HU221118B1 - Synthetic leader peptide sequences - Google Patents

Synthetic leader peptide sequences Download PDF

Info

Publication number
HU221118B1
HU221118B1 HU9603477A HU9603477A HU221118B1 HU 221118 B1 HU221118 B1 HU 221118B1 HU 9603477 A HU9603477 A HU 9603477A HU 9603477 A HU9603477 A HU 9603477A HU 221118 B1 HU221118 B1 HU 221118B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
seq
sequence
ser
expression cassette
leu
Prior art date
Application number
HU9603477A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT76378A (en
HU9603477D0 (en
Inventor
Thomas Borglum Kjeldsen
Knud Vad
Original Assignee
Novo Nordisk As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novo Nordisk As filed Critical Novo Nordisk As
Publication of HU9603477D0 publication Critical patent/HU9603477D0/hu
Publication of HUT76378A publication Critical patent/HUT76378A/hu
Publication of HU221118B1 publication Critical patent/HU221118B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

A jelen találmány tárgya egy új típusú vezérpeptid, amely lehetővéteszi, hogy egy heterológ polipeptid nagy mennyiségben szekretálódjonélesztőben. A találmány tárgya továbbá eljárás egy polipeptidelőállítására élesztőben, amely eljárás abban áll, hogy egy olyanélesztősejtet, amely képes egy polipeptid expresszálására, és amelyetegy, a találmány szerinti élesztő-expressziósvektorraltranszformáltak, amely vektor tartalmaz egy, a találmány szerintivezérpeptid-szekvenciát, megfelelő táptalajban tenyésztik, apolipeptid expressziójának és szekréciójának elérése céljából, majd apolipeptidet kinyerik a táptalajból. ŕ

