CZ290069B6 - DNA expresní kazeta, kvasinkový expresní vektor,buňka kvasinky a způsob výroby heterologního polypeptidu v kvasinkách - Google Patents

DNA expresní kazeta, kvasinkový expresní vektor,buňka kvasinky a způsob výroby heterologního polypeptidu v kvasinkách Download PDF

Info

Publication number
CZ290069B6
CZ290069B6 CZ19963641A CZ364196A CZ290069B6 CZ 290069 B6 CZ290069 B6 CZ 290069B6 CZ 19963641 A CZ19963641 A CZ 19963641A CZ 364196 A CZ364196 A CZ 364196A CZ 290069 B6 CZ290069 B6 CZ 290069B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
seq
sequence
dna
leu
ser
Prior art date
Application number
CZ19963641A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ364196A3 (en
Inventor
Thomas Borglum Kjeldsen
Knud Vad
Original Assignee
Novo Nordisk A/S
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novo Nordisk A/S filed Critical Novo Nordisk A/S
Publication of CZ364196A3 publication Critical patent/CZ364196A3/cs
Publication of CZ290069B6 publication Critical patent/CZ290069B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Je pops na DNA expresn kazeta, kter obsahuje n sleduj c sekvenci 5'-P-SP-LS-PS-*gen*-(T).sub.i.n.-3', v n P znamen sekvenci promotoru, SP znamen DNA sekvenci k duj c sign ln peptid, LS znamen DNA sekvenci k duj c leader peptid, PS znamen DNA sekvenci k duj c m sto opracov n , *gen* znamen DNA sekvenci k duj c polypeptid, T znamen sekvenci termin toru a i znamen slo 0 nebo 1. D le je pops n kvasinkov² expresn vektor, kter² obsahuje tuto kazetu, a bu ka kvasinky, kter je schopna exprimovat polypeptid a kter je transformov na kvasinkov²m expresn m vektorem. Je pops n tak zp sob v²roby polypeptidu v kvasink ch, kter² zahrnuje kultivov n kvasinkov bu ky, kter je schopna exprimovat dan² polypeptid a kter je transformov na kvasinkov²m expresn m vektorem, ve vhodn m m diu, tak e dojde k expresi a sekreci polypeptidu, na e se polypeptid izoluje z m dia.\

