JPH09512030A - 選択マーカー遺伝子のない dnaベクターを用いる遺伝子治療方法 - Google Patents
選択マーカー遺伝子のない dnaベクターを用いる遺伝子治療方法Info
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Abstract
(57)【要約】
遺伝子治療による哺乳類またはヒトの治療用の医薬を製造するための環状ベクターDNAの使用であって、前記治療においてそのベクターは選択マーカー遺伝子及び、内在性の遺伝子の発現の調節、修正もしくは活性化またはそのベクターDNAにより哺乳類またはヒトの細胞に導入される遺伝子の発現をもたらす、そのベクターについて異種性であるDNA配列を含有し、そのベクターはそのベクター核酸をa)選択圧力下で増幅し、前記選択マーカー遺伝子と前記異種性のDNAが別個のDNA断片上に存在するように切断し、b)前記異種性のDNAを含有するDNA断片または両断片を再環状化してベクターを形成し、c)前記DNA断片を再環状化の前または後に分離し、d)前記異種性のDNAを含有する再環状化されたDNA断片を単離し、そして、e)このようにして得られた再環状化されたDNA断片を前記医薬の製造に用いることを特徴とする。
Description
【発明の詳細な説明】
選択マーカー遺伝子のないDNAベクターを用いる遺伝子治療方法
本発明は遺伝子治療における選択マーカー遺伝子のないベクターDNAの使用並
びに遺伝子治療のための医薬の製造のためのこれらのベクターの使用に関する。
体細胞の遺伝子治療は、たとえば、レトロウイルスベクターもしくは他のウイ
ルスベクターを用いるかまたは非−ウイルス性遺伝子の転移により実施し得る(
復習のために、T.Friedmannの(1)(1989年)、Morganの(2)(1993年)参照)。
遺伝子治療のために適当な配送システムは、たとえば、レトロウイルス(Malli
gan,R.C.の(3)(1991年))、アデノ関連ウイルス(McLughlinの(4)(1988年)、ワ
クシニアウイルス(Moss他の(5)(1987年)、ウシ乳頭腫ウイルス(Rasmussen他の(
6)(1987年)またはヘルペスウイルス群、たとえばエプスタイン・バールウイルス
(Margolskee他の(7)(1988年))もしくは単純ヘルペスウイルスからのウイルスで
ある。
非−ウイルス性配送システムも公知である。「裸の(naked)」核酸、好ましく
はDNAが通常このために、または核酸が補助物質、たとえば、転移試薬〔リポソ
ーム、デンドロマー、ポリリシン−トランスフェリン複合体(Wagner他の(14)(19
90年)、Felgner他の(8)(1987年))〕といっしょに用いられる。
遺伝子治療のために治療的量で用い得る核酸を提供するために、治療的な応用
の前にこれらの核酸を増やす必要がある。これは、核酸上に位置するマーカー遺
伝子及びその遺伝子生成物を利用する、少くとも一つの選択工程を含む。一般的
な選択マーカーはたとえば
アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオ
マイシン及びテトラサイクリンである(Davies他の(9)(1978年))。
いまだに動物実験段階であるか(Alton他の(15)(1993年);国際出願公開第93/
1224号明細書(10);Hyde他の(16)(1993年)、Debs他の(17)(1991年))または既
に患者での臨床実験中である(Nabe1の(18)(1993年)、(19)(1994年))、遺伝子治
療のためのいくつかのプロトコルは既知である。pBR322またはpUC18/19に基づ
くベクターは、通常、微生物選択マーカーとしてアンシピリン耐性遺伝子を担持
する、これらのプロトコルで用いられる。
遺伝子治療で核酸を投与する時、呼吸管及び消化管中に並びに皮膚上に存在す
る微生物は核酸を吸収する。しかしながら、マーカーが活性抗生物質耐性遺伝子
(ABR遺伝子)である時、これは患者に所望しない副作用として抗生物質耐性を
生成するかもしれない。これは特にのう胞性繊維症を遺伝子治療により治療する
時に不都合である。この場合、大量のベクター核酸を、プラスミドDNAとしてま
たはDNA転移試薬としてリポソームを用いるエアゾールとして患者に投与する(Al
ton他の(15)(1993年))。
のう胞性繊維症病にかかった患者は通常、付加的にペニシリンのような抗生物
質の投与により通常治療される、たとえば緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、
黄色ブドウ状球菌(Staphylococcus aureus)、インフルエンザ菌(Haemophilus in
