 생식선 키메라의 생산이 어려운 단점이 있다.
이러한 한계성을 극복하기 위하여 원시생식세포를 이용한 형질전환연구가 진행되고 있다. 원시생식세포는 성성숙후 정자나 난자가 되는 초기 배아내의 전구세포로서 배아 초기에 외배엽 (epiblast)에서 유래되어 내배엽 (hypoblast)으로 이동한 다음 생식반월 (germinal crescent)로 이동한다. 이후 혈관계가 형성되면서 혈관으로의 함입이 일어나며 혈관에 함입된 원시생식세포는 혈류를 따라 이동되어 최종적으로 원시생식기내로 착상되어 분열 및 분화과정을 거치게 된다. 따라서 원시생식세포는 생식반월, 혈관 내 및 원시생식기에서 회수가 가능하다. 그러나 생식반월과 혈관 내 원시생식세포는 회수할 수 있는 수가 한정되어 있어 이의 증폭을 위한 체외배양 및 배아줄기세포의 일종인 생식선 줄기세포확립을 위한 연구가 진행되었다. 원시생식기 유래의 원시생식세포의 장기배양을 통한 배아 생식선 줄기세포가 확립되었으며, 확립된 배아 생식선 줄기세포는 체외에서 내배엽성, 외배엽성 및 중배엽성 세포로 분화되었으며 초기 배자에 주입하여 체세포 키메라를 생산하였다. 또한 체외에서 장기간 계대 배양한 배아 생식선 줄기세포를 이용하여 생식선 키메라 생산도 성공하였다 (Park 등 2003). 특히, 개발된 배아 생식선 줄기세포는 조류 특이 줄기세포로서의 특성을 가지고 있음이 줄기세포 마커분석을 통해 확인되었다 (Jung 등 2005). Van de Lavoir 등 (2006)은 2.5일령 혈관에서 원시생식세포를 분리하여 체외배양 후 유전자를 도입하여 형질전환된 생식선 키메라를 보고하였다. 일련의 연구결과는 생식선 유래 줄기세포를 이용한 방법이 형질전환 닭 생산의 산업적 활용이 가능함을 시사하고 있다.
이에 본 발명의 발명자들은 인간의 상피세포 성장인자를 조류에서 대량으로 생산하기 위하여, 인간의 상피세포 성장인자를 조류의 코돈으로 최적화시키고, 상기 유전자를 난관 특이적으로 발현시켜 난백 내에 인간의 상피세포 성장인자가 축적되도록 벡터를 제조하고, 상기 벡터를 원시 생식세포에 도입한 후, 원시 생식세포를 이용하여 인간의 상피세포 성장인자를 발현하는 형질전환 조류를 제조함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 조류의 코돈으로 코돈 최적화된 인간의 상피세포 성장인자 유전자를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 코돈 최적화된 인간 상피세포 성장인자 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터로 형질도입된 가금의 원시 생식세포를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 원시 생식세포를 이용한 인간의 상피세포 성장인자를 난관 특이적으로 발현시키기 위한 가금 키메라 및 형질전환 조류를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 가금 키메라 및 형질전환 조류의 제조방법을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 조류의 코돈으로 코돈 최적화된 인간 상피세포 성장인자 유전자 및 이를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 "코돈 최적화"란 특정 유전자를 다른 개체에서 발현시키는 경우, 유전자가 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 발현할 수 있도록, 유전자의 염기서열을 변환시키는 것을 말한다.
본 발명의 코돈 최적화된 인간 상피세포 성장인자 유전자는 이를 조류에서 발현시키는 경우, 인간에서 발현되는 경우와 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 생산할 수 있다. 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서 용어“벡터”는 프로모터로 하여금 외부 DNA 서열의 발현, 즉 전사 및 번역을 유도하도록 하는 모든 핵산 분자, 바람직하게는 DNA 서열을 의미한다.
상기 발현벡터는, 조류의 난관에서 인간의 상피세포 성장인자 유전자를 특이적으로 발현시킬 수 있도록 구성되어 있다.
구체적으로는, 상기 발현벡터는, 두 개의 조류의 코돈으로 최적화된 인간의 상피세포 성장인자 유전자;
상기 유전자가 발현되는 단백질을 난백 내 발현시키는 리소자임 신호 서열;
상기 유전자 사이에 위치하는 IRES (internal ribosome entry site); 및
상기 유전자의 발현을 조절하는 오브 알부민의 프로모터;를 포함할 수 있다.
상기 유전자를 두 개로 배치하는 이유는 유전자의 발현을 극대화시키기 위함이다.
또한, IRES (internal ribosome entry site)는 단백질 번역과정에서 리보솜이 결합하는 부위로 상기 유전자 사이에 존재하여 번역을 효율적으로 일어날 수 있도록 한다.
또한, 오브알부민은 조류의 난관 내에서 가장 발현이 높은 단백질로, 상기 프로모터는 난관 내 특이적으로 발현할 수 있도록 한다. 본 명세서에서 용어 “프로모터”는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다.
본 발명의 유전자를 과발현 시키기 위하여 에스트로젠-반응 인자 (estrogen-responding element)를 더 포함시킬 수 있으며, 에스트로젠과 반응하는 경우, 유전자 발현이 증가한다.