Description

Oblast techniky
Předložený vynález se týká DNA expresní kazety, kvasinkového expresního vektoru, buňky kvasinky a způsobu výroby polypeptidu v kvasinkách. Podrobněji - předložený vynález se týká sekvencí syntetického leader peptidu pro sekretování polypeptidů v kvasinkách.
Dosavadní stav techniky
Kvasinkové organismy produkují četné proteiny, které jsou syntetizovány intracelulámě, ale které mají funkci mimo buňku. Tyto extracelulámí proteiny se označují jako sekretované proteiny. Tyto sekretované proteiny se exprimují původně uvnitř buňky ve formě prekurzoru nebo preproteinu obsahujícím presekvenci zajišťující efektivní směrování exprimovaného produktu přes membránu endoplazmového retikula (ER). Presekvence, normálně označovaná jako signální peptid, se během translokace obvykle odštěpí od žádaného produktu. Jakmile jednou protein vstoupí na sekreční cestu, je transportován do Golgiho aparátu. Odtud může protein pokračovat různými cestami, které vedou k takovým částečkám, jako je buněčná vakuola nebo buněčná membrána, nebo může být veden ven z buňky, takže je sekretován do vnějšího prostředí [Pfeffer S.R. a Rothman J.E.: Ann. Rev. Biochem. 56, 829 (1987).].
Pro expresi a sekreci proteinů v kvasinkách heterologních pro kvasinky bylo navrženo několik přístupů. Evropská publikovaná patentovaná přihláška č. 88 632 popisuje postup, podle kterého jsou proteiny heterologní pro kvasinky exprimovány, opracovány a sekretovány transformováním kvasinkového organismu expresním vektorem nesoucím DNA kódující žádaný protein a signální peptid, připravením kultury transformovaného organismu, růstem kultury a izolováním proteinu z kultivačního prostředí.
Signální peptid může znamenat signální peptid žádaného proteinu samotného, heterologní signální peptid nebo hydrid přírodního nebo heterologního signálního peptidu.
Problémem, se kterým se setkáváme při použití signálních peptidů heterologních pro kvasinku, může být to, že heterologní signální peptid nezajišťuje účinnou translokaci a/nebo odštěpení po signálním peptidu.
Saccharomyces cerevisiae MFal (alfa-faktor) je syntetizován jako propro-forma 165 aminokyselin obsahující signální nebo pre-peptid 19 aminokyselin následovaných „leader“ nebo pre-peptidem 64 aminokyselin, zahrnujícím tři N-navázaná glykosylační místa následovaná (LysArg((Asp/Glu)Ala)2_3alfafaktorem)4 [Kurjan J. a Herskowitz I.: Cell 30. 933 (1982).]. Část signál-leader prepro MFal je široce používána při syntéze a sekreci heterologních proteinů v S. cerevisiae.
Použití signálních/leader peptidů homologních pro kvasinku jě“ známo z, mimo jiné, USA patentového spisu číslo 4 546 082, evropských publikovaných patentových přihlášek číslo 116 201, 123 294,123 544, 163 529 a 123 189 a dánské patentové přihlášky č. 3614/83.
V evropském patentu 123 289 je popsáno použití S. cerevisiae alfa-faktorového prekurzoru, zatímco spis WO 84/01 153 popisuje použití S. cerevisiae invertasového signálního peptidu a dánská přihláška 3614/83 použití S. cerevisiae PH05 signálního peptidu pro sekreci cizích proteinů.
- 1 CZ 290069 B6
US patentový spis č. 4 546 082 a evropské patenty číslo 16 201, 123 294, 123 544 a 163 529 popisují postupy, při nichž se signál-leader alfa-faktoru z S. cerevisiae (MFlal nebo MFa2) používá při sekreci exprimovaných heterologních proteinů v kvasince. Bylo prokázáno napojení DNA sekvence kódující S. cerevisiae MFal signální/leader sekvenci na 5' konec genu pro sekreci 5 žádaného proteinu a opracování žádaného proteinu.
Evropský patent 206 783 popisuje systém pro sekreci polypeptidů z S. cerevisiae použitím leader sekvence alfa-faktoru, která byla upravena tak, že byly odstraněny 4 alfa-faktorové jednotky přítomné v přírodní leader sekvenci takže se získá leader peptid samotný napojený na heterologní ío polypeptid místem Lys. konstrukce vede k účinnému opracování menších peptidů (menší než aminokyselin). Pro sekreci a opracování větších polypeptidů se leader sekvence přírodního alfa-faktoru upraví tak, aby zůstala jedna nebo dvě alfa-faktorové jednotky mezi leader peptidem a polypeptidem.
Četné sekretované proteiny jsou vedeny po takové cestě, aby byly vystaveny působení proteolytického opracovávacího systému, který může štěpit peptidovou vazbu na karboxylovém konci dvou po sobě jdoucích bazických aminokyselin. Tato enzymatická aktivita je v S. cerevisiae kódována KEX 2 genem [Julius D.A. a spol.: Cell 37, 1075 (1084b).]. Opracování produktu KEX 2 proteázou je potřeba pro sekreci aktivního S. cerevisiae kopulačního faktoru al 20 (MFal nebo alfa-faktor), při čemž KEX 2 není zahrnuta v sekreci aktivního S. cerevisiae faktoru alfa.
Sekrece a správné opracování polypeptidu, o kterém se předpokládá, že bude sekretován, se dosáhne v některých případech tak, že se kultivuje kvasinkový organismus, kteiý je 25 transformován vektorem zkonstruovaným tak, jak je shora uvedeno v odkazech. V mnoha případech je však úroveň sekrece velmi nízká nebo vůbec nedochází k sekreci a nebo proteolytické opracování může být nepřesné nebo neúplné. Předmětem předloženého vynálezu je tedy získat leader peptidy, které zajišťují účinnější expresi a/nebo opracování polypeptidů.
Podstata vynálezu
Překvapivě byl nalezen nový typ leader peptidu, který umožňuje sekreci polypeptidu v kvasince ve vysokém výtěžku.
Předložený vynález se tedy týká DNA expresní kazety, která obsahuje následující sekvenci
5'-P-SP-LS-PS-*gen*-(T)i-3', v níž P znamená sekvenci promotoru,
SP znamená DNA sekvenci kódující signální peptid,
LS znamená DNA sekvenci kódující leader peptid obecného vzorce I
GlnProIleíAsp/GluXAsp/GlujX^GluPAspjX^snZtThr/SerjX3©, v němž
X1 znamená peptidovou vazbu nebo 1 z 21 přirozeně se vyskytujících aminokyselin,
X2 znamená peptidovou vazbu, 1 z 21 přirozeně se vyskytujících aminokyselin nebo sekvenci až 4 z 21 přirozeně se vyskytujících aminokyselin, které mohou být stejné nebo různé,
Z znamená 1 z 21 přirozeně se vyskytujících aminokyselin vyjma Pro a
-2CZ 290069 B6
X3 znamená sekvenci 4 až 30 z 21 přirozeně se vyskytujících aminokyselin, které mohou být stejné nebo různé,
PS znamená DNA sekvenci kódující místo opracování, *gen* znamená DNA sekvenci kódující heterologní polypeptid,
T znamená sekvenci terminátoru a i znamená číslo 0 nebo 1.
V této souvislosti výraz „leader peptid“ označuje takový peptid, jehož funkce umožňuje, aby exprimovaný polypeptid byl směrován z endoplazmového retikula do Golgiho aparátu a dále do sekrečních váčků pro sekreci do prostředí (tj. export exprimovaného polypeptidu přes buněčnou stěnu nebo alespoň buněčnou membránu do periplazmového prostoru buňky). Pojem „syntetický“ tak, jak se používá v souvislosti s leader peptidy, je míněn tak, že dotyčný leader peptid znamená peptid, který se nenachází v přírodě.
Pojem „signální peptid“ je zde chápán jako označení presekvence, která je převážně hydrofobní a která je přítomna jako N-koncová sekvence prekurzorové formy extracelulámího proteinu exprimovaného v kvasince. Funkcí signálního peptidu je umožnit, aby exprimovaný protein, který je sekretován, vstoupil do endoplazmového retikula. Signální peptid se normálně během tohoto procesu odštěpí. Signální peptid může být pro kvasinkový organismu, který produkuje tento protein, heterologní nebo homologní.
Výraz „polypeptid“ zde označuje heterologní polypeptid, tj. takový polypeptid, který není produkován organismem hostitelské kvasinky v přírodě, stejně jako homologní polypeptid, tj. takový polypeptid, který je produkován organismem hostitelské kvasinky v přírodě, ajakoukoliv jejich preformu. Ve výhodném provedení expresní kazeta podle předloženého vynálezu kóduje heterologní polypeptid.
Výraz „kódovatelná aminokyselina“ je zde míněn jako označení takové aminokyseliny, která může být kódována tripletem („kodonem“) nukleotidů.
Jestliže v aminokyselinových sekvencích uvedených v předloženém spisu jsou třípísmenkové kódy dvou aminokyselin oddělené lomítkem uvedeny v závorkách, např. (Asp/Glu), znamená to, že sekvence má v příslušné poloze buď jednu nebo druhou z těchto aminokyselin.
Podle dalšího aspektu se tento vynález týká způsobu výroby polypeptidu v kvasince, který se vyznačuje tím, že se kultivuje kvasinková buňka, která je schopna exprimovat polypeptid a která je transformována kvasinkovým expresním vektorem jak shora popsáno včetně sekvence leader peptidu podle tohoto vynálezu, ve vhodném prostředí, takže dojde k expresi a sekreci polypeptidu, načež se polypeptid z prostředí izoluje.
Předložený vynález je ilustrován odkazem na připojené obrázky.
Obr. 1 schematicky ukazuje plazmid pAK492.
Obr. 2 ukazuje část DNA sekvence kódující signální peptid/leader/MI3 inzulínový prekurzor.
Obr. 3 ukazuje konstrukci plazmidu pAK546.
Obr. 4 ukazuje aminokyselinovou sekvenci leader sekv. ind. č. 4 a DNA sekvenci, která ji kóduje.
Obr. 5 ukazuje DNA sekvenci S. cerevisiae expresního plazmidu pAK546 kódující signální peptid YAP3, leader sekv. id. č. 4 a MI3 inzulínový prekurzor a kódovanou aminokyselinovou sekvenci.
Obr. 6 ukazuje aminokyselinovou sekvenci leaderu sekv. id. č. 6 a DNA sekvenci, která ji kóduje.
Obr. 7 ukazuje aminokyselinovou sekvenci leaderu sekv. id. č. 8 a DNA sekvenci, která ji kóduje.
Obr. 8 ukazuje aminokyselinovou sekvenci leaderu sekv. id. č. 17 a DNA sekvenci, která ji kóduje.
Obr. 9 ukazuje aminokyselinovou sekvenci leaderu sekv. id. č. 16 a DNA sekvenci, která ji kóduje.
Obr. 10 ukazuje aminokyselinovou sekvenci leaderu sekv. id. č. 19 a DNA sekvenci, která ji kóduje.
Obr. 11 ukazuje aminokyselinovou sekvenci leaderu sekv. id. č. 20 a DNA sekvenci, která ji kóduje.
Obr. 12 ukazuje aminokyselinovou sekvenci leaderu sekv. id. č. 21 a DNA sekvenci, která ji kóduje.
Obr. 13 ukazuje DNA fragment pAK527 použitý jako řídicí templát při konstrukci sekv. id. č. 4 a 6.
Obr. 14 ukazuje DNA fragment pAD531 použitý jako řídicí templát při konstrukci sekv. id. č. 8.
Obr. 15 ukazuje DNA fragment pAK555 použitý jako řídicí templát při konstrukci sekv. id č. 16 a 17.
Obr. 16 ukazuje DNA fragment pAK559 použitý jako řídicí templát při konstrukci sekv. id č. 19 a 20.
Obr. 17 ukazuje DNA fragment pAK562 použitý jako řídicí templát při konstrukci sekv. id č. 21.
Obr. 18 ukazuje aminokyselinovou sekvenci leaderu sekv. id. č. 27 a DNA sekvenci sekv. id. č. 66, která ji kóduje.
Obr. 19 ukazuje aminokyselinovou sekvenci leaderu sekv. id. č. 70 na N-konci rozšířeného MI3 inzulínového prekurzoru a DNA sekvenci sekv. id. č. 71, která ji kóduje.
Obr. 20 ukazuje aminokyselinovou sekvenci leaderu sekv. id č. 67 a DNA sekvenci sekv. id. č. 69, která ji kóduje.
Obr. 21 ukazuje DNA fragment sekv. id. č. 72 pAK614 použitý jako řídicí templát při konstrukci sekv. id. č. 27.
A konečně obr. 22 ukazuje DNA fragment sekv. id. č. 73 pAK625 použitý jako řídicí templát při konstrukci sekv. id. č. 67.
V následující části spisu bude předložený vynález popsán podrobněji.
-4CZ 290069 B6
Jestliže X1 v obecném vzorci I znamená aminokyselinu, s výhodou znamená Ser, Thr nebo Ala. Jestliže X2 v obecném vzorci I znamená jednu aminokyselinu, s výhodou znamená Ser, Thr nebo Ala. Jestliže X2 v obecném vzorci I znamená sekvenci dvou aminokyselin, s výhodou znamená Serlle. Jestliže X2 v obecném vzorci I znamená sekvenci tří aminokyselin, s výhodou znamená SerAlalle. Jestliže X2 v obecném vzorci I znamená sekvenci čtyř aminokyselin, s výhodou znamená SerPheAlaThr. Ve výhodném provedení X3 znamená aminokyselinovou sekvenci obecného vzorce Π
X4-X5-X6 (Π), v němž
X4 znamená sekvenci 1 až 21 kódovatelných aminokyselin, které mohou být stejné nebo různé,
X5 znamená Pro nebo aminokyselinovou sekvenci vybranou ze sekvencí ValAsnLeu a LeuAlaAsnVaLAlaMetAla a
X6 znamená sekvenci 1 až 8 kódovatelných aminokyselin, které mohou být stejné nebo různé.
V obecném vzorci Π X4 znamená s výhodou aminokyselinovou sekvenci zahrnující jeden nebo více z motivů LeuValAsnLeu, SerValAsnLeu, MetAlaAsp, Thr,GluSer, ArgPheAlaThr nebo ValAla.MetAla nebo X4 znamená aminokyselinovou sekvenci AsnSerThr nebo AsnThrThr nebo X4 znamená aminokyselinovou sekvenci zahrnující sekvenci (Ser/Leu)ValAsnLeu, (Ser/Leu)ValAsnLeuMetALa.Asp, (Ser/Leu)ValAsnLeuMetAlaAspAsp, (Ser/Leu)ValAsnLeuMetAla.AspAspThrGluSer, (Ser/Leu)ValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerIle nebo (Ser/Leu)ValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThr nebo X4 znamená aminokyselinovou sekvenci zahrnující sekvenci Asn.(Thr/Ser)ThrLeu, Asn(Thr/Ser)ThrLeuAsnLeu nebo Asn(Thr/Ser).ThrLeu. ValAsnLeu nebo jakoukoliv jejich kombinaci.
X5 v obecném vzorci Π znamená s výhodou Pro nebo aminokyselinou sekvenci ValAsnLeu, LeuAlaAsnVaLAlaMetAla, leuAspVal.ValAsnLeuProGly nebo LeuAspValValAsnLeuIleSerMet.
Jestliže X6 v obecném vzorci Π znamená jednu aminokyselinu, s výhodou znamená Ala, Gly, Leu, Thr, Val nebo Ser. Jestliže X6 v obecném vzorci Π znamená sekvenci dvou aminokyselin, s výhodou znamená GlyAla nebo SerAla. Jestliže X6 v obecném vzorci Π znamená sekvenci tří aminokyselin, s výhodou znamená AlaValAla. Jestliže X6 v obecném vzorci II znamená sekvenci osmi aminokyselin, s výhodou znamená GlyAlaAspSerLysThrValGlu.
Příklady výhodných peptidů kódovaných DNA sekvencí LS jsou:
sekv. id. č. 1:
GlnProIleAspGluAspAsnAspThrSerV alAsnLeuProAla, sekv. id. č. 2:
GlnProIleAspAspGluAsnThrThrSerValAsnLeuProAla, sekv. id. č. 3:
GlnProIleAspAspGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuProAla, sekv. id. č. 4:
GlnProIleAspAspGluAsnThrThr SerV al AsnLeuPro V al, sekv. id. č. 5:
GlnProIleAspAspThrGluAsnThrThrSerVaLAsnLeuProAla,
-5CZ 290069 B6 sekv. id. č. 6:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuProAla, sekv. id. č. 7:
GlnProIleAspAspGluAsnThrThrYSerValAsnLeuMetAla, sekv. id. č. 8:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuProGlyAla, sekv. id. č. 9:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAla, sekv. id. č. 10:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerV alAsnV alProThr, sekv. id. č. 11:
GlnProIle Asp AspThrGluSerAsnThrThrLeuV alAsnV alProThr, sekv. id. č. 12:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerVaLAsnLeuProThr, sekv. id. č. 13:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrLeuV alAsnV alProGlyAla, sekv. id. č. 14:
GlnProIleAspAspThrGluYSerAsnThrThrSerVaLAsnLeuMetAlaProAlaVlaAla, sekv. id. č. 15:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerVaLAsnLeuMetAspLeuAlaValGlyLeuProGlyAla, sekv. id. č. 16:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerlleAsnThrThrLeu V alAsnLeuProGlyAla, sekv. id. č. 17:
GlnProIleAspAspThrGluSerlleAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla, sekv. id. č. 18:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrLeuVlaAsnLeuProGlyAla, sekv. id. č. 19:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerVaLAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuVlaAsnLeuProLeu, sekv. id. č. 20:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerlleAsnThrThrLeuVlaAsnLeuAlaAsnValAlaMetAIa, sekv. id. č. 21:
GlnProIleAspAspThrGluSerAlalleAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla, sekv. id. č. 22:
GlnProIleAspAspThrGluSerPheAlaThrAsnThrThrLeuVlaAsnLeuProGlyAla,
-6CZ 290069 B6 sekv. id. č. 23:
GlnProIleAspAspThrGluSerlleAsnThrThrLeuValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuValLeuPro Leu, sekv. id. č. 24:
GlnProIleAspAspThrGluSerlleAsnThrThrLeuVlaAslLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAsp V alV alAsnLeuProGlyAla, sekv. id. č. 25: GlnProIleAspAspThrGluSerAlaAlalIeAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla, sekv. id. č. 26:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuV alAsnLeuAlaAsn V alAlaMetAla, sekv. id. č. 27:
GlnProileAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAspV al-V aLAsnLeuIleSerMetAla, sekv. id. č. 28:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAsnThrThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAspV al V alAsnLeuIleSerMetAla a sekv. id. č. 67:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAlaLeuAspValVIaAsnLeuIleSerMetALaLysArg.
Zvláště výhodnými leader peptidy, které jsou kódovány DNA sekvencí LS, jsou:
sekv. id. č. 15:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAspLeuAlaValGlyLeuProGlyAIa, sekv. id. č. 16:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerlleAsnThrThrLeuV alAsnLeuProGlyAla, sekv. id. č. 17:
GlnProIleAspAspThrGluSerlleAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla, sekv. id. č. 18:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla, sekv. id. č. 19:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuVlaAsnLeuProLeu, sekv. id. č. 20:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerlleAsnThrThrLeuV alAsnLeuAlaAsnV alAlaMetALa, sekv. id. č. 21:
GlnProIleAspAspThrGluSerAlalleAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla, sekv. id. č. 22:
GlnProIleAspAspThrGluSerPheAlaThrAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla,
-7CZ 290069 B6 sekv. id. č. 23: GInProILeAspAspThrGIuSerIleAsnThrThrLeuValAsnLeuMetAlaAspAspThrGIuSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuV aLAsnLeuProLeu, sekv. id. č. 24: GlnProIleAspAspThrGluSerneAsnThrThrLeuValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAspV alV alAsnLeuProGlyAla, sekv. id. č. 25: GlnProIleAspAspThrGluSerAlaAlalleAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla, sekv. id. č. 26:
GlnProIleAspAspThrGluSerAnsThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuV aLAsnLeuAlaAsnV alAlaMetAla, sekv. id. č. 27: GlnProIieAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAspV al-V alAsnLeulleSerMetAla, sekv. id. č. 28: GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAsnThrThrGluSerArgpheAlaThrAsnThrThrLeuAspV alV alAsnLeulleSerMetAla a sekv. id. č. 67:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAlaLeuAspValValAsnLeuIleSerMetAlaLysArg.
Signální sekvence (SP) může kódovat jakýkoliv signální peptid, který zajišťuje efektivní směrování exprimovaného polypeptidu do sekvenční cesty buňky. Signální peptid může znamenat přirozeně se vyskytující signální peptid nebo jeho funkční části nebo může znamenat syntetický peptid. Bylo zjištěno, že vhodnými signálními peptidy jsou α-faktorový signální peptid, signální peptid myší slinné amylázy, modifikovaný karboxypeptidázový signální peptid, kvasinkový BARI signální peptid nebo Humicola lanuginosa Upasový signální peptid nebo jejich derivát. Signální sekvence myší slinné amylázy je popsána Hagenbůchlem O. a spol.: Nátuře 289, 643 (1981). Karboxypeptidázová signální sekvence je popsána Vallsem L.A. a spol.: Cell 48. 887 (1987). BARI signální peptid je popsán ve spisu WO 87/02670. Signální peptid kvasinkové aspartové proteázy 3 je popsán v dánské patentové přihlášce č. 0828/93.
Kvasinkovým místem opracování kódovaným DNA sekvencí PS může být s výhodou jakákoliv párová kombinace Lys a Arg, jako je LysArg, ArgLys, ArgArg nebo LysLys, která umožňuje opracování polypeptidu KEX2 proteázou Saccharomyces secevisiae nebo ekvivalentní proteázou v jiných druzích kvasinek [Julius D.A. a spol.: Cell 37. 1075 (1984).] Jestliže KEX2 opracování není vhodné, např. kdyby vedlo ke štěpení polypeptidového produktu, např. díky přítomnosti dvou po sobě následujících bazických aminokyselin uvnitř žádaného produktu, může být vybráno místo opracování jinou proteázou obsahující kombinaci aminokyselin, která se nenachází v polypeptidovém produktu, např. místo opracování pro FKa, IleGluGlyArg (viz např. Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 1989).
Protein vyrobený způsobem podle vynálezu může znamenat jakýkoliv protein, který lze s výhodou produkovat v kvasince. Příklady takových proteinů jsou heterologní proteiny, jako je aprotinin, inhibitor cesty tkáňového faktoru nebo jiné proteázové inhibitory, inzulín nebo prekurzor inzulínu, lidský nebo hovězí růstový hormon, interleukin, glukagon, GLP-1, IGF-I, IGF-Π, aktivátor tkáňového plazminogenu, transformační růstový faktor a nebo β, růstový faktor
-8CZ 290069 B6 odvozený od destiček, enzymy nebo jejich funkčních analogy. V této souvislosti pojem „funkční analog“ znamená protein s podobnou funkcí jako má přírodní protein (to je zamýšleno tak, že jde spíše o povahu než o úroveň biologické aktivity přírodního proteinu). Tento protein může být strukturně podobný přírodnímu proteinu a může být od přírodního proteinu odvozen přidáním jedné nebo více aminokyselin na jeden nebo na oba C- a N-konce přírodního proteinu, substitucí jedné nebo více aminokyselin na jednom nebo více různých místech přírodní aminokyselinové sekvence, delecí jedné nebo více aminokyselin na kterémkoliv nebo na obou koncích přírodního proteinu nebo na jednom nebo několika místech aminokyselinové sekvence nebo vložením jedné nebo více aminokyselin na jednom nebo na více místech přírodní aminokyselinové sekvence. Tyto modifikace jsou dobře známy pro některé shora uvedené proteiny. Způsobem podle vynálezu se mohou vyrábět také prekurzory nebo meziprodukty dalších proteinů. Příkladem takového prekurzoru je MI3 inzulínový prekurzor, který obsahuje sekvenci aminokyselin B(l-29)AlaAlaLysA(l-21), kde A(l-21)znamená A řetězec lidského inzulínu a B(l-29) znamená B řetězec lidského inzulínu, v němž chybí Thr(B30).
Výhodné DNA konstrukce kódující leader sekvence znamenají sekvence uvedené na obrázcích 4 až 12 nebo jejich vhodné modifikace. Příklady vhodných modifikací DNA sekvence jsou nukleotidové substituce, které neposkytují jinou aminokyselinovou sekvenci proteinu, ale které mohou odpovídat kodonů používanému kvasinkovým organismem, do něhož je DNA konstrukce vložena, nebo nukleotidové substituce, které poskytují odlišnou aminokyselinovou sekvenci a tedy, možná, odlišnou proteinovou struktur. Jiným příkladem možných modifikací je inserce jednoho nebo více kodonů do sekvence, přidání jednoho nebo více kodonů na kterýkoliv konec sekvence a delece jednoho nebo více kodonů na kterémkoliv konci sekvence nebo uvnitř sekvence.
Rekombinantní expresní vektor nesoucí expresní kazetu
5'-P-SP-LS-PS-*gen*-(T)r-3', v níž P, SP, LS, *gen*, T a i znamenají jak shora uvedeno, může znamenat jakýkoliv vektor, který je schopen replikace v kvasinkových organismech. Promotorem může být jakákoliv DNA sekvence, která vykazuje transkripční aktivitu v kvasince, a může být odvozen od genů kódujících proteiny bud’ homologní nebo heterologní s kvasinkou. Promotor je s výhodou odvozen od genu kódujícího protein homologní s kvasinkou. Mezi příklady vhodných promotorů patří Saccharomyces cerevisiae MFal, TPI, ADH nebo PGK promotory.
Shora uvedené sekvence by také měly být s výhodou odštěpitelně napojeny na vhodný terminátor, např. TPI terminátor [viz např. Alber T. a Kawasaki G.: J. Mol. Appl. Genet. 1, 419 (1982)].
Rekombinantní expresní vektor podle vynálezu dále obsahuje DNA sekvenci umožňující vektoru replikovat v kvasince. Příklady těchto sekvencí jsou kvasinkový plazmid 2μ, replikační geny REP 1-3 a počátek replikace. Vektor může obsahovat také sektovatelný markér, např. Schizosaccharomyces pombe TPI gen, jak popsal Russell P.R.: Gene 40,125 (1985).
Způsoby použité pro ligaci sekvence obecného vzorce 5'-P-SP-LS-PS-*gen*-(T)—3' a její vložení do vhodných kvasinkových vektorů obsahujících informaci nutnou pro replikaci v kvasince jsou dobře známy odborníkům z oblasti techniky (viz např. Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T.: viz shora). Je třeba chápat, že vektor lze zkonstruovat buď tak, že se nejdříve připraví DNA konstrukce obsahující celou sekvenci 5'-P-SP-LS-PS-*gen*-(T)i-3' a tento fragment se následně vloží do vhodného expresního vektoru obsahujícího genetickou informaci pro jednotlivé prvky (jako je promotorová sekvence, signální peptid, leader sekvence, sekvence obecného vzorce GlnProIleíAsp/GluXAsp/GIjX^Glu/AspjX^AsnZÍThr/SerjX3, místo pro opracování, polypeptid a, jestliže je přítomna, terminátorová sekvence) a následuje ligace.
-9CZ 290069 B6
Kvasinkovým organismem použitým ve způsobu podle vynálezu může být jakýkoliv vhodný kvasinkový organismus, který při kultivaci poskytuje velká množství žádaného polypeptidu. Příklady vhodných kvasinkových organismů mohou být kmeny kvasinek druhu Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe nebo Saccharomyces uvarum. Transformace kvasinkových buněk se může . například provést vytvořením protoplastu a následující transformací známým způsobem. Médiem použitým pro kultivaci buněk může být jakékoliv konvenční médium vhodné pro růst kvasinkových organismů. Sekretovaný polypeptid, jehož významný podíl bude přítomen v prostředí ve správně opracované formě, se může z prostředí izolovat konvenčními postupy, mezi něž patří oddělení buněk kvasinky od prostředí odstřeďováním nebo odfiltrováním, vysrážení proteinových složek supematantu nebo filtrátu solí, například síranem amonným, následující vyčištění rozmanitými chromatografickými postupy, např. chromatografií na ionexu, afinitní chromatografií nebo podobně.
Tento vynález bude dále popsán následujícími příklady, které nejsou zkonstruovány jako omezení rozsahu vynálezu, jak je uveden v patentových nárocích.
Příklady provedení vynálezu
Plazmidy a DNA materiál
Všechny expresní plazmidy jsou typu C-POT. Tyto plazmidy jsou popsány v evropské patentové přihlášce č. 171 142 a jsou charakterizovány tím, že obsahují gen Schizosaccharomyces pombe triosofosfátizomerázy (POT) pro selekci a stabilizaci plazmidu. Plazmid, který obsahuje POT-gen, je dostupný jako uložený E. coli kmen (ATCC 39685). Plazmidy dále obsahují promotor a terminátor S. cerevisiae triosofosfátizomerázy (Ptpi a Tm). Jsou identické s pMT742 (Egel-Mitani M. a spol.: Gene 73. 113 (1988). (viz obr. 1) až na oblast definovanou EcoR I-Xba I restrikčními místy zahrnujícími kódující oblast signál/leader/produkt.
Při konstrukci leaderů popsaných v příkladech byly jako DNA templáty v PCR reakcích použity plazmidy pAK527m pAK531, pAK555, pAK559, pAK562, pAK614 a pAK625. Syntetické DNA fragmenty, které slouží jako templát, jsou uvedeny v obrázcích 13 až 17. S výjimkou uvedených DNA oblastí jsou tyto plazmidy identické s pAK492, který je uveden na obr. 1.
Syntetické DNA fragmenty byly syntetizovány na automatickém DNA syntetizátoru (Applied Biosystems model 380A) použitím fosforamiditové chemie a komerčně dostupných reakčních činidel [Beaucage S.L. a Caruthers M.H.: Tetrahedron Letters 22, 1859 (1981).].
Všechny další způsoby a materiály jsou obvyklé v oblasti techniky [viz např. Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 1989].
Příklad 1
Syntéza leaderu sekv. id č. 4 pro expreci MI3 inzulínového prekurzoru v S. cereviciae (kmen yAK546)
Leader sekv. id č. 4 má následující sekvenci aminokyselin: GLNProIleAspGluAsnThrThrSerV alAsnLeuProVla.
Byly syntetizovány následující oligonukleotidy:
č. 94 5'-TAAATCTATAACTACAAAAAACATA-3' (sekv. id č. 29),
-10CZ 290069 B6
č. 333 5'-GACTCTCTTAACTGGCAAGTTGACA-3' (sekv. id č. 30),
č. 312 5'-AAGTACAAAGCTTCAACCAAGTGAGAACCACACAAGTGTTGGTTAACGAATCTCTT-3' (sekv. id č. 31) a
č. 1845 5'-CATACACAATATAAACGACGG-3' (sekv. id. č. 31).
Následující polymerázové řetězové reakce (PCR) byly provedeny pomocí Gene Amp PCR sestavy reakčních činidel (Perkin Elmer, 761 Main Avewalk, Kt. 06859, USA) podle pokynů výrobce. Během reakce byly PCR směsi převrstveny 100 μΐ minerálního oleje (Sigma Chemical Co. St. Louis, Mo., USA).
Polymerázová řetězová reakce č. 1 μΐ oligonukleotidu č. 94 (50 pmolů) μΐ oligonukleotidu č. 333 (50 pmolů) μΐ lOxPCR pufru μΐ dNTP směsi
0,5 μΐ Taq enzymu
0,5 μΐ pAK527 plazmidu (obr. 13) jako templát (0,3 pg DNA) μΐ vody
Bylo provedeno celkem 12 cyklů. Jeden cyklus byl 1 minuta při 94 °C, 2 minuty při 37 °C a 3 minuty při 72 °C. PCR směs pak byla nanesena na 2% (hmotn.) agarosový gel a elektroforezována standardními způsoby (Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T.: viz shora). Výsledný DNA fragment byl vyříznut z agarosového gelu a izolován pomocí sestavy Gene Clean (Bio 101 lne., PO Box 2284, La Jolla, Ka. 92038, USA) podle pokynů výrobce.
Polymerázová řetězová reakce č. 2 μΐ oligonukleotidu č. 312 (50 pmolů) μΐ oligonukleotidu č. 94 (50 pmolů) μΐ lOx PCR pufru μΐ dNTP směsi
0,5 μΐ Taq enzymu μΐ vyčištěného DNA fragmentu z PCR č. 1
53,5 μΐ vody
Bylo provedeno celkem 12 cyklů. Jeden cyklus byl 1 minuta při 94 °C, 2 minuty při 37 °C a 3 minuty při 72 °C. DNA fragment z polymerázové řetězové reakce č. 2 byl izolován a vyčištěn sestavou Gene Clean kit (Bio 101 lne., PO Box 2284, La Jolla, Ka. 92038, USA) podle pokynů výrobce.
Vyčištěný PCR DNA fragment byl rozpuštěn v 10 μΐ vody a pufru s restrikční endonukleázou a rozštěpen restrikčními endonukleadami Asp 718 a Hind ΙΠ v celkovém objemu 15 μΐ podle standardních způsobů (Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T.: viz shora). Asp 71//Hind ΙΠ DNA fragment o 167 párech nukleotidů byl elektroforezován na agarosovém gelu a vyčištěn sestavou The Gene Celan Kit, jak shora popsáno. S. cerevisiae expresní plazmid pAK492 (uvedený na obr. 1) je derivátem dříve popsaného plazmidu pMT742, v němž fragment, který kóduje signál/leader/inzulinový prekurzor, byl nahrazen EcoR I-XbA I fragmentem uvedeným na obrázku 2. Tento fragment byl syntetizován na syntetizátoru Applied Biosystems DNA synthesizer podle pokynů výrobce. Plazmid pAK492 byl rozštěpen restrikčními endonukleázami Asp 718 a Xba I. Byl izolován vektorový fragment o 10986 párech nukleotidů. Plazmid pAK492 byl rozštěpen restrikčními endonukleázami Hind ΙΠ a Xba I. Byl izolován DNA fragment o 140 párech nukleotidů kódující část MI3 inzulínového prekurzorů. Tyto tři DNA fragmenty byl
-11 CZ 290069 B6 spolu ligovány použitím T4 DNA ligasy za standardních podmínek (Sambrook J., Fritsch E.F. aManiatis T.: viz shora). Ligační směs byla pak transformována do příslušného E. coli kmene (R-, M+) a tranformanty byly identifikovány ampicilinovou rezistencí. Z výsledných E. coli kolonií byly standardními DNA minipreparačními způsoby (Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T.: viz shora) izolovány plazmidy a zkontrolovány příslušnými restrikčními endonukleázami, tj. EcoR I, Xba I, Nco I a Hind ΠΙ. DNA sekvenační analýzou (Sequenase, U.S. Biochemical Corp.) pomocí primerů č. 94 bylo prokázáno, že vybraný plazmid pAK546 obsahuje DNA sekvenci kódující leader sekv. id. č. 4. Pro DNA sekvenci kódující leader sekv. id. č. 4 viz obr. 4. Plazmid pAK546 byl transformován do S. cerevisiae kmene MT663, jak je popsáno v evropské publikované patentové přihlášce č. 214 826. Výsledný kmen byl nazván yAK546. DNA sekvence proteinu kódující oblast expresního plazmidu je uvedena na obr. 5.
Příklad 2
Syntéza leaderu sekv. id. č. 6 pro expresi MI3 inzulínového prekurzoru v S. cerevisiae (kmene yAK531)
Leader sekv. id. č. 6 má následující sekvenci aminokyselin: GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuProAla.
Byl syntetizován následující oligonukleotid:
č. 331 5'-GAATCTCTTAGCTGGCAAGTTGACAGAAGTAGTGTTAGTTTCAGAGTCGTCAATT-3' (sekv. č. id č. 33)
Polymerázová řetězová reakce byla provedena jak popsáno v příkladu 1 s tím, že se místo oligonukleotidu č. 333 použije oligonukleotid č. 331.
Asp 718/Hind ΙΠ DNA fragmentu o 168 párech nukleotidů (pn) byl elektroforezován na agarosovém gelu, jak je popsáno v příkladu 1. Asp 718/Hind ΙΠ DNA fragment byl subklonován do S. cerevisiae expresního plazmidu, jak popsáno v příkladu 1. DNA sekvenční analýzou, jak je popsáno v příkladu 1, bylo ukázáno, že vybraný plazmid pAK531 obsahuje DNA sekvenci kódující leader sekv. id č. 6. Pro DNA sekvenci kódující leader sekv. id. č. 6 viz obr. 6. Plazmid pAK531 byl transformován do S. cerevisiae kmene MT663, jak je to popsáno v evropské patentové přihlášce 86306721.1, a výsledný kmen byl nazván yAK531. DNA sekvence kódující signální peptid a inzulínový prekurzor MI3 jsou stejné jako sekvence uvedené na obrázku 5.
Příklad 3
Syntéza leaderu sekv. id. č. 8 pro expresi MI3 inzulínového prekurzoru v S. cerevisiae (kmen yAK547)
Leader sekv. id. č. 8 má následující sekvenci aminokyselin: GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuProGlyAla.
Byl syntetizován následující oligonukleotid:
č. 345 5'-AACGAATCTCTTAGCACCTGGCAAGTTGACAGAAGT-3' (sekv. id. č. 34)
-12CZ 290069 B6
Polymerázová řetězová reakce byla provedena jak popsáno v příkladu 1 s tím, že se místo oligonukleotidu č. 333 použije oligonukleotid č. 345 a plazmid pAK531 (obr. 14) se použije jako templát.
Asp 718/Hind ΙΠ DNA fragment o 171 párech nukleotidů byl elektroforezován na agarosovém gelu a vyčištěn, jak je popsáno v příkladu 1. Asp 718/Hind ΠΙ DNA fragment byl subklonován do S. cerevisiae expresního plazmidu, jak popsáno v příkladu 1. DNA sekvenční analýzou, jak je popsáno v příkladu 1, bylo ukázáno, že vybraný plazmid pAK547 obsahuje DNA sekvenci kódující leader sekv. id. č. 8. Pro DNA sekvenci kódující leader sekv. id č. 8 viz obr. 7. Plazmid pAK547 byl transformován do S. cerevisiae kmene MT663, jak je to popsáno v evropské patentové přihlášce 86306721.1, a výsledný kmen byl nazván yAK547. DNA sekvence kódující signální peptid a inzulínový prekurzor MI3 jsou stejné jako sekvence uvedené na obrázku 5.
Příklad 4
Syntéza leaderu sekv. id. č. 17 pro expresi MI3 inzulínového prekurzoru v S. cerevisiae (kmen yAK561)
Leader sekv. id č. 17 má následující sekvenci aminokyselin: GlnProIleAspAspThrGluSerlleAsnThrThrLeuVlaAsnLeuProGlyAla.
Byl syntetizován následující oligonukleotid:
č. 376 5'-AACGAATCTCTTAGCACCTGGCAAGTTGACCAAAGTAGTGTTGATAGATTCAGTGTCGTC-3' (sekv. id. č. 35)
Polymerázová řetězová reakce byla provedena jak popsáno v příkladu 1 s tím, že se místo oligonukleotidu č. 333 použije oligonukleotid č. 376 a plazmid pAK555 (obr. 15) se použije jako templát.
Asp 718/Hind ΙΠ DNA fragment o 180 párech nukleotidů byl elektroforezován na agarosovém gelu a vyčištěn, jak je popsáno v příkladu 1. Asp 718/Hind ΙΠ DNA fragment byl subklonován do S. cerevisiae expresního plazmidu, jak popsáno v příkladu 1. DNA sekvenční analýzou, jak je popsáno v příkladu 1, bylo ukázáno, že vybraný plazmid pAK561 obsahuje DNA sekvenci kódující leader sekv. id č. 17. Pro DNA sekvenci kódující leader sekv. id. č. 17 viz obr. 8. Plazmid pAK561 byl transformován do S. cerevisiae kmene MT663, jak je to popsáno v evropské patentové přihlášce 86306721.1, a výsledný kmen byl nazván yAK561. DNA sekvence kódující signál peptid a inzulínový prekurzor MI3 jsou stejné jako sekvence uvedené na obrázku 5.
Příklad 5
Syntéza leaderu sekv. id č. 16 pro expresi MI3 inzulínového prekurzoru v S. cerevisiae (kmen yAK559)
Leader sekv. id. č. 16 má následující sekvenci aminokyselin: GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerlleAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla.
- 13 CZ 290069 B6
Byl syntetizován následující oligonukleotid:
č. 375 5'-AACGAATCTCTTAGCACCTGGCAAGTTAACCAAAGTAGTGTTGATAGATTCAGTGTCGTCAGCCATCAAGTTGAC-3' (sekv. id č. 36)
Polymerázová řetězová reakce byla provedena jak popsáno v příkladu 1 s tím, že se místo oligonukleotidu č. 333 použije oligonukleotid č. 375 a plazmid pAK555 (obr. 15) se použije jako templát.
Asp 718/Hind ΠΙ DNA fragment o 222 párech nukleotidů byl elektroforezován na agarosovém gelu a vyčištěn, jak je popsáno v příkladu 1. Asp 718/Hind ΙΠ DNA fragment byl subklonován do S. cerevisiae expresního plazmidu, jak popsáno v příkladu 1. DNA sekvenační analýzou, jak je popsáno v příkladu 1, bylo ukázáno, že vybraný plazmid pAK559 obsahuje DNA sekvenci 15 kódující leader sekv. id. č. 16. Pro DNA sekvenci kódující leader sekv. id č. 16 viz obr. 9.
Plazmid pAK559 byl transformován do S. cerevisiae kmene MT663, jak je to popsáno v evropské patentové přihlášce 86306721.1, a výsledný kmen byl nazván yAK559. DNA sekvence kódující signální peptid a inzulínový prekurzor MI3 jsou stejné jako sekvence uvedené na obrázku 5.
Příklad 6
Syntéza leader sekv. id č. 19 pro expresi MI3 inzulínového prekurzoru v S. cerevisiae (kmen 25 yAK580)
Leader sekv. id. č. 19 má následující sekvenci aminokyselin: GlnProIleAspAspThrGluSerAnsThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaTheAsnThrThrLeuValAsnLeuPro Leu.
Byl syntetizován následující oligonukleotid:
č. 384 5'-AACGAATCTCTTCAATGGCAAGTTAACCAAAGTAGTGTTAGTAGCGAATCTAGATTCAGTGTCGTCAGCCAT-3' (sekv. id. č. 37)
Polymerázová řetězová reakce byla provedena jak popsáno v příkladu 1 s tím, že se místo oligonukleotidu č. 33 použije oligonukleotid č. 384 a plazmid pAK559 (obr. 16) se použije jako templát.
Asp 718/Hind ΙΠ DNA fragment o 228 párech nukleotidů byl eletroforezován na agarosovém gelu a vyčištěn, jak je popsáno v příkladu 1. Asp 718/Hind ΙΠ DNA fragment byl subklonován do S. cerevisiae expresního plazmidu, jak popsáno v příkladu 1. DNA sekvenční analýzou, jak je popsáno v příkladu 1, bylo ukázáno, že vybraný plazmid pAK580 obsahuje DNA sekvenci 45 kódující leader sekv. id č. 19. Pro DNA sekvenci kódující leader sekv. id. č. 19 viz obr. 10.
Plazmid pAK580 byl transformován do S. cerevisiae kmene MT663, jak je to popsáno v evropské patentové přihlášce 86306721.1, a výsledný kmen byl nazván yAK580. DNA sekvence kódující signální peptid a inzulínový prekurzor MI3 jsou stejné jako sekvence uvedené na obrázku 5.
- 14CZ 290069 B6
Příklad 7
Syntéza leaderu sekv. id. č. 20 pro expresi MI3 inzulínového prekurzoru v S. cerevisiae (kmene yAK583)
Leader sekv. id č. 20 má následující sekvenci aminokyselin: GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerlleAsnThrThrLeuVlaAsnLeuAlaAsnValAlaMetAla.
Byl syntetizován následující oligonukleotid:
č. 390 5'-AACGAATCTCTTAGCCATGGCAACGTTAGCCAAGTTAACCAAAGT-3' (sekv. id č. 38)
Polymerázová řetězová reakce byla provedena jak popsáno v příkladu 1 s tím, že se místo oligonukleotidu č. 333 použije oligonukleotid č. 390 a plazmid pAK559 (obr. 16) se použije jako templát.
Asp 718/Hind ΙΠ DNA fragment o 231 párech nukleotidů byl elektroforezován na agarosovém gelu a vyčištěn, jak je popsáno v příkladu 1. Asp 718/Hind M DNA fragment byl subklonován do S. cerevisiae expresního plazmidu, jak popsáno v příkladu 1. DNA sekvenční analýzou, jak je popsáno v příkladu 1, bylo ukázáno, že vybraný plazmid pAK583 obsahuje DNA sekvenci kódující leader sekv. id. č. 20. Pro DNA sekvenci kódující leader sekv. id 4. 20 viz obr. 11. Plazmid pAK583 byl transformován do S. cerevisiae kmene MT663, jak je to popsáno v evropské patentové přihlášce 86306721.1, a výsledný kmen byl nazván yAK583. DNA sekvence kódující signální peptid a inzulínový prekurzor MI3 jsou stejné jako sekvence uvedené na obrázku 5.
Příklad 8
Syntéza leaderu sekv. id. č. 21 pro expresi MI3 inzulínového prekurzoru v S. cerevisiae (kmen yAK586)
Leader sekv. id č. 21 má následující sekvenci aminokyselin: GlnProIleAspAspThrGluSerAlaIle AsnThrThrLeuV alAsnLeuProGlyAla.
Byl syntetizován následující oligonukleotid:
č. 401 5'-AACGAATCTCTTAGCACCTGGCAAGTTGACCAAAGTAGTGTTGATAGCAGATTCAGTGTCG-3' (sekv. id. č. 39)
Polymerázová řetězová reakce byla provedena jak popsáno v příkladu 1 stím, že se místo oligonukleotidu č. 333 použije oligonukleotid č. 401 a plazmid pAK562 (obr. 17) se použije jako templát.
Asp 718/Hing ΙΠ DNA fragment o 183 párech nukleotidů byl elektroforezován na agarosovém gelu a vyčištěn, jak je popsáno v příkladu 1. Asp 718/Hind ΙΠ DNA fragment byl subklonován do S. cerevisiae expresního plazmidu, jak popsáno v příkladu 1. DNA sekvenční analýzou, jak je popsáno v příkladu 1, bylo ukázáno, že vybraný plazmid pAK586 obsahuje DNA sekvenci kódující leader sekv. id. č. 21, viz obr. 12. Plazmid pAK586 byl transformován do S. cerevisiae kmene MT663, jak je to popsáno v evropské patentové přihlášce 86306721.1, a výsledný kmen byl nazván yAK586. DNA sekvence kódující signální peptid a inzulínový prekurzor MI3 jsou stejné jako sekvence uvedené na obr. 5.
-15CZ 290069 B6
Příklad 9
Exprese MI3 inzulínového prekurzoru použitím vybraných leader sekvencí podle předloženého vynálezu
Kvasinkové kmeny nesoucí plazmidy, jak shora popsáno, byly nechány růst vYPD médiu (Sherman F. a spol.: Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1981). Pro každý kmen bylo 6 individuálních 5ml kultur třepáno 72 h při 30 °C na konečnou ODeoo přibližně 15. Po odstřeďování byl supematant odebrán pro HPLC analýzu, při čemž byla způsobem popsaným Snelem L. a spol.: Chromatographia 24. 329 (1987) změřena koncentrace sekretovaného inzulínového prekurzoru.
V tabulce 1 jsou uvedeny úrovně exprese inzulínového prekurzoru MI3, získané použitím vybraných leader sekvencí podle předloženého vynálezu, jako procenta úrovně získané s transformanty pMT742 použitím MFa(l)leaderu z S. cerevisiae.
Tabulka 1 leader__________
MT748 a-leader sekv. id. č. 15 sekv. id. č. 16 sekv. id. č. 17 sekv. id. č. 19 sekv. id. č. 20 sekv. id. č. 21 sekv. id. č. 22 sekv. id. č. 23 úroveň exprese (%)
100
215
157
166
145
137
121
Příklad 10
Syntéza leaderu sek. id č. 27 pro expresi prodlouženého MI3 inzulínového prekurzoru v S. cerevisiae (kmen yAK677)
Leader sekv. id č. 27 má následující sekvenci aminokyselin: GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAspValValAsnLeuIle SerMetAla.
Byly syntetizovány následující oligonukleotidy:
č. 440 5'-GGTTAACGAACTTTGGAGCTTCAGCTTCAGCTTCTTCTCTCTTAGCAATGGAGATCAAGTTAACAACATCCAAAGTAGTGTT-3' (sek. id. č. 64) a
č. 441 5'-CAAGTACAAAGCTTCAACCAAGTGGGAACCGCACAAGTGTTGGTTAACGAACTT-3' (sekv. id. č. 65)
-16CZ 290069 B6
Polymerázová řetězová reakce byla provedena jak popsáno v příkladu 1 s tím, že se místo oligonukleotidu č. 333 použije oligonukleotid č. 440 a plazmid pAK614 se použije jako templát. V druhé polymerázové řetězové reakci se místo oligonukleotidu č. 312 použije oligonukleotid č. 441.
Vyčištěný PCR DNA fragment se izoluje a rozštěpí se restrikčními endonukleázami Asp 718 a Hind ΙΠ, jak je popsáno v příkladu 1. Asp 718/Hind ΙΠ DNA fragment o 268 párech nukleotidů byl elektroforezován na agarosovém gelu a vyčištěn, jak je popsáno v příkladu 1. Asp 718/Hind ΙΠ DNA fragment byl subklonován do S. cerevisiae expresního plazmidu, jak popsáno v příkladu 1 stou výjimkou, že Hind ΙΠ/Xba I DNA fragment o 140příkladu 1 stou výjimkou, že Hind ΠΙ/Xba I DNA fragment o 140 párech nukleotidů byl odvozen od pAK602 a kóduje AspB28 lidský inzulín. DNA sekvenační analýzou, jak je popsáno v příkladu 1, bylo ukázáno, že vybraný plazmid pAK616 obsahuje DNA sekvenci kódující leader sekv. id č. 27. Pro DNA sekvenci sekv. id. č. 66 kódující leader sekv. id. č. 27 viz obr. 18. Byl izolován Asp 718/Hind ΙΠ DNA fragment o 268 párech nukleotidů z pAK616 a byl ligován s ASP 718/Xba I DNA fragmentem o 10986 párech nukleotidů zpAK601 a DNA fragmentem Hind ΠΙ/Xba I o 140 párech nukleotidů zpAK464 (kódující rozšířenou verzi AspB28 lidského inzulínu) a byl pojmenován pAK 625. Byl izolován Asp 718/Nco I DNA fragment o 180 párech nukleotidů z pAK625 a byl ligován s Nco I/Xba I DNA fragmentem o 221 páru nukleotidů zpJB146 (kódující rozšířenou verzi inzulínového prekurzoru) a Asp 718/Xba i DNA fragmentem o 221 páru nukleotidů zpJB146 (kódující rozšířenou verzi inzulínového prekurzoru) a Asp 718/Xba I DNA fragmentem o 10824 párech nukleotidů z pAK601. Výsledný plazmid byl pojmenován pAK677. Plazmid pAK677 byl transformován do S. cerevisiae kmene MT663, jak je to popsáno v evropské patentové přihlášce 86306721.1, a výsledný kmen byl nazván yAK677. S výjimkou DNA sekvence, která kóduje leader je DNA sekvence kódující signální peptid stejná jako sekvence uvedená na obrázku 5. DNA sekvence kódující rozšířený MI3 inzulínový prekurzor je popsána na obr. 19.
Příklad 11
Syntéza leaderu sekv. id. č. 67 pro expresi rozšířeného MI3 inzulínového prekurzoru v S. cerevisiae (kmen yAK680)
Leader sekv. id č. 67 má následující sekvenci aminokyselin: GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrSerVaLAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAlaLeuAspValValAsn LeulleSerMetAla.
Byl syntetizován následující oligonukleotid:
č. 577 5'-TCTCTTAGCCATGGAGATCAAGTTAACAACATCCAAAGCCAAAGTAGTGTT-3' (sekv. id. č. 68)
PCR byla provedena jak popsáno v příkladu 1 s tím, že se místo oligonukleotidu č. 333 použije oligonukleotid č. 577 a plazmid pAK625 se použije jako templát. Druhá CPR nebyla provedena. DNA fragment se rozštěpí restrikční endonukleázami Asp 718 a Nco I, jak je popsáno v příkladu 1.
Asp 718/Nco I DNA fragment o 190 párech nukleotidů byl elektroforezován na agarosovém gelu a vyčištěn, jak je popsáno v příkladu 1 s tou výjimkou, že byl z ppAKóOl izolován Asp 718/Xba I vektorový DNA fragment o 10824 párech nukleotidů. Asp 718/Nco I DNA fragment o 190 párech nukleotidů byl subklonován do S. cerevisiae expresního plazmidu, jak popsáno v příkladu 1 s tou výjimkou, že Nco I/Xba I DNA fragment o 221 párech nukleotidů (kódující rozšířenou verzi MI3 inzulínového prekurzoru) byl izolován z pAK677 a byl použit místo Hind ΙΠ/Xba I DNA fragmentu. DNA sekvenační analýzou, jak je popsáno v příkladu 1, bylo ukázáno,
-17CZ 290069 B6 že vybraný plazmid obsahuje DNA sekvenci kódující leader sekv. id č. 67 a byl nazván pAK680. Pro DNA sekvenci sekv. id. č. 69 kódující leader sekv. id č. 67 viz obr. 20. Plazmid pAK680 byl transformován do S. cerevisiae kmene MT663, jak je to popsáno v evropské patentové přihlášce číslo 86306721.1, a výsledný kmen byl nazván yAK680. S výjimkou DNA sekvence, která kóduje signální peptid, je DNA sekvence stejná jako sekvence uvedená na obrázku 5. DNA sekvence rozšířeného MI3 inzulínového prekurzoru je popsána na obr. 19.
Příklad 12
Exprese na N-konci rozšířeného MI3 inzulínového prekurzoru použitím leader sekvencí sekv. id. č. 27 a sekv. id č. 67 podle předloženého vynálezu
Kvasinkové kmeny nesoucí plazmidy, jak shora popsáno, byly nechány růst vYPD médiu (Sherman F. a spol.: Methods in Years Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1981). Pro každý kmen bylo 6 individuálních 5ml kultur třepáno 72 h při 30 °C na konečnou ODeoo přibližně 15. Po odstřeďování byl supematant odebrán pro HPLC analýzu, při čemž byla způsobena popsaným Snelem L. a spol.: Chromatographia 24, 329 (1987) změřena koncentrace sekretovaného inzulínového prekurzoru.
V tabulce 2 jsou uvedeny úrovně exprese některých na N-konci rozšířených inzulínových prekurzorů MI3, získaných použitím leader sekvencí sekv. id č. 27 a sekv. id. č. 67 podle předloženého vynálezu, jako procenta úrovně získané s transformanty pMT742 použitím MFa(l) leaderu z S. cerevisiae.