fluenza)の細菌性肺感染症にかかっている。だから、これらの抗生物質に対する
患者の耐性は不都合である。
CFTRプラスミド/リポソーム複合体の手段によるのう胞性繊維症の遺伝子治療
についての以前に記載されたプロトコル及び試験管内または動物実験の刊行物は
、細菌選択マーカーとしてアンピシリン
耐性遺伝子を含有するpUC18/19またはpBR322に基づくベクターを用いる(Alton
他(15)(1993年);国際出願公開第93/1224号明細書(10);Hyde他(16)(1993年)
)。
アンピシリン耐性遺伝子を有するpUCまたはpBRに基づく一般的な大腸菌ベクタ
ー(Nabel他(18)(1993年);Lori他(20)(1994年);Cotten他(21)(1994年);Lew他(
22)(1994年)等)も他の生体内遺伝子治療プロトコル及び裸のDNAまたはDNA/転移
システム複合体を有する、試験管内または動物モデル研究の刊行物で用いられて
いる。
本発明は遺伝子治療による哺乳類またはヒトの治療のための医薬を製造するた
めの環状ベクターDNAに関し、その治療においてそのベクターは選択マーカー遺
伝子及び、内在性の遺伝子の発現の修飾、補正もしくは活性化またはそのベクタ
ーDNAにより哺乳類またはヒトの細胞に導入された遺伝子の発現をもたらす、そ
のベクターについて異種性(heterologous)であるDNA配列を含有し、そのベク
ターはそのベクター核酸を
a)選択圧力下で増幅し、前記選択マーカー遺伝子と前記異種性のDNAが別個のD
NA断片上に存在するように切断し、
b)前記異種性のDNAを含有するDNA断片または両断片を再環状化してベクターを
形成し、
c)前記DNA断片を再環状化の前または後に分離し、
d)前記異種性のDNAを含有する再環状化されたDNA断片を単離し、そして
e)このようにして得られた再環状化されたDNA断片を医薬の製造に用いること
を特徴とする。
段階(a)における切断は好ましくは制限エンドヌクレアーゼ手段により実施
される。この場合、リガーゼを加えることによって再
環状化する(段階b)。切断を再環状化と、部位特異的レコンビナーゼ系(SSR)
を用いる組換えによる1段階で実施することも好ましい。
特異的組換え部位が正しく配置されたら、部位特異的レコンビナーゼ(SSR系)
の使用は、ABR遺伝子を明快な方法で、そのベクターの残存部分(プラスミド複
製開始点及び挿入断片)から分離することを可能にする。この目的のために2つ
の特異的組換え部位をABR遺伝子の上流と下流に取り込まなければならない。SSR
を加えると、組換え部位の間のDNA片を分離する手段によって、SSRは両組換え部
位の間の特異的組換えをもたらす。この方法で、2つの環様の分子が形成され(
1つはABR遺伝子を持ち、1つは挿入断片とプラスミド複製開始点を持つ)、そ
の各々が1つの組換え部位を担う。
環状DNAは線状DNAよりも高効率でトランスフェクトが可能であり(Chen及び岡
山(37)(1987年))、血液中または標的細胞中での半減期がより長い、すなわち、
ヌクレアーゼの作用を受けにくいから、(リガーゼまたはレコンビナーゼによる
)ベクター部分の欠失後、DNAを再度再環状化することが必須である。
このようにして形成された2つの環状分子をクロマトグラフィー法によって、
互いに分離することができる。2つの分子のサイズの相違が大きいほど、分離は
効果がある。得られた環状の治療用のDNAは、ヒト標的細胞中での遺伝子の発現
を保証するために、いまや治療的に活性な遺伝子に加えて必要な調節要素並びに
、技術的な理由のために、大腸菌プラスミド複製開始点(しかしながら、まった
く干渉しない)を含有するだけである。干渉するABR遺伝子は欠失されている。
部位特異的組換えは生体内並びに試験管内で実施し得る。生体内部位特異的組
換えの場合、宿主細胞DNA(またはFエピソーム)に組
込まれたSSR遺伝子は誘発され、遺伝子生成物が形成され、そのSSRは、細胞中に
付加的に存在する治療用のプラスミド上で生体内で特異的組換え反応を行う。細
胞から組換え生成物を単離し、クロマトグラフィー処理工程で分離する。試験管
内で部位特異的組換えを実施するために、精製したSSRを適宜方法により単離さ
れた治療用のプラスミドに加える。組換え完了後、クロマトグラフィー処理工程
により、環状最終生成物を互いに分離する。
主な3つの系はSSRのように利用できる。
1.浴原性ファージのSSR系:
たとえば、バクテリオファージP1のcre/lox系(Sauer及びHenderson(44)(1988
年);Baubonis(46)(1993年))、バクテリオファージλのλint系(Landy他(42)(19