또한, 본 발명의 벡터에 상피세포 성장인자 유전자가 발현하는 RNA의 안정성을 높이기 위하여 소의 폴리아데닐화 부위 (bovine polyadenylation site)를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 발현벡터 또는 발현벡터가 형질도입된 세포에서 형질도입 여부를 용이하게 확인할 수 있도록, 형광단백질을 코딩하는 서열을 더 포함할 수 있다.
상기 형광단백질을 코딩하는 서열은 소의 폴리아데닐화 부위 (bovine polyadenylation site)와 연결되고, 형광단백질의 발현의 조절을 위한 CMV의 프로모터(cytomegalovirus immediate-early enhancer/promoter)를 더 포함할 수 있으며, 상기 형광단백질은 황색 형광단백질, 녹색 형광단백질 및 적색 형광단백질을 포함한다.
또한, 본 발명의 벡터는 형질도입된 세포를 확인하기 위하여, 항생제 내성 유전자를 포함시킬 수 있으며, 상기 항생제는 네오마이신이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터를 형질도입한 조류의 원시 생식세포를 제공한다.
본 발명에서 조류는 닭, 메추라기, 칠면조, 오리, 거위, 꿩 및 비둘기를 포함한다. 상기 원시생식세포로의 유전자 전이 방법은 당업계에 잘열려진 뉴클레오펙션 (Nucleofection) 방법 또는 리포펙션 (Lipofection) 방법을 이용할 수 있고, 바람직하게는 상기 방법을 혼합하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은,
1) 상기 원시 생식세포를 조류의 수용체 배자 (recipient embryo)의 혈관에 주입하는 단계; 및
2) 상기 수용체 배자를 포함하는 난을 배양 및 부화하여 조류 형질전환체를 생산하는 단계; 를 포함하는, 인간의 상피세포 성장인자 유전자를 조류의 난관에 특이적으로 발현시키기 위한 키메라 조류의 제조 방법 및 이에 의하여 제조된 키메라 조류를 제공한다.
상기 1)단계의 경우, 원시 생식세포에 인간의 상피세포 성장인자 유전자를 형질도입한 후, in vitro 배양을 통하여 1 내지 200일 배양할 수 있으며, 상기 원시 생식세포는 조류의 수용체 배자 (recipient embryo)의 혈관에 주입하여, 원시 생식세포를 정상적인 성세포로 분화시킬 수 있다.
상기 2) 단계의 조류 형질전환체를 생산하는 단계는 난을 배양 후, 부화시켜 조류 형질전환체를 선별할 수 있다. 형광 단백질을 함께 형질도입한 경우, 조류 형질전환체의 선별은 보다 용이할 수 있고, PCR 등 유전적 방법을 이용하여 형질전환체를 선별할 수 있다.
또한, 본 발명은 키메라 교류를 교배하는 단계;를 포함하는 조류의 코돈으로 최적화된 인간 상피세포 성장인자 유전자가 난관 특이적으로 발현되는 형질전환 조류 생산 방법 및 이에 의하여 생산된 형질전환 조류를 제공한다.
본 발명의 형질전환 조류는 인간의 상피세포 성장인자가 난관 특이적으로 발현되어 난백 내에 축적되어 효율적으로 상피세포 성장인자를 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조류를 의학, 축산 및 화장품 등 관련분야에 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 인간 상피세포 성장인자를 발현하는 형질전환된 조류는 인간의 상피세포 성장인자가 난관 특이적으로 발현되어 난백 내에 축적되어 효율적으로 상피세포 성장인자를 생산할 수 있다.
도 1은 닭 유전자의 코돈표 (codon usage)를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 닭의 코돈으로 코돈 최적화된 인간의 상피세포 성장인자의 서열을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 코돈 최적화된 인간 상피세포 성장인자를 포함하는 CMV 발현벡터의 구조를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 발현 벡터가 조류 유래 세포인 CEFs(chiken embryonic fibroblast) 및 DT40 세포 주에서 발현하는지 여부를 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 코돈 최적화된 인간 상피세포 성장인자를 난관 특이적으로 발현시키기 위한 발현벡터의 구조를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 코돈 최적화된 인간 상피세포 성장인자를 닭의 원시 생식세포 내 전이 후 발현 양상을 확인한 도이다.
도 7은 본 발명의 코돈 최적화된 인간 상피세포 성장인자를 닭의 원시 생식세포 내 전이 후, 원시 생식세포의 특성을 분석한 도이다.
도 8은 본 발명의 원시 생식세포를 수용체 배자 내 주입 후, GFP 형광 단백질의 발현을 확인한 도이다.
도 9는 본 발명의 원시 생식세포를 수용체 배자 내 주입 후, 발생 개체 생식기 내에서 GFP를 발현하는 생식세포를 확인한 도이다.
도 10은 생식선 키메라 기술을 이용한 형질전환 조류의 제조과정을 대략적으로 나타낸 도이다.
도 11은 PCR을 이용하여 형질전환 개체를 확인한 도이다.
도 12는 본 발명의 형질전환 개체의 난백내 상피세포 성장인자의 발현량을 비교한 도이다.