Tabulka 2
kmen signální peptid leader (sekv. id. č.) prodloužení vzhledem k MT748
MT748 a a
yAK675 YAP3 č. 27 EEAEAEAPK 251 %
yAK677 YAP3 č. 27 EEAEAEAEPK 224 %
yAK681 YAP3 č. 67 EEAEAEAPK 248 %
yAK680 YAP3 č. 67 EEAEAEAEPK 362 %
SEZNAM SEKVENCÍ (1) Obecné informace (i) Přihlašovatel:
(A) jméno: Novo Nordisk A/S (B) ulice: Novo Allé (C) město: DK2880 Bagsvaerd (E) stát: Dánsko (G) telefon:+45 44448888 (H) telfax: 45 44490555 (I) telex: 37713 (ii) Název vynálezu: 2-Imidazolinylaminoindolová sloučenina, farmaceutický prostředek ji obsahující a její použití (iii) Počet sekvencí: 73
-18CZ 290069 B6 (iv) Korespondenční adresa:
(A) adresát: Novo Nordisk A/S
Corporate Patents (B) ulice: Novo Allé (C) město: DK-2880 Bagsvaerd (E) stát: Dánsko (v) Počítačová čtecí forma:
(A) typ média: floppy disk (B) počítač: IBM PC compatible (C) operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) počítačový program (software): PatentIN Release #1.0, verze #1.25 (vi) Údaje o současné přihlášce:
(A) číslo přihlášky:
(B) datum podání:
(C) klasifikace:
(vii) Údaje o předchozí přihlášce:
(A) číslo přihlášky: dánský patent DK 0705/945 a USA patentová přihláška US OS/282852 (B) datum podání: 16. června 1994 a 29. července 1994 (viii) Informace o zástupci:
(A) Jméno: Jorgansen Dan a spol.
(C) odkaz/číslo spisu: 4085-WO, DJPCT (ix) Informace o spojení:
(A) telefon: +45 4444888 (C) telefax: +45 44493256 (2) Informace o sekvenci id. č. 1:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 15 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 1:
Gin Pro Ile Asp Glu Asp Asn Asp Thr Ser Val Asn Leu Pro
10
Ala
- 19CZ 290069 B6 (2) Informace o sekvenci id. č. 2:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 15 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 2:
Gin Pro Ile Asp Asp Glu Asn Thr Thr Ser Val Asn Leu Pro 1 5 10
Ala (2) Informace o sekvenci id. č. 3:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 16 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 3:
Gin Pro Ile Asp Asp Glu Ser Asn Thr Thr Sér Val Asn Leu 1 5 10
Pro Ala (2) Informace o sekvenci id. č. 4:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 15 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 4:
Gin Pro Ile Asp Asp Glu Asn Thr Thr Ser Val Asn Leu Pro
5 10
Val
-20CZ 290069 B6 (2) Informace o sekvenci id. č. 5:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 16 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 5:
Gin Pro Ile Asp Asp Thr Glu 1 5
Pro Ala (2) Informace o sekvenci id. č. 6:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 17 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 6:
Gin Pro Ile Asp Asp Thr Glu !
5
Leu Pro Ala (2) Informace o sekvenci id. č. 7:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 15 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 7:
Gin Pro Ile Asp Asp Glu Asn
5
Ala
Thr Thr Ser Val Asn Leu
Asn Thr Thr Ser Val Asn
Thr Ser Val Asn Leu Met
-21 CZ 290069 B6 (2) Informace o sekvenci id. č. 8:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 18 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 8:
Gin Pro Ile Asp Asp Thr Glu Ser Asn Thr Thr Ser Val Asn 15 10
Leu Pro Gly Ala (2) Informace o sekvenci id. č. 9:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 17 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 9:
Gin Pro Ile Asp Asp Thr Glu Ser Asn Thr Thr Ser Val Asn 15 1.0
Leu Met Ala (2) Informace o sekvenci id. č. 10:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 17 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 10:
Gin Pro Ile Asp Asp Thr Glu Ser Asn Thr Thr Sér Val Asn 1 5 10
Val Pro Thr 15
-22CZ 290069 B6 (2) Informace o sekvenci id. č. 11:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 17 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 11:
Gin Pro Ile Asp Asp Thr Glu
5
Val Pro Thr (2) Informace o sekvenci id. č. 12:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 17 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 12:
Gin Pro Ile Asp Asp Thr Glu
5
Leu Pro Thr (2) Informace o sekvenci id. č. 13:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 18 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 13:
Gin Pro Ile Asp Asp Thr Glu
5
Val Pro Gly Ala
Ser Asn Thr Thr Leu Val Asn
Ser Asn Thr Thr Ser Val Asn 10
Ser Asn Thr Thr Leu Val Asn
-23CZ 290069 B6 (2) Informace o sekvenci id. č. 14:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 21 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 14:
Gin Pro Ile Asp Asp Thr Glu Ser Asn Thr Thr Ser Val Asn 1 5 10
Leu Met Ala Pro Ala Val Ala
20 (2) Informace o sekvenci id. č. 15:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 25 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 15:
Gin Pro Ile Asp Asp Thr Glu Ser
5
Asn Thr
Thr Ser Val Asn
Leu Met Asp Leu Ala
Val
Gly Leu Pro Gly Ala (2) Informace o sekvenci id. č. 16:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 33 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid
-24CZ 290069 B6 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 16:
Gin Pro Ile Asp Asp Thr Glu
5
Ser Asn Thr Thr Šer Val Asn
Léu Met Ala Asp Asp Thr Glu
20
Asn Leu Pro Gly Ala
Ser Ile Asn Thr Thr Leu Val (2) Informace o sekvenci id. č. 17:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 19 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární o
(ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 17:
Gin Pro Ile Asp Asp Thr Glu
5
Asn Leu Pro Gly Ala (2) Informace o sekvenci id. č. 18:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 18 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 18:
Gin Pro Ile Asp Asp Thr Glu 1 5
Leu Pro Gly Ala
Ser Ile Asn Thr Thr Leu Val
Ser Asn Thr Thr Leu Val Asn
-25CZ 290069 B6 (2) Informace o sekvenci id. č. 19:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 35 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 19:
Gin 1 Pro Ile Asp Asp 5 Thr Glu Ser Asn Thr 10 Thr Ser Val Asn
Leu 15 Met Ala Asp Asp Thr 20 Glu Ser Arg Phe Ala Thr Asn Thr 25
Thr Leu 30 Val Asn Leu Pro Leu 35
(2) Informace o sekvenci id. č. 20:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 36 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 20:
Gin 1 Pro Ile Asp Asp 5 Thr Glu Ser Asn Thr 10 Thr Ser Val Asn
Leu 15 Met Ala Asp Asp Thr 20 Glu Ser Ile Asn Thr 25 Thr Leu Val
Asn Leu 30 Ala Asn Val Ala Met 35 Ala
(2) Informace o sekvenci id. č. 21:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 20 (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární
(ii) Typ molekuly: peptid -26-
(xi) popis sekvence: sekvence id. č. 21:
Gin Pro Ile Asp Asp Thr Glu Ser Ala Ile Asn Thr Thr Leu 15 10
Val Asn Leu Pro Gly Ala
20 (2) Informace o sekvenci id. č. 22:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 21 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 22:
Gin Pro Ile Asp Asp Thr Glu Ser Phe Ala Thr Asn Thr Thr 1 5 10
Leu Val Asn Leu Pro Gly Ala
20 (2) Informace o sekvenci id. č. 23:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 36 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 23:
Gin Pro 1 Ile Asp Asp 5 Thr Glu Ser Ile Asn Thr 10 Thr Leu Val
Asn Leu Met Ala Asp Asp Thr Glu Ser Arg Phe Ala Thr Asn
15 20 25
Thr Thr Leu Val Asn Leu Pro Leu
30 35
(2) Informace o sekvenci id. č. 24:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 39 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární
-27CZ 290069 B6 (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 24:
Gin Pro Ile Asp Asp Thr Glu Ser Ile Asn Thr Thr Leu Val
1 5 10
Asn Leu Met Ala Asp Asp Thr Glu Ser Arg Phe Ala Thr Asn
15 20 25
Thr Thr Leu Asp Val Val Asn Leu Pro Gly Ala
30 35
(2) Informace o sekvenci id. č. 25:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 21 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 25:
Gin Pro Ile Asp Asp
5
Thr Glu
Ser
Ala
Ala
Ile
Asn
Thr
Thr
Leu Val Asn Leu Pro 15
Gly Ala (2) Informace o sekvenci id. č. 26:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 39 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 26:
Gin 1 Pro Ile Asp Asp 5 Thr Glu Ser Asn Thr 10 Thr Ser Val Asn
Leu 15 Met Ala Asp Asp Thr 20 Glu Ser Arg Phe Ala 25 Thr Asn Thr
Thr Leu 30 Val Asn Leu Ala Asn 35 Val Ala Met Ala
(2) Informace o sekvenci id. č. 27:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 39 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 27:
Gin 1 Pro Ile Asp Asp 5 Thr Glu Ser Asn Thr 10 Thr Sér Val Asn
Leu Met Ala Asp Asp Thr Glu Ser Arg Phe Ala Thr Asn Thr
15 20 25
Thr Leu Asp Val Val Asn Leu Ile Ser Met Ala
30 35
(2) Informace o sekvenci id. č. 28:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 39 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 28:
Gin Pro Ile Asp Asp Thr Glu Ser Asn Thr Thr Ser Val Asn
1 5 10
Leu Met Ala Asn Thr Thr Glu Ser Arg Phe Ala Thr Asn Thr
15 20 25
Thr Leu Asp Val Val Asn Leu Ile Ser Met Ala
30 35
(2) Informace o sekvenci id. č. 29:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 27 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA
-29CZ 290069 B6 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 29:
TAAATCTATA ACTACAAAAA ACACATA 27 (2) Informace o sekvenci id. č. 30:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 25 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 30:
GACTCTCTTA ACTGGCAAGT TGACA 25 (2) Informace o sekvenci id. č. 31:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 56 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 31:
AAGTACAAAG CTTCAACCAA GTGAGAACCA CACAAGTGTT GGTTAACGAA 50
TCTCTT 56 (2) Informace o sekvenci id. č. 32:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 21 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 32:
CATACACAAT ATAAACGACG G 21
-30CZ 290069 B6 (2) Informace o sekvenci id. č. 33:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 55 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 33:
GAATCTCTTA GCTGGCAAGT TGACAGAAGT AGTGTTAGTT TCAGAGTCGT 50
CAATT 55 (2) Informace o sekvenci id. č. 34:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 36 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 34:
AACGAATCTC TTAGCACCTG GCAAGTTGAC AGAAGT 36 (2) Informace o sekvenci id. č. 35:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 60 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 35:
AACGAATCTC TTAGCACCTG GCAAGTTGAC CAAAGTAGTG TTGATAGATT 50
CAGTGTCGTC 60
-31 CZ 290069 B6 (2) Informace o sekvenci id. č. 36:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 75 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 36:
AACGAATCTC TTAGCACCTG GCAAGTTAAC CAAAGTAGTG TTGATAGATT 50
CAGTGTCGTC AGCCATCAAG TTGAC 75 (2) Informace o sekvenci id. č. 37:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 72 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 37:
AACGAATCTC TTCAATGGCA AGTTAACCAA AGTAGTGTTA GTAGCGAATC 50
TAGATTCAGT GTCGTCAGCC AT 72 (2) Informace o sekvenci id. č. 38:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 45 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 38:
AACGAATCTC TTAGCCATGG CAACGTTAGC CAAGTTAACC AAAGT 45
-32CZ 290069 B6 (2) Informace o sekvenci id. č. 39:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 61 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 39:
AACGAATCTC TTAGCACCTG GCAAGTTGAC CAAAGTAGTG TTGATAGCAG 50
ATTCAGTGTC G (2) Informace o sekvenci id. č. 40:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 372 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Znak:
(A) název/klíč: CDS (B) umístění: 82.531
-33 CZ 290069 B6 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 40:
GAATTCATTC AAGAATAGTT CAAACAAGAA GATTACAAAC TATCAATTT 50
ATACACAATA TAAACGACGG GTACCAAAAT A ATG AAA CTG AAA 93 Met Lys Leu Lys
ACT GTA AGA TCT GCG GTC CTT TCG TCA CTC TTT GCA TCT 132
Thr Val Arg Ser Ala Val Leu Ser Ser Leu Phe Ala Ser
5 10 15
CAG GTC CTT GGC CAA CCA ATA GAC GAA GAC AAC GAC ACT 171
Gin val Leu Gly Gin Pro ne Asp Glu Asp Asn Asp Thr
20 25 30
TCT TCC ATG GCT AAG AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGC 210
Ser ser Met Ala Lys Arg Phe Via Asn Gin His Leu Cys
35 40
GGT Tec CAG TTG GTT GAA GCT TTG TAC TTG GTT TGC GGT 249
Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly
45 50 55
GAA AGA GGT TTC TTC TAC ACT CCT AAG GCT GCT AAG GGT 288
Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Ala Lys Gly
60 65
ATT GTC GAG CAA TGC TGT ACC TCC ATC TGC TCC TTG TÁC 327
Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
70 75 80
CAA TTG GAA ÁAC TÁC TGC AAC TAGACGCAGC CCGCAGGCTC 368
Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
TAGA 372
(2) Informace o sekvenci id. č. 41:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 89 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid
-34CZ 290069 B6 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 41:
Met 1 Lys Leu Lys Thr 5 Val Arg Ser Ala Val 10 Leu Ser Ser Leu
Phe 15 Ala Ser Gin Val Leu 20 Gly Gin Pro Ile Asp 25 Glu Asp Asn
Asp Thr 30 Ser Ser Met Ala Lys 35 Arg Phe Via Asn Gin 40 His Leu
Cys Gly Ser 45 HÍS Leu Val Glu Ala 50 Leu Tyr Leu Val Cys 55 Gly
Glu Arg Gly Phe 60 Phe Tyr Thr Pro Lys 65 Ala Ala Lys Gly Ile 70
Val Glu Gin Cys Cys 75 Thr Ser Ile Cys Ser 80 Leu Tyr Gin Leu
GlU Asn Tyr Cys Asn
(2) Informace o sekvenci id. č. 42:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 45 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Znak:
(A) název/klíč: CDS (B) umístění: 1...45 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 42:
CAA CCA ATT GAC GAC GAA AAC ACT ACT TCT GTC AAC TTG 39
Gin Pro Ile Asp Asp Glu Asn Thr Thr Ser Val Asn Leu
1 5 10
CCA GTT 45
Pro Val
15
-35CZ 290069 B6 (2) Informace o sekvenci id. č. 43:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 15 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 43:
Gin Pro Ile Asp Asp Glu Asn Thr Thr Ser Val Asn Leu 15 10
Pro Val (2) Informace o sekvenci id. č. 44:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 297 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Znak:
(A) název/klíč: CDS (B) umístění: 1 ...276
-36CZ 290069 B6 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 44:
ATG Met 1 AAA CTG AAA ACT GTA AGA TCT GCG GTC CTT TCG TCA 39
Lys Leu Lys Thr 5 val Arg Ser Ala Val 10 Leu Ser Ser
CTC TTT GCA TCT CAG GTC CTT GGC CAA CCA ATT GAC GAC 78
Leu Phe 15 Ala Ser Gin Val Leu 20 Gly Gin Pro Ile Asp 25 Asp
GAA AAC ACT ACT TCT GTC AAC TTG CCA GTT AAG AGA TTC 117
Glu Asn Thr Thr 30 Ser Val Asn Leu Pro 35 Val Lys Arg Phe
GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGT TCT CAC TTG GTT GAA GCT 156
Val 40 Asn Gin His Leu Cys 45 Gly Ser His Leu Val 50 G1U Ala
TTG TAC TTG GTT TGC GGT GGA AGA GGT TTC TTC TAC ACT 195
Leu Tyr Leu 55 Val Cys Gly Glu Arg 60 Gly Phe Phe Tyr Thr 65
CCT AAG GCT GCT AAG GGT ATT GTC GAA CAA TGC TGT ACC 234
Pro Lys Ala Ala Lys 70 Gly Ile Val G1U Gin 75 Cys Cys Thr
TCC ATC TGC TCC TTG TAC CAA TTG GAA AAC TAC TGC AAC 273
Ser Ile 80 Cys Ser Leu Tyr Gin 85 Leu Glu Asn Tyr Cys 90 Asn
TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA 297 (2) Informace o sekvenci id. č. 45:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 91 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid
-37CZ 290069 B6 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 45:
Met Lys Leu Lys Thr Val Arg Ser Ala Val Leu Sér Ser
1 5 10
Leu Phe 15 Ala Ser Gin val Leu 20 Gly Gin Pro Ile Asp 25 Asp
Glu Asn Thr Thr 30 Ser Val Asn Leu Pro 35 Val Lys Arg Phe
Val 40 Asn Gin His Leu Cys 45 Gly Sér His Leu Val 50 Glu Ala