89年))またはバクテリオファージMuのGin系(Klippel他(41)(1993年))。
2.酵母菌のプラスミド2μ及び他の酵母菌株からの類似のプラスミドのSSR
系:
たとえば、ビール酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)からの2μエピソームの
「FLP/FRT」系(Cox他(40)(1983年))、チゴサッカロミセス ロウクシ(Zygosacc
haromyces rouxi)からのエピソームpSR1の「R」SSR系(松崎他(43)(1990年))、
クルイベロミセス ドロソフィラリウム(Kluyveromyces drosophilarium)から
のエピソームpKD1のSSR系(Chen他(38)(1986年))またはクルイベロミセス ワル
チイ(Kluyveromyces waltii)からのエピソームpKW1のSSR系(Chen他(39)(1992
年))。
3.トランスポゾンをコードするインテグラーゼ:
たとえば、トランスポゾンTn3のインテグラーゼ(Stark他(45)(1992年))。
このために、バクテリオファージP1のcre/lox系が特に好ましく用いられる
(N.Sternberg他(34)(1986年);B.Sauer及びN.Henderson(35)(1989年))。この目
的のために、そのベクターは異種性のDNAの5′及び3′末端にloxPを含有する
。組換え(相当する切断及び再環状化)をcre遺伝子生成物レコンビナーゼによ
り実施する。2つの環状プラスミド断片を形成し(異種性DNAの有無)、それら
は、サイズの差が適当なら、たとえば、クロマトグラフィーで分離し得る。その
ベクターは、好ましくは、異種性のDNA成分のサイズと基礎ベクター成分のサイ
ズが1.5倍、好ましくは2倍よりも大で異なるように構成する。環状DNAは線状の
DNA(ヌクレアーゼに感受性が少ない)より高効率で形質転換でき、血液中または
標的細胞中でより長い半減期を有する。
医薬は好ましくはエアゾールとして投与される。
欠失遺伝子を補正し、完全な遺伝子を導入できるか、または正しい遺伝子座で
交換され得る、ベクターDNAが特に好ましく用いられる。本発明の意味の内で、
ベクターDNAは、原核プラスミドに基づく非−ウイルス性DNA分子と解される。こ
のDNA分子は付加的に遺伝子治療方法において転移されるDNA、好ましくは、発現
可能な遺伝子を含有する。
本発明の意味の内で、非−ウイルス性DNAは、DNAは感染性のウイルスの粒子の
成分ではなく、そして完全なウイルス性ゲノムを含有しないことを意味すると解
される。しかしながら、非−ウイルス性DNAはウイルスの配列、たとえば調節配
列(たとえば、プロモーター、エンハンサー)、転写終止、またはウイルス性遺
伝子、たとえば単純ヘルペスTK遺伝子を含有し得る。
このようなベクターDNAはヒトののう胞性繊維症の治療のために特に好ましく
用いられる。これに適切な遺伝子は、たとえば国際出
願公開第91/02796号明細書(11)に記載されている。
これは、遺伝子治療によるのう胞性繊維症の治療のためのベクターの産生及び
使用も記載している。
DNAベクターは、特にそのベクターが直接に哺乳類またはヒトの表面に接触す
る遺伝子治療方法に適切である。上記表面とはたとえば呼吸管及び消化管並びに
皮膚の表面である。
この発明はさらに、内在性のう胞性繊維症遺伝子(CFTR遺伝子、のう胞性繊維
症トランスメンブランコンダクタンス調節遺伝子)の哺乳類細胞内の発現の活性
化、修飾もしくは補正の原因となる、遺伝子もしくは遺伝子断片を含有するか、
または哺乳類細胞がそのベクターDNAでトランスフェクトされた後でこの遺伝子
の発現をもたらすCFTR遺伝子を含有する、300〜500μg(30〜90pmol)の量のプ
ラスミドの環状ベクターDNAの調製に関し、このベクターを、
a)選択圧力下で増幅し、前記選択マーカー遺伝子と前記異種性のDNAが別個のD
NA断片上に存在するように切断し、
b)前記DNA断片を再環状化の前または後に分離し、
c)前記異種性のDNAを含有するDNA断片または両断片を再環状化してベクターを
形成し、
d)前記異種性のDNAを含有する再環状化されたDNA断片を単離し、そして、
e)このようにして得られた再環状化されたDNA断片を医薬を製造することに用
いることを特徴とする。
単離後、このベクターDNA調製物を、凍結乾燥または緩衝液(たとえば、TE緩
衝液)に貯蔵することができる。
本発明に適当な核酸は、たとえばサムブルック(Sambrook)他の(47)(1985年)
に記載された方法により製造し得る。しかしながら、RNA及びタンパク質から、