도 13은 본 발명의 형질전환 개체의 난백을 추출한 후, 인간 상피세포 성장인자의 활성을 확인한 도이다.
도 2는 본 발명의 닭의 코돈으로 코돈 최적화된 인간의 상피세포 성장인자의 서열을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 코돈 최적화된 인간 상피세포 성장인자를 포함하는 CMV 발현벡터의 구조를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 발현 벡터가 조류 유래 세포인 CEFs(chiken embryonic fibroblast) 및 DT40 세포 주에서 발현하는지 여부를 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 코돈 최적화된 인간 상피세포 성장인자를 난관 특이적으로 발현시키기 위한 발현벡터의 구조를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 코돈 최적화된 인간 상피세포 성장인자를 닭의 원시 생식세포 내 전이 후 발현 양상을 확인한 도이다.
도 7은 본 발명의 코돈 최적화된 인간 상피세포 성장인자를 닭의 원시 생식세포 내 전이 후, 원시 생식세포의 특성을 분석한 도이다.
도 8은 본 발명의 원시 생식세포를 수용체 배자 내 주입 후, GFP 형광 단백질의 발현을 확인한 도이다.
도 9는 본 발명의 원시 생식세포를 수용체 배자 내 주입 후, 발생 개체 생식기 내에서 GFP를 발현하는 생식세포를 확인한 도이다.
도 10은 생식선 키메라 기술을 이용한 형질전환 조류의 제조과정을 대략적으로 나타낸 도이다.
도 11은 PCR을 이용하여 형질전환 개체를 확인한 도이다.
도 12는 본 발명의 형질전환 개체의 난백내 상피세포 성장인자의 발현량을 비교한 도이다.
도 13은 본 발명의 형질전환 개체의 난백을 추출한 후, 인간 상피세포 성장인자의 활성을 확인한 도이다.
이하, 본 발명의 내용을 실험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기의 실험예는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
[
실시예
1] 인간 상피세포 성장인자 (
EGF
;
epidermal
growth
factor
)의 조류에서 발현을 위한 코돈 최적화
안정적인 유전자 발현 및 발현 효율을 증가시키기 위하여, 인간 유전자를 일본 Kazusa DNA Research Institute (http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=208526)에서 제공하는 닭의 코돈표 (chicken codon usage; 도 1 참조)를 바탕으로 닭 코돈-최적화 유전자 (chicken codon-optimized gene)를 합성하였다. 합성된 닭 코돈-최적화 상피세포 성장인자에 두 개의 종결 코돈 (stop codon; TGA 및 TAA)을 연속으로 배치하여 단백질 합성효율을 증가시켰다. 또한, 닭 코돈-최적화 EGF 앞쪽에 출발 코돈 (start codon) 인 ATG를 포함하는 닭의 리소자임 신호 서열을 추가하여, 단백질 합성시에 EGF에 있는 ATG를 제거하였다. 상기 합성한 유전자 염기서열을 도 2 및 서열번호 1로 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 인간의 EGF와 닭의 EGF의 DNA 서열 상동성은 77.6% (128/165)로 나타남을 확인하였다.
[
실시예
2] 코돈 최적화된 인간 상피세포 성장인자의 닭의 난백 내 발현을 위한 벡터의 제조 및 발현 확인
1. 코돈 최적화된 상피세포 성장인자를 포함하는 발현 벡터의 제조
상기 실시예 1에서 합성된 유전자의 발현을 위하여, 닭의 난백 내 발현 벡터를 제조하였다. 보다 구체적으로, 합성된 닭 코돈-최적화 상피세포 성장인자를 발현할 수 있는 기본 발현 벡터는, pcDNA3 (Invitrogen)를 골격으로 하여, CMV (cytomegalovirus immediate-early enhancer/promoter) 프로모터 및 SV40 (simian vacuolating virus 40) 프로모터에 의해 발현이 조절되는 네오마이신-저항성 유전자 (neomycin-resistance gene)를 포함하는 벡터를 제조하였다. 본 발명의 코돈 최적화 상피세포 성장인자를 Sac II/Xba I를 이용하여 pcDNA3의 CMV 프로모터와 polyA 부위 사이에 클로닝하였다. 발현 벡터를 세포 내 형질도입 후, 선발 마커로 NeoR을 사용하여 형질도입세포를 스크리닝하였다. 또한, 상기 상피세포 성장인자의 경우에는 두 개의 동일한 DNA 서열을 재조합하여, 상피세포 성장인자의 발현량을 향상시킬 수 있도록 두 개의 복제 유전자를 동시에 발현할 수 있는 시스템을 생성하였고, 상기 상피세포 성장인자의 서열사이를 IRES (internal ribosome entry site) 조절 인자로 연결하였다. IRES 조절인자는 두 개의 상피세포 성장인자 유전자 사이에 존재하여 전사 후 단백질 번역 과정에서 앞쪽의 상피세포 성장인자의 유전자와 동일하게 뒤쪽의 상피세포 성장인자를 발현함으로써 하나의 발현 벡터의 형질도입만으로 두 배의 유전자 발현을 유도할 수 있도록 제조하였다. 상기 제조된 벡터의 구조를 도 3에 나타내었다.