Leu Tyr Leu 55 Val Cys Gly Glu Arg 60 Gly Phe Phe Tyr Thr 65
Pro Lys Ala Ala Lys 70 Gly Ile Val Glu Gin 75 Cys Cys Thr
Ser Ile 80 Cys Ser Leu Tyr Gin 85 Leu Glu Asn Tyr Cys 90 Asn
(2) Informace o sekvenci id. č. 46:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 51 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Znak:
(A) název/klíč: CDS (B) umístění: 1...51 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 46:
CAA CCA Gin Pro 1 ATT GAC GAC Asp 5 ACT GAA TCT AAC ACT Thr 10 ACT TCT GTC 39
Ile Asp Thr Glu Ser Asn Thr Ser Val
AAC TTG CCA GCT 51
Asn Leu Pro Ala
15
-38CZ 290069 B6 (2) Informace o sekvenci id. č. 47:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 17 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 47:
Gin Pro Ile Asp Asp Thr Glu Ser Asn Thr Thr Ser Val 15 10
Asn Leu Pro Ala (2) Informace o sekvenci id. č. 48:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 54 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Znak:
(A) název/klíč: CDS (B) umístění: 1...54 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 48:
CAA Gin 1 CCA ATT GAC Asp GAC Asp 5 ACT Thr GAA TCT AAC ACT ACT TCT GTC 39
Pro Ile G1U Ser Asn Thr 10 Thr Ser Val
AAC TTG CCA GCT GCT 54
Asn Leu Pro Gly Ala
15
(2) Informace o sekvenci id. č. 49:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 57 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA
-39CZ 290069 B6 (ix) Znak:
(A) název/klíč: CDS (B) umístění: 1...57 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 49:
CAA CGA ATT GAC GAC ACT GAA TCT ATC AAC ACT ACT TTG 39
Gin Pro Ile Asp Asp Thr Glu Sér ile Asn Thr Thr Leu
1 5 10
GTC AAC TTG CCA GCT GCT 54
Val Asn Leu Pro Gly Ala
(2) Informace o sekvenci id. č. 50:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 99 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Znak:
(A) název/klíč: CDS (B) umístění: 1...99 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 50:
CAA Gin 1 CCA ATT GAC GAC Asp 5 ACT GAA TCT AAC ACT ACT TCT GTC 39
Pro Ile Asp Thr Glu Ser Asn Thr Thr 10 Ser Val
AAC TTG ATG GCT GAC GAC ACT GAA TCT ATC AAC ACT ACT 78
Asn Leu Met Ala Asp Asp Thr G1U Ser Ile Asn Thr Thr
15 20 25
TTG GTT AAC TTG CCA GGT GCT 99
Leu Val Asn Leu Pro Gly Ala
30
(2) Informace o sekvenci id. č. 51:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 105 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární
-40CZ 290069 B6 (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Znak:
(A) název/klíč: CDS (B) umístění: 1...105 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 51:
CAA Gin 1 CCA Pro ATT GAC GAC ACT Thr GAA TCT Glu Ser AAC ACT ACT Asn Thr Thr 10 TCT GTC Ser Val 39
Ile Asp Asp 5
AAC TTG ATG GCT GAC GAC ACT GAA TCT AGA TTC GCT ACT 78
Asn Leu Met Ala Asp Asp Thr Glu Ser Arg Phe Ala Thr
15 20 25
AAC ACT ACT TTG GTT AAC TTG CCA TTG 105
Asn The The Leu Val Asn Leu Pro Leu
30 35
(2) Informace o sekvenci id. č. 52:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 108 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Znak:
(A) název/klíč: CDS (B) umístění: 1...108 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 52:
CAA Gin 1 CCA Pro ATT GAC Ile Asp GAC Asp 5 ACT Thr GAA TCT Glu Ser AAC ACT ACT TCT GTC 39
Asn Thr 10 Thr Ser Val
AAC TTG ATG GCT GAC GAC ACT GAA TCT ATC AAC ACT ACT 78
Asn Leu Met Ala Asp Asp Thr Glu Ser Ile Asn Thr Thr
15 20 25
TTG GTT AAC TTG GCT AAC GTT GCC ATG GCT 105
Leu Val Asn Leu Ala Asn Val Ala Met Ala
30 35
(2) Informace o sekvenci id. č. 53:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 60 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Znak:
(A) název/klíč: CDS (B) umístění: 1...60 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 53:
CAA Gin 1 CCA ATT Pro Ile GAC GAC ACT GAA TCT GCT ATC AAC ACŤ ACT Thr Thr 39
Asp Asp 5 Thr Glu Ser Ala Ile 10 Asn
TTG GTC AAC TTG CCA GGT GCT 60
Leu Val Asn Leu Pro Gly Ala
15 20
(2) Informace o sekvenci id. č. 54:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 276 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Znak:
(A) název/klíč: CDS (B) umístění: 113... 274
-42CZ 290069 B6 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 54:
TTAAATCTAT AACTACAAAA AACACATACA GGAATTCATT CAAGAATAGT 50
TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT CATACACAAT ATAAACGACG 100
GGTACCAAAA TA ATG AAA CTG AAA ACT GTA AGA TCT GCG GTC 142
Met Lys Leu Lys Thr Val Arg Ser Ala Val 15 10
CTT Leu TCG TCA CTC TTT Leu Phe 15 GCA TCT Ala Ser CAG GTC Gin Val 20 CTT GGC CAA Gin CCA Pro 181
Ser Ser Leu Gly
ATT GAC GAC GAA AAC ACT ACT TCT GTT AAC TTG CCA GCT 220
Ile Asp Asp Glu Asn Thr Thr Ser Val Asn Leu Pro Ala
25 30 35
AAG AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGC GGT TCC CAC TTG 259
Lys Arg Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu
45
GTT GAA GCT TTG TAC TT 276
val 50 G1U Ala Leu Tyr
(2) Informace o sekvenci id. č. 55:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 54 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární o
(ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 55:
Met 1 Lys Leu Lys Thr 5 Val Arg Ser Ala Val 10 Leu Ser Ser
Leu Phe 15 Ala Ser Gin Val Leu 20 Gly Gin Pro Ile Asp 25 Asp
Glu Asn Thr Thr 30 Ser Val Asn Leu Pro 35 Ala Lys Arg Phe
Val 40 Asn Gin His Leu cys 45 Gly Ser His Leu Val 50 Glu Ala
Leu Tyr
-43CZ 290069 B6 (2) Informace o sekvenci id. č. 56:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 282 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Znak:
(A) název/klíč: CDS (B) umístění: 113...280 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 56:
TTAAATCTAT AACTACAAAA ÁACACATACA GGAATTCATT CAAGAATAGT 50
TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT CATACACAAT ATAAACGACG 1OO
GGTACCAAAA TA ATG AAA CTG AAA ACT GTA AGA TCT GCG GTC 142 Met Lys Leu Lys Thr Val Arg Ser Ala Val
5 10
CTT TCG TCA CTC TTT GCA TCT CAG GTC CTT GGC Gly GTC Val CAA CCA 181 220
Leu Ser Ser Leu Phe Ala Ser AAC Asn 30 Gin Val ACT ACT Leu 20 TCT Ser Gin AAC Asn 35 Pro TTG Leu
ATT Ile GAC ASp 25 GAC ACT 15 GAA Glu TCT Ser
Ašp Thr Thr Thr
CCA GCT AAG AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGC GGT TCC 259
Pro Ala Lys Arg Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser
40 45
CAC TTG GTT GAA GCT TTG TAC TT 282
His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
50 55
(2) Informace o sekvenci id. č. 57:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 56 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid
-44CZ 290069 B6 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 57:
Met 1 Lys Leu Lys Thr 5 Val Arg Ser Ala Val 10 Leu Ser Ser
Leu Phe 15 Ala Ser Gin Val Leu 20 Gly Gin Pro Ile Ašp 25 Asp
Thr Glu Ser Asn 30 Thr Thr Ser Val Asn 35 Leu Pro Ala Lys
Arg 40 Phe Val Asn Gin His 45 Leu Cys Gly Ser His 50 Leu Val
Glu Ala Leu Tyr (2) Informace o sekvenci id. č. 58:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 282 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová ío (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Znak:
(A) název/klíč: CDS (B) umístění: 113...280
-45CZ 290069 B6 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 58:
TTAAATCTAT
AACTACAAAA
AACACATACA GGAATTCATT CAAGAATAGT 50
TCAAACAAGA
AGATTACAAA
CTATCAATTT CATACACAAT ATAAACGACG
100
GGTACCAAAA
TA ATG AAA Met Lys 1
CTG AAA ACT GTA AGA TCT GCG GTC
Leu Lys Thr Val Arg Ser Ala Val 5
142
CTT TCG TCA CTC TTT GCA TCT CAG GTC CTT GGC CAA CCA
Leu Ser Ser Leu Phe Ala Ser Glh Val Leu Gly Gin Pro
15 20
ATT GAC GAC ACT GAA TCT AAC ACT ACT TCT GTC AAC TTG
lle ASp Asp Thr Glu Ser Asn Thr Thr Ser Val Asn Leu
25 30 35
ATG GCT AAG AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGC GGT TCC
Met Ala Lys Arg Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly ser
40 45
CAC TTG GTT GAA GCT TTG TAC TT
His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
50 55
181
220
259
282 (2) Informace o sekvenci id. č. 59:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 56 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární o
(ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 59:
Met 1 Lys Leu Lys Thr 5 Val Arg Ser Ala Val 10 Leu Sér Ser
Leu Phe 15 Ala Ser Gin Val Leu 20 Gly Gin Pro lle Asp 25 Asp
Thr Glu Šer Asn 30 Thr Thr Ser Val Asn 35 Leu Met Ala Lys
Arg 40 Phe Val Asn Gin His 45 Leu Cys Gly Ser His 50 Leu Val
Glu Ala Leu Tyr
-46CZ 290069 B6 (2) Informace o sekvenci id. č. 60:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 330 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Znak:
(A) název/klíč: CDS (B) umístění: 113.. .328 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 60:
TTAAATCTAT AACTACAAAA AACACATACA GGAATTCATT CAAGAATAGT 50
TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT CATACACAAT ATAAACGACG 100
GGTACCAAAA TA ATG AAA CTG AAA ACT GTA AGA TCT GCG GTC 142
Met Lys Leu Lys Thr Val Arg Ser Ala Val
5 10
CTT TCG TCA CTC Leu TTT Phe 15 GCA TCT CAG GTC CŤT Leu 20 GGC Gly CAA Gin CCA Pro 181
Leu Ser Ser Ala Ser Gin Val
ATT GAC GAC ACT GAA TCT AAC ACT ACT TCT GTC AAC TTG 220
Ile Asp Asp Thr Glu Ser Asn Thr Thr Ser Val Asn Leu
25 30 35
ATG GCT GAC GAC ACT GAA TCT ATC AAC ACT ACT TTG GTT 259
Met Ala Asp Asp Thr Glu Ser Ile Asn Thr Thr Leu Val
40 45
AAC TTG CCA GGT GGT AAG AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTG 298
Asn Leu Pro θίγ Ala Lys Arg Phe Val Asn Gin His Léu
50 55 60
TGC GGT TCC CAC TTG GTT GAA GCT TTG TAC TT 330
Cys Gly Ser His Leu Val G1U Ala Leu Tyr
65 70
(2) Informace o sekvenci id. č. 61:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 72 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid
-47CZ 290069 B6 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 61:
Met 1 Lys Leu Lys Thr Val Arg Ser Ala Val Leu Ser Ser
5 10
Leu Phe Ala Ser Gin Val Leu Gly Gin Pro Ile Asp Asp
15 20 25
Thr Glu Ser Asn Thr Thr Ser Val Asn Leu Met Ala Asp
30 35
Asp Thr Glu Ser Ile Asn Thr Thr Leu Val Asn Leu Pro
40 45 50
Gly Ala Lys Arg Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser
55 60 65
His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
(2) Informace o sekvenci id. č. 62:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 288 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina io (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Znak:
(A) název/klíč: CDS (B) umístění: 113.. .286
-48CZ 290069 B6 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 62:
TTAAATCTAT AACTACAAAA AACACATACA GGAATTCATT CAAGAATAGT 50
TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT CATACACAAT ATAAACGACG 100
GGTACCAAAA TA ATG AAA GTG AAA ACT GTA AGA TCT GCG GTC 142 Met Lys Leu Lys Thr Val Arg Ser Ala Val 1 5 10
CTT TCG Leu Ser TCA Ser CTC Leu TTT GCA TCT CAG GTC CTT GGC Gly CAA CCA Gin Pro 181
Phe 15 Ala Ser Gin Val Leu 20
ATT GAC GAC ACT GAA TCT ATC AÁC ACT ACT TTG GTC AAC 220
Ile Asp Asp Thr Glu Ser Ile Asn Thr Thr Leu Val Asn
25 30 35
TTG CCA GGT GCT AAG AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGC 259
Leu Pro Gly Ala Lys Arg Phe Val Asn Gin His Leu Cys
40 45
GGT TCC CAC TTG GTT GAA GCT TTG TAC TT 330
Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
50 55
(2) Informace o sekvenci id. č. 63:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 58 aminokyselin (B) typ: aminokyselina io (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 63:
Met 1 Lys Leu Lyš Thr 5 Val Arg Ser Ala Val 10 Leu Ser Ser
Leu Phe 15 Ala Ser Gin Val Leu 20 Gly Gin Pro Ile Asp 25 Asp
Thr Glu Ser Ile 30 Asn Thr Thr Leu Val 35 Asn Leu Pro Gly
Ala 40 Lys Arg Phe Val Asn 45 Gin His Leu Cys Gly 50 Ser His
Leu Val Glu Ala Leu Tyr
-49CZ 290069 B6 (2) Informace o sekvenci id. č. 64:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 82 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 64:
GGTTAACGAA CTTTGGAGCT TCAGCTTCAG CTTCTTCTCT CTTAGCCATG 50
GAGATCAAGT TAAÚAACATC CAAAGTAGTG TT (2) Informace o sekvenci id. č. 65:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 54 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 65:
CAAGTACAAA GCTTCAACCA AGTGGGAACC GCACAAGTGT TGGTTAACGA 50
ACTT (2) Informace o sekvenci id. č. 66:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 117 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 66:
CAACCAATTG ACGACACTGA ATCTAACACT ACTTCTGTCA ACTTGATGGC 50
TGACGACACT GAATCTAGAT TCGCTACTAA CACTACTTTG GATGTTGTTA 100
ACTTGATCTC CATGGCT 117
-50CZ 290069 B6 (2) Informace o sekvenci id. č. 67:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 41 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 67:
Gin 1 Pro Ile Asp Asp 5 Thr Glu Ser Asn Thr 10 Thr Ser Val Asn
Leu 15 Met Ala Asp Asp Thr 20 Glu Ser Arg Phe Ala 25 Thr Asn Thr
Thr Leu 30 Ala Leu Asp Val Val 35 Asn Leu Ile Ser Met 40 Ala
(2) Informace o sekvenci id. č. 68:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 51 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 68:
TCTCTTAGCC ATGGAGATCA AGTTAACAAC ATCCAAAGCC AAAGTAGTGT 50 (2) Informace o sekvenci id. č. 69:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 123 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA
-51 CZ 290069 B6 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 69:
CAACCAATTG ACGACACTGA ATCTAACACT ACTTCTGTCA ACTTGATGGC 50
TGACGACACT GAATCTAGAT TCGCTACTAA CACTACTTTG GCTTTGGATG 100
TTGTTAACTT GATCTCCATG GCT 123 (2) Informace o sekvenci id. č. 70:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 65 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 70:
Lys Arg Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Pro Lys Phe Val
1 5 10
Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
15 20 25
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala
30 35 40
Ala Lys Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
45 50 55
Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
60 65
(2) Informace o sekvenci id. č. 71:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 219 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA
-52CZ 290069 B6 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 71:
AAGAGAGAAG AAGCTGAAGC TGAAGCTGAA CCAAAGTTCG TTAACCAACA 50
CTTGTGTGGT TCTCACTTGG TTGAAGCTTT GTACTTGGTT TGCGGTGAAA 100
GAGGTTTCTT CTACACTCCT AAGGCTGCTA AGGGTATTGT CGAACAATGC 150
TGTACCTCCA TCTGCTCCTT GTACCAATTG GAAAACTACT GCAACTAGAC 200
GCAGCCCGCA GGCTCTAGA 219 (2) Informace o sekvenci id. č. 72:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 348 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 72:
TTAAATCTAT AACTACAAAA AACACATACA GCAATTCCAT TCAAGAATAG 50
TTCAAACAAG AAGATTACAA ACTATCAATT TCATACACAA TATAAACGAC 100
GGTACCAAAA TAATGAAACT GAAAACTGTA AGATCTGCGG TCCTTTCGTC 150
ACTCTTTGCA TCTCAGGTCC TTGGCCAACC AATTGACGAC ACTGAATCTA 200
ACACTACTTC TGTCAACTTG ATGGCTGACG ACACTGAATC TAGATTCGCT 250
ACTAACACTA CTTTGGTTAA CTTGGCTAAC GTTGCCAACC AACACTTGTG 300
TGGTTCTCAC TTGGTTGAAG CTTTGTACTT ATGGCTAAGA GATTCGTT 348 (2) Informace o sekvenci id. č. 73:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 379 párů nukleotidů (B) typ: nukleotidová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA
-53 CZ 290069 B6 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 73:
TTAAATCTAT AAGTACAAAA AACACATAGA GCAATTCCAT TCAAGAATAG 50
TTCAAACAAG AAGATTACAA ACTATCAATT TCATACACAA TATAAAČGAC 100
GGTACCAAAA TAATGAAACT GAAAACTGTA AGATCTGCGG TCCTTTCGTC 150
ACTCTTTGCA TCTCAGGTCC TTGGCCAACC AATTGACGAC ACTGAATCTA 200
ACACTACTTC TGTCAACTTG ATGGCTGACG ACACTGAATC TAGATTCGCT 250
ACTAACACTA CTTTGGATGT TGTTAACTTG ATCTCCATGG CTAAGAGAGA 300
AGAAGCTGAA GGTGAAGCTG AACCAAAGTT CGTTAACCAA CACTTGTGTG 350
GTTCTCACTT GGTTGAAGCT TTGTACTTG 379