そのDNAを分離するためにアニオン交
換カラムを用いることも可能である(たとえば、Qiagen plasmid purification K
it)。
重要な用途は遺伝子治療による改良されたのう胞性繊維症の治療法である。の
う胞性繊維症の治療のための既知の方法はたとえば国際出願公開第91/2796号明
細書(11)に記載されている。遺伝子治療に適切なCFTR遺伝子もそこに記載され
ている。
のう胞性繊維症は、2500出産当り1の頻度の過酷な1遺伝子的な常染色体的劣
性遺伝病である。それは、呼吸管、膵臓(粘液腺の分泌産物の増加した産生及び
増加した粘度)、汗腺(汗の中の増加した電解質含有量及び付随する液体及び電
解質の損失)及び生殖腺の機能の異常性(外分泌腺の機能不全)をもたらす上皮
組織膜の欠乏した電解質の輸送を特徴とする。呼吸器官の上皮細胞による気管支
粘液への不十分なクロライドイオンの分泌による呼吸不全がのう胞性繊維症患者
のもっとも頻繁な臨床の兆候及び死因である。責任のある遺伝子をクローン化し
、遺伝子産物を環状アデノシンモノリン酸塩(cAMP)依存性クロライドイオンチ
ャンネルタンパク質(CFTR=のう胞性繊維症トランスメンブラン コンダクタン
ス調節剤)(国際出願公開第91/2796号明細書(11)と特徴づけることができた。
その病気の病理生理学の知識、CFTRの構造及び機能並びにCFTR機能疾患に関連す
る変異は、現在では、非常に効果的ではない伝統的な治療法に加えて実施される
、種々の遺伝子治療のアプローチを可能にする。
二つの方法がのう胞性繊維症の治療のために公表され、現在通用している臨床
プロトコルにおいて以前に用いられていた。最初の方法によると、CFTR遺伝子を
CFTRアデノウイルスベクターの吸入手段により投与する。アデノウイルスは本来
、肺上皮に感染する。最初の臨床的な成功はこの方法により達成されたが、ほん
の数週間とい
う短期間であって所望しない毒性の副作用を伴った(Zabner及びWelsh(23)(1993
年))。第2の方法は、カチオン性リポソームと複合したCFTRプラスミドを吸入手
段によって呼吸管に導入することを含む(Alton他(15)(1993年))。この場合、1
マウス当り約1mgのプラスミドDNAをマウスに投与する。ヒトの場合、プラスミ
ド投与量は1患者当り100μg〜1mg、好ましくは300〜500μgの範囲のプラス
ミドであって、それは、8.2Kbのプラスミドのサイズで約5×1013DNA分子に相当
する(Alton他(15)(1993年));Whitsett他(24)(1992年))。この応用と投与量は本
発明においても好ましい。
肺上皮細胞は導入された量のプラスミドの少量のみを摂取できる。プラスミド
の多くの部分が患者により吐き出されるかまたは飲み込まれること、すなわち、
大量が周囲に(低圧の安全室中の患者)及び患者の胃腸管に達することが予想さ
れる。
種々の細菌属が肺微生物叢に居所を定め、その内のいくつかは、自身をひより
見病原体、たとえば、シュードモナス(Pseudomonads)、ヘモフィルス属(Haemo
philus)、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、ブドウ球菌属(Staphylococci)等で
あることを証明し得る(Balows(12)(1991年))。
のう胞性繊維症の患者では、非常に増加する、呼吸管の領域の粘稠なタンパク
質に富んだ分泌の細菌のコロニー化は、重症の気管支炎及び肺炎の普通の原因で
ある。のう胞性繊維症患者はとりわけインフルエンザ菌、緑膿菌及び黄色ブドウ
球菌による感染にさらされ(Dodge他(25)(1993年)、Fitz Simmons(25)(1993年))
、それがとめどなく抗生物質治療を受けなければならない理由である。
このためのもっとも重要な抗生物質はペニシリン及びその誘導体、たとえばア
ンピシリン(インフルエンザ菌)及びカルベニシリン(緑膿菌、β−ラクタマー
ゼ感受性ペニシリン誘導体、Davis他(
27)(1980年))である。黄色ブドウ球菌の広く普及したペニシリン耐性により、β
−ラクタマーゼ耐性ペニシリン誘導体(メチシリン、オキサシリン、セファロス
ポリン)はこの場合特に重要である。
さらに、他の病原体は肺の感染の場合に、たとえば、細菌性肺炎の原因となる
もっとも普通の病原性作因である、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae=p
neumococci)及び腸内細菌科(たとえば肺炎杆菌、Klebsiella pneumoniae)は特に
重要であり、特に肺炎連鎖球菌の場合、ペニシリンはもっとも重要な治療剤であ