2. 본 발명의 코돈 최적화된 인간 상피세포 성장인자가 형질도입된 세포의 발현 확인
실시예 2-1에서 제조한 닭 코돈-최적화된 인간의 EGF를 발현하기 위한 발현 벡터를 닭 유래세포에 형질 감염 후, 배양 in vitro assay를 수행하였고, 단백질 발현을 확인하였다. 구체적으로, 실시예 2에서 제조된 발현 벡터를 닭 유래 CEFs (chicken embryonic fibroblasts)와 DT40 (chicken B cell-derived line)에 형질도입시킨 후, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)를 수행하여 닭 코돈-최적화된 인간의 상피세포 성장인자의 발현 여부를 확인하였다. 이의 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, CEFs 및 DT40 모두에서 본원 발명의 EGF의 세포 수준 발현을 확인하였고, B 세포 유래의 DT40에서 CEFs보다 다소 높은 발현량을 나타냄을 확인하였다.
또한, ELISA에 사용한 시료는 상기 두 세포에 EGF 발현 벡터를 형질도입한 후, 상층 배양액을 사용하였고, 상기 배양 상층액에서 단백질이 검출되었는바, 리소자임 신호 펩티드 서열에 의하여 정상적으로 발현된 단백질이 세포 밖으로 이동되었음을 나타낸다. 난관 세포가 아닌 일반 섬유아세포 및 B 세포에서 리소자임 신호 펩티드가 작용하였는바, 최종적으로 형질전환 개체를 생산하는 경우, 난관 세포에서 생산된 단백질이 계란의 난백 내로 이동 및 축적이 가능할 것으로 판단된다.
[
실시예
4] 본 발명의
EGF
유전자를 닭의 난관에 특이적으로 과발현시키는 발현 벡터의 제조
1.
GFP
를 포함하는 발현 벡터의 제조
형질전환 닭을 이용한 생체반응기 생산을 위하여, 계란의 난백이 축적되는 닭의 난관 (oviduct)에 특이적으로 과발현 (overexpression)될 수 있는 발현 벡터를 제조하였다.
우선, 닭의 난관 내에서 강력하게 과발현되는 유전자인 오브알부민의 프로모터를 클로닝하여 벡터를 제작하였다. 오브알부민 유전자는 매일 계란 한 개에 2g 이상 발현이 되지만 아직 정확한 오브알부민 프로모터의 구성과 정확한 크기는 알려지지 않았다. 따라서 현재까지 조절인자가 정확하게 밝혀진 3.5kb에 대한 프로모터를 클로닝하여 벡터 제작을 하였다. 기본 발현 벡터로는 오브알부민 프로모터 3.5kb에 본 발명의 닭 코돈-최적화된 인간의 EGF 또는 인간의 EGF 유전자를 클로닝하고, 유전자 전이 및 선발 과정 중에 육안으로 확인 가능한 리포터 유전자인 GFP (green fluorescent protein) 유전자를 삽입함으로써 보다 손쉬운 선발 방법을 확립하였다. 또한, 닭 코돈-최적화된 EGF 발현 방향과 서로 반대 방향으로 GFP 유전자 및 NeoR 유전자의 발현 방향을 구성함으로써 상호 발현에 간섭이 없도록 제조하였다. 기본 발현 벡터의 경우, 네오마이신 선발에 의해 안정적으로 유전자가 삽입된 세포 선별과 더불어 GFP 형광 단백질이 발현되는 세포만을 파이펫을 이용하여 픽킹이 가능하여 보다 손쉽고 빠르게 선발이 가능하도록 제작하였다. 또한, 닭의 세포에서 안정적인 발현 유도를 위하여 발현 유전자는 모두 소의 폴리아데닐화 부위 (bovine polyadenylation site)를 추가하여 RNA 전사 후 안정성을 증가시켰다 (도 5 참조).
2.
ERE
(
estrogen
-
responding
element
)
조절인자를
포함하는 발현 벡터의 제조.
고 발현 유도를 위한 조절인자를 추가한 벡터를 제조하기 위하여, 닭의 오브알부민 (chicken ovalbumin) 프로모터에서 과발현 유도에 매우 중요한 에스트로젠 반응 인자 (ERE; estrogen-responding element)를 이용하였다. 최소한의 발현 벡터를 이용한 최대 발현 효과를 얻기 위하여, 과발현에 중요 인자인 ERE를 오브알부민 3.5kb 프로모터에 추가로 클로닝하였다. 특히 ERE 조절인자를 3.5kb 오브알부민 프로모터 앞쪽에 두 개를 삽입함으로써 에스트로젠 촉진 반응을 극대화하였다. 또한 본 발명의 닭 코돈-최적화 EGF 발현 벡터에는 닭의 난관에서의 발현 후, 세포 밖으로 이동시킴으로써 난백 내 축적을 위한 닭 리소자임 신호 서열을 포함하고 있고, 상기 리소자임 신호 펩티드가 잘린 후, 최초의 메티오닌 (ATG)의 역할이 중요하지 않아 이를 제거하였다. 단백질 발현을 위한 출발 코돈은 리소자임 신호 서열의 ATG (methionine)를 사용할 수 있도록 제작하였다. 또한 발현 효율 증가를 위하여 두 개의 종결 코돈 (TAG TAA)을 사용하여 신속한 번역을 유도할 수 있도록 하였다. 발현 벡터 제조를 위하여, 우선 기본 벡터에 역방향으로 CMV-GFP와 SV40-NeoR을 Pac I 제한 효소에 의해 클로닝하여 제조하였으며, 이 후 닭 코돈-최적화된 EGF 유전자 모두 AsiS I/Fse I 제한 효소를 이용하여 정방향으로 클로닝하였다. 따라서 유전자 전이 후, 유전체 내로 최소 필요 유전자 (GFP, NeoR, EGF)만 삽입되도록 구성하였으며 AmpR 등 부수적인 부위는 유전체 내 삽입 과정 중에서 제거되도록 하였다. 상기 EGF의 경우, IRES를 EGF 유전자 사이에 위치시켜 EGF의 발현량 증대 시켰다(도 5 참조).