Description

A találmány tárgyát fehérjék élesztőben való szekretálására alkalmas szintetikus vezérszekvenciák képezik.
Az élesztők számos olyan fehérjét expresszálnak, amelyek intracellulárisan szintetizálódnak, de funkciójuk a sejten kívül van. Az ilyen extracelluláris fehérjéket hívják szekretált fehéijéknek. Ezek a szekretált fehérjék a sejtben először prekurzor vagy prefehérje formájában szintetizálódnak, tartalmaznak egy olyan preszekvenciát, amely biztosítja az expresszált termék hatékony átirányítását az endoplazmatikus retikulum (ER) membránján keresztül. A preszekvencia, amit általában szignálszekvenciának is neveznek, a transzlokáció során általában lehasad a kívánt termékről. Ha egyszer belépett a szekréciós bioszintézisútba, akkor a fehérje a Golgi-készülékbe transzportálódik. A Golgi-készülékből a fehérje különböző útvonalakat követhet, amelyek vezethetnek a sejt különböző kompartmentjeibe, azaz például a sejtvakuólumba vagy a sejtmembránhoz, de a sejten kívülre is irányíthatók, hogy a sejtet körülvevő közegbe szekretálódjanak [Pfeffer, S. R. és Rothman, J. E.: Annu. Rév. Biochem. 65, 829-852 (1987)].
Számos megközelítést javasoltak az élesztő számára heterológ fehérjék expresszálására és szekretálására. A No. 88632 számú publikált európai szabadalmi bejelentésben leírnak egy eljárást, amelynek segítségével az élesztő számára heterológ fehérjék expresszálódnak, processzálódnak és szekretálódnak, oly módon, hogy az élesztősejtet egy olyan expressziós hordozóval transzformálják, amely a kívánt fehérjét és egy szignálpeptidet kódoló DNS-t hordoz, a transzformált sejtből tenyészetet készítenek, szaporítják a tenyészetet és kinyerik a fehérjét a tenyészközegből. A szignálpeptid lehet magának a kívánt fehérjének a szignálpeptidje, lehet egy heterológ szignálpeptid, vagy a természetes és a heterológ szignálpeptid hibridje.
Az élesztő számára idegen szignálpeptidek alkalmazása olyan problémákat eredményezhet, hogy a heterológ szignálpeptid nem biztosítja a hatékony transzlokációt és/vagy a szignálpeptid lehasítását.
A Saccharomyces cerevisiae MFal (a-faktor) 165 aminosavból álló pre-pro formában szintetizálódik, amely tartalmaz egy 19 aminosavból álló szignálvagy prepeptidet, ezt követi egy 64 aminosavból álló „vezér” vagy propeptid, amely közrefog három Nkapcsolt glikozilezési helyet, amit követ a (LysArg((Asp/Glu)Ala)2_3a-faktor)4 szekvencia [Kurjan, J. és Herskovitz, I.: Cell 30, 933-943 (1982)]. A pre-proMFal szignálpeptid részét széles körben alkalmazzák a Saccharomyces cerevisiae-ben heterológ fehérjék szintézisére és szekretálására.
Az élesztőben homológ szignál/vezér peptidek használatát több publikációban is leírták: 4,546,082 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, a 116 201, 123 294, 123 544, 163 529 és 123 289 számú európai szabadalmi bejelentés, valamint a 3614/83 számú DK bejelentés.
Az EP 123 289 számú bejelentésben a Saccharomyces cerevisiae α-faktor prekurzor alkalmazását írják le, míg a WO 84/01153 számú bejelentésben a Saccharomyces cerevisiae invertáz szignálpeptid alkalmazását írják le, a DK 3614/83 számú bejelentésben pedig a Saccharomyces cerevisiae PHO5 szignálpeptid alkalmazását írják le idegen fehérjék szekretálására.
A 4,546,082 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, az EP 16 201, 123 294, 123 544 és 163 529 számú bejelentés olyan eljárásokat ismertet, amelyekkel a Saccharomyces cerevisiae afaktor szignál/vezér szekvenciát (MFal vagy MFa2) alkalmazzák az expresszált heterológ fehérjék szekréciós folyamataiban élesztőben. A Saccharomyces cerevisiae MFal szignál/vezér szekvenciát kódoló DNSszekvenciát fuzionáltatva a kívánt fehérjét kódoló gén 5’ végéhez, a kívánt fehérje szekréciója és processzálása volt kimutatható.
Az EP 206 783 számú szabadalmi bejelentésben leírnak egy rendszert Saccharomyces cerevisiae-bő\ való szekrécióra, egy α-faktorszekvenciát alkalmazva, amit megcsonkítottak, hogy eliminálják a természetes vezérszekvencián levő négy α-faktoregységet, és ezáltal csak a vezérszekvenciát fuzionáltatják egy heterológ polipeptidhez a LysArgGluAlaGluAla α-faktor processzálási helyén keresztül. Erről a konstrukcióról leírják, hogy kisebb (50 aminosavnál kevesebbet tartalmazó) fehérjék hatékony processzálását eredményezi. A nagyobb polipeptidek szekretálásához és processzálásához a természetes a-faktor-vezérszekvenciát megcsonkították, hogy csak egy vagy két a-faktoregység maradjon a vezérpeptid és a polipeptid között.
Számos szekretált fehérje olyan úton halad, hogy érintkezésbe kerüljön a proteolitikus processzálási rendszerrel, amely képes lehasítani a peptidkötést két egymást követő bázikus aminosav C-terminálisán. Ezt az enzimaktivitást a Saccharomyces cerevisiae-ben a KEX 2 gén kódolja [Julius, D. A. és munkatársai: Cell 37, 1075 (1984b)]. A KEX 2 proteáz termékének a processzálására van szükség az aktív Saccharomyces cerevisiae mating faktor al (MFal vagy α-faktor) szekretálásához, míg a KEX 2 nem játszik szerepet az aktív Saccharomyces cerevisiae mating faktor a szekretálásában.
Egy szekretálásra szánt polipeptid szekrécióját és helyes processzálását néhány esetben akkor érjük el, ha egy élesztősejtet tenyésztünk, amelyet egy olyan vektorral transzformáltunk, amelyet az előzőekben ismertetett referenciák alapján állítottunk elő. Számos esetben azonban a szekréció szintje nagyon alacsony, vagy egyáltalán nincs szekréció, vagy pedig a proteolitikus processzálás nem helyes vagy nem teljes. Ennélfogva a jelen találmány tárgyát olyan vezérpeptidek képezik, amelyek a polipeptidek hatékony expresszióját és/vagy processzálását biztosítják.
A feltalálóknak meglepő módon sikerült olyan új típusú vezérpeptidet találniuk, amely lehetővé teszi egy polipeptid magas hozammal való szekrécióját élesztőben.
A jelen találmány tárgya tehát az alábbi szekvenciát tartalmazó DNS-expressziós kazetta:
5’-P-SP-LS-PS-*gén*-(T)j-3’ amelyben
P jelentése promoterszekvencia,
HU 221 118 Β1
SP jelentése egy szignálpeptidet kódoló DNS-szekvencia,
LS jelentése egy (I) általános képletű vezérpeptidet kódoló DNS-szekvencia:
GlnProIle(Asp)/Glu)(Asp/Glu)X1(Glu)/Asp)X2Asn Z(Thr/Ser)X3, (I) amelyben
X* jelentése peptidkötés vagy kódolható aminosav;
X2 jelentése peptidkötés, egy kódolható aminosav vagy egy maximum 4 kódolható aminosavat tartalmazó szekvencia, amely aminosavak lehetnek azonosak vagy eltérőek;
Z jelentése egy kódolható aminosav, Pro kivételével; és
X3 jelentése egy 4-30 kódolható aminosavat tartalmazó szekvencia, amely aminosavak lehetnek azonosak vagy eltérőek;
PS jelentése egy processzálási helyet kódoló DNS-szekvencia;
*gén* jelentése egy polipeptidet kódoló DNS-szekvencia;
T jelentése terminátorszekvencia; és i értéke 0 vagy 1.
Az előző szövegösszefüggésben a „vezérpeptid” szakkifejezés egy olyan pepiidet jelent, amelynek az a funkciója, hogy lehetővé tegye, hogy az expresszált polipeptid az endoplazmatikus retikulumból a Golgi-készülékbe irányuljon, majd ezután egy szekréciós vezikulumba, a táptalajba való szekréció céljából (azaz az expresszált polipeptidnek a sejtfalon át való expressziója, vagy legalább a sejtmembránon át való expressziója a sejt periplazmatikus terébe). A „szintetikus” szakkifejezés a vezérpeptiddel kapcsolatban használva azt jelenti, hogy a vezérpeptid nem található meg a természetben.
A „szignálpeptid” szakkifejezés jelentése egy olyan preszekvencia, amely főleg hidrofób tulajdonságú, és egy élesztőbe expresszálódó extracelluláris fehérje prekurzor formájának N-terminális szekvenciája formájában van jelen. A szignálpeptid funkciója az, hogy lehetővé teszi az expresszált fehérje szekrécióját, és az endoplazmatikus retikulumba való belépését. A szignálpeptid általában lehasad az eljárás során. A szignálpeptid lehet heterológ vagy homológ a fehérjét termelő élesztősejt szempontjából.
A „polipeptid” szakkifejezés jelentése vagy egy heterológ polipeptid, azaz egy olyan polipeptid, amely természetes körülmények között nem termelődik az élesztősejtben, vagy egy homológ polipeptid, azaz egy olyan polipeptid, amely természetes körülmények között is termelődik az élesztőben, vagy ennek bármely pre formája. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a jelen találmány szerinti expressziós kazetta egy heterológ polipeptidet kódol.
A „kódolható aminosav” szakkifejezés jelentése egy olyan aminosav, amit egy nukleotidtriplett („kodon”) kódolhat.
Ha a jelen leírásban az aminosavszekvenciákban két aminosav hárombetűs kódját egy perjel választja el és zárójelbe vannak téve [azaz például (Asp/Glu)], akkor ez azt jelenti, hogy a szekvenciában az adott pozícióban vagy az egyik, vagy a másik aminosav található meg.
A jelen találmány tárgya továbbá eljárás egy polipeptid előállítására élesztőben, amely eljárás abban áll, hogy egy olyan élesztősejtet, amely képes egy polipeptid expresszálására, és amelyet egy, az előzőekben ismertetett élesztő-expressziósvektorral transzformáltunk, amely vektor tartalmaz egy, a találmány szerinti vezérpeptidszekvenciát, megfelelő táptalajban tenyésztünk, a polipeptid expressziójának és szekréciójának elérése céljából, majd a polipeptidet kinyerjük a táptalajból.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.
Az 1. ábrán a pAK492 plazmid sematikus ábrázolása látható.
A 2. ábrán a szignálpeptid/vezér/MI3 inzulin prekurzort kódoló DNS-szekvencia egy része látható.
A 3. ábrán a pAK.456 plazmid készítése látható.
A 4. ábrán a 4. számú szekvenciával leírható vezérszekvencia aminosavszekvenciája, valamint az azt kódoló DNS-szekvencia látható.
Az 5. ábrán a pAK456 Saccharomyces cerevisiae expressziós vektor DNS-szekvenciája látható, amely a YAP3 szignálpeptidet, a 4. számú szekvenciával leírható vezérszekvenciát, valamint az MI3 inzulin prekurzort kódolja, valamint látható az aminosavszekvencia is.
A 6. ábrán a 6. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvencia aminosavszekvenciája, valamint az azt kódoló DNS-szekvencia látható.
A 7. ábrán a 8. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvencia aminosavszekvenciája, valamint az azt kódoló DNS-szekvencia látható.
A 8. ábrán a 17. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvencia aminosavszekvenciája, valamint az azt kódoló DNS-szekvencia látható.
A 9. ábrán a 16. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvencia aminosavszekvenciája, valamint az azt kódoló DNS-szekvencia látható.
A 10. ábrán a 19. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvencia aminosavszekvenciája, valamint az azt kódoló DNS-szekvencia látható.
All. ábrán a 20. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvencia aminosavszekvenciája, valamint az azt kódoló DNS-szekvencia látható.
A 12. ábrán a 21. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvencia aminosavszekvenciája, valamint az azt kódoló DNS-szekvencia látható.
A 13. ábrán a pAK527 DNS-fragmens látható, amelyet a 4. és 6. számú szekvenciának megfelelő szekvenciák készítésénél használunk.
A 14. ábrán a pAK531 DNS-fragmens látható, amelyet a 8. számú szekvenciának megfelelő szekvencia készítésénél használunk.
A 15. ábrán a pAK.555 DNS-fragmens látható, amelyet a 16. és 17. számú szekvenciáknak megfelelő szekvenciák készítésénél használunk.
A 16. ábrán a pAK.559 DNS-fragmens látható, amelyet a 19. és 20. számú szekvenciáknak megfelelő szekvenciák készítésénél használunk.
HU 221 118 Β1
A 17. ábrán a pAK562 DNS-fragmens látható, amelyet a 21. számú szekvenciának megfelelő szekvencia készítésénél használunk.
A 18. ábrán a 27. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvencia, valamint az azt kódoló 66. számú DNS-szekvencia látható.
A 19. ábrán egy N-terminálisán meghosszabbított MI3 inzulin prekurzor 70. számú szekvenciának megfelelő szekvenciája látható, valamint az azt kódoló 71. számú DNS-szekvencia.
A 20. ábrán a 67. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvencia aminosavszekvenciája, valamint az azt kódoló 69. számú DNS-szekvencia látható.
A 21. ábrán a pAK614 72. számú DNS-szekvenciának megfelelő DNS-fragmense látható, amit a 27. számú szekvencia készítésénél használunk közvetlen templátként.
A 22. ábrán a pAK.625 73. számú szekvenciának megfelelő DNS-fragmense látható, amit a 67. számú szekvencia készítésénél közvetlen templátként haszná- 20 lünk.
Ha az (I) általános képletben az X1 jelentése aminosav, akkor az az aminosav előnyösen Ser, Thr vagy Alá. Ha az (I) általános képletben X2 jelentése egy aminosav, akkor az előnyösen Ser, Thr vagy Alá. Ha 25 az (I) általános képletben X2 jelentése két aminosavból álló szekvencia, akkor az előnyösen Serlle. Ha az (I) általános képletben X2 jelentése három aminosavból álló szekvencia, akkor ez előnyösen SerAlalle.
Ha az (I) általános képletben X2 jelentése négy 30 aminosavból álló szekvencia, akkor ez előnyösen SerPheAlaThr. Egy előnyös megvalósítási mód szerint X3 jelentése a (II) általános képletű aminosavszekvencia:
X4-X5-X6 (II), 35 ahol X4 jelentése 1-21 kódolható aminosavból álló szekvencia, amelyben az aminosavak lehetnek azonosak vagy eltérőek, X5 jelentése a Pro, ValAsnLeu vagy a LeuAlaAsnValAlaMetAla szekvenciák közül az
1. számú szekvencia:
GlnProIleAspGluAspAsnAspThrSerValAsnLeuProAla;
2. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspGluAsnThrThrSerValAsnLeuProAla;
3. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuProAla;
4. számú szekvencia:
GlnProIle Asp AspGluAsnThrThrSerV alAsnLeuProV al;
5. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluAsnThrThrSerValAsnLeuProAla;
6. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuProAla
7. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspGluAsnThrThrSerValAsnLeuMetAla;
8. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuProGlyAla;
9. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAla;
10. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnValProThr;
egyik, és X6 7 8 9 10 jelentése 1-8 kódolható aminosavból álló szekvencia, amelyben az aminosavak lehetnek azonosak vagy eltérőek.
A (II) általános képletben X4 jelentése egy olyan aminosavszekvencia, amely egyet tartalmaz az alábbi motívumok közül: LeuValAsnLeu, SerValAsnLeu, MetAlaAsp, ThrGluSer, ArgPheAlaThr vagy ValAlaMetAla; vagy X4 jelentése egy aminosavszekvencia, amelynek összetétele: AsnSerThr vagy AsnThrThr; vagy X4 jelentése aminosavszekvencia, amely az alábbi összetételű lehet: (Ser/Leu)V al AsnLeu, (Ser/Leu)ValAsnLeuMetAlaAsp, (Ser/Leu) V al AsnLeuMet AlaAsp Asp, (Ser/Leu)ValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSer, (Ser/Leu) ValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerlle vagy (Ser/Leu)ValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPhe AlaThr; vagy X4 jelentése aminosavszekvencia, amely az alábbi összetételű lehet:
Asn(Thr/Ser)ThrLeu,
Asn(Thr/Ser)ThrLeuAsnLeu vagy Asn(Thr/Ser)ThrLeuValAsnLeu; vagy ezek bármely kombinációja.
A (II) általános képletben X5 jelentése előnyösen Pro vagy egy aminosavszekvencia, amely az alábbi összetételű lehet: ValAsnLeu, LeuAlaAsnValAlaMetAla, LeuAspValValAsnLeuProGly vagy LeuAspValVal AsnLeuIleSerMet.
Ha a (II) általános képletben X6 jelentése egy aminosav, akkor az előnyösen Alá, Gly, Leu, Thr, Val vagy Ser. Ha a (II) általános képletben X6 jelentése két aminosavból álló szekvencia, akkor az előnyösen GlyAla vagy SerAla. Ha a (II) általános képletben X6 jelentése három aminosavból álló szekvencia, akkor az előnyösen Alá Val Alá. Ha a (II) általános képletben X6 jelentése nyolc aminosavból álló szekvencia, akkor az előnyösen GlyAlaAspSerLysThrValGlu.
Az LS DNS-szekvencia által kódolt előnyös vezérpeptid-szekvenciákra az alábbi példákat adjuk meg:
HU 221 118 Β1
11. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrLeuValAsnValProThr;
12. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuProThr;
13. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrLeuValAsnValProGlyAla;
14. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaProAlaValAla;
15. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAspLeuAlaValGly
LeuProGlyAla;
16. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGlu
SerlleAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla;
17. számú szekvencia:
GlnProlle Asp AspThrGl uSerlleAsnThrThrLeuV al AsnLeuProGlyAla;
18. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla;
19. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGlu
SerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuValAsnLeuProLeu;
20. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGlu
SerlleAsnThrThrLeuValAsnLeuAlaAsnValAlaMetAla;
21. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAlalleAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla;
22. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerPheAlaThrAsnThrThrLeuValAsnLeuPro
GlyAla;
23. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerlleAsnThrThrLeuValAsnLeuMetAlaAspAspThr GluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuValAsnLeuPro Leu;
24. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerlleAsnThrThrLeuValAsnLeuMetAlaAspAspThr
GluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAspValValAsnLeuGlyAla;
25. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerPheAlaAlalleAsnThrThrLeuValAsnLeuProGly
Alá;
26. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGlu SerArgPheAlaThrAsnThrThrLeúV al AsnLeuAlaAsnV alAlaMet Alá;
27. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGlu
SerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAspValValAsnLeuIleSerMetAla;
28. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAsnThrThrGlu SerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAspValValAsnLeuIleSerMetAla; és
29. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGlu
SerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAlaLeuAspValValAsnLeuIleSerMetAlaLys
Arg.
Az LS DNS-szekvenciák által kódolt, különösen előnyös vezérpeptidek az alábbiak :
15. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAspLeuAlaValGly
LeuProGlyAla;
16. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGlu
SerlleAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla;
17. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerlleAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla;
HU 221 118 Β1
18. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla;
19. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGlu
SerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuValAsnLeuProLeu;
20. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGlu
SerlleAsnThrThrLeuValAsnLeuAlaAsnValAlaMetAla;
21. számú szekvencia :
GlnProIleAspAspThrGluSerAlalleAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla;
22. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerPheAlaThrAsnThrThrLeuValAsnLeuPro
GlyAla;
23. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerlleAsnThrTheLeuValAsnLeuMetAlaAspAspThr GluSer ArgPhe AlaThr AsnThrThrLeuV al AsnLeuProLeu;
24. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerlleAsnThrTheLeuValAsnLeuMetAlaAspAspThr
GluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAspValValAsnLeuGlyAla;
25. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerPheAlaAlalleAsnThrThrLeuValAsnLeuProGly
Alá;
26. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGlu
SerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuValAsnLeuAlaAsnValAlaMetAla;
28. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAsnThrThrGlu Ser ArgPhe AlaThr AsnThrThrLeuAsp V al V al AsnLeuIleSerMet Alá; és 67. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGlu
SerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAlaLeuAspValValAsnLeuIleSerMetAlaLys
Arg.
A szignálszekvencia (SP) kódolhat bármilyen szignálpeptidet, amely biztosítja az expresszált polipeptid hatékony irányítását a sejt szekréciós bioszintézis útjára. A szignálpeptid lehet természetes szignálpeptid, vagy annak funkcionális része, vagy lehet szintetikus peptid. Megfelelő szignálpeptidnek találták az a-faktor szignálpeptidjét, az egémyálmirigyek amilázát, egy módosított karboxipeptidáz szignálpeptidet, az élesztő BARI szignálpeptidjét, vagy a Humicola lanuginosa lipáz szignálpeptidjét, vagy ezek származékát. Az egérnyálmirigy amiláz szignálszekvenciáját Hagenbüchle és munkatársai írták le [Hagenbüchle, O. és munkatársai: Natúré 289, 643-646 (1981)]. A karboxipeptidáz szignálszekvenciáját Valis és munkatársai közölték [Valis, L. A. és munkatársai: Cell 48, 887-897 (1987)]. A BARI szignálpeptidet a WO 87/0260 szabadalmi bejelentésben írták le. Az élesztő aszparagin proteáz 3 szignálpeptidjét a 0828/93 számú dán szabadalmi bejelentésben írták le.
A PS DNS-szekvencia által kódolt élesztő-processzálásihely lehet alkalmas módon Lys és Arg bármelyik párosított kombinációja, azaz például LysArg, ArgLys, ArgArg vagy LysLys, ami lehetővé teszi, hogy a polipeptidet a Saccharomyces cerevisiae KEX2 proteáza processzálja, illetve az egyéb élesztőfajokban jelen levő ekvivalens proteázok processzálják [Julius, D. A. és munkatársai: Cell 37, 1075 (1984)]. Ha a
K.EX2 processzálás nem felel meg, azaz például a polipeptidtermék hasítását eredményezi például egymást követő bázikus aminosav jelenléte miatt a kívánt termék belsejében, akkor egy másik proteáznak megfelelő processzálási helyet lehet választani, ami egy olyan aminosavkombinációt tartalmaz, ami nem található meg a polipeptidtermékben, azaz például az FXa processzálási helye, az IleGluGlyArg [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)].
A találmány szerinti módszerrel előállított fehérje lehet bármilyen fehérje, amely előnyösen élesztőben állítható elő. Ilyen fehérjék lehetnek például heterológ fehérjék, azaz például az aprotinin, a szöveti faktor bioszintézis inhibitor, vagy egyéb proteázinhibitorok, inzulin vagy inzulinprekurzorok, humán- vagy szarvasmarhanövekedési hormon, interleukin, glukagon, GLP-1, IGF-I, IGF-II, szöveti plazminogén aktivátor, a és β transzformáló növekedési faktor, vérlemezke-eredetű növekedési faktor, enzimek vagy azok funkcionális analógjai. A jelen találmány szövegösszefüggésében a „funkcionális analóg” szakkifejezés jelentése egy olyan fehérje, amelynek hasonlóak a funkciói, mint a természetes fehérjének (ezt úgy kell érteni, hogy inkább hasonlít a természetes formához, mint a természetes fehérje biológiai aktivitási szintjéhez). A fehérje szerkezetileg lehet hasonló a természetes fehérjéhez, és a természetes fehérjéből egy
HU 221 118 Β1 vagy több aminosavnak vagy a C-terminális vagy az Nterminális végéhez, vagy mindkettőhöz való hozzáadásából, egy vagy több aminosavnak a természetes aminosavszekvencia egy vagy több pontján való helyettesítéséből, egy vagy több aminosavnak vagy az egyik, vagy mindkét végről való deléciójából, vagy az aminosavszekvenciában egy vagy több ponton való deléciójából, vagy egy vagy több aminosavnak a természetes aminosavszekvencia egy vagy több pontjában való beszúrásából származhat. Ezek a módosítások jól ismertek számos, az előzőekben ismertetett fehérjénél. Emellett egyéb fehérjék prekurzoijait vagy intermedieijeit is elő lehet állítani a jelen találmány szerinti módszerrel. Egy ilyen prekurzor lehet például az MI3 inzulin prekurzor, amely tartalmazza a B(l-29)AlaAlaLysA(l-21) aminosavszekvenciát, amelyben A(l—21) jelentése a humáninzulin A lánca, B(1 29) jelentése a humáninzulin B lánca, amelyből hiányzik a Thr(B30).
A vektorszekvenciákat kódoló előnyös DNS-konstrukciókat a 4-12. ábrán mutatjuk be, illetve előnyösek lehetnek ezek megfelelő módosításai is. A DNS-szekvenciák megfelelő módosítása például az olyan nukleotidhelyettesítések, amelyek nem eredményezik a fehérje aminosavszekvenciájának megváltozását, de amelyek megfelelnek azon élesztősejt kodonhasznosításának, amelybe a DNS-konstrukciót bejuttatjuk, vagy az olyan nukleotidhelyettesítések, amelyek más aminosavszekvenciát eredményeznek, és ennek következtében feltehetőleg egy másik fehérjeszerkezetet eredményeznek. Egyéb lehetséges módosítás egy vagy több kodonnak a szekvencia bármelyik végéhez való hozzáadása, és egy vagy több kodonnak a lehasítása akármelyik végről, vagy kihasítása a szekvenciából.
Az 5’-P-SP-LS-PS-*gén*-(T)j-3’ expressziós kazettát, amelyben P, SP, LS, *gén*, T és i jelentése ugyanaz, mint amit az előzőkben meghatároztunk, hordozó rekombináns expressziós vektor lehet bármely vektor, amely képes élesztőben replikációra. A promoter lehet bármely olyan DNS-szekvencia, amely transzkripciós aktivitást mutat élesztőben, és az élesztőben homológ vagy heterológ fehérjéket kódoló génekből származhat. A promoter előnyösen egy, az élesztőben homológ fehérjéből származik. Megfelelő promoter lehet például a Saccharomyces cerevisiae MFal, TPI, ADH vagy PGK promotere.
Az előzőkben ismertetett szekvenciáknak emellett előnyösen működés szempontjából egy megfelelő terminátorhoz kell kapcsolódniuk, azaz például a TPI terminátorhoz [Alber, T. és Kawasaki, G.: J. Mól. Appl. Génét. 1 419-434 (1982)].
A jelen találmány szerinti rekombináns expressziós vektor tartalmaz egy olyan DNS-szekvenciát, amely lehetővé teszi, hogy a vektor replikálódjon élesztőben. Ilyen szekvencia lehet például az élesztő 2 pm-os plazmidjának REP 1-3 replikációs génje és replikációs origója. A vektor tartalmazhat emellett egy szelektálható markert, azaz például a Schizoaccharomyces pombe TPI génjét [Russell, P. R.: Gene 40, 125-130 (1985)].
Az 5’-P-SP-LS-PS-*gén*-(T)j-3’ szekvencia ligálására használt módszerek, valamint olyan megfelelő élesztővektorokba való beépítése, amelyek tartalmazzák az élesztő replikációjához szükséges információt, jól ismertek a szakterületen jártas szakember számára [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)]. Az nyilvánvaló, hogy a vektor vagy úgy állítható elő, hogy először egy olyan DNS-konstrukciót készítünk, amely a teljes 5’-P-SP-LS-PS-*gén*-(T)j-3’ szekvenciát tartalmazza, majd ezt a fragmenst beépítjük egy megfelelő expressziós vektorba, vagy pedig úgy, hogy egymás után építjük be a DNS-fragmenseket az egyes elemek (azaz például promoter szekvencia, a szignálpeptid, a GlnProIle (Asp/Glu)(Asp/Glu)X'(Glu/Asp)X2AsnZ (Thr/Ser)X3 vezérszekvencia, a processzálási pont, a polipeptid, és ha jelen van, akkor a terminátorszekvencia) genetikai információját tartalmazó alkalmas vektorba, ligálást követően.
A jelen találmány szerinti élesztő lehet bármelyik alkalmas élesztő, amely tenyésztése során nagy mennyiséget termel a kívánt polipeptidből. Megfelelő élesztő lehet például a Saccharomyces cerevisiae, a Saccharomyces kluyveri, a Schizoaccharomyces pombe vagy a Saccharomyces uvarum faj egy törzse. Az élesztősejtek transzformációját végezhetjük például protoplasztképzéssel majd azt követő, önmagában ismert transzformációval. A sejtek tenyésztésére használt táptalaj lehet bármelyik, az élesztősejtek szaporítására alkalmas szokványos táptalaj. A szekretált polipeptidet, amelynek jelentős része a táptalajban megfelelően processzált formában lehet jelen, szokványos módszerekkel nyerhetjük ki a táptalajból, beleértve az élesztősejtek centrifugálással vagy szűréssel való elválasztását a táptalajtól, a fehérjeszerű anyagok kicsapását a felülúszóból vagy a szűrletből valamilyen só segítségével, azaz például ammónium-szulfáttal, majd ezt követi a tisztítás különböző kromatográfiás eljárásokkal, azaz például ioncserés kromatográfiával, affinitáskromatográfiával vagy hasonlókkal.
A jelen találmányt tovább ismertetjük az alábbi példákban, amelyeknek nem az a céljuk, hogy a találmány oltalmi körét korlátozzák.
Példák
Plazmidok és DNS-ek
Mindegyik plazmid C-POT típusú. Ezeket a plazmidokat a 171 142 számú EP szabadalmi bejelentésben írták le, és azzal jellemezhetők, hogy a Schizoaccharomyces pombe triózfoszfát-izomeráz (POT)-génjét tartalmazzák, a plazmid szelektálhatósága és stabilitása érdekében. Egy, a POT-gént tartalmazó plazmid elérhető egy letétbe helyezett Escherichia coli törzsben (ATCC 39685). A plazmidok emellett tartalmazzák a Saccharomyces cerevisiae triózfoszfát-izomeráz promotert és terminátort (ΡΨΡ! és TTPI). Ezek azonosak a pMT742-vel [Egel-Mitani, M. és munkatársai: Gene 73, 113-120 (1988)] (lásd 1. ábra), azzal az eltéréssel, hogy az EcoRI-Xbal restrikciós hasítási hely által meghatározott régió lefedi a szignál/vezér/termék kódoló régiót.
A pAK527, pAK531, pAK555, pAK559, pAK562, pAK614 és pAK625 plazmidokat alkalmazzuk DNS7
HU 221 118 Β1 templátként a PCR-reakciókban, amiket a példákban említett vezérszekvenciák készítésekor használunk. A közvetlen templátként szolgáló szintetikus DNS-fragmenseket a 13-17. ábrákon mutatjuk be. A bemutatott DNS-régiók kivételével a plazmidok azonosak az 1. ábrán bemutatott pAK492-vel.
A szintetikus DNS-fragmenseket automatizált DNS-szintetizátorokkal szintetizáljuk (Applied Biosystems, 38OA modell), foszforamidit-kémiát és kereskedelmi forgalomban levő reagenseket alkalmazva [Beaucage, S. L. és Caruthers, Μ. H.: Tetrahedron Lettére 22, 1859-1869(1981)].
Az összes többi anyag és módszer ismert a szakterületen [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)].
1. példa
Az M13 inzulin prekurzor Saccharomyces cerevi.szae-ben (yAK.546 törzs) való expressziójához használható, a 4. számú szekvenciavázlatban ismertetett vezérszekvencia szintézise
A 4. számú szekvenciavázlatban ismertetett vezérszekvencia aminosavszekvenciája az alábbi: GlnProlleAspAspGluAsnThrThrSerValAsnLeuProVal.
Az alábbi oligonukleotidokat szintetizáljuk:
#94 5’-TAAATCTATAACTACAAAAAACAC
ATA-3’:
29. számú szekvencia #333 5’-GACTCTCTTAACTGGCAAGTTGA CA-3’
30. számú szekvencia #312 5’-AAGTACAAAGCTTCAACCAAGTGA GAACCA
C AC AAGTGTTGGTTAACGAATCTCTT - 3 ’
31. számú szekvencia #1845 5’-CATACACAATATAAACGACGG-3’
32. számú szekvencia.
Az alábbi polimeráz láncreakciókat (PCR) hajtottuk végre a Gene Amp PCR-reagens-kit alkalmazásával (Perkin Elmer, 761 Main Avewalk, CT 06589, USA), a gyártó előírásai szerint. A reakciókban a PCR-elegyeket 100 μΐ ásványolajjal borítjuk (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO):
1. számú polimeráz láncreakció 5 μΐ #94 oligonukleotid (50 pmol) μΐ #333 oligonukleotid (50 pmol) μΐ 10X PCR puffer 16 μΐ dNTP keverék 0,5 μΐ Taq enzim
0,5 μΐ pAK.527 plazmid (13. ábra) templátként (0,2 pg
DNS) μΐ víz.
Összesen 12 ciklust hajtunk végre, egy ciklus a következő: 94 °C 1 perc; 37 °C 2 perc; 72 °C 3 perc. A PCR-elegyet azután 2%-os agarózgélre visszük, és az elektroforézist standardtechnikák alkalmazásával hajtjuk végre [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Press,
Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)]. A kapott DNS-fragmenst kivágjuk az agarózgélből, és a Gene Clean-kit alkalmazásával (Bio 101 Inc. PO BOX 2284, La Jolla, CA 92038, USA) izoláljuk, a gyártó előírásai szerint.
2. számú polimeráz láncreakció 5 μΐ #312 oligonukleotid (50 pmol) μΐ #94 oligonukleotid (50 pmol) μΐ 10X PCR puffer μΐ dNTP keverék 0,5 μΐ Taq enzim μΐ tisztított DNS-fragmens az 1. számú polimeráz láncreakcióból
53,5 μΐ víz.
Összesen 12 ciklust hajtunk végre. Egy ciklus az alábbi: 94 °C 1 perc; 37 °C 2 perc; 72 °C 3 perc.
A 2. számú polimeráz láncreakcióból származó
DNS-fragmenst a Gene Clean-kit alkalmazásával (Bio 101 Inc. PO BOX 2284, La Jolla, CA 92038, USA) izoláljuk és tisztítjuk, a gyártó előírásai szerint.
A tisztított PCR-DNS-fragmenst 10 μΐ vízben oldjuk, majd restrikciósendonukleáz-puffert adunk hozzá, utána pedig Asp718, valamint HindlII restrikciós endonukleázokkal hasítjuk 15 μΐ össztérfogatban, standardtechnikákat alkalmazva [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)]. A 167 bázispár méretű Asp718/Hindlll DNS-fragmenst agarózgélen elektroforézisnek vetjük alá, majd az előzőkben ismertetett módon a Gene Clean-kittel tisztítjuk. A Saccharomyces cerevisiae pAK.492 expressziós plazmid (lásd 1. ábra) egy származéka az előzőkben ismertetett pMT742 plazmidnak, amelyben a szignál/vezér/inzulin prekurzor komplexet kódoló fragmenst a