Claims (29)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. DNA expresní kazeta, která obsahuje následující sekvenci
    5'-P-SP-LS-PS-*gen*-(T)i-3', v níž P znamená sekvenci promotoru,
    SP znamená DNA sekvenci kódující signální peptid,
    LS znamená DNA sekvenci kódující leader peptid obecného vzorce I
    GlnProIle(Asp/Glu)(Asp/Glu)X1(Glu/Asp)X2AsnZ(Thr/Ser)X3 (I), v němž
    X1 znamená peptidovou vazbu nebo 1 z 21 přirozeně se vyskytujících aminokyselin,
    X2 znamená peptidovou vazbu, 1 z 21 přirozeně se vyskytujících aminokyselin nebo sekvenci až 4 z 21 přirozeně se vyskytujících aminokyselin, které mohou být stejné nebo různé,
    Z znamená 1 z 21 přirozeně se vyskytujících aminokyselin vyjma Pro a
    X3 znamená sekvenci 4 až 30 z 21 přirozeně se vyskytujících aminokyselin, které mohou být stejné nebo různé,
    PS znamená DNA sekvenci kódující místo opracování, *gen* znamená DNA sekvenci kódující heterologní polypeptid,
    T znamená sekvenci terminátoru a i znamená číslo 0 nebo 1.
    -54CZ 290069 B6
  2. 2. DNA expresní kazeta podle nároku 1, kde X1 v obecném vzorci I znamená Ser, Thr nebo Ala.
  3. 3. DNA expresní kazeta podle nároku 1, kde X2 v obecném vzorci I znamená Ser, Thr nebo Ala.
  4. 4. DNA expresní kazeta podle nároku 1, kde X2 v obecném vzorci I znamená Serlle.
  5. 5. DNA expresní kazeta podle nároku 1, kde X2 v obecném vzorci I znamená SerAlalle.
  6. 6. DNA expresní kazeta podle nároku 1, kde X2 v obecném vzorci I znamená SerPheAlaThr.
  7. 7. DNA expresní kazeta podle nároku 1, kde X3 v obecném vzorci I znamená aminokyselinovou sekvenci obecného vzorce Π
    X-X-X6 (Π), v němž
    X4 znamená sekvenci 1 až 21 kódovatelných aminokyselin,
    X5 znamená Pro nebo aminokyselinovou sekvenci zahrnující aminokyselinovou sekvenci ValAsnLeu, LeuAlaAsnValAla. X6 znamená sekvenci 1 až 8 kódovatelných aminokyselin.
  8. 8. DNA expresní kazeta podle nároku 7, kde X4 v obecném vzorci Π znamená aminokyselinovou sekvenci zahrnující jeden nebo více z motivů LeuValAsnLeu, SerValAsnLeu, MetAla.
  9. 9. DNA expresní kazeta podle nároku 7, kde X4 v obecném vzorci Π znamená aminokyselinovou sekvenci zahrnující sekvenci AsnSerThr nebo AsnThrThr.
  10. 10. DNA expresní kazeta podle nároku 7, kde X4 v obecném vzorci Π znamená aminokyselinovou sekvenci zahrnující sekvenci (Ser/Leu)ValAsnLeu, (Ser/Leu)ValAsnLeuMetAlaAsp, (SerZLeu)ValAsnLeuMetAlaAspAsp, (Ser/Leu)VaLAsnLeuMetAla.
  11. 11. DNA expresní kazeta podle nároku 7, kde X4 v obecném vzorci Π znamená aminokyselinovou sekvenci zahrnující sekvenci Asn(Thr/Ser)ThrLeu, Asn(Thr/Ser)ThrLeuAsnLeu nebo Asn(Thr/Ser)ThrLeuValAsnLeu.
  12. 12. DNA expresní kazeta podle nároku 7, kde v obecném vzorci II znamená Pro.
  13. 13. DNA expresní kazeta podle nároku 7, kde v obecném vzorci Π znamená aminokyselinovou sekvenci ValAsnLeu.
  14. 14. DNA expresní kazeta podle nároku 7, kde X5 v obecném vzorci Π znamená aminokyselinovou sekvenci LeuValAsnVal.
  15. 15. DNA expresní kazeta podle nároku 7, kde X5 v obecném vzorci Π znamená aminokyselinovou sekvenci LeuAspValVal.
  16. 16. DNA expresní kazeta podle nároku 7, kde X5 v obecném vzorci Π znamená aminokyselinovou sekvenci LeuAspValVal.
    -55 CZ 290069 B6
  17. 17. DNA expresní kazeta podle nároku 7, kde X6 v obecném vzorci Π znamená Ala, Gly, Leu, Thr, Val nebo Ser.
  18. 18. DNA expresní kazeta podle nároku 7, kde X6 v obecném vzorci II znamená GlyAla nebo SerAla.
  19. 19. DNA expresní kazeta podle nároku 7, kde X8 v obecném vzorci Π znamená AlaValAla.
  20. 20. DNA expresní kazeta podle nároku 7, kde X6 v obecném vzorci Π znamená GlyAlaAspSerLysThrValGlu.
  21. 21. DNA expresní kazeta podle nároku 1, kde leader peptid kódovaný DNA sekvencí LS je vybrán ze skupiny sestávající ze:
    sekv. id. č. 1:
    GlnProIleAspGluAspAsnAspThrSerValAsnLeuProAla, sekv. id. č. 2:
    GlnProIleAspAspGluAsnThrThrSerValAsnLeuProAla, sekv. id. č. 3:
    GlnProIleAspAspGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuProAla, sekv. id. č. 4:
    GlnProIleAspAspGluAsnThrThrSerV alAsnLeuProV al, sekv. id. č. 5:
    GlnProIleAspAspThrGluAsnThrThrSerValAsnLeuProAla, sekv. id. č. 6:
    GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuProAla, sekv. id. č. 7:
    GlnProIleAspAspGluAsnThrThrSerValAsnLeuMetAla, sekv. id. č. 8:
    GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuProGlyAla, sekv. id. č. 9:
    GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAla, sekv. id. č. 10:
    GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerV alAsnV alProThr,
    -56CZ 290069 B6 sekv. id. č. 11:
    GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrLeuValAsnValProThr, sekv. id. č. 12:
    GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuProThr, sekv. id. č. 13:
    GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrLeuV alAsnV alProGlyAla, sekv. id. č. 14:
    GlnProIleAspAspThrGluYSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaProAlaVlaAla, sekv. id. č. 15:
    GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAspLeuAlaValGlyLeuProGlyAla, sekv. id. č. 16:
    GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerlleAsnThrThrLeuV alAsnLeuProGlyAla, sekv. id. č. 17:
    GlnProIleAspAspThrGluSerlleAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla, sekv. id. č. 18:
    GlnProneAspAspThrGluSerAsnThrThrLeuVlaAsnLeuProGlyAla, sekv. id. č. 19:
    GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuVlaAsnLeuProLeu, sekv. id. č. 20:
    GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerlleAsnThrThrLeuVlaAsnLeuAlaAsnV alAlaMetAla, sekv. id. č. 21:
    GlnProIleAspAspThrGluSerAlalleAsnThrThrLeuValAsnLeuProGIyAla, sekv. id. č. 22:
    GlnProIleAspAspThrGluSerPheAlaThrAsnThrThrLeuVlaAsnLeuProGlyAla, sekv. id. č. 23:
    GlnProIleAspAspThrGluSerlleAsnThrThrLeuValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuValLeuPro Leu,
    -57CZ 290069 B6 sekv. id. č. 24:
    GlnProIleAspAspThrGluSerlleAsnThrThrLeuVlaAslLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAspV al V alAsnLeuProGlyAla, sekv. id. č. 25:
    GlnProIleAspAspThrGluSerAlaAlalleAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla, sekv. id. č. 26:
    GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuV alAsnLeuAlaAsnV alAlaMetAla, sekv. id. č. 27:
    GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAspVal-ValAsnLeulleSerMetAIa, sekv. id. č. 28:
    GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAsnThrThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAspValValAsnLeuIleSerMetAlaa sekv. id. č. 67:
    GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAlaLeuAspValVlaAsnLeuIleSerMetALaLysArg.
  22. 22. DNA expresní kazeta podle nároku 21, kde leader peptid kódovaný DNA sekvencí LS je vybrán ze skupiny sestávající ze:
    zvláště výhodnými leader peptidů, které jsou kódovány DNA sekvencí LS, jsou:
    sekv. id. č. 15:
    GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAspLeuAlaValGlyLeuProGlyAla, sekv. id. č. 16:
    GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerneAsnThrThrLeuV alAsnLeuProGlyAla, sekv. id. č. 17:
    GlnProIleAspAspThrGluSerlle AsnThrThrLeuV alAsnLeuProGlyAla, sekv. id. č. 18:
    GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla,
    -58CZ 290069 B6 sekv. id. č. 19:
    GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuVlaAsnLeuProLeu, sekv. id. č. 20:
    GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerlleAsnThrThrLeuV alAsnLeuAlaAsnV alAlaMetAla, sekv. id. č. 21:
    GlnProIleAspAspThrGluSerAlalleAsnThrThrLeuV alAsnLeuProGlyAla, sekv. id. č. 22:
    GlnProIleAspAspThrGluSerPheAlaThrAsnThrThrLeuVaLAsnLeuProGlyAla, sekv. id. č. 23:
    GlnProILeAspAspThrGluSerlleAsnThrThrLeuValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuValAsnLeuProLeu, sekv. id. č. 24:
    GlnProIleAspAspThrGluSerlleAsnThrThrLeuValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAspV alV alAsnLeuProGlyAla, sekv. id. č. 25:
    GlnProIleAspAspThrGluSerAlaAlalleAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla, sekv. id. č. 26:
    GlnProIleAspAspThrGluSerAnsThrThrSerVaLAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuV alAsnLeuAlaAsnV alAlaMetAla, sekv. id. č. 27:
    GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAspV al-V alAsnLeulleSerMetAla, sekv. id. č. 28:
    GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAsnThrThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAspV alV alAsnLeulleSerMetAla.
  23. 23. DNA expresní kazeta podle nároku 21, kde leader peptid kódovaný DNA sekvencí LS je zvláště výhodným leader peptidem, který je kódován DNA sekvencí LS:
    sekv. id. č. 67:
    GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAlaLeuAspV alV alAsnLeuIleSerMetAlaLy sArg.
    -59CZ 290069 B6
  24. 24. DNA expresní kazeta podle nároku 1, kde SP znamená DNA sekvenci, která kóduje α-faktor signální peptid, signální peptid myší slinné amylázy, karboxypeptidázový signální peptid, signální peptid kvasinkové espartové proteázy 3 nebo kvasinkový BARI signální peptid.
  25. 25. DNA expresní kazeta podle nároku 1, kde PS znamená DNA sekvenci kódující LysArg, ArgLys, ArgArg, LysLys nebo Ile-GluGlyArg.
  26. 26. DNA expresní kazeta podle nároku 1, kde *gen* je DNA sekvence kódující polypeptid vybraný ze skupiny, která sestává zaprotininu, inhibitoru cesty tkáňového faktoru nebo prekurzorů inzulínu, inzulínu podobajícího se růstového faktoru I, inzulínu podobajícího se růstového faktoru Π, lidského nebo hovězího růstového hormonu, interleukinu, glukagonu, glukagonu, podobajícího se peptidu 1, aktivátoru tkáňového plazminogenu, transformujícího růstového faktoru a nebo β růstového faktoru odvozeného od destiček a enzymů.
  27. 27. Kvasinkový expresní vektor, který obsahuje expresní kazetu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 24.
  28. 28. Buňka kvasinky, která je schopna exprimovat heterologní polypeptid a která je transformována kvasinkovým expresním vektorem podle nároku 25.
  29. 29. Způsob výroby heterologního polypeptidů v kvasinkách, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivování kvasinkové buňky, která je schopna exprimovat žádaný heterologní polypeptid a která je transformována kvasinkovým expresním vektorem podle nároku 25, ve vhodném médiu, takže dojde k expresi a sekreci heterologního polypeptidů, načež se tento polypeptid z média izoluje.
CZ19963641A 1994-06-16 1995-06-16 DNA expresní kazeta, kvasinkový expresní vektor,buňka kvasinky a způsob výroby heterologního polypeptidu v kvasinkách CZ290069B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK70594 1994-06-16
US28285294A 1994-07-29 1994-07-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ364196A3 CZ364196A3 (en) 1997-05-14
CZ290069B6 true CZ290069B6 (cs) 2002-05-15