[
실시예
5] 인간
EGF
발현 벡터의 닭 생식세포 내 전이 및 선발
1.조류 원시생식세포의 배양
닭 원시생식세포 (chicken primordial germ cells, PGCs)는 본 연구팀이 기 확립한 세포주를 사용하여 실험에 이용하였다. 본 실험에 사용한 닭 원시생식세포 주는 계대 배양 100회 이상까지도 정상적인 분열 및 특성을 보유하고 있는 생식세포주로서 다음 세대로의 안정적인 전이도 검증 완료하였다 (박태섭 & 한재용, 2012; p47 내지 67).
2. 생식세포 내 효율적인 유전자 전이 및 선발
상기 4-1의 닭 원시생식세포로의 유전자 전이 방법은 뉴클레오펙션 (Nucleofection) 방법과 리포펙션 (Lipofection) 방법을 수행하였다. Lipofectamine® reagent (invitrogen)을 사용하여 닭 원시생식세포에 실시예 3에서 제조한 발현 벡터를 형질도입하였다. 상기 형질도입 2일 후, GFP 리포터 유전자의 발현수준을 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 뉴클레오펙션 또는 리포펙션으로 본 발명의 벡터를 형질도입시킨 경우, 평균 15-20% 정도의 GFP 발현 효율을 나타냄을 확인하였다. 또한, 특이적으로 뉴클레오펙션을 이용한 형질도입의 경우, 반복적인 유전자 전이에 의해 발현 효율이 증가하는 양상을 확인하였다. 그러나, 뉴로펙션을 이용한 경우, 리포펙션을 이용한 경우와 비교하여, 세포 손상이 크고, 형질도입된 세포가 낮은 생존률을 나타냄을 확인하였다. 따라서, 뉴클레오펙션과 리포펙션을 조합하여 효율적인 유전자 전이 조건을 확립하여 이를 이용하였다.
3.유전체 내로 발현 벡터가 안정적으로 삽입된 생식세포 선별
(1)안정적으로 유전자 전이가 일어난
생식세포주
선별
상기, 4-2의 유전자 전이 후, 형질도입된 세포를 2일동안 배양 후, 300ug/ml 로 G418를 처리하였다. 닭 유래 CEFs 또는 DT40의 경우, 500 ug/ml 내지 1 mg/ml의 G418 농도를 사용하여 유전자 전이 세포를 선별하였고, 발현 벡터가 안정적으로 전이된 닭의 원시생식세포의 선별을 위하여, G418 처리와 동시에 현미경 상에서 GFP가 발현되는 원시생식세포 또는 콜로니를 파이펫으로 조심스럽게 픽킹하여 계대배양을 진행하였다. GFP 유전자가 없는 발현 벡터의 경우, 전적으로 G418에 의존하여 표현형으로 볼 때 건강한 원시생식세포만을 선별하여 계대배양 하였다. 최종적으로 유전자 전이 닭 원시생식세포 선별은 1 내지 1.5개월 정도가 소요되었다. 최종적으로 선별된 닭 원시생식세포는 수용체 배자 주입 전 앞서 확립된 유전체 DNA를 하기의 표 1의 조건으로 PCR 분석을 수행한 후, 실시예 3에서 제조한 벡터를 포함하는 세포주를 제조하였다.
| 유전자 | 크기 (bp) | 어닐링 온도 | 온도 사이클 |
| EGFP-2 | 470 | 63 ℃ | 30초, 30초, 30초/30 사이클 |
| EGFP-2 | 654 | 63 ℃ | 30초, 30초, 30초/ 30 사이클 |
| NEO-2 | 503 | 63 ℃ | 30초, 30초, 30초/ 30 사이클 |
| NEO-2 | 604 | 63 ℃ | 30초, 30초, 30초/30 사이클 |
| EGF | 200 | 63 ℃ | 30초, 30초, 30초/ 30 사이클 |
| coEGF | 547 | 63 ℃ | 30초, 30초, 30초/ 30 사이클 |
(2) 선별된 생식세포주의 특성 분석 및
분화능
검증
상기 실시예 4에서 제조된 발현 벡터로 형질도입된 닭 원시 생식세포 내 전이 및 G418 선별에 의해 선발된 원시 생식세포에 대해서, 유전자 전이 및 선별 과정 중에 다음 세대로 전이가 가능한 생식세포로서의 특성을 유지하고 있는지 확인하였다. 보다 구체적으로, 원시 생식세포로서의 특성 규명은 생식세포-특이적 항체인 항-SSEA1 (stage specific embryonic antigen-1)에 대한 면역염색법 (도 7의 (A))을 수행하였다. 기본적으로 닭 생식세포의 경우, 배 발달 초기에 SSEA1이 특이적으로 발현되며 이를 통한 원시 생식세포의 확인이 가능하기 때문에 G418 선별 후, SSEA1의 발현을 확인하였다. 또한, 정량적 데이터를 구하기 위해 유세포분석법 (flow cytometry)를 이용한 특성 분석을 수행하였다 (도 7의 (B)). 상기 면역염색법 및 유세포 분석법 모두 이차 항체로, PE (Phycoerythrin)-결합된 항체를 사용하였다. 이의 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 생식세포 특이적 유전자가 발현됨을 확인하였다. 또한, 생식세포 특이 항체인 항-SSEA1 및 항-EMA1에 대한 유세포 분석법 결과, G418 선별 이 후, 각각의 항체에 대해 90% 이상 원시생식세포의 특성을 유지하고 있음을 확인하였다.