2. ábrán látható EcoRI-Xbal fragmenssel helyettesítjük. Ezt a fragmenst egy Applied Biosystems DNS-szintetizátorral állítjuk elő, a gyártó előírásai szerint. A pAK492 plazmidot Asp718 és Xbal restrikciós enzimmel hasítjuk, majd a 10896 bázispár méretű vektorfragmenst izoláljuk. A pAK492 plazmidot HindlII és Xbal restrikciós enzimekkel hasítjuk, majd izoláljuk a 140 bázispár méretű DNS-fragmenst, amely az MI3 inzulin prekurzor egy részét kódolja. A három DNS-fragmenst T4 DNS-ligázzal Egáljuk, standard körülmények között [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)]. A ligálóelegyet azután kompetens Escherichia coli (R~, M+) törzsbe transzformáljuk, és a transzformánsokat az ampicillinrezisztencia alapján azonosítjuk. A kapott Escherichia colitelepekből plazmidokat izolálunk, standard minipreptechnika alkalmazásával [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)], ellenőrizzük őket a megfelelő restrikciós endonukleázokkal, azaz EcoRI, Xbal, Ncol és HindlII enzimekkel. A kiválasztott pAK.546 jelű plazmidot DNS-szekvenálással ellenőrizzük (Sequenase, U. S. Biochemical Corp.), a #94-es prímért alkalmazva, hogy tartalmazza-e a 4. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvenciát. A 4.
HU 221 118 Β1 számú szekvenciának megfelelő vezérszekvencia DNSszekvenciáját a 4. ábrán mutatjuk be. A pAK.546 plazmidot Saccharomyces cerevisiae MT663 törzsbe transzformáljuk, a 214 826 számú európai szabadalmi publikáció alapján, majd a kapott törzsnek az yAK.546 jelzést adjuk. Az expressziós plazmid DNS-szekvenciáját az 5. ábrán adjuk meg.
2. példa
Az MI3 inzulin prekurzor Saccharomyces cerevisiae-ben (yAK.531 törzs) való expressziójához használható, a 6. számú szekvenciavázlatban ismertetett vezérszekvencia szintézise.
A 6. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvencia aminosavszekvenciája az alábbi: GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeu ProAla.
A következő oligonukleotidot szintetizáljuk meg: #331 5 ’ -GAATCTCTTAGCTGGCAAGTTGACAG AAGTAGT
GTTAGTTTCAGAGTCGTCAATT-3’ 33. számú szekvencia
A polimeráz láncreakciót az 1. példában leírtak alapján hajtjuk végre, azzal az eltéréssel, hogy a #331 számú oligonukleotidot használjuk a #333-as oligonukleotid helyett.
A 168 bázispár méretű Asp718/HindIII DNS-fragmenst agarózgélen végzett gélelektroforézisnek vetjük alá, majd az 1. példában leírtak alapján tisztítjuk. Az Asp718/HindIII DNS-fragmenst Saccharomyces cerevisiae expressziós plazmidba szubklónozzuk, az 1. példában leírtak alapján. A kiválasztott pAK531 jelű plazmádról DNS-szekvenálással kimutatjuk, az 1. példában leírtak alapján, hogy a 6. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvenciát tartalmazza. A 6. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvenciát kódoló DNSszekvenciát a 6. ábrán mutatjuk be. A pAK531 jelű plazmidot Saccharomyces cerevisiae MT663 törzsbe transzformáljuk, a 86306721.1 számú európai szabadalmi bejelentésben leírtak alapján, és a kapott törzsnek a yAK531 jelzést adjuk. A szignálpeptidet és az MI3 inzulin prekurzort kódoló DNS-szekvenciák azonosak azzal, amit az 5. ábrán bemutattunk.
3. példa
Az MI3 inzulin prekurzor Saccharomyces cerevi.óűc-ben (yAK.547 törzs) való expressziójához használható, a 8. számú szekvenciavázlatban ismertetett vezérszekvencia szintézise.
A 8. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvencia aminosavszekvenciája az alábbi: GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeu ProGlyAla,
Az alábbi oligonukleotidot szintetizáljuk meg:
#345 5 ’ -AACGAATCTCTTAGCACCTGGCAAGTT GACAGAAGT-3’
34. számú szekvencia.
A polimeráz láncreakciót az 1. példában leírtak alapján hajtjuk végre, azzal az eltéréssel, hogy a #333-as oligonukleotid helyett a #345-ös oligonukleotidot használjuk, és templátként a pAK.351 plazmidot (14. ábra) használjuk.
A 171 bázispár méretű Asp718/HindIII DNS-fragmenst agarózgélen végzett gélelektroforézisnek vetjük alá, majd az 1. példában leírtak alapján tisztítjuk. Az Asp718/HindIII DNS-fragmenst Saccharomyces cerevisiae expressziós plazmidba szubklónozzuk, az 1. példában leírtak alapján. A kiválasztott pAK547 jelű plazmidról DNS-szekvenálással kimutatjuk, az 1. példában leírtak alapján, hogy a 8. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvenciát tartalmazza. A 8. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvenciát kódoló DNS-szekvenciát a 7. ábrán mutatjuk be. A pAK.547 jelű plazmidot Saccharomyces cerevisiae MT663 törzsbe transzformáljuk, a 86306721.1 számú európai szabadalmi bejelentésben leírtak alapján, és a kapott törzsnek a yAK.547 jelzést adjuk. A szignálpeptidet és az MI3 inzulin prekurzort kódoló DNS-szekvenciák azonosak azzal, amit az 5. ábrán bemutattunk.
4. példa
Az MI3 inzulin prekurzor Saccharomyces cerevisiae-ben (yAK.561 törzs) való expressziójához használható, a 17. számú szekvenciavázlatban ismertetett vezérszekvencia szintézise
A 17. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvencia aminosavszekvenciája az alábbi: GlnProIleAspAspThrGluSerlleAsnThrThrLeuValAsn LeuProGlyAla
Az alábbi oligonukleotidot szintetizáljuk meg:
#376 5 ’ - AACGAATCTCTTAGCACCTGGCAAGTT GACCAAAGT
AGTGTTGATAGATTCAGTGTCGTC-3’ 35. számú szekvencia
A polimeráz láncreakciót az 1. példában leírtak alapján hajtjuk végre, azzal az eltéréssel, hogy a #333-as oligonukleotid helyett a #376-os oligonukleotidot használjuk, és templátként a pAK555 plazmidot (15. ábra) használjuk.
A 180 bázispár méretű Asp718/HindIII DNS-fragmenst agarózgélen végzett gélelektroforézisnek vetjük alá, majd az 1. példában leírtak alapján tisztítjuk. Az Asp718/HindIII DNS-fragmenst Saccharomyces cerevisiae expressziós plazmidba szubklónozzuk, az 1. példában leírtak alapján. A kiválasztott pAK.561 jelű plazmidról DNS-szekvenálással kimutatjuk, az 1. példában leírtak alapján, hogy a 17. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvenciát tartalmazza. A 17. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvenciát kódoló DNSszekvenciát a 8. ábrán mutatjuk be. A pAK561 jelű plazmidot Saccharomyces cerevisiae MT663 törzsbe transzformáljuk, a 86306721.1 számú európai szabadalmi bejelentésben leírtak alapján, és a kapott törzsnek a yAK561 jelzést adjuk. A szignálpeptidet és az MI3 inzulin prekurzort kódoló DNS-szekvenciák azonosak azzal, amit az 5. ábrán bemutattunk.
5. példa
Az MI3 inzulin prekurzor Saccharomyces cerevisiae-ben (yAK559 törzs) való expressziójához használ9
HU 221 118 Bl ható, a 16. számú szekvenciavázlatban ismertetett vezérszekvencia szintézise
A 16. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvencia aminosavszekvenciája az alábbi: GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeu MetAlaAspAspThrGlu
SerlleAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla
Az alábbi oligonukleotidot szintetizáljuk meg:
#375 5’-AACGAATCTCTTAGCACCTGGCAAGTT AACCAAAGTAGTGTTGATAGAT
TCAGTGTCGTCAGCCATCAAGTTGAC-3’ 36. számú szekvencia
A polimeráz láncreakciót az 1. példában leírtak alapján hajtjuk végre, azzal az eltéréssel, hogy a #333-as oligonukleotid helyett a #375-ös oligonukleotidot használjuk, és templátként a pAK555 plazmidot (15. ábra) használjuk.
A 222 bázispár méretű Asp718/HindIII DNS-fragmenst agarózgélen végzett gélelektroforézisnek vetjük alá, majd az 1. példában leírtak alapján tisztítjuk. Az Asp718/HindIII DNS-fragmenst Saccharomyces cerevisiae expressziós plazmidba szubklónozzuk, az 1. példában leírtak alapján. A kiválasztott pAK.559 jelű plazmidról DNS-szekvenálással kimutatjuk, az 1. példában leírtak alapján, hogy a 16. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvenciát tartalmazza. A 16. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvenciát kódoló DNSszekvenciát a 9. ábrán mutatjuk be. A pAK559 jelű plazmidot Saccharomyces cerevisiae MT663 törzsbe transzformáljuk, a 86306721.1 számú európai szabadalmi bejelentésben leírtak alapján, és a kapott törzsnek a yAK559 jelzést adjuk. A szignálpeptidet és az MI3 inzulin prekurzort kódoló DNS-szekvenciák azonosak azzal, amit az 5. ábrán bemutattunk.
6. példa
Az MI3 inzulin prekurzor Saccharomyces cerevisiae-ben (yAK580 törzs) való expressziójához használható, a 19. számú szekvenciavázlatban ismertetett vezérszekvencia szintézise
A 19. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvencia aminosavszekvenciája az alábbi: GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeu MetAlaAspAspThrGlu
SerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuValAsnLeuProLeu
Az alábbi oligonukleotidot szintetizáljuk meg:
#384 5 ’ - AACG AATCTCTTC AATGGC AAGTT AA CCAAAGTAGTGTTAGTAGCGA
ATCTAGATTCAGTGTCGTCAGCCAT-3’ 37. számú szekvencia
A polimeráz láncreakciót az 1. példában leírtak alapján hajtjuk végre, azzal az eltéréssel, hogy a #333-as oligonukleotid helyett a #384-es oligonukleotidot használjuk, és templátként a pAK559 plazmidot (15. ábra) használjuk.
A 228 bázispár méretű Asp718/HindIII DNS-fragmenst agarózgélen végzett gélelektroforézisnek vetjük alá, majd az 1. példában leírtak alapján tisztítjuk. Az Asp718/HindlII DNS-fragmenst Saccharomyces cerevisiae expressziós plazmidba szubklónozzuk, az 1. példában leírtak alapján. A kiválasztott pAK.580 jelű plazmidról DNS-szekvenálással kimutatjuk, az 1. példában leírtak alapján, hogy a 19. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvenciát tartalmazza. A 19. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvenciát kódoló DNSszekvenciát a 10. ábrán mutatjuk be. A pAK.580 jelű plazmidot Saccharomyces cerevisiae MT663 törzsbe transzformáljuk, a 86306721.1 számú európai szabadalmi bejelentésben leírtak alapján, és a kapott törzsnek a yAK.580 jelzést adjuk. A szignálpeptidet és az MI3 inzulin prekurzort kódoló DNS-szekvenciák azonosak azzal, amit az 5. ábrán bemutattunk.
7. példa
Az MI3 inzulin prekurzor Saccharomyces cerevis/ne-ben (yAK.583 törzs) való expressziójához használható, a 20. számú szekvenciavázlatban ismertetett vezérszekvencia szintézise
A 20. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvencia aminosavszekvenciája az alábbi: GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeu MetAlaAspAspThrGlu
Serlle AsnThrThrLeuV al AsnLeuAlaAsn V al AlaMet Alá
Az alábbi oligonukleotidot szintetizáljuk meg:
#390 5 ’ - AACGAATCTCTTAGCCATGGCAACGTT AGCCAAGTTAACCAAAGT-3’ 38. számú szekvencia
A polimeráz láncreakciót az 1. példában leírtak alapján hajtjuk végre, azzal az eltéréssel, hogy a #333-as oligonukleotid helyett a #390-es oligonukleotidot használjuk, és templátként a pAK559 plazmidot (15. ábra) használjuk.
A 231 bázispár méretű Asp718/HindIII DNS-fragmenst agarózgélen végzett gélelektroforézisnek vetjük alá, majd az 1. példában leírtak alapján tisztítjuk. Az Asp718/HindIII DNS-fragmenst Saccharomyces cerevisiae expressziós plazmidba szubklónozzuk, az 1. példában leírtak alapján. A kiválasztott pAK.583 jelű plazmidról DNS-szekvenálással kimutatjuk, az 1. példában leírtak alapján, hogy a 20. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvenciát tartalmazza. A 20. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvenciát kódoló DNS-szekvenciát all. ábrán mutatjuk be. A pAK583 jelű plazmidot Saccharomyces cerevisiae MT663 törzsbe transzformáljuk, a 86306721.1 számú európai szabadalmi bejelentésben leírtak alapján, és a kapott törzsnek az yAK.583 jelzést adjuk. A szignálpeptidet és az MI3 inzulin prekurzort kódoló DNS-szekvenciák azonosak azzal, amit az 5. ábrán bemutattunk.
8. példa
Az MI3 inzulin prekurzor Saccharomyces cerevisiae-ben (yAK586 törzs) való expressziójához használható, a 21. számú szekvenciavázlatban ismertetett vezérszekvencia szintézise
A 21. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvencia aminosavszekvenciája az alábbi: GlnProIleAspAspThrGluSerAlalleAsnThrThrLeuVal AsnLeuProGlyAla
Az alábbi oligonukleotidot szintetizáljuk meg:
HU 221 118 Β1 #401 5 ’ - AACGAATCTCTTAGCACCTGGC A AGTT GACCAAAGTAGTGTTGATAG
CAGATTCAGTGTCG-3’ 39. számú szekvencia.
A polimeráz láncreakciót az 1. példában leírtak alapján hajtjuk végre, azzal az eltéréssel, hogy a #333-as oligonukleotid helyett a #401-es oligonukleotidot használjuk, és templátként a pAK.562 plazmidot (15. ábra) használjuk.
A 183 bázispár méretű Asp718/HindIII DNS-fragmenst agarózgélen végzett gélelektroforézisnek vetjük alá, majd az 1. példában leírtak alapján tisztítjuk. Az Asp718/HindIII DNS-fragmenst Saccharomyces cerevisiae expressziós plazmidba szubklónozzuk, az 1. példában leírtak alapján. A kiválasztott pAK586 jelű plazmidról DNS-szekvenálással kimutatjuk, az 1. példában leírtak alapján, hogy a 21. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvenciát tartalmazza. A 21. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvenciát kódoló DNSszekvenciát a 12. ábrán mutatjuk be. A pAK.586 jelű plazmidot Saccharomyces cerevisiae MT663 törzsbe transzformáljuk, a 86306721.1 számú európai szabadalmi bejelentésben leírtak alapján, és a kapott törzsnek az yAK586 jelzést adjuk. A szignálpeptidet és az MI3 inzulin prekurzort kódoló DNS-szekvenciák azonosak azzal, amit az 5. ábrán bemutattunk.
9. példa
Az MI3 inzulin prekurzor expressziója, a jelen találmány szerinti kiválasztott vezérszekvenciák alkalmazásával
Az előzőkben ismertetett plazmidokat hordozó élesztőtörzseket YPD táptalajon szaporítjuk [Sherman, F. és munkatársai: Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1981)]. Minden egyes törzsből 6 db 5 ml-es tenyészetet készítünk, ezeket 30 °C-on rázatjuk 72 óra hosszat, a végső OD6(x)-értékük körülbelül 15. Centrifugálás után HPLC-elemzés céljára eltávolítjuk a felülúszót, és a szekretált inzulin koncentrációját Snel és munkatársai módszerét használva mérjük meg [Snel, L. és munkatársai: Chromatographia 24, 329-332 (1987)].
Az 1. táblázatban az MI3 inzulin prekurzor expressziós szintjei láthatók, amiket a jelen találmány szerinti vezérszekvenciák alkalmazásával el lehet érni, és ezeknek az értékét százalékban adjuk meg, a pMT742 transzformánsok értékéhez viszonyítva, amelyekben a Saccharomyces cerevisiae MFa(l) vezérszekvenciáit használjuk.
1. táblázat
Vezérszekvencia Expressziós szint, %
MT748 a-vezérszekvencia 100
15. számú szekvencia 87
16. számú szekvencia 215
17. számú szekvencia 157
19. számú szekvencia 166
20. számú szekvencia 86
Vezérszekvencia Expressziós szint, %
21. számú szekvencia 145
22. számú szekvencia 137
23. számú szekvencia 121
10. példa
A meghosszabbított MI3 inzulin prekurzor Saccharomyces cerevisiae-b&a (yAK677 törzs) való expressziójához használható, a 27. számú szekvenciavázlatban ismertetett vezérszekvencia szintézise.
A 27. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvencia aminosavszekvenciája az alábbi: GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeu MetAlaAspAspThrGlu
SerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAspValValAsnLeulle
SerMetAla
Az alábbi oligonukleotidokat szintetizáljuk meg: #440 5 ’ - GGTTAACGAACTTTGGAGCTTCAGCTT CAGCTTCTTCTCTCTTAGC CAT
GGAGATCAAGTTAACAACATCCAAAGTAGTGT
T-3’
64. számú szekvencia és #441 5 ’ - C A AGTAC AAAGCTTC AACC AAGTGGG AACCGCACAAGT
GTTGGTTAACGAACTT-3’ 65. számú szekvencia.
A polimeráz láncreakciókat az 1. példában leírtak alapján hajtjuk végre, azzal az eltéréssel, hogy a #333-as oligonukleotid helyett a #440-es oligonukleotidot használjuk, és templátként a pAK614 plazmidot használjuk. A második polimeráz láncreakcióban a #312-es oligonukleotid helyett a #441-es oligonukleotidot használjuk.
A tisztított PCR-DNS-fragmenst izoláljuk, majd az Asp718 és HindllI restrikciós endonukleázzal emésztjük, az 1. példában leírtak alapján. A 268 bázispár méretű Asp718/HindIII DNS-fragmenst agarózgélen végzett gélelektroforézisnek vetjük alá, majd az 1. példában leírtak alapján tisztítjuk. Az Asp718/HindIII DNS-fragmenst Saccharomyces cerevisiae expressziós plazmidba szubklónozzuk, az 1. példában leírtak alapján, azzal az eltéréssel, hogy a 140 bázispár méretű HindlII/Xbal DNS-fragmens a pAK.602 plazmidból származik, és az AspB28 humáninzulint kódolja. A kiválasztott pAK616 jelű plazmidról DNS-szekvenálással kimutatjuk, az 1. példában leírtak alapján, hogy a 27. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvenciát tartalmazza. A 66. számú szekvenciának megfelelő DNSszekvenciát és a 27. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvenciát kódoló DNS-szekvenciát a 18. ábrán mutatjuk be. A pAK.616-ból származó, 268 bázispár méretű DNS-fragmenst izoláljuk, majd ligáljuk a 10986 bázispár méretű, a pAK601 plazmidból származó DNS-fragmenssel és a pAK464-ből származó 140 bázispár méretű HindlII/Xbal DNS-fragmenssel (ez az AspB28 inzulin meghosszabbított verzióját kódolja), majd a kapott konstrukciónak a pAK625 jelzést adjuk. Izoláljuk a pAK.625 plazmidból származó 180 bá11