る(Davis他(27)(1980))。
腸内細菌科及び腸球菌(Enterococci)は、とりわけ胃腸管に存在する(Balows
他(12)(1991年)。ペニシリン及びその誘導体もエンテロバクター属、大腸菌、セ
ラチア属(Serratia)及び大便連鎖球菌(Streptococcus faecalis)を原因とす
る腸の感染の治療にも中心的な役割を演じる(Davis他(27)(1980年))。
すでに1944年にエイブリは培地からの肺炎菌による高分子量DNAの取り込みを
記載し、自然適格を示す過程は、細菌の進化に重要な役割を演じ、したがって細
菌界で普及している。生理的な形質転換がヘモフィルス属、連鎖球菌属、ブドウ
球菌属、ナイセリア属、バチルス属及びアシネトバクター属に観察された(Davis
他(27)(1980年))。水平の遺伝子転移が普及しているシュードモナスも培地から
高分子量のDNAを取り込むことができると推測し得る。
ヒトの自然の微生物叢の細菌(呼吸管、胃腸管、皮膚、粘液膜、眼等)は、し
たがってプラスミドDNAを取り込むことができる。取り込まれるDNAは組換えによ
って細胞自身のDNA(染色体、プラスミド)に組み込まれ、したがって、宿主のプ
ロモーターの制御下に至る、すなわち発現される。
のう胞性繊維症患者1人当たり約300〜500μgのプラスミドDN
Aを投与した時(8.2Kbのプラスミドのサイズで約5×1013分子に相当する。Alton
他(15)(1993年))、抗生物質耐性生物体が肺の微生物叢の細菌の内及び体の他の
領域の細菌にも生ずるリスクがある。既に述べたように、抗生物質耐性及び特に
アンピシリン耐性(β−ラクタマーゼ)の生成は、特に以前に用いられた遺伝子
療法がいまだ完全な治癒または持続性の補正を生じていないという理由で、特に
細菌性の肺の感染にかかり、継続して抗生物質で補治療をしなければならない、
のう胞性繊維症患者には特に悲惨である。
さらに、CFTRプラスミドで組み込まれたアンピシリン耐性は、患者のDNAに組
み込まれ、細胞のプロモーターの1つの制御下にそこで発現され、遺伝子産物が
積極的にまたは消極的に分泌される(たとえば炎症反応の場合の細胞溶解)こと
を無視することは不可能である。局部的に放出されたβ−ラクタマーゼは、一般
的な細菌感染の場合にすらペニシリン治療を妨げるだろう。
本発明の選択マーカー遺伝子のないDNAベクターの使用はエイズ(Lori他(20)(1
994年))またはがん患者(Nabel他(18)(1993年))の遺伝子治療による治療にも有益
である。というのは両方の場合に患者は常に臨床的症候群自身により(エイズの
場合)または化学療法剤による治療もしくは放射性治療(がんの場合)により免
疫抑制されているからである。これらの患者の細菌感染を抗生物質治療により、
防ぐことができるか、または抑制することができる。
肺及び呼吸管を別にして、遺伝子治療のアプローチは上述の観点のもとで他の
組織の治療のためにも考慮することができる。
筋肉組織:遺伝子治療用のプラスミドはたとえば生体ワクチン接種のために、
筋肉組織に(Ulmer他(28)(1993年);Davis他(29)(1993年);Lew他(22)(1994年))
または腫瘍に(腫瘍ワクチン接種のための免疫刺激;Nabel他(18)(1993年);San
他(30)(1993年
))直接に注射することができる。治療用のプラスミドは、注射されたプラスミド
DNAが注射導管の周囲に局在化してのみ残存するという理由のために、以前に低
投与量で注射された。全身的な反応を得るためには、治療用のプラスミドのより
大きな投薬または全身的投与を避けることはできない。これは次に血液系中への
プラスミドDNAの分散をもたらすだろう。
血液系:肝臓中の遺伝子治療のために、プラスミドDNA/ポリリシン/肝臓標
的基の複合体を静脈に投与することができる(Chion他(31)(1994年))。これは血
液系中へのプラスミドDNAの分散をもたらす。
両方の場合(筋肉組織、血液系)に、導入されたプラスミドが細菌の病巣に到
達し、これらの細菌によって取り込まれ、感染が起こる時に抗生物質治療を妨げ
ることがあり得る。
腸:結腸がんの遺伝子治療のために、治療用のプラスミドの複合体(たとえば
腫瘍抑制遺伝子との)を腸に直接に導入することができる(Arenas他(32)(1994年
))。たとえば、腸の粘液膜を経由するLDLをコードする遺伝子の遺伝子輸送も検
討中である。導入されたプラスミドは胃腸管の細菌へ抗生物質耐性を転移し得る
。
皮膚:プラスミドDNAはリポソームとの複合体として直接に皮膚細胞に、たと
えば、黒色腫または血友病B(因子IX,X)の遺伝子治療のために取り込ませる