[
실시예
6]
EGF
를 발현하는
생식세포의 수용체 배자 내 미세 주입 및 생식선 키메라 생산
1. 생식세포의 수용체 배자 내 미세 주입을 위한 조건 확립
실시예 5에서 선별된 닭 원시생식세포를 수용체 배자 (recipient embryo)의 혈관에 미세 주입함으로써 정상적인 성세포로 분화를 유도하기 위하여, 배자 당 3,000 원시생식세포 이상을 주입하는 조건을 확립하였다. 기본적으로 G418 선별 후에도 in vitro 배양을 통해 많은 수의 원시 생식세포를 확보할 수 있었으며, 수용체 배자 내 주입을 위한 완충액 내 원시생식세포의 수를 최대한 증가시킬 수 있는 조건을 확립하였다. 이에 배자당 10,000 원시생식세포 이상의 주입 조건을 확립하였다.
2.
생식세포의 수용체 배자 내
이동능
및 체내
분화능
검증
생식선 키메라 생산 효율을 검증하기 위하여, 검정교배에 앞서 G418로 선별된 원시생식세포의 수용체 배자 내 주입 후 원시생식기 (embryonic gonads)내로 이동 여부를 확인하였다. 앞서 설명한 바와 같이 원시생식세포가 정상적인 성세포 (sperm or egg)로 분화하기 위해서는 기본적으로는 주입 후 원시생식기로의 이동이 가능해야 한다. 따라서, G418에 선별된 원시생식세포 중에서 GFP 형광 단백질이 발현되는 닭 원시생식세포를 수용체 배자에 주입 후 이동 능력을 확인하였다 (도 8 참조). 또한, 배발달 초기 (6일령) 및 발생 후 (21일령)에 주입한 원시생식세포의 분열 및 분화능을 확인하였다 (도 9 참조). GFP 형광 단백질을 발현하는 원시생식세포를 수용체 배자에 주입한 후, 발생한 개체에 대해 생식기를 적출하여 GFP를 발현하는 생식세포의 존재 여부를 확인하였다. 이의 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 배자 내로 주입한 GFP 형광 단백질을 발현하는 원시생식세포의 경우, 많은 수가 성공적으로 원시생식기 내로 이동이 가능함을 확인하였다.
도 9에 나타난 바와 같이, 부화 후 생식기에도 정상적으로 분열 및 분화하고 있음을 확인하였다. 또한, 배 발달 초기의 혈관 내 주입한 닭 원시생식세포는 원시생식기로 이동하여 발생 후까지 정상적으로 분열과 분화 과정을 거치고 있음을 확인하였다.
3. 생식세포의 수용체 배자 내 주입을 통한 실험축 조성
인간의 EGF 생체반응기용 형질전환 개체 생산을 위하여, 실험축 조성 현황은 하기 표 2와 같다.
| 발현벡터 | 생산 수 | |
| GFP 유전자 | GFP53OVcEGF | 30 |
| ERE | ERE53OVcEGF | 25 |
화이트 레그혼 (White Leghorn, WL) 유래 원시생식세포주에 EGF 발현 벡터 (GFP53OVcEGF 및 ERE53OVcEGF)의 전이 및 선발 과정을 거치고, G418에 의해 선별된 원시생식세포를 한국 오골계 수용체 배자 내에 주입하여 기본 실험축을 조성하였다(이하, GFP53OVcEGF와 ERE53OVcEGF 실험축 이라함). GFP53OVcEGF 및 ERE53OVcEGF 실험축을 각각 30수 및 25수를 확보하여 생식선 키메라를 생산을 위한 기초 실험군으로 하였다. 조성된 실험축에 대해서는 수컷 개체에 대하여 정액 성상이 좋은 개체 (GFP53OVcEGF, 3수; ERE53OVcEGF, 2수)에 대하여 검정교배를 통해 주입된 원시생식세포 유래 잡종 병아리를 확인하고 최종적으로 발생된 병아리 중 형질전환 개체 (transgenic chicken)를 검출하였다.