HU 221 118 Β1 zispár méretű Asp718/Ncol DNS-fragmenst, és ligáljuk a 221 bázispár méretű Ncol/Xbal DNS-fragmenshez, amely a pJB146 plazmidból származik (az inzulinprekurzor meghosszabbított verzióját kódolja), valamint a pAK601 plazmidból származó 10824 bázispár méretű Asp718/Xbal DNS-fragmenshez, és a kapott plazmidnak a pAK677 jelzést adjuk. A pAK.677 jelű plazmidot Saccharomyces cerevisiae MT663 törzsbe transzformáljuk, a 86306721.1 számú európai szabadalmi bejelentésben leírtak alapján, és a kapott törzsnek az yAK.677 jelzést adjuk. A vezérszekvenciát kódoló DNS-szekvencia kivételével a szignálpeptidet kódoló DNS-szekvencia azonos azzal, amit az 5. ábrán bemutattunk. A meghosszabbított MI3 inzulin prekurzort kódoló DNS-szekvenciát a 19. ábrán mutatjuk be.
11. példa
Az MI3 inzulin prekurzor Saccharomyces cerevisiae-ben (yAK680 törzs) való expressziójához használható, a 67. számú szekvenciavázlatban ismertetett vezérszekvencia szintézise
A 67. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvencia aminosavszekvenciája az alábbi: GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeu MetAlaAspAspThrGlu
SerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAlaLeuAspValValAs nLeuIleSerMetAla
Az alábbi oligonukleotidot szintetizáljuk meg:
#577 5’ -TCTCTTAGCC ATGG AGATCAAGTTAAC AACATCCAAAGC
CAAAGTAGTGTT-3’ 68. számú szekvencia
A polimeráz láncreakciót az 1. példában leírtak alapján hajtjuk végre, azzal az eltéréssel, hogy a #333-as oligonukleotid helyett az #577-es oligonukleotidot használjuk, és templátként a pAK625 plazmidot használjuk, és a második polimeráz láncreakciót nem végezzük el. A PCR-fragmenst Asp718 és Ncol restrikciós endonukleázokkal emésztjük, az 1. példában leírtak alapján.
A 190 bázispár méretű Asp718/Ncol DNS-fragmenst agarózgélen végzett gélelektroforézisnek vetjük alá, majd az 1. példában leírtak alapján tisztítjuk, azzal az eltéréssel, hogy a 10824 bázispár méretű Asp718/Xbal vektor DNS-fragmenst a pAK.601 plazmidból izoláljuk. A 190 bázispár méretű Asp718/Ncol DNS-fragmenst Saccharomyces cerevisiae expressziós plazmidba szubklónozzuk, az 1. példában leírtak alapján, azzal az eltéréssel, hogy a 221 bázispár méretű Ncol/Xbal DNS-fragmenst (amely az MI3 inzulin prekurzor meghosszabbított verzióját kódolja) a pAk677-es plazmidból izoláljuk, és ezt használjuk a HindlII/Xbal DNS-ffagmens helyett. A kiválasztott pAK680 jelű plazmidról DNS-szekvenálással kimutatjuk, az 1. példában leírtak alapján, hogy a 67. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvenciát tartalmazza. A 67. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvenciát kódoló DNSszekvenciát (69. számú szekvencia) a 20. ábrán mutatjuk be. A pAK680 jelű plazmidot Saccharomyces cerevisiae MT663 törzsbe transzformáljuk, a 86306721.1 számú európai szabadalmi bejelentésben leírtak alapján, és a kapott törzsnek az yAK.680 jelzést adjuk. A vezérszekvenciát kódoló DNS-szekvencia kivételével a szignálpeptidet és a meghosszabbított MI3 inzulin prekurzort kódoló DNS-szekvenciák azonosak azzal, amit a 19. ábrán bemutattunk.
12. példa
Az N-terminálison meghosszabbított MI3 inzulin prekurzorok expressziója a 27. számú szekvenciának és a 67. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvenciák alkalmazásával
Az előzőkben ismertetett plazmidokat hordozó élesztőtörzseket szaporítunk YPD tenyésztő táptalajon [Sherman, F. és munkatársai: Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1981)]. Minden egyes törzsből 6 db 5 ml-es tenyészetet készítünk, ezeket 30 °C-on rázatjuk 72 óra hosszat, a végső OD600-értékük körülbelül 15. Centrifugálás után HPLC-elemzés céljára eltávolítjuk a felülúszót, és a szekretált inzulin koncentrációját Snel és munkatársai módszerét használva mérjük meg [Snel, L. és munkatársai: Chromatographia 24, 329-332 (1987)].
A 2. táblázatban néhány, az N-terminálisán meghosszabbított MI3 inzulin prekurzor expressziós szintjei láthatók, amiket a jelen találmány szerinti, a 27. számú szekvenciának és a 67. számú szekvenciának megfelelő vezérszekvenciák alkalmazásával el lehet érni, és ezeknek az értékét százalékban adjuk meg, a pMT742 transzformánsok értékéhez viszonyítva, amelyekben a Saccharomyces cerevisiae MFa(l) vezérszekvenciáit használjuk.
2. táblázat
Törzs Szignálpcptid Vezérszekvencia Meghosszabbítás Az MT748-hoz viszonyítva
MT748 a a
yAK675 YAP3 27. számú szekvencia EEAEAEAPK 251%
yAK677 YAP3 27. számú szekvencia EEAEAEAEPK 224%
yAK681 YAP3 67. számú szekvencia EEAEAEAPK 248%
yAK680 YAP3 67. számú szekvencia EEAEAEAPK 362%
Az alábbiakban ismertetjük a szövegben szereplő szekvenciákat.
HU 221 118B1
A szekvencialista (1) Általános információ:
(i) Benyújtó:
(A) Név: Novo Nordisk A/S (B) Utca: Novo Allé (C) Város: DK-2880Bagsvaerd (E) Ország: Dánia (G) Telefon: +45 44448888 (H) Telefax: +45 44490555 (I) Telex: 37173 (ii) A találmány címe: Szintetikus vezérpeptid-szekvenciák (iii) A szekvenciák száma: 73 (iv) Levelezési cím:
(A) Címzett: Novo Nordisk A/S Corporate Patents (B) Utca: Novo Allé (C) Város: DK-2880 Bagsvaerd (E) Ország: Dánia (v) Számítógépes forma:
(A) A hordozó típusa: flopilemez (B) Számítógép: IBM PC kompatibilis (C) Operációs rendszer: PC-DOS/MS-DOS (D) Program: Patentln Release #1.0, Version#1.25 (vi) A jelenlegi benyújtása adatai:
(A) A benyújtás sorszáma:
(B) A benyújtás időpontja:
(C) Osztályozás:
(vii) A korábbi benyújtás adatai:
(A) A benyújtás sorszáma: DK 0705/94 és US 08/282,852 (B) A benyújtás időpontja: 1994. június 16. és 1994. július 29.
(viii) Ügyvivő/ügynök információ:
(A) Név: Jorgensen, Dán és munkatársai (B) Referencia/lajstromszám: 4085-WO, DJ (ix) Telekommunikációs információ:
(A) Telefon: +45 44448888 (B) Telefax: +45 44493256
1. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 15 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 1. számú szekvencia GlnProIleAspGluAs pAsnAs pThrSerVa1As nLeuPr oAla 1 5 10 15
2. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 15 aminosav (B) Típus: aminosav (D)Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 2. számú szekvencia GlnProI1eAspAs pGluAsnThrThrSerValAsnLeuProAla 1 5 10 15
3. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 16 aminosav (B) Típus: aminosav
HU 221 118 Β1 (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 3. számú szekvencia
GlnProIleAs pAspGluSerAsnThrThrSerVa1AsnLeuPr oAla 15 10 15
4. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 15 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 4. számú szekvencia G1nPr ο I1eAspAspGluAsnThrThr Se rValAsnLeuProVal
10 15
5. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 16 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 5. számú szekvencia GlnProIleAspAspThrGluAs nThrThrSerValAsnLeuProAla
10 15
6. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 17 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 6. számú szekvencia GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuPr oAla
10 15
7. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 15 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 7. számú szekvencia GlnProI1eAs pAspGluAsnTh rTh rSerValAsnLe uMe t Al a
10 15
8. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 18 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 8. számú szekvencia GlnProIleAs pAspTh rGluSe rAsnTh rTh rSerValAsnLeuProGlyAla
10 15
9. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 17 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 9. számú szekvencia GlnProIleAs pAs pThrGluSerAsnThrThrSerVa1 As nLe uMe t Al a
10 15
HU 221 118 Β1
10. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 17 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 10. számú szekvencia GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAs nVa1Pr oTh r
10 15
11. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 17 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 11. számú szekvencia GlnProIleAs pAs pThrGluSerAsnThrThr LeuVa1As nVa1Pr oTh r
10 15
12. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 17 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 12. számú szekvencia GlnProIleAspAs pThrGluSerAs nTh rThrSerValAsnLeuProThr
10 15
13. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 18 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 13. számú szekvencia GlnProIleAs pAs pThrGluSerAsnThrTh r LeuVa1As nVa1Pr oGlyAla
10 15
14. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 14. számú szekvencia GlnProIleAs pAs pThrGluSerAsnThrThrSerVa1AsnLeuMe tAla Pr oAla
10 15
ValAla
15. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 25 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 15. számú szekvencia GlnProI1eAs pAspTh rGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMe t As pLeuAl a
10 15
ValGlyLeuProGlyAla
HU 221 118 Β1
16. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 33 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 16. számú szekvencia G1 nPrο I1eAspAspThrGluSerAsnThrThrSerVa1AsnLeuMe tAIaAspAsp
10 15
ThrGluSerI1eAs nTh r Th r Le uValAsnLeuPr oGlyAla
25 30
17. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 19 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 17. számú szekvencia GlnProIleAs pAs pThrGluSerIleAsnThrThr LeuValAsnLeuProGlyAl a
10 15
18. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 18 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 18. számú szekvencia GlnProIleAspAs pTh rGluSe rAsnTh rTh rLeuValAsnLeuProGlyAla
10 15
19. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 35 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 19. számú szekvencia GlnProIleAspAs pThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLe uMetAIaAs pAs p
10 15
ThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuValAsnLeuProLeu
25 30 35
20. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 36 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 20. számú szekvencia GlnProI leAs pAspTh rGluSerAsnThrThrSerVa1As nLeuMe tAIaAs pAs p
10 15
ThrGluSer11eAsnThrThrLeuValAsnLeuAlaAsnVa1AIaMe tAI a
25 30 35
21. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 20 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid
HU 221 118 Β1 (xi) A szekvencia leírása: 21. számú szekvencia G1 nPr ο 11eAspAs pThrGluSerAlalleAsnThrTh rLeuValAsnLeuProGly
10 15
Al a
22. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 22. számú szekvencia GlnProIleAs pAs pThrGluSerPheAlaThrAsnThrThr LeuValAsnLeuPro
10 15
GlyAla
23. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 36 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 23. számú szekvencia GlnProI leAspAspThrGluSerIleAs nTh rTheLeuVa1AsnLeuMe tAlaAs p
10 15
AspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrTh r LeuValAsnLeuProLeu
25 30 35
24. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 39 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 24. számú szekvencia GlnProIleAspAspThrGluSerIleAsnTh rTheLeuVa1AsnLeuMe tAlaAs p
10 15
As pTh rGluSe rArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAspValValAsnLeuGlyAla
25 30 35
25. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 25. számú szekvencia GlnProI1eAs pAs pTh rGluSerPheAlaAlalleAsnTh rTh rLeuVa1AsnLe u
10 15
Pr oGlyAla
26. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 39 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 26. számú szekvencia GlnProI1eAs pAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLe uMe tAlaAs pAs p
10 15
ThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLe uVa1As nLeuAlaAs nVa1 Al aMe t
25 30 35
Al a
HU 221 118 Β1
27. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 39 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 27. számú szekvencia GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMe tA1aAspAsp
10 15
ThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThr LeuAs pVaIValAsnLeuIleSe rMe t
25 30 35
A1 a
28. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 39 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 28. számú szekvencia GlnProIleAs pAs pThrGluSerAsnThrThrSerValAs nLeuMe tAlaAsnThr
10 15
ThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThr LeuAs pVaIValAsnLeuIleSe rMe t
25 30 35
A1 a
29. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 27 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 29. számú szekvencia TAAATCTATAACTACAAAAAACACATA
30. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 25 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 30. számú szekvencia GACTCTCTTAACTGGCAAGTTGACA
31. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 56 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 31. számú szekvencia AAGTACAAAGCTTCAACCAAGTGAGAACCACACAAGTGTTGGTTAACGAATCTCTT
32. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia : lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 32. számú szekvencia CATACACAATATAAACGACGG
HU 221 118 Β1
33. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 55 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 33. számú szekvencia GAATCTCTTAGCTGGCAAGTTGACAGAAGTAGTGTTAGTTTCAGAGTCGTCAATT
34. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 36bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 34. számú szekvencia AACGAATCTCTTAGCACCTGGCAAGTTGACAGAAGT
35. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 60 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 35. számú szekvencia
AACGAATCTCTTAGCACCTGGCAAGTTGACCAAAGTAGTGTTGATAGATTCAGTGTCGTC
36. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 75 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 36. számú szekvencia
AACGAATCTCTTAGCACCTGGCAAGTTAACCAAAGTAGTGTTGATAGATTCAGTGTCGTCAGC
CATCAAGTTGAC
37. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia j ellemzői:
(A) Hossz: 72 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltipus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 37. számú szekvencia
AACGAATCTCTTCAATGGCAAGTTAACCAAAGTAGTGTTAGTAGCGAATCTAGATTCAGTGTC
GTCAGCCAT
38. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 45 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 38. számú szekvencia AACGAATCTCTTAGCCATGGCAACGTTAGCCAAGTTAACCAAAGT
39. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 61 bázispár (B) Típus: nukleinsav
HU 221 118 Β1 (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 39. számú szekvencia
AACGAATCTCTTAGCACCTGGCAAGTTGACCAAAGTAGTGTTGATAGCAGATTCAGTGTCG
40. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 372 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (ix) Tulajdonság:
(A) Név/kulcs: CDS (B) Lokalizáció: 82...351 (xi) A szekvencia leírása: 40. számú szekvencia
GAATTCATTC AAGAATAGTT CAAACAAGAA GATTACAAAC TATCAATTTC ATACACAATA TAAACGACGG GTACCAAAAT A ATG AAA CTG AAA ACT
Met Lys Leu Lys Thr
GTA AGA TCT GCG GTC CTT TCG TCA CTC TTT GCA TCT CAG GTC
Va 1 Arg Ser Al a Va 1 Leu Ser Ser Leu Ph e Al a Ser Gin Va 1
CTT GGC CAA CCA ATC GCA GAA GAC AAC GAC ACT TCT TCC ATG
Leu Gly Gin Pro lle As p Glu As p As n As p Thr Ser Ser Me t
GCT AAG AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGC GGT TCC CAC TTG
Alá Ly s Arg Phe Va 1 Asn Gin Hi s Leu Cy s Gly Ser Hi s Leu
GTT GAA GCT TTG TAC TTG GTT TGC GGT GAA AGA GGT TTC TTC
Va 1 Glu Al a Leu Tyr Leu Val Cy s Gly Glu Arg Gly Phe Ph e
TAC ACT CCT AAG GCT GCT AAG GGT ATT GTC GAG CAA TGC TGT
Tyr Thr Pro Lys Al a Al a Ly s Gly lle Va 1 G1 u Gin Cys Cy s
ACC TCC ATC TGC TCC TTG TAC CAA TTG GAA AAC TAC TGC AAC
Thr Ser lle Cy s Ser Leu Tyr Gin Leu Glu As n Tyr Cy s As n
TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA
41. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 89 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid
(xi i) A szekvenc ia leírása: 41 . számi ú szekvencia
Me t Ly s Leu Ly s Thr Va 1 Arg Ser Al a Va 1 Leu Ser Ser Le u
1 5 10
Phe Al a Ser Gin Va 1 Leu Gly Gin Pro lle As p Glu As p As n
15 20 25
As p Thr Ser Ser Me t Alá Lys Arg Phe Va 1 As n Gin Hi s Le u
30 35 40
Cy s Gly Ser Hi s Le u Va 1 Glu Al a Leu Tyr Leu Va 1 Cy s Gly
45 50 55
Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Ly s Al a Al a Ly s Gly lle
60 65 70
Val Glu Gin Cys Cy s Thr Ser lle Cy s Ser Le u Tyr Gin Leu