Family

ID=26064490

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19963641A CZ290069B6 (cs) 1994-06-16 1995-06-16 DNA expresní kazeta, kvasinkový expresní vektor,buňka kvasinky a způsob výroby heterologního polypeptidu v kvasinkách

Country Status (20)

Country Link
US (2) US5639642A (cs)
EP (1) EP0763117B1 (cs)
JP (1) JP3676369B2 (cs)
KR (1) KR100251054B1 (cs)
CN (1) CN1115413C (cs)
AT (1) ATE208823T1 (cs)
AU (1) AU693569B2 (cs)
BR (1) BR9508033A (cs)
CZ (1) CZ290069B6 (cs)
DE (1) DE69523915T2 (cs)
DK (1) DK0763117T3 (cs)
ES (1) ES2168367T3 (cs)
FI (1) FI965005A (cs)
HU (1) HU221118B1 (cs)
MX (1) MX9606492A (cs)
NO (1) NO965362L (cs)
PL (1) PL317722A1 (cs)
PT (1) PT763117E (cs)
UA (1) UA40648C2 (cs)
WO (1) WO1995034666A1 (cs)

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2686899B1 (fr) * 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US6500645B1 (en) 1994-06-17 2002-12-31 Novo Nordisk A/S N-terminally extended proteins expressed in yeast
ZA9610456B (en) * 1995-12-20 1997-06-20 Novo Nordisk As N-terminally extended proteins expressed in yeast
ATE253120T1 (de) * 1996-12-13 2003-11-15 Chiron Corp Verfahren zur expression von heterologen proteinen in hefe
DE69735242T2 (de) * 1996-12-20 2006-09-21 Novo Nordisk A/S N-terminal verlängerte proteine exprimiert in hefe
EP0954589A1 (en) 1997-01-24 1999-11-10 Novo Nordisk A/S Synthetic leader peptide sequences
CA2205076A1 (en) 1997-05-14 1998-11-14 Jim Hu Episomal expression cassettes for gene therapy
AU2149899A (en) 1998-01-23 1999-08-09 Novo Nordisk A/S Process for making desired polypeptides in yeast
US20040010134A1 (en) * 2000-04-12 2004-01-15 Rosen Craig A. Albumin fusion proteins
KR20030004315A (ko) 1999-12-29 2003-01-14 노보 노르디스크 에이/에스 효모에서 개선된 발효 수율을 갖는 인슐린 선구물질 및인슐린 선구물질 유사체의 제조 방법
US20050100991A1 (en) * 2001-04-12 2005-05-12 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2002097038A2 (en) * 2001-05-25 2002-12-05 Human Genome Sciences, Inc. Chemokine beta-1 fusion proteins
DK1463751T3 (da) 2001-12-21 2013-08-26 Human Genome Sciences Inc Albuminfusionsproteiner.
WO2003059934A2 (en) * 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
GB0217033D0 (en) 2002-07-23 2002-08-28 Delta Biotechnology Ltd Gene and polypeptide sequences
EP1594530A4 (en) 2003-01-22 2006-10-11 Human Genome Sciences Inc HYBRID PROTEINS OF ALBUMIN
JP2007532096A (ja) 2003-11-14 2007-11-15 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ アシル化されたインスリンの製造方法
JP5697831B2 (ja) 2003-12-03 2015-04-08 ノヴォ ノルディスク アー／エス 単鎖インシュリン
EP1729795B1 (en) * 2004-02-09 2016-02-03 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US7527947B2 (en) * 2004-06-14 2009-05-05 Novozymes A/S Signal peptide for producing a polypeptide
JP5366546B2 (ja) 2005-08-16 2013-12-11 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 成熟インスリンポリペプチドの作製方法
US20090068158A1 (en) * 2005-12-09 2009-03-12 Medin Jeffrey A Thymidylate kinase mutants and uses thereof
CA2566267A1 (en) * 2005-12-09 2007-06-09 University Health Network Thymidylate kinase mutants and uses thereof
ATE482977T1 (de) 2006-02-27 2010-10-15 Novo Nordisk As Insulinderivate
EP1989308B1 (en) 2006-03-03 2017-05-31 ProMIS Neurosciences Inc. Methods and compositions to treat and detect misfolded-sod1 mediated diseases
PL2074141T3 (pl) 2006-09-22 2017-02-28 Novo Nordisk A/S Analogi insuliny oporne na proteazę
ES2464282T3 (es) 2006-09-27 2014-06-02 Novo Nordisk A/S Método para preparar polipéptidos de insulina madura
CA2584494A1 (en) * 2007-03-27 2008-09-27 Jeffrey A. Medin Vector encoding therapeutic polypeptide and safety elements to clear transduced cells
WO2008134879A1 (en) 2007-05-04 2008-11-13 University Health Network Il-12 immunotherapy for cancer
WO2008139496A1 (en) * 2007-05-16 2008-11-20 Bigtec Private Limited Recombinant human insulin and a method thereof
EP2170945A1 (en) 2007-07-16 2010-04-07 Novo Nordisk A/S Protease stabilized, pegylated insulin analogues
EP2910570B1 (en) 2008-03-18 2016-10-12 Novo Nordisk A/S Protease stabilized, acylated insulin analogues
US8568709B2 (en) * 2008-03-20 2013-10-29 University Health Network Thymidylate kinase fusions and uses thereof
US8815541B2 (en) 2009-11-25 2014-08-26 Novo Nordisk A/S Method for making polypeptides
CN102791730A (zh) 2010-01-22 2012-11-21 诺沃—诺迪斯克有限公司 低度o-糖基化的fgf21的制备方法
RU2460795C1 (ru) * 2011-07-06 2012-09-10 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") Способ микробиологического синтеза секретируемого соматотропина человека и штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae - продуцент секретируемого соматотропина человека
JP6502259B2 (ja) 2012-11-16 2019-04-17 トランスポサジェン バイオファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 部位特異的酵素および使用方法
JP6735561B2 (ja) 2012-12-03 2020-08-05 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ． Ｏ−グリコシル化カルボキシ末端部分（ｃｔｐ）ペプチド系のインスリンおよびインスリン類似体
WO2014195452A1 (en) 2013-06-07 2014-12-11 Novo Nordisk A/S Method for making mature insulin polypeptides
US20170151281A1 (en) 2015-02-19 2017-06-01 Batu Biologics, Inc. Chimeric antigen receptor dendritic cell (car-dc) for treatment of cancer
EP3268384B1 (en) 2015-03-10 2021-11-03 Merck Sharp & Dohme Corp. Process for preparing recombinant insulin using microfiltration
EP3310909B1 (en) 2015-06-17 2021-06-09 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for directing proteins to specific loci in the genome
CN105418755A (zh) * 2015-12-28 2016-03-23 珠海冀百康生物科技有限公司 速效胰岛素前体蛋白以及速效胰岛素的制备方法
WO2019126578A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for directing proteins to specific loci in the genome
MX2020007929A (es) * 2018-02-09 2020-10-01 Jiangsu Hengrui Medicine Co Gen percursor del codón optimizado y gen de péptido señal de analógo de la insulina humana.
CA3197423A1 (en) 2020-11-04 2022-05-12 Daniel Getts Engineered chimeric fusion protein compositions and methods of use thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1340772C (en) * 1987-12-30 1999-09-28 Patricia Tekamp-Olson Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences
US5037743A (en) * 1988-08-05 1991-08-06 Zymogenetics, Inc. BAR1 secretion signal
DK300090D0 (da) * 1990-12-19 1990-12-19 Novo Nordisk As Fremgangsmaade til fremstilling af leadersekvenser

Also Published As

Publication number Publication date
MX9606492A (es) 1997-03-29
EP0763117A1 (en) 1997-03-19
ES2168367T3 (es) 2002-06-16
UA40648C2 (uk) 2001-08-15
AU693569B2 (en) 1998-07-02
JPH10501413A (ja) 1998-02-10
KR100251054B1 (ko) 2000-04-15
FI965005A0 (fi) 1996-12-13
CN1115413C (zh) 2003-07-23
HU9603477D0 (en) 1997-02-28
EP0763117B1 (en) 2001-11-14
WO1995034666A1 (en) 1995-12-21
DE69523915D1 (en) 2001-12-20
DK0763117T3 (da) 2002-02-18
FI965005A (fi) 1997-02-13
DE69523915T2 (de) 2002-08-22
HU221118B1 (en) 2002-08-28
ATE208823T1 (de) 2001-11-15
US5639642A (en) 1997-06-17
AU2733495A (en) 1996-01-05
US5795746A (en) 1998-08-18
NO965362L (no) 1997-02-13
CN1154143A (zh) 1997-07-09
JP3676369B2 (ja) 2005-07-27
PT763117E (pt) 2002-05-31
NO965362D0 (no) 1996-12-13
CZ364196A3 (en) 1997-05-14
PL317722A1 (en) 1997-04-28
HUT76378A (en) 1997-08-28
BR9508033A (pt) 1999-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ290069B6 (cs) DNA expresní kazeta, kvasinkový expresní vektor,buňka kvasinky a způsob výroby heterologního polypeptidu v kvasinkách
JP3730255B2 (ja) イーストにおいて発現されたｎ末端に伸長した蛋白質
JP2708518B2 (ja) 合成酵母リーダーペプチド
AU660161B2 (en) A method of constructing synthetic leader sequences
US6214547B1 (en) Synthetic leader peptide sequences
JP3542604B2 (ja) Ｙａｐ３シグナルペプチドをコードするｄｎａ構築体
US6500645B1 (en) N-terminally extended proteins expressed in yeast
ES2258797T3 (es) Proteinas con extension n-terminal expresadas en la levadura.
JPH06197787A (ja) 新規なるｄｎａ分子及び宿主
JP4180112B2 (ja) 酵母細胞におけるｎ末端を伸長されたタンパクの発現のためのベクター
RU2167939C2 (ru) Способ продуцирования полипептида в дрожжах
CA2192942C (en) Synthetic leader peptide sequences

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 19950616