4. 형질전환 개체 생산을 위한 검정 교배 및 형질전환 개체 생산
(1)형질전환 개체 생산을 위한 검정 교배
조성된 기초 실험축에 대한 형질전환 개체 생산을 위해 검정교배를 실시하였다. 검정교배는 기초 실험축 중에서 성성숙에 도달한 수컷 개체 중에 각각의 발현 벡터에 대해 수컷 GFP53OVcEGF (3수)와 ERE53OVcEGF (2수)를 일반축 암컷에 대하여 인공수정을 통하여 다음 자손을 생산하였다. 생식세포는 화이트 레그혼 (WL, I/I)을 사용하였으며, 수용체로는 오골계 (KO, i/i)를 사용하였다. 또한 검정교배에서는 오골계 수용체 수컷 개체와 오골계 일반축을 사용하였다. 따라서 일반적으로 오골계 사이의 교배에서 태어나는 모든 자손은 검정색 오골계 자손 (i/i)이지만 주입한 화이트 레그혼 생식세포로부터 생산된 정자에 의해 수정이 되어 발생한 개체의 경우에는 하얀색 자손 (I/i)이 발생하여 그 표현형으로 일차적인 구분이 가능하게 된다. 이후 화이트 레그혼 생식세포 유래 자손에 대한 게놈 DNA 추출 및 PCR 검증을 통해 최종으로 형질전환 개체를 선별하였다. GFP53OVcEGF의 자손의 경우 GFP 유전자 발현에 의해 쉽게 형질전환 개체가 판별되어 유전자 분석은 진행하지 않았다. ERE53OVcEGF의 자손의 경우, 게놈 DNA 추출 및 PCR 분석을 통해 cEGF 유전자를 검출함으로써 형질전환 개체를 선별하였다. 검정교배를 통해 최종 GFP53OVcEGF 20수 및 ERE53OVcEGF 48수를 기초 실험 계군으로 확보하였다. 전체적인 형질전환 개체의 제조의 개략도를 도 10에 나타내었다.
(2) 형질전환 개체의 확인
ERE53OVcEGF 자손 중에 난백 내 EGF 발현이 높은 개체에 대하여 정확한 유전자 삽입 위치를 파악하기 위하여 DNA Walking 방법으로 검정하였다. 씨젠사의 DNA walking kit를 사용하여 3회에 거친 PCR 후, 특이적인 밴드에 대해 T-벡터 클로닝을 수행하였다. 최종적으로 유전자 삽입 위치를 파악하기 위하여, DNA 서열분석 및 NCBI/UCSC 데이터베이스에 alignment를 수행하여 정확한 위치를 결정하였다. PCR 결과를 도 11에 나타내었고, 유전자가 삽입된 위치를 표 3에 나타내었다.
도 11 및 표 3에 나타난 바와 같이, TG ID#4625와 #4617은 동일한 유전자 좌위 (염색체 21)에 삽입되었음을 확인하였고, TG ID#4767의 경우에는 염색체 6번에 통합되었음을 확인하였다. 두 유전자 좌위 모두 유전자 손상은 확인되지 않았으며, 안정적으로 삽입되었음을 확인하였다.
| Sample. ID | Chromosome | Ref sequence ID |
| #4625 (G1) | 21 | NC_006108 |
| #4617(G1) | 21 | NC_006108.3 |
| #4767(G1) | 6 | NC_006093.3 |
(3) 형질전환 개체의
EGF
발현 확인
생산된 형질전환 자손 개체에 대해 성성숙에 도달한 암컷 개체에 대한 계란 난백 내 발현량을 확인하였다. EGF의 경우, ELISA를 통해 난백 내 발현을 확인하였고, 구체적으로 고마바이오텍의 human EGF ELISA kit (K0331115)및 R&D system의 human EGF ELISA kit (DY236)를 이용하였다. 형질전환 개체의 계란으로부터 난황이 포함되지 않게 난백을 분리한 뒤 상온에서 30분간 천천히 섞어서 난백을 풀어 준 뒤 100ul를 취해서 ELISA 분석을 진행하였다. 이의 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, 개체별로 0 내지 10 ng/ml까지 다양한 발현양상을 관찰할 수 있었다. 모든 개체에서 외래 유전자의 혈액 내 비특이적 발현은 확인되지 않았고, 오브알부민 프로모터가 닭 난관 특이적으로 발현하고 있음을 확인하였다.
(4) 형질전환 개체 난백에서
EGF
의 추출
상기 난백 내 발현이 확인된 개체의 난백을 모아서 50% 암모늄 설페이트((NH4)2SO4)로 2회 침전하여 EGF를 추출하였다. 먼저 난백과 50% 암모늄 설페이트를 1:1 (v/v)로 섞은 뒤 상온에서 30분간 교반하였다. 교반한 난백을 4oC에서 1시간 이상 보관한 뒤 3,000rpm x 30분간 원심분리하여 상등액을 거어즈를 통과시켜서 모았다. 상등액의 부피를 확인한 뒤 다시 50% 암모늄 설페이트를 1:1 (v/v)로 섞은 다음, 상온에서 30분간 교반하였다. 동일하게 4oC에서 1시간 이상 보관한 후, 3,000rpm x 30분간 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 상등액이 제거된 침전물에 PBS를 가해서 30분동안 교반한 후, 3,000rpm x 30분간 원심분리하여 용해되지 않은 침전물을 제거하였다. 상등액을 UF를 이용 농축하여 정량한 뒤 -70oC에서 보관하였다. ELISA로 정량한 결과, EGF의 농도는 60ng/ml 이상으로 확인되었으며 회수율은 50% 이상이었다.
(5)난백 추출
EGF
의 활성 측정
상기 (4)의 방법으로 추출한 EGF 분획과 동일한 방법으로 추출한 일반 난백을 이용 HeLa cell에서 활성을 비교하였다. 활성의 측정은 먼저 96 well plate에 자궁경부암 유래 세포주(HeLa cell)를 웰 당 1 × 104이 되게 접종하였다. 먼저 hEGF에 대한 활성 측정이 가능한 농도 구간을 확인하기 위해 상업용 hEGF (Millipore)를 이용하여 0.01 내지 10 ng/ml까지의 비교 실험을 진행하였다 (도면 13A 참조). 이 후, 추출한 EGF 발현 난백과 일반 난백을 각각 10 ng 또는 동일 단백질량이이 되게 DMEM (no serum)으로 희석하여 첨가하였다. 이때 배양 조건은 37 ℃ (5% CO2, humidified 환경)에서 72시간 배양한 뒤 CCK-8 세포 증식 어세이 키트 (cell proliferation assay kit)로 450nm에서 확인하였다. 이의 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타난 바와 같이, hEGF가 포함된 계란에서 세포수가 증가함을 확인하였다.
<110> SNU R&DB FOUNDATION
Optipharm.CO.,LTD
<120> Transgenic aves expressing codon-optimized human epidermal
growth
factor and method for preparing the same
<130> p-22
<160> 1
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 162
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> It is chicken codon-optimized human epidermal growth factor.
<400> 1
aacagcgata gcgagtgccc actgagccat gatggttatt gcctgcatga tggtgtttgc 60
atgtatatcg aggcactgga taaatatgca tgcaactgcg ttgtgggtta tatcggtgag 120
aggtgccagt atagggatct gaaatggtgg gagctgaggt ag 162
Claims (15)
- 서열번호 1의 염기서열로 표시되는, 조류의 코돈으로 코돈 최적화된 인간의 상피세포 성장인자 유전자.
- 삭제
- 제 1항의 조류의 코돈으로 코돈 최적화된 인간 상피세포 성장인자 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
- 제 3항에 있어서, 상기 발현벡터는,
조류의 코돈으로 최적화된, 두 개의 인간의 상피세포 성장인자 유전자;
상기 유전자가 발현되는 단백질을 난백 내 발현시키는 리소자임 신호 서열;
상기 유전자 사이에 위치하는 IRES (internal ribosome entry site); 및
상기 유전자의 발현을 조절하는 오브 알부민의 프로모터;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 발현 벡터. - 제 4항에 있어서, 상기 발현벡터는 하나 이상의 에스트로젠-반응 인자 (estrogen-responding element)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 발현 벡터.
- 제 4항에 있어서, 상기 발현벡터는 소의 폴리아데닐화 부위 (bovine polyadenylation site)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 발현 벡터.
- 제 4항에 있어서, 상기 발현벡터는 형광단백질을 코딩하는 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 발현 벡터.
- 제 7항에 있어서, 상기 형광단백질을 코딩하는 서열은 소의 폴리아데닐화 부위 (bovine polyadenylation site)와 연결되고, 형광단백질의 발현의 조절을 위한 CMV의 프로모터(cytomegalovirus immediate-early enhancer/promoter)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 발현 벡터.
- 제 7항에 있어서, 상기 형광단백질은 황색 형광단백질, 녹색 형광단백질 및 적색 형광단백질로 이루어진 군 중에서 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 발현 벡터.
- 제 3항 내지 제9항 중 어느 한 항의 발현벡터로 형질도입된 조류의 원시 생식세포.
- 제 10항에 있어서, 상기 조류는 닭, 메추라기, 칠면조, 오리, 거위, 꿩 또는 비둘기인 것을 특징으로 하는 원시 생식세포.
- 1) 제 10항의 원시 생식 세포를 조류의 수용체 배자 (recipient embryo)의 혈관에 주입하는 단계; 및
2) 상기 수용체 배자를 포함하는 난을 배양 및 부화하여 조류 형질전환체를 생산하는 단계;를 포함하는, 조류의 코돈으로 최적화된 인간의 상피세포 성장인자 유전자를 조류의 난관에 특이적으로 발현시키기 위한 키메라 조류의 제조 방법. - 제 12항의 방법에 의하여 제조된, 조류의 코돈으로 최적화된 인간 상피세포 성장인자 유전자를 조류의 난관에 특이적으로 발현시키기 위한 키메라 조류.
- 제 13항의 키메라 조류를 교배하는 단계;를 포함하는, 조류의 코돈으로 최적화된 인간의 상피세포 성장인자 유전자가 난관 특이적으로 발현되는 형질전환 조류 생산 방법.
- 제 14항의 방법으로 제조된, 조류의 코돈으로 코돈 최적화된 인간의 상피세포 성장인자 유전자가 난관 특이적으로 발현되는 형질전환 조류.
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