75 80
Glu As n Tyr Cys As n
85
42. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 45 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS
HU 221 118 Β1 (ix) Tulajdonság:
(A) Név/Kulcs: CDS (B) Lokalizáció: 1.. .45
(xi) A szekvencia leírása: 42. számú szekvencia CAA CCA ATT GAC GAC GAA AAC ACT ACT TCT GTC AAC TTG CCA
Gin Pro I le Asp Asp Glu Asn Thr Thr Ser Va 1 As n Leu Pro
1 5 10
GTT
Val
43. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 15 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 43. számú szekvencia Gin Pro I le Asp Asp Glu Asn Thr Thr Ser Va1 Asn Leu Pro
5 10
Val
44. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 297 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (ix) Tulajdonság:
(A) Név/Kulcs: CDS (B) Lokalizáció: 1... 276 (xi) A szekvencia leírása: 44. számú szekvencia
GTA AGA TCT Ser GCG GTC CTT Leu TCG Ser TCA CTC ATG Me t 1 TTT Ph e 15 AAA Ly s GCA A1 a CTG Leu TCT Ser AAA Ly s CAG Gin ACT Thr 5 GTC Va 1
Val Arg A1 a Va 1 10 Ser Leu
CTT GGC CAA CAA ATT GAC GAC GAA AAC ACT ACT TCT GTC AAC
Le u Gly Gin Pro I 1 e As p As p Glu As n Thr Thr Ser Va 1 As n
20 25 30
TTG CCA GTT AAG AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT TGT TCT
Leu Pro Va 1 Ly s Arg Phe Val Asn Gin Hi s Leu Cy s Gly Ser
35 40 45
CAC TTG GTT GAA GCT TTG TAC TTG GTT TGC GGT GAA AGA GGT
Hi s Leu Va 1 Glu Alá Leu Ty r Le u Va 1 Cy s Gly Glu Arg Gly
50 55 60
TTC TTC TAC ACT CCT AAG GCT GCT AAG GGT ATT GTC GAA CAA
Phe Phe Ty r Thr Pro Ly s A1 a A1 a Ly s Gly 1 le Va 1 Glu Gin
65 70 75
TGC TGT ACC TCC ATC TGC TCC TTG TAC CAA TTG GAA AAC TAC
Cy s Cy s Thr Ser I le Cy s Ser Le u Tyr Gin Le u Glu As n Tyr
80 85
TGC AAC TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA
Cy s As n
90
45. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 91 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris
HU 221 118 Β1 (ii) A molekula típusa: peptid
(xi) A szekvencia leírása: 45 . számú szekvencia
Me t Lys Leu Lys Thr Va1 Arg Ser Al a Val Le u Ser Ser Le u
1 5 10
Phe Alá Ser Gin Va1 Leu Gly Gin Pro I le As p As p Glu As n
15 20 25
Thr Thr Ser Va1 Asn Leu Pro Va1 Ly s Arg Phe Va 1 As n Gin
30 35 40
His Leu Cys Gly Ser His Leu Va1 Glu Al a Leu Tyr Le u Va 1
45 50 55
Cys Lys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Al a Al a
60 65 70
Lys Gly I le Va1 Glu Gin Cys Cys Thr Ser I le Cys Ser Le u
75 80
Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85 90
46. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 51 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (ix) Tulajdonság:
(A) Név/Kulcs: CDS (B) Lokalizáció: 1...51 (xi) A szekvencia leírása: 46. számú szekvencia CAA CCA ATT GAC GAC ACT GAA TCG AAC ACT ACT TCT Gin Pro I le Asp Asp Thr Glu Ser Asn Thr Thr Ser
5 10
TTG CCA GCT Leu Pro Alá
GTC AAC Va1 Asn (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 17 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 47. számú szekvencia
47. számú szekvenciavázlat
Gin Pro I le
1
Leu Pro Al a
15
Va1 Asn
48. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 54 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (ix) Tulajdonság:
(A) Név/Kulcs: CDS (B) Lokalizáció: 1... 54 (xi) A szekvencia leírása: 48. számú szekvencia CAA CCA ATT GAC GAC ACT GAA TCT AAC ACT ACT TCT Gin Pro I le Asp Asp Thr Glu Ser Asn Thr Thr Ser
5 10
GTC AAC Va1 Asn
HU 221 118 Β1
TTG CCA GGT GCT
Leu Pro Gly Alá 15
49. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 57 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (ix) Tulajdonság:
(A) Név/Kulcs: CDS (B) Lokalizáció: 1...57 (xi) A szekvencia leírása: 49. számú szekvencia
CAA CCA ATT GAC GAC ACT GAA TCT ATC AAC ACT TCT TTG GTC
Gin Pro I le As p As p Thr Glu Ser I le As n Thr Thr Le u Va 1
1 5 10
AAC TTG CCA GGT GCT
As n Le u Pro Gly Al a
15
50. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 99 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (ix) Tulajdonság:
(A) Név/Kulcs: CDS (B) Lokalizáció: 1...99 (xi) A szekvencia leírása: 50. számú szekvencia
CAA CCA ATT GAC GAC ACT GAA TCT AAC ACT ACT TCT GTC AAC
Gin Pro I le As p As p Thr G1 u Ser As n Thr Thr Ser Va 1 As n
1 5 10
TTG ATG GCT GAC GAC ACT GAA TCT ATC AAC ACT ACT TTG GTT
Le u Me t Al a As p As p Thr Glu Ser I le Asn Thr Thr Leu Va 1
15 20 25
AAC TTG CCA GGT GCT
Asn Leu Pro Gly Al a
51. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 105 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (ix) Tulajdonság:
(A) Név/Kulcs: CDS (B) Lokalizáció: 1...105 (xi) A szekvencia leírása: 51. számú szekvencia
CAA CCA ATT GAC GAC ACT GAA TCT AAC ACT ACT TCT GTC AAC
Gin Pro I le Asp As p Thr Glu Ser Asn Thr Thr Ser Val Asn
1 5 10
TTG ATG GCT GAC GAC ACT GAA TCT AGA TTC GCT ACT AAC ACT
Le u Me t Al a As p As p Thr Glu Ser Arg Phe Al a Thr As n Thr
15 20 25
ACT TTG GTT AAC TTG CCA TTG
Thr Le u Va 1 As n Leu Pro Le u
30 35
HU 221 118 Β1
52. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 108 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (ix) Tulajdonság:
(A) Név/Kulcs: CDS (B) Lokalizáció: 1... 108 (xi) A szekvencia leírása: 52. számú szekvencia
CAA CCA ATT GAC GAC ACT GAA TCT AAC ACT ACT TCT GTC AAC
Gin Pro Ile Asp Asp Thr Glu Ser Asn Thr Thr Ser Va 1 As n
1 5 10
TTG ATG GCT GAC GAC ACT GAA TCT ATC AAC ACT ACT TTG GTT
Leu Me t AI a As p As p Thr Glu Ser Ile As n Thr Thr Leu Va 1
15 20 25
AAC TTG GCT AAC GTT GCC ATG GCT
Asn Le u AI a Asn Va 1 AI a Me t AI a
30 35
53. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 60 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (ix) Tulajdonság:
(A) Név/Kulcs: CDS (B) Lokalizáció: 1... 60 (xi) A szekvencia leírása: 53. számú szekvencia
CAA CCA ATT GAC GAC ACT GAA TCT GCT ATC AAC ACT ACT TTG
Gin Pr o Ile Asp As p Thr Glu Ser AI a I 1 e As n Thr Thr Leu
1 5 10
GTC AAC TTG CCA GGT GCT
Va 1 As n Leu Pro Gly AI a
15 20
54. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 276bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (ix) Tulajdonság:
(A) Név/Kulcs: CDS (B) Lokalizáció: 113...274 (xi) A szekvencia leírása: 54. számú szekvencia TTAAATCTAT AACTACAAAA AACACATACA GGAATTCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT CATACACAAT ATAAACGACG GGTACCAAAA TA ATG AAA CTG AAA ACT GTA AGA TCT GCG GTC CTT
Me t Lys Leu Lys Thr Val Arg Ser Alá Val Leu 1 5 10
TCG TCA CTC TTT GCA TCT CAG GTC CTT GGC CAA CCA ATT GAC
Ser Ser Leu Phe AI a Ser Gin Va 1 Leu G1 y Gin Pro I 1 e As p
15 20
GAC GAA AAC ACT ACT TCT GTT AAC TTG CCA GCT AAG AGA TTC
As p Glu Asn Thr Thr Ser Va 1 As n Leu Pro AI a Ly s Arg Phe
25 30 35
HU 221 118B1
GTT AAC CAA CAC TTG TGC GGT TCC CAC TTG GTT GAA GCT TTG
Va 1 As n Gin Hí s Le u Cy s Gly Ser Hi s Leu Va 1 Glu Alá Leu
40 45 50
TAC TT
Tyr
55. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 54 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 55. számú szekvencia
Me t Ly s Leu Lys Thr Val Arg Ser Alá Va 1 Leu Ser Ser Le u
1 5 10
Phe Al a Ser Gin Val Leu Gly Gin Pro I le As p Asp Glu As n
15 20 25
Thr Thr Ser Val As n Leu Pro Al a Lys Arg Phe Val As n G1 n
30 35 40
Hi s Le u Cy s Gly Ser Hi s Leu Va 1 Glu Al a Le u Tyr
45 50
56. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 282 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (ix) Tulajdonság:
(A) Név/Kulcs: CDS (B) Lokalizáció: 113...280 (xi) A szekvencia leírása: 54. számú szekvencia TTAAATCTAT AACTACAAAA AACACATACA GGAATTCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT CATACACAAT ATAAACGACG GGTACCAAAA TA ATG AAA CTG AAA ACT GTA AGA TCT GCG GTC CTT
Me t Lys Leu Lys Thr Val Arg Ser Alá Val Leu
1 5 10
TCG TCA CTC TTT GCA TCT CAG GTC CTT GGC CAA CCA ATT GAC
Ser Ser Le u Phe Al a Ser Gin Va 1 Leu Gly Gin Pro I 1 e As p
15 20 25
GAC ACT GAA TCT AAC ACT ACT TCT GTT AAC TTG CCA GCT AAG
As p Thr Glu Ser As n Thr Thr Ser Val Asn Le u Pro Al a Ly s
30 35
AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGC GGT TCC CAC TTG GTT GAA
Arg Phe Va 1 Asn Gin Hi s Leu Cys Gly Ser Hi s Leu Va 1 Glu
40 45 50
GCT TTG TAC TT
Al a Leu Tyr
55
57. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 56 aminosav (B) Típus : aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 57. számú szekvencia
Me t 1 Ly s Leu Ly s Thr 5 Va 1 Arg Ser Al a Va 1 10 Le u Ser Ser Leu
Ph e Al a Ser Gin Va 1 Leu Gly Gin Pro I le As p Asp Thr Glu
25 25
HU 221 118 Β1
Ser Asn Thr Thr Ser Val Asn Leu Pro Alá Lys Arg Phe Val 30 35 40
Asn Gin Hís Leu Cys Gly Ser Hís Leu Val Glu Alá Leu Tyr 45 50 55
58. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 282 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (ix) Tulajdonság:
(A) Név/Kulcs: CDS (B) Lokalizáció: 113...280 (xi) A szekvencia leírása: 58. számú szekvencia TTAAATCTAT AACTACAAAA AACACATACA GGAATTCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT CATACACAAT ATAAACGACG GGTACCAAAA TA ATG AAA CTG AAA ACT GTA AGA TCT GCG GTC CTT
Me t Lys Leu Lys Thr Val Arg Ser Alá Val Leu
1 5 10
TCG TCA CTC TTT GCA TCT CAG GTC CTT GGC CAA CCA ATT GAC
Ser Ser Leu Phe Al a Ser Gin Va 1 Leu Gly Gin Pro I 1 e As p
15 20 25
GAC ACT GAA TCT AAC ACT ACT TCT GTT AAC TTG ATG GCT AAG
As p Thr Glu Ser As n Thr Thr Ser Va 1 Asn Leu Me t Al a Ly s
30 35
AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGC GGT TCC CAC TTG GTT GAA
Arg Phe Val Asn Gin Hí s Leu Cys Gly Ser Hi s Leu Va 1 Glu
40 45 50
GCT TTG TAC TT
Al a Leu Tyr
55
59. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 56 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 59. számú szekvencia
Me t Ly s Leu Ly s Thr Va 1 Arg Ser Al a Va 1 Le u Ser Ser Le u
1 5 1 0
Ph e Al a Ser Gin Va 1 Leu Gly Gin Pr 0 I 1 e As p As p Thr G1 u
1 5 20 25
Se r As n Thr Thr Ser Va 1 As n Leu Me t Al a Ly s Arg Phe Va 1
30 35 40
As n Gin Hi s Le u Cy s Gly Ser Hi s Le u Va 1 Glu Al a Leu Ty r
45 50 55
60. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 330bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (ix) Tulajdonság:
(A) Név/Kulcs: CDS (B) Lokalizáció: 113...328 (xi) A szekvencia leírása: 60. számú szekvencia TTAAATCTAT AACTACAAAA AACACATACA GGAATTCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT CATACACAAT ATAAACGACG
HU 221 118 Β1
GGTACCAAAA ΤΑ ATG AAA CTG AAA ACT GTA AGA TCT GCG GTC CTT Me t Lys Leu Lys Thr Va1 Arg Ser Alá Va1 Leu
5 10
TCG TCA CTC TTT GCA TCT CAG GTC CTT GGC CAA CCA ATT GAC
Ser Ser Leu Phe A1 a Ser Gin Val Leu Gly Gin Pro I le As p
15 20 25
GAC ACT GAA TCT AAC ACT ACT TCT GTT AAC TTG ATG GCT GAC
As p Thr Glu Ser As n Thr Thr Ser Va 1 As n Le u Me t A1 a As p
30 35
GAC ACT GAA TCT ATC AAC ACT ACT TTG GTT AAC TTG CCA GGT
Asp Thr Glu Ser I le As n Thr Thr Leu Va 1 As n Leu Pro Gly
40 45 50
GCT AAG AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGC GGT TCC CAC TTG
A1 a Ly s Arg Phe Val Asn Gin Hí s Leu Cy s Gly Ser Hi s Le u
55 60 65
GTT GAA GCT TTG TAC TT
Va 1 Glu A1 a Leu Tyr
70
61. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 72 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 61. számú szekvencia
Me t Ly s Le u Ly s Thr Val Arg Se r A1 a Va 1 Le u Ser Ser Leu
1 5 1 0
Phe A1 a Ser Gin Va 1 Leu Gly G1 n Pr 0 I 1 e As P As p Thr Glu
15 20 2 5
Ser As n Thr Thr Ser Va 1 Asn Le u Me t A1 a As P Asp Thr Glu
30 35 40
Ser I le Asn Thr Thr Leu Val As n Le u Pr 0 G1 y A1 a Ly s Arg
45 5 0 55
Phe Va 1 Asn Gin Hi s Leu Cy s G1 y Se r Hi s Le u Va 1 Glu A1 a
60 6 5 70
Leu Tyr
62. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 288 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (ix) Tulajdonság:
(A) Név/Kulcs: CDS (B) Lokalizáció: 113...286 (xi) A szekvencia leírása: 62. számú szekvencia TTAAATCTAT AACTACAAAA AACACATACA GGAATTCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT CATACACAAT ATAAACGACG GGTACCAAAA TA ATG AAA CTG AAA ACT GTA AGA TCT GCG GTC CTT
Met Lys Leu Lys Thr Va1 Arg Ser Alá Va1 Leu 1 5 10
TCG TCA CTC TTT GCA TCT CAG GTC CTT GGC CAA CCA ATT GAC
Ser Ser Le u Ph e A1 a Ser Gin Va 1 Leu Gly Gin Pro I le As p
1 5 20 25
GAC ACT GAA TCT AAC ATC ACT ACT TTG GTT AAC TTG CCA GGT
As p Thr Glu Ser I le Asn Thr Thr Leu Va 1 As n Leu Pro Gly
30 35
HU 221 118 Β1
GCT AAG AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGC GGT TCC CAC TTG
Al a Ly s Arg Phe Va 1 Asn Gin Hi s Leu Cy s Gly Ser Hi s Le u
40 45 50
GTT GAA GCT TTG TAC TT
Val Glu Al a Leu Tyr
55
63. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 58 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 63. számú szekvencia
Me t Ly s Le u Ly s Thr Va 1 Arg Se r Al a Va 1 Le u Ser Ser Le u
1 5 1 0
Ph e Al a Ser Gin Va 1 Leu Gly G1 π Pr 0 I 1 e As P Asp Thr G1 u
1 5 20 2 5
Se r I le Asn Thr Thr Leu Val As n Le u Pr 0 G1 y Al a Ly s Ar g
30 35 40
Ph e Va 1 Asn Gin Hi s Leu Cy s G1 y Se r Hi s Le u Va 1 Glu Al a
45 5 0 55
Le u Tyr
64. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 82 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 64. számú szekvencia
GGTTAACGAACTTTGGAGCTTCAGCTTCAGCTTCTTCTCTCTTAGCCATGGAGATCAAGTTAA
CAACATCCAAAGTAGTGTT
65. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 54 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 65. számú szekvencia CAAGTACAAAGCTTCAACCAAGTGGGAACCGCACAAGTGTTGGTTAACGAACTT
66. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 117 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 66. számú szekvencia
CAACCAATTG ACGACACTGA TGACGACACT GAATCTAGAT ACTTGATCTC CATGGCT
ATCTAACACT
TCGCTACTAA
ACTTCTGTCA
CACTACTTTG
ACTTGATGGC
GATGTTGTTA
67. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 41 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid
HU 221 118 Β1 (xi) A szekvencia leírása: 67. számú szekvencia GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerVa1As nLeuMetAlaAs pAs p
10 15
ThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAlaLeuAspVaIValAsnLeuIle
25 30 35
Se rMe tAla
68. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 51 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 68. számú szekvencia TCTCTTAGCCATGGAGATCAAGTTAACAACATCCAAAGCCAAAGTAGTGTT
69. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 123 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 69. számú szekvencia
CAACCAATTG ACGACACTGA ATCTAACACT ACTTCTGTCA ACTTGATGGC TGACGACACT GAATCTAGAT TCGCTACTAA CACTACTTTG GCTTTGGATG TTGTTAACTT GATCTCCATG GCT
70. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 65 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 70. számú szekvencia
Ly s Arg Glu Glu Al a Glu Al a Glu Alá Glu Pro Ly s Ph e Va 1
1 5 10
Asn Gin Hi s Leu Cy s Gly Ser Hi s Leu Va 1 G1 u Al a Leu Tyr
15 20 25
Leu Va 1 Cy s Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Phe Ly s Al a
30 35 40
Al a Ly s Gly I le Va 1 Glu Gin Cy s Cy s Thr Ser 1 le Cy s Ser
45 50 55
Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cy s As n
60 65
71. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 219 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 71. számú szekvencia AAGAGAGAAG AAGCTGAAGC TGAAGCTGAA CTTGTGTGGT TCTCACTTGG
GAGGTTTCTT CTACACTCCT TGTACCTCCA TCTGCTCCTT
TTGAAGCTTT
AAGGCTGCTA
GTACCAATTG
CCAAAGTTCG
GTACTTGGTT
AGGGTATTGT
GAAAACTACT
TTAACCAACA
TGCGGTGAAA
CGAACAATGC
GCAACTAGAC
GCAGCCCGCA GGCTCTAGA (i) A szekvencia jellemzői: (A) Hossz: 348 bázispár
72. számú szekvenciavázlat
HU 221 118 Β1 (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 72. számú szekvencia
TTAAATCTAT
TTCAAACAAG
GGTACCAAAA
ACTCTTTGCA
ACACTACTTC
ACTAACACTA
TGGTTCTCAC
AACTACAAAA
AAGATTACAA
TAATGAAACT
TCTCAGGTCC
TGTCAACTTG
CTTTGGTTAA
AACACATACA
ACTATCAATT
GAAAACTGTA
TTGGCCAACC
ATGGCTGACG
CTTGGCTAAC
GGAATTCCAT
TCATACACAA
AGATCTGCGG
AATTGACGAC
ACACTGAATC
GTTGCCAACC
TTGGTTGAAG CTTTGTACTT ATGGCTAAGA GATTCGTT
TCAAGAATAG
TATAAACGAC
TCCTTTCGTC
ACTGAATCTA
TAGATTCGCT
AACACTTGTG
73. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 379 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 73. számú szekvencia TTAAATCTAT AACTACAAAA AACACATACA GGAATTCCAT TCAAGAATAG TTCAAACAAG AAGATTACAA ACTATCAATT TCATACACAA TATAAACGAC GGTACCAAAA TAATGAAACT GAAAACTGTA AGATCTGCGG TCCTTTCGTC ACTCTTTGCA TCTCAGGTCC TTGGCCAACC AATTGACGAC ACTGAATCTA ACACTACTTC TGTCAACTTG ATGGCTGACG ACACTGAATC TAGATTCGCT ACTAACACTA CTTTGGATGT TGTTAACTTG ATCTCCATGG CTAAGAGAGA AGAAGCTGAA GCTGAAGCTG AACCAAAGTT CGTTAACCAA CACTTGTGTG GTTCTCACTT GGTTGAAGCT TTGTACTTG