ことができる。こんなふうに、皮膚の微生物叢の細菌が抗生物質耐性を得ること
が考えられる。
眼:眼の持続的なウイルス感染は、眼の微生物叢の細菌に抗生物質耐性を転移
させるリスクを含む、治療用のプラスミドを用いる遺伝子治療によって治療でき
る。
本発明をさらに下記の例、図面及び配列プロトコルによって説明する。実験条
件の詳細な記載はJ.Sambrook(13)(1989年)に包含
されている。
図1はpCMV−CFTRのプラスミドマップを示す。
配列番号1はpCMV−CFTRのDNA配列を示す。
配列番号2〜5はDNAリンカーのDNA配列を示す。
例1プラスミドの取り込み率の測定とヒトの肺及び腸の微生物叢の細菌による抗生物 質耐性の生成
大腸菌プラスミドDNA、たとえばpUC18またはその誘導体が他の属の細菌により
取り込まれ、耐アンピシリンクローンをもたらす、アンピシリン耐性遺伝子が発
現することがあることを示すつもりである。耐アンピシリン微生物の形成の確率
は基質からのプラスミドDNAの取り込み率及び宿主細菌の染色体DNAへの非−相同
組換えによるアンピシリン耐性遺伝子の取り込み率により決定される。代替的な
マーカーまたは終止コドンにより不活性化されたプラスミド(上記参照)はもは
や耐性の開発をもたらさない。
下記の細菌属について実施する。
グラム陰性:
インフルエンザ菌
緑膿菌
肺炎杆菌
大腸菌(WT)
グラム陽性:
黄色ブドウ球菌
肺炎連鎖球菌
このために、種々の量のプラスミドDNAを種々の条件下で上述の生物体の培養
に加えた。
栄養培地中の液体培養を等張緩衝液(NaCl,Mg2+,Ca2+)を用いて実施する。
種々の濃度のプラスミドDNA(たとえばpUC18/apR遺伝子)を培養に加える。振
とうしながら数時間のインキュベーション後、抗生物質を加える。さらにインキ
ュベートし、抗生物質を含有する寒天上に塗布し、抗生物質を含有していない寒
天上で一連の希釈を実施する。インキュベーション後に、得られたコロニーを数
え、同定または特徴づけることにより、生きている生物体の数を測定する。
これについて詳細には、1夜インキュベートされた細菌培養を遠心分離し、ペ
レットをリン酸緩衝化塩類溶液(PBS)で洗浄し、2%の培養(容積)でPBSに再懸
濁し、1ml当り200ngのプラスミドDNAを混合する。一連の希釈液を抗生物質のな
いプレート上にただちに塗布する。懸濁液を37℃でゆっくりと振とうし、種々の
間隔で(1,2及び4時間)、抗生物を含みまたは含まない(アンピシリン100
μg/ml)標準I寒天上に塗布し、37℃でインキュベートする。101〜105希釈液
を抗生物質含有プレート上に塗布し、109〜1010希釈液を選択なしのプレート上
に塗布する。次の日に形質転換された培養を数え、生存可能な微生物の数に関連
させる。
代りに限定された量のプラスミド及び限定された微生物数の細菌を栄養寒天上
に塗布し、数時間インキュベートし、抗生物質を噴霧により加え、得られたコロ
ニーを数えて、同定または特徴づける。
限定された量のプラスミドと限定された微生物数の細菌をナイロンフィルター
に塗布し、そのフィルターを栄養寒天上で数時間インキュベートすることも可能
である。続いて、そのフィルターを抗生物質を含有している栄養寒天上に転移さ
せ、インキュベートし、得られたコロニーを数えて、同定または特徴づける。
例2もはや選択マーカーを持たないpUC18に基づく安全なベクターの構築及び増幅
本方法の主旨は単離された治療用のプラスミドの制限、ベクター部分(+耐性
遺伝子)を含有する小さい断片の分離及び治療的に活性な遺伝子を有する大きい
断片の試験管内(制限エンドヌクレアーゼ+リガーゼ)での数段階の、または、
生体内もしくは試験管内(部位特異的レコンビナーゼ)での1段階の再結合に基
づく。
この方法の可能性をベクターpUC18及び治療上のプラスミドpCMV−CFTRを用い
て示した(Alton他(15))。
pCMV−CFTRのプラスミドマップを図1に示し、DNA配列を配列番号1に示す。プラスミドの構築
1.挿入断片(治療用の遺伝子を含有している)のベクター部分からの分離を
容易にするために、制限切断部位を有するいくつかのリンカーを導入し、ベクタ
ー中に分布させた。例として選ばれたプラスミドpCMV−CFTR中の挿入断片(CMV−
CFTR)を切断しないので、PstI及びPvuIを制限酵素として選んだ。しかしながら
、挿入断片を切断しないという同じ性質を有する他の酵素も使用し得る。さらに
、1よりも多い制限切断部位を有するリンカーも用い得る。この例では2つの制
限切断部位、すなわちPstI及びPvuIを有するリンカーを用いた。
したがって、PvuI+PstIの認識配列を含有する合成のDNAリンカーを一般的な