Claims (28)

1. DNS-expressziós kazetta, amely az alábbi szekvenciát tartalmazza:
5’-P-SP-LS-PS*gcn*-(T),-3’ amelyben
P jelentése promoterszekvencia,
SP jelentése egy szignálpeptidet kódoló DNS-szekvencia,
LS jelentése egy (I) általános képletű vezérpeptidet kódoló DNS-szekvencia:
GlnProIle(Asp)/Glu)(Asp/Glu)Xl(Glu)/Asp)X2AsnZ (Thr/Ser)X3, amelyben
X1 jelentése peptidkötés vagy kódolható aminosav; X2 jelentése peptidkötés, egy kódolható aminosav vagy egy maximum 4 kódolható aminosavat tartalmazó szekvencia, amely aminosavak lehetnek azonosak vagy eltérőek;
Z jelentése egy kódolható aminosav, Pro kivételével; és
X3 jelentése egy 4-30 kódolható aminosavat tartalmazó szekvencia, amely aminosavak lehetnek azonosak vagy eltérőek;
PS jelentése egy processzálási helyet kódoló DNS-szekvencia;
*gén* jelentése egy polipeptidet kódoló DNS-szekvencia;
T jelentése terminátorszekvencia; és i értéke 0 vagy 1.
2. Az 1. igénypont szerinti expressziós kazetta, amelyben az (I) általános képletben X1 jelentése Ser, Thr vagy Alá.
3. Az 1. igénypont szerinti expressziós kazetta, amelyben az (I) általános képletben X2 jelentése Ser, Thr vagy Alá.
4. Az 1. igénypont szerinti expressziós kazetta, amelyben az (I) általános képletben X2 jelentése Serlle.
5. Az 1. igénypont szerinti expressziós kazetta, amelyben az (I) általános képletben X2 jelentése SerAlalle.
6. Az 1. igénypont szerinti expressziós kazetta, amelyben az (I) általános képletben X2 jelentése SerPheAlaThr.
7. Az 1. igénypont szerinti expressziós kazetta, amelyben az (I) általános képletben X3 jelentése a (II) általános képletű X4-X5-X6 aminosavszekvencia, amelyben
X4 jelentése 1-21 kódolható aminosavból álló szekvencia,
X5 jelentése Pro vagy a ValAsnLeu, LeuAlaAsn V al AlaM et Alá, Leu A sp V al V al AsnLeuProGly vagy LeuAspValValAsnLeuIleSerMet szekvenciák közül az egyik,
X6 jelentése 1-8 kódolható aminosavból álló szekvencia.
8. A 7. igénypont szerinti expressziós kazetta, amelyben a (II) általános képletben X4 jelentése a Leu ValAsnLeu, SerValAsnLeu, MetAlaAsp, ThrGluSer, ArgPheAlaThr vagy ValAlaMetAla szekvenciák közül az egyik.
HU 221 118 Β1
9. A 7. igénypont szerinti expressziós kazetta, amelyben a (II) általános képletben X4 jelentése az Asn SerThr vagy AsnThrThr szekvenciák közül az egyik.
10. A 7. igénypont szerinti expressziós kazetta, amelyben a (II) általános képletben X4 jelentése a (Ser/Leu)V al AsnLeu, (Ser/Leu)ValAsnLeuMetAlaAsp, (Ser/Leu)ValAsnLeuMetAlaAspAsp, (Ser/Leu)ValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSer, (Ser/Leu)ValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerIle vagy (Ser/Leu)ValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPhe AlaThr szekvenciák közül az egyik.
11. A 7. igénypont szerinti expressziós kazetta, amelyben a (II) általános képletben X4 jelentése az Asn(Thr/Ser)ThrLeu,
Asn(Thr/Ser)ThrLeuAsnLeu vagy
Asn(Thr/Ser)ThrLeuValAsnLeu szekvenciák közül az egyik.
12. A 7. igénypont szerinti expressziós kazetta, amelyben a (II) általános képletben X5 jelentése Pro.
13. A 7. igénypont szerinti expressziós kazetta, amelyben a (II) általános képletben X5 jelentése a Val AsnLeu szekvencia.
14. A 7. igénypont szerinti expressziós kazetta, amelyben a (II) általános képletben X5 jelentése a LeuAlaAsnValAlaMetAla szekvencia.
15. A 7. igénypont szerinti expressziós kazetta, amelyben a (II) általános képletben X5 jelentése a LeuAspV alV al AsnLeuProGly szekvencia.
16. A 7. igénypont szerinti expressziós kazetta, amelyben a (II) általános képletben X5 jelentése a LeuAspValValAsnLeuIleSerMet szekvencia.
17. A 7. igénypont szerinti expressziós kazetta, amelyben a (II) általános képletben X6 jelentése Alá, Gly, Leu, Thr, Val vagy Ser.
18. A 7. igénypont szerinti expressziós kazetta, amelyben a (II) általános képletben X6 jelentése Gly Alá vagy SerAla.
19. A 7. igénypont szerinti expressziós kazetta, amelyben a (II) általános képletben X6 jelentése Alá Val Alá.
20. A 7. igénypont szerinti expressziós kazetta, amelyben a (II) általános képletben X6 jelentése GlyAlaAspSerLysThrValGlu.
21. Az 1. igénypont szerinti expressziós kazetta, amelyben az LS DNS-szekvencia által kódolt vezérpeptidet az alábbi csoportból választjuk:
1. számú szekvencia:
GlnProIleAspGluAspAsnAspThrSerValAsnLeuProAla;
2. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspGluAsnThrThrSerValAsnLeuProAla;
3. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuProAla;
4. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspGluAsnThrThrSerValAsnLeuProVal;
5. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluAsnThrThrSerValAsnLeuProAla;
6. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuProAla;
7. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspGluAsnThrThrSerValAsnLeuMetAla;
8. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuProGlyAla;
9. számú szekvencia:
GlnProIle Asp AspThrGluSerAsnThrThrSerV al AsnLeuM et Alá;
10. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnValProThr;
11. számú szekvencia :
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrLeuValAsnValProThr;
12. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuProThr;
13. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrLeuV al AsnV alProGlyAla;
14. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaProAlaValAla;
15. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAspLeuAlaValGlyLeuProGlyAla;
16. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGlu
SerlleAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla;
17. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerlleAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla;
HU 221 118 Β1
18. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla;
19. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGlu
SerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuValAsnLeuProLeu;
20. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGlu
SerlleAsnThrThrLeuValAsnLeuAlaAsnValAlaMetAla;
21. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAlalleAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla;
22. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerPheAlaThrAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla;
23. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerlleAsnThrTheLeuValAsnLeuMetAlaAspAspThr GluSerArgPheAlaThr AsnThr ThrLeuV alAsnLeuProLeu;
24. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerlleAsnThrTheLeuValAsnLeuMetAlaAspAspThr
GluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAspValValAsnLeuGlyAla;
25. számú szekvencia:
GlnProlleAspAspThrGluSerPheAlaAlalleAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla;
26. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGlu SerArgPheAlaThrAsnThrThr LeuValAsnLeuAlaAsnValAlaMetAla;
27. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGlu
SerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAspValValAsnLeuIleSerMetAla;
28. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAsnThrThrGlu SerArgPheAlaThrAsnThrThr LeuAspValValAsnLeuIleSerMetAla;
67. számú szekvencia:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGlu
SerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAlaLeuAspValValAsnLeulleSerMetAla.
22. Az 1. igénypont szerinti expressziós kazetta, amelyben SP egy DNS-szekvencia, amely az a-faktor szignálpeptidjét, az egémyálmirigy amiláz szignálpeptidjét, a karboxipeptidáz szignálpeptidjét, az élesztő aszparagin proteáz 3 szignálpeptidjét vagy az élesztő BARI szignálpeptidjét kódolja.
23. Az 1. igénypont szerinti expressziós kazetta, amelyben SP egy DNS-szekvencia, amely a LysArg, ArgLys, ArgArg, LysLys vagy Ile-GluGlyArg pepiidet kódolja.
24. Az 1. igénypont szerinti expressziós kazetta, amelyben SP egy DNS-szekvencia, amelyben a polipeptidet az alábbi csoportból választjuk: aprotinin, szöveti faktor bioszintézis inhibitor, vagy egyéb proteázinhibitorok, inzulin vagy inzulinprekurzorok, inzulinszerű I-es növekedési faktor, inzulinszerű Π-es növekedési faktor, humán- vagy szarvasmarha-növekedési hormon, interleukin, glukagon, glukagonszerű I-es peptid, szöveti plazminogén aktivátor, a és β transzformáló növekedési faktor, vérlemezke-eredetű növekedési faktor, enzimek vagy azok funkcionális analógjai.
25. Élesztő-expressziósvektor, amely az előző igénypontok bármelyike szerinti expressziós kazettát tartalmaz.
26. Elesztősejt, amely képes polipeptid expressziójára, és amelyet a 25. igénypont szerinti élesztő-expressziósvektorral transzformáltunk.
27. Eljárás polipeptid előállítására élesztőben, azzal jellemezve, hogy egy olyan élesztősejtet tenyésztünk megfelelő táptalajban, amely képes a kívánt polipeptid expressziójára, és amelyet a 25. igénypont szerinti élesztő-expressziósvektorral transzformáltunk, hogy a polipeptid expresszióját és szekrécióját elérjük, majd a polipeptidet kinyerjük a táptalajból.
HU 221 118 Β1
Int. Cl.7: C 12 N 15/81
11283
EcoRI
HindlII
8000
10000
EcoRI HindlII Xbal
HindlII
2000
EcoRI
HindlII EcoRI 6000
HindlII
EcoRI
HindlII HindlII 4000
1. ábra
HU 221 118 Β1
Int. Cl.7: C 12 N 15/81
2. ábra
EcoR i
GAATTCATTCAAGAATAGT
CTTAAGTAAGTTCTTATCA
TCAAACAAGAAGATTACAAACTATCAATTTCATACACAATATAAACGACGGGTACCAAAA
AGTTTGTTCTTCTAATGTTTGATAGTTAAAGTATGTGTTATATTTGCTGCCCATGGTTTT taatgaaactgaaaactgtaagatctgcggtcctttcgtcactctttgcatctcaggtcctt attactttgacttttgacattctagacgccaggaaagcagtgagaaacgtagagtccaggaa
MetLysLeuLysThrValArgSerAlaValLeuSerSerLeuPheAlaSerGlnValLeu
GGCCAACCAATAGACGAAGACAACGACACTTCTTCCATGGCTAAGAGATTCGTTAACCAA
CCGGTTGGTTATCTGCTTCTGTTGCTGTGAAGAAGGTACCGATTCTCTAAGCAATTGGTT
GlyGlnProIleAspGluAspAsnAspThrSerSerMetAlaLysArgPheValAsnGln
CACTTGTGCGGTTCCCACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTC
GTGAACACGCCAAGGGTGAACCAACTTCGAAACATGAACCAAACGCCACTTTCTCCAAAG
HisLeuCysGlySerHisLeuValGluAlaLeuTyrLeuValCysGlyGluArgGlyPhe
TTCTACACTCCTAAGGCTGCTAAGGGTATTGTCGAGCAATGCTGTACCTCCATCTGCTCC
AAGATGTGAGGATTCCGACGATTCCCATAACAGCTCGTTACGACATGGAGGTAGACGAGG
PheTyrThrProLysAlaAlaLysGlylleValGluGlnCysCysThrSerlleCysSer
Xba I
TTGTACCAATTGGAAAACTACTGCAACTAGACGCAGCCCGCAGGCTCTAGA AACATGGTTAACCTTTTGATGACGTTGATCTGCGTCGGGCGTCCGAGATCT LeuTyrG1nLeuG1uAsnTyrCysAsn*
HU9603477A 1994-06-16 1995-06-16 Synthetic leader peptide sequences HU221118B1 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK70594 1994-06-16
US28285294A 1994-07-29 1994-07-29
PCT/DK1995/000249 WO1995034666A1 (en) 1994-06-16 1995-06-16 Synthetic leader peptide sequences