実験技術を用いて、pUC18中に限定された配列において(AatII及びAflIIIにおけ
る5′PstI−PvuI;AlwNIにおける5′Pvu−PstI)、唯一のAflII,AlwNI及びAatI
I切断部位に取り込ませる。
物理的な分離は別にして、AmpR遺伝子の挿入断片との再結合を防ぐ付加的な安
全策を組み立てるので、この配列はAatII及びAlwNI切断部位にとってとりわけ重
要である。
したがって、二本鎖リンカーはそれらを正しい方向づけでクローン化するため
に、酵素切断部位の各々について相当する張り出しを持たなければならないか、
またはリンカーがブラント末端を経てクローン化されるなら、正しい方向づけを
有するクローンを捜し求めなければならない。
2.pUC18のポリリンカーは、第1にCMV−CFTR遺伝子カセットのクローン化を
容易にするために、第2にベクターと挿入断片(=CMV−CFTR遺伝子カセット)
のきれいな分離を可能とするために、新しく合成されたポリリンカーと交換した
。
合成のDNAポリリンカーは下記配列中に制限切断部位を含有している。
かっこは、そのポリリンカーが対応する酵素のための張り出し(overhang)を
有し、この方向づけで、HindIII及びEcoRIで切断さ
れているpUC18に正しい方向づけで結合し得ることを意味する。
形成されたベクターをpUC−PP_1という。
3.また、XhoI/NotIの2重消化手段によりpCMV−CFTRから切り出されたCMV
−CFTR遺伝子カセットを含有する5.8KbDNA断片をpUC−PP_1のXhoI及びNotI切
断部位の間に正しい方向づけで挿入した(リガーゼの付加)。形成されたベクタ
ーをpCMV−CFTR_PP2という。PvuI+PstIで特定部位を切断すると、次のサイズ
の断片に分解する。
5.8及び0.85,0.55,0.42,0.36,0.34,0.12Kb。耐性のないプラスミドの構築
a)制限エンドヌクレアーゼを用いる切断
pCMV−CFTR_PP2を大腸菌に形質転換させた。大腸菌(pCMV−CFTR_PP2)を
発酵させ、粉砕し、プラスミドDNAをQIAGEN(商標)カラムによって、製造者の仕
様書に従って(QUIAGEN、ドイツ国)、精製した。精製されたプラスミドDNAをPvuI
(10U/μg;20μl容積中に1μg;PvuI製造者の仕様書に従って)で切断し
た。次いでそのDNAをPvuI+PstI(5U/μgPvuI+10U/μgPstI)で再切断
した。その断片をモレキュラーシーブカラムで分離し、大きい方の5.8Kb断片を
この方法で分離した。溶離された5.8Kb断片をT4リガーゼ手段により(製造者
の仕様書に従って)再結合させた。CMV−CFTR遺伝子カセットを含有する、5.8Kb
の再環状化されたDNA(1mlの緩衝液中に1mgのDNA)を再びQIAGENカラム手段に
より精製し、少量の緩衝液トリスHCl/EDTA緩衝液(10mmol/トリスHCl,0.1mmol
/1EDTA,pH=7.0)中に溶解した。
b)切断及び組換えによる再環状化
ba)ABR遺伝子の組換え欠失のためのcre/lox系の生体内使用:
この手順はソーヤー(Sauyer(44)(1988年)によって記載された、loxP部位に隣
接する大きな線状DNA分子に組み込まれて存在した環状プラスミドのcre−レコン
ビナーゼ仲介の放出を経る方法と同様に実施された。しかしながら、これらの方
法では、cre−レコンビナーゼ遺伝子が構成的に発現されて存在している、大腸
菌を用いた。ここに記載された例について、cre−レコンビナーゼ遺伝子は厳格
に調節し得るプロモーターの制御の下に存在しなければならない。
この目的のために、2つの34bp loxP組換え部位を治療用のプラスミドpCMV−C
FTR中に、アンピシリン耐性遺伝子の上流及び下流に組み込んだ。このプラスミ
ドをpCMV−CFTR_2loxPという。得られたプラスミドであるpCMV−CFTR_2loxP
を、厳格に制御し得るT5プロモーター(Bujard他(36)(1987年))の制御下のcre
−レコンビナーゼ遺伝子並びにlaclq−遺伝子(F−エピソーム的にコードされ
ている)を含有する大腸菌XL1−Blue_λimm434nin5_Xi−T5−cre中(Saue
r(44)(1988年)と類似する構築)にクローン化した。
bb)培養及び生体内組換え
大腸菌Xl1−Blue_λimm434nin5_X1−T5−cre(pCMV−CFTR_2loxP)を
100μg/mlのアンピシリンを含有するLB培地で培養した。T5プロモーターを
5mMのIPTGの添加により誘導させ、このようにして、cre−レコンビナーゼ遺伝
子の発現が開始された。
cre−レコンビナーゼはpCMV−CFTR_2loxp中の2つのloxP部位の生体内組換え
を実施した。結果として、プラスミドpCMV−CFTR_loxPを非常に異なったサイズ
の2つの環状プラスミドに転換した。続いて大腸菌を収集し、粉砕し、環状プラ
スミドの混合物を分離した。混合物は未変化pCMV−CFTR_2loxP,loxP部位を含
有している環
状AmpR遺伝子及び所望の最終生成物(治療用の挿入断片+loxP部位+pUC複製開始
点を含有する環状DNA)からなる。続いて、種々のサイズの環状DNA分子をクロマ
トグラフィー法の手段により分離し、所望の最終生成物をクエン酸緩衝液(pH=7
.0)中に溶解した。
cre/lox組換えは両方向に進行し得るから、IPTG誘導後の反応期間または収集
の時を最適化することが重要である。T5プロモーター系はlaclq株中にすら完
全には抑制されずに存在するので、常にcre−レコンビナーゼ遺伝子の低い発現
があり、したがって低レベルの組換えがある。
しかしながら、AmpR遺伝子及び複製開始点の間に2つのloxP部位を位置させる
ことにより、cre−仲介組換えは複製できず、もはやアンピシリン耐性を仲介し
ない構築物の生成のみをもたらすことを保証し得る。それらはアンピシリンの添
加により選択圧の下での複製サイクルの間に急速になくなる。
【手続補正書】
【提出日】1997年4月21日
【補正内容】
明細書第15頁第25行の「Pvu−PstI)、唯一のAf1 II」を『PvuI−PstI
)、唯一のAf1 III』に補正する。
同第17頁第14行の「QUIAGEN」を『QIAGEN』に補正する。
同第18頁第15〜16行の「XL1…cre」及び第19行の「X11…cre」を『XL1−B
lue_λimm434nin 5_X1−T5−cre』に補正する。
同第20頁第5行の「エソロジー(ethiologey)」を『病因学』に補正する。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI
C07H 21/04 9051−4C A61K 37/02 ADA
C12N 15/09 ZNA 9282−4B C12N 15/00 ZNAA
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.遺伝子治療による哺乳類またはヒトの治療用医薬を製造するための環状ベ クターDNAの使用であって、そのベクターDNAは選択マーカー遺伝子及び内在性遺 伝子の発現の調節、修正もしくは活性化または哺乳類もしくはヒトの細胞にその ベクターDNAにより導入された遺伝子の発現をもたらす、そのベクターに異種性 であるDNA配列を含有し、そのベクター核酸を a)選択圧下で増幅し、前記選択マーカー遺伝子及び前記異種性のDNAが別のDNA 断片上に存在するように切断し、 b)前記異種性のDNAを含有するDNA断片または両方の断片を再環状化してベクタ ーを形成させ、 c)前記DNA断片を再環状化の前または後に分離し、 d)前記異種性のDNAを含有する再環状化されたDNA断片を単離し、そして、 e)このようにして得られた再環状化されたDNA断片を医薬を製造するために用 いる、前記使用。 2.請求項1に記載の使用であって、a)段階の切断が制限エンドヌクレアー ゼ手段により達成される、前記使用。 3.請求項1に記載の使用であって、a)段階の切断及び再環状化が部位特異 的組換えにより1段階で実施される、前記使用。 4.請求項1または3に記載の使用であって、その異種性のDNAの3′末端及 び5′末端に各々の場合にloxP部位が続き、段階a)及びb)はレコンビナーゼ Creによって達成される、前記使用。 5.請求項1または3に記載の使用であって、遺伝子治療による治療が呼吸管 中、消化管中または皮膚表面上で実施される、前記使用。 6.請求項5に記載の使用であって、その環状ベクターDNAがのう胞性繊維症 の内在性遺伝子の発現の調節、または活性化をもたらすか、またはのう胞性繊維 症遺伝子をコードする、前記使用。 7.請求項6に記載の使用であって、その医薬が呼吸管中への適用のためのエ アゾールとして製造される、前記使用。 8.30〜90pmolの濃度の環状ベクターDNAの治療用調製物であって、そのベク ターDNAは、哺乳類細胞中の内在性のう胞性繊維症遺伝子の調節、活性化もしく は修正をもたらすか、または哺乳類の細胞中で発現され得るのう胞性繊維症遺伝 子を含有する、そのベクターに異種性のDNA配列を含有し、このベクターDNAは選 択マーカー遺伝子を含まない、前記調製物。
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