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9603477D0 HU9603477D0 (en) 1997-02-28
HUT76378A HUT76378A (en) 1997-08-28
HU221118B1 true HU221118B1 (en) 2002-08-28

Family

ID=26064490

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9603477A HU221118B1 (en) 1994-06-16 1995-06-16 Synthetic leader peptide sequences

Country Status (20)

Country Link
US (2) US5639642A (hu)
EP (1) EP0763117B1 (hu)
JP (1) JP3676369B2 (hu)
KR (1) KR100251054B1 (hu)
CN (1) CN1115413C (hu)
AT (1) ATE208823T1 (hu)
AU (1) AU693569B2 (hu)
BR (1) BR9508033A (hu)
CZ (1) CZ290069B6 (hu)
DE (1) DE69523915T2 (hu)
DK (1) DK0763117T3 (hu)
ES (1) ES2168367T3 (hu)
FI (1) FI965005A (hu)
HU (1) HU221118B1 (hu)
MX (1) MX9606492A (hu)
NO (1) NO965362L (hu)
PL (1) PL317722A1 (hu)
PT (1) PT763117E (hu)
UA (1) UA40648C2 (hu)
WO (1) WO1995034666A1 (hu)

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2686899B1 (fr) * 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US6500645B1 (en) 1994-06-17 2002-12-31 Novo Nordisk A/S N-terminally extended proteins expressed in yeast
ZA9610456B (en) * 1995-12-20 1997-06-20 Novo Nordisk As N-terminally extended proteins expressed in yeast
EP1365028B1 (en) * 1996-12-13 2009-03-18 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Method for expression of PDGF or IGF proteins in yeast
EP0946735B1 (en) * 1996-12-20 2006-02-08 Novo Nordisk A/S N-terminally extended proteins expressed in yeast
AU5549998A (en) 1997-01-24 1998-08-18 Novo Nordisk A/S Synthetic leader peptide sequences
CA2205076A1 (en) 1997-05-14 1998-11-14 Jim Hu Episomal expression cassettes for gene therapy
JP2003525570A (ja) 1998-01-23 2003-09-02 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 酵母において所望のポリペプチドを産生する方法
PL356005A1 (en) 1999-12-29 2004-05-31 Novo Nordisk A/S Method for making insulin precursors and insulin precursor analogues having improved fermentation yield in yeast
EP1278544A4 (en) 2000-04-12 2004-08-18 Human Genome Sciences Inc ALBUMIN FUSION PROTEINS
US20050100991A1 (en) * 2001-04-12 2005-05-12 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP1401477A4 (en) * 2001-05-25 2005-02-02 Human Genome Sciences CHIMIOKINE BETA-1 HYBRID PROTEINS
WO2005003296A2 (en) 2003-01-22 2005-01-13 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP2277910A1 (en) 2001-12-21 2011-01-26 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP1463752A4 (en) * 2001-12-21 2005-07-13 Human Genome Sciences Inc ALBUMIN FUSION PROTEINS
GB0217033D0 (en) * 2002-07-23 2002-08-28 Delta Biotechnology Ltd Gene and polypeptide sequences
EP1687428A1 (en) 2003-11-14 2006-08-09 Novo Nordisk A/S Processes for making acylated insulin
ATE517119T1 (de) 2003-12-03 2011-08-15 Novo Nordisk As Einzelketteninsulin
PL1729795T3 (pl) * 2004-02-09 2016-08-31 Human Genome Sciences Inc Białka fuzyjne albuminy
US7527947B2 (en) * 2004-06-14 2009-05-05 Novozymes A/S Signal peptide for producing a polypeptide
WO2007020256A1 (en) 2005-08-16 2007-02-22 Novo Nordisk A/S Method for making mature insulin polypeptides
US20090068158A1 (en) * 2005-12-09 2009-03-12 Medin Jeffrey A Thymidylate kinase mutants and uses thereof
US20090074733A1 (en) * 2005-12-09 2009-03-19 Medin Jeffrey A Thymidylate kinase mutants and uses thereof
ATE557037T1 (de) 2006-02-27 2012-05-15 Novo Nordisk As Insulin derivate
EP2514823B1 (en) 2006-03-03 2018-05-02 ProMIS Neurosciences Inc. Methods and compositions to treat and detect misfolded-SOD1 mediated diseases
CN101541830A (zh) 2006-09-22 2009-09-23 诺沃-诺迪斯克有限公司 蛋白酶抗性的胰岛素类似物
WO2008037735A1 (en) 2006-09-27 2008-04-03 Novo Nordisk A/S Method for making maturated insulin polypeptides
CA2584494A1 (en) * 2007-03-27 2008-09-27 Jeffrey A. Medin Vector encoding therapeutic polypeptide and safety elements to clear transduced cells
ES2654303T3 (es) 2007-05-04 2018-02-13 University Health Network Inmunoterapia de IL-12 contra el cáncer
WO2008139496A1 (en) * 2007-05-16 2008-11-20 Bigtec Private Limited Recombinant human insulin and a method thereof
EP2170945A1 (en) 2007-07-16 2010-04-07 Novo Nordisk A/S Protease stabilized, pegylated insulin analogues
EP2910571B1 (en) 2008-03-18 2016-10-05 Novo Nordisk A/S Protease stabilized, acylated insulin analogues
US8568709B2 (en) * 2008-03-20 2013-10-29 University Health Network Thymidylate kinase fusions and uses thereof
WO2011089170A2 (en) 2010-01-22 2011-07-28 Novo Nordisk A/S Process for preparing fgf-21 with low degree of o-glycosylation
ES2550761T3 (es) 2009-11-25 2015-11-12 Novo Nordisk A/S Método para producción de polipéptidos
RU2460795C1 (ru) * 2011-07-06 2012-09-10 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") Способ микробиологического синтеза секретируемого соматотропина человека и штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae - продуцент секретируемого соматотропина человека
WO2014078819A2 (en) 2012-11-16 2014-05-22 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Site-specific enzymes and methods of use
EP2925345B1 (en) 2012-12-03 2018-09-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Method for making o-glycosylated carboxy terminal portion (ctp) peptide-based insulin and insulin analogues
WO2014195452A1 (en) 2013-06-07 2014-12-11 Novo Nordisk A/S Method for making mature insulin polypeptides
WO2015128507A1 (en) 2014-02-28 2015-09-03 Novo Nordisk A/S Mating factor alpha pro-peptide variants
US20170151281A1 (en) 2015-02-19 2017-06-01 Batu Biologics, Inc. Chimeric antigen receptor dendritic cell (car-dc) for treatment of cancer
EP3268384B1 (en) 2015-03-10 2021-11-03 Merck Sharp & Dohme Corp. Process for preparing recombinant insulin using microfiltration
PT3310909T (pt) 2015-06-17 2021-09-09 Poseida Therapeutics Inc Composições e métodos para dirigir proteínas para loci específicos no genoma
CN105418755A (zh) * 2015-12-28 2016-03-23 珠海冀百康生物科技有限公司 速效胰岛素前体蛋白以及速效胰岛素的制备方法
WO2019126578A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for directing proteins to specific loci in the genome
EP3750998A4 (en) * 2018-02-09 2022-02-23 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. CODON-OPTIMIZED PRECURSOR GENE AND SIGNAL PEPTID GENE OF HUMAN INSULIN ANALOGUE
AU2021376354A1 (en) 2020-11-04 2023-06-22 Myeloid Therapeutics, Inc. Engineered chimeric fusion protein compositions and methods of use thereof
WO2022197949A2 (en) 2021-03-17 2022-09-22 Myeloid Therapeutics, Inc. Engineered chimeric fusion protein compositions and methods of use thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1340772C (en) * 1987-12-30 1999-09-28 Patricia Tekamp-Olson Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences
US5037743A (en) * 1988-08-05 1991-08-06 Zymogenetics, Inc. BAR1 secretion signal
DK300090D0 (da) * 1990-12-19 1990-12-19 Novo Nordisk As Fremgangsmaade til fremstilling af leadersekvenser

Also Published As

Publication number Publication date
DE69523915T2 (de) 2002-08-22
BR9508033A (pt) 1999-06-29
JPH10501413A (ja) 1998-02-10
KR100251054B1 (ko) 2000-04-15
WO1995034666A1 (en) 1995-12-21
AU2733495A (en) 1996-01-05
EP0763117B1 (en) 2001-11-14
DK0763117T3 (da) 2002-02-18
FI965005A (fi) 1997-02-13
NO965362L (no) 1997-02-13
FI965005A0 (fi) 1996-12-13
ATE208823T1 (de) 2001-11-15
PL317722A1 (en) 1997-04-28
CZ290069B6 (cs) 2002-05-15
HUT76378A (en) 1997-08-28
HU9603477D0 (en) 1997-02-28
CN1154143A (zh) 1997-07-09
MX9606492A (es) 1997-03-29
EP0763117A1 (en) 1997-03-19
US5795746A (en) 1998-08-18
NO965362D0 (no) 1996-12-13
UA40648C2 (uk) 2001-08-15
DE69523915D1 (en) 2001-12-20
JP3676369B2 (ja) 2005-07-27
ES2168367T3 (es) 2002-06-16
PT763117E (pt) 2002-05-31
CZ364196A3 (en) 1997-05-14
CN1115413C (zh) 2003-07-23
AU693569B2 (en) 1998-07-02
US5639642A (en) 1997-06-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU221118B1 (en) Synthetic leader peptide sequences
AU660161B2 (en) A method of constructing synthetic leader sequences
JP3730255B2 (ja) イーストにおいて発現されたｎ末端に伸長した蛋白質
US5162498A (en) Synthetic yeast leader peptides
JP3542604B2 (ja) Ｙａｐ３シグナルペプチドをコードするｄｎａ構築体
HU211600A9 (en) Yeast expressing system
EP0946735B1 (en) N-terminally extended proteins expressed in yeast
JP4180112B2 (ja) 酵母細胞におけるｎ末端を伸長されたタンパクの発現のためのベクター
RU2167939C2 (ru) Способ продуцирования полипептида в дрожжах
CA2192942C (en) Synthetic leader peptide sequences

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees