JPS60186288A - 新規インタ−フエロン発現ベクタ− - Google Patents

新規インタ−フエロン発現ベクタ−

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JPS60186288A
JPS60186288A JP59090862A JP9086284A JPS60186288A JP S60186288 A JPS60186288 A JP S60186288A JP 59090862 A JP59090862 A JP 59090862A JP 9086284 A JP9086284 A JP 9086284A JP S60186288 A JPS60186288 A JP S60186288A
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interferon
gene
expression vector
yeast
host
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JP59090862A
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リチヤード　クラマー
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F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 最近の分子生物学分野における進歩により、高等生物の
特有のたん白をコードするＤＮＡを酵母細胞中に導入す
ることができるようになった。現実に、組換えＤＮＡ技
術を用いて真核細胞のたん白遺伝子をプラスミドのよう
なベクターにクローン化伝子を非調節性のアルコール脱
水素酵素（１：＋ａ　）（１９８３年）、ホヒトインク
フエロン遺伝子の　８．７ケ１．ヤ。、ア、ヤケー１．
ヶ、ヵ、６゜７ｏ　”［モータを用いた。　。
通常毒性のない遺伝子産物でも、過剰生産のため宿主に
害を及ぼし、その宿主−ベクター系の安定性を低下させ
ることもあるため、異種遺伝子の調節発現が望ましい事
は先行技術罠より確認されている。従って、クローン化
した遺伝子の転写および翻訳効率の改善に加え、有効な
発現調節配列により宿主細胞の増殖中に発現を調整する
ように　゛支配できる筈である。望ましい発現調節配列
は、宿主細胞が目的の異ｎ遺伝子産物を生産しないで増
殖できるようスイッチを切り、その後、目的の遺伝子の
プロモータを用い、インクフエロンの発現レベルを炭素
源により調節している。Ｎ誘導〃レベルのインクフエロ
ン発現は高いｌ）”ｈ％非誘導〃Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ、８０巻、１−５負（１９８６年
）、は酵母の酸性フォスファターゼ遺伝子（ＰＨ０５）
プロモータな用いて酵母中でのＢ型肝炎ウィルスの調節
発現を報告している。
しかしながら、先行技術は異種インタフエロンたん白発
現のＮ非誘導〃レベルが低く、−＼誘導〃レベルは高い
というような、酵母中でのインクフエロン遺伝子発現の
しつかりした調節要因に欠けていた。従って、酵母細胞
に真にインタフエロンたん白の発現誘導を望むまで、イ
ンクフエロンたん白の有害な生産の危険を冒すことなく
酵母細胞を高濃度まで増殖させるような、この種の調節
支配要素を提供することが本発明の目的である。
本発明は、形質転換した酵母株中で、異種遺伝子の発現
を調節できるような改良した発現ベクターを提供する。
さらに詳しくは、酵母の抑制酸性フォスファターゼ遺伝
子のフ０ロモータ／レギュレータＤＮＡ領域を含んだこ
の改良型発現ベクターは、ヒト白血球インクフエロンの
遺伝子の発現を調節する。
本発明はまた、改良した発現ベクター−で形質転換した
酵母細胞も提供するものである。このように形質転換し
た酵母細胞は無機りん酸（Ｐ］）を含まない培地中で生
育させる時のみ著量のインクフエロンを生産する。
本発明はさらに、２つのフォスファターゼ、洞部遺伝子
の変異株（リプレッサーの欠陥および温度感受性の陽性
レギュレータ）で、高温（６０−６５°Ｃ）下でよく生
育するが異種たん白、即ちインクフエロン、をりん酸濃
度に関係なく低温（２０−３０°Ｃ）でのみ生産するよ
うな酵母形質転換細胞をも提供する。
酵母細胞中での異種遺伝子の発現をしっかりと調節する
本発明のベクター系は、別名ＰＨ０５遺伝子として知ら
れている酵母の抑制酸性フォスファターゼ（Ａｐａｓｅ
　）遺伝子の５′−末端のフランキング領域を利用して
いる。酵母細胞中でのＰＨ０５遺伝子の転写は生育培地
中に無機りん酸（Ｐｌ）が存在すると抑制され、りん酸
が欠如すると高レベルに誘導される。ＰＨ０５遺伝子の
プロモータ／レギュレータＤＮＡ推定領域を有するＤＮ
Ａ断片上で、転写開始部位より下流、ＡＴＧ開始コドン
より上流に、特有の制限酵素切断部位を導入した。本部
位に挿入した構造遺伝子では翻訳がそれ自身の開始コド
ンで始まる。本発明で用いる構造遺伝子は好ましくは宿
主酵母細胞にとって異種たん白をコードする真核細胞遺
伝子である。本発明で使用する特有な真核細胞遺伝子は
成熟ヒト白血球インタフエロン、特にＡおよびＤ種（Ｉ
ＦＮ−αＡおよびＩＦＮ−αＤ）、をコードするもので
ある。これらのたん白をコードする遺伝子配列および対
応するアミノ酸配列は知られており、種々の印刷論文に
報告されている。
ペスカ（Ｐｓｓｔｋａ）　による［ヒトインターフェロ
ン−タンパク質精製およびバクテリアにおけるクローン
形成に対する配列および表式：前、中および後Ｊ　（Ｔ
ｈｅ　Ｈｕｍａｎ工ｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ−Ｆｒｏｍ　
ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　５
ｅｑｕｅｎｃｓ　ｔｏ、、　Ｏｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　
ＩＣｘ−ｐｒｅａｓｉｏｎ　ｉｎ　ＢＩＬｃｔｅｒｉａ
　：　Ｂｅｆｏｒｅ、Ｂｅｔｗｅｅｎ　ａｎｄＢｅｙｏ
ｎｄｌ”　）　アーチペス　オブ　バイオケミストリイ
　アンド　バイオフィジックス（Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆ
　Ｅｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ
ｉｃｓ　）、２２１巻、１号、１−６７頁（１’９８３
年）を参照。本発明に於いてはヒト真核細胞遺伝子を用
いたが、他のいかなる真核細胞の遺伝子（例えば、ウシ
、ネズミおよびブタ）もＰＨ０５遺伝子のゾロモータ／
゛レギュレータ系と共に用い得ることは予測される。
しかしながら、後述の明細実施例に記載するように、本
発明ではＰＨ０５遺伝子プロモ一タ発現系をヒト白血球
インタフエロンγ工ＦＮ−αＤお、１：　ヒｒ工ＦＮ−
αＡ　のクローン化遺伝子を発現ベクターに挿入する事
により試験した。
誘導のための、特に大量培養のための・もう一つの効率
よい望ましい方法は、温度に対応してのみＡＰａｓθを
、従ってＰＲｏ　５プロモ一タ発現ベクター（そのベク
ターは調節および構造遺伝子ケ含む）中の遺伝子を、誘
導するような酵母株を開発するために、Ｓａｃｃｂａｒ
ｏｍｙｃｅｓ　Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ａ　Ｐａ５ｅ調
節変異株を用いるものである。非許容温度（約３０−３
５°Ｃ）では細胞は良好に生育するが低Ｐ１培地中でも
ＡＰａ８Ｑを生成しないが、許容温度（約２０−６０℃
、望ましくは２３℃）では培地中のＰｌの有無にかかわ
らずＡ　Ｐａ５ｅを生成する。ＰＨ０５−ｆロモータ発
現ベクターを有する本菌株も酵母中で異種遺伝子、具体
的にはγＩＦＮ−αＤ遺伝子の発現の温度による調節を
示すのに用いられている。白血球インタフエロンの生産
は低温、好ましくは２６℃で誘導される・。
本発明の種々の実施態様に用いられる材料は以下に記載
する。本明細書中でかっこ内に示した文献番号は、添付
の文献一覧中に記載するものに対応する。
酵母菌株および培地： ｗ３０Ｌ−１８Ａ（αａｄｅ　２−１　’＋　ｌｅｕ　
２　３　＋２２１−２５２頁：１９８１年）より入数し
た。
本研究からの菌株は、ｐｌ　２２（ｐｈｏ８０＋ｔｒｐ
　１　、ａｄｅ　２．　ｈｉｓ　３．　ｌｅｕ　’２　
）、２９Ｂ５（ｐｈｏ　８０．　ｐ’ｈｏ　４ｔＳ、ｔ
ｒｐ　１．　ａｄｅ’２．　ｈｉｓ　３゜１ｅｕ２）お
よび２９Ａ２１．（ａｐｈｏ８０　ｔｒｐｌ。
ａｄｅ　２．　ｌｅｕ　２　）である。本発明の実施に
おいて、当業者であれば同等の酵母菌株を代用するこ゛
とも出来る。ｗ３０１−？１８Ａの場合Ｋ　ｋ′１ｔｒ
ｐ　１マーカーを有する他の株を使用することもできる
。本発明の実施においては、いかなるｐｈｏ　４　或い
はｐｈｏ　８０変異の酵母株をも使用できる。
高りん酸培地はＹ、ＮＢ　＋　ＣＡＡ　（“ＹＮＢ　”
−酵母窒素ペース：“ＣＡＡ”−力ずミノ酸）（１）で
、必要に応じてアデニンおよびウラシルを添加する。非
りん酸培地はＵＭＤ　（６）　に必要ならウラシルを添
加したもので、無機りん酸を加えない。両培地共、転換
株の選択にはトリプトファンを除いくいる。
ＤＮＡおよびプラスミド： ＰＨ０５遺伝子は、本遺伝子を含有している８キロペー
ス（Ｋｂ）のＺ−ｃ　ｏ’Ｒ１断片より得た（７゜Ｎａ
ｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、７６巻、４９５１−４９５
５頁：１９７９年）から入手した。γＩＦＮ−αＤを含
むリセルアルデヒド６−りん酸脱水素酵素遺伝子は、ク
ローン化したニワトリ遺伝子を用いて酵母ＤＮＡのライ
ブラリーより検索して得た。
七−素上のものである。酵素は販売元の指示通り一般的
に、ＰＨＯ’５プロモータ発現ベクターを造　５、成す
るには、ＰＨ０５の転写の５′−末端（１８）と開始Ａ
ＴＧコドンの間のＤＮＡ領域に、第１図に示す’ｒａｑ
　Ｉ部位を合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いてＥ
ｃｏＲＩ部位に変換することにより、特肩の制限酵素部
位を挿入した。
このようにして得られる転写開始部位を有するＣ１ａｌ
からＥｃｏＲＩへの断片を１．４ｋｂのＥｃｏＲＩ制限
断片上の酵母’ｒＲＰ　１遺伝子と共にｐＢＲ３２２に
挿入し、ＰＨ０５プロモータを有するＹＲＴ）　７　（
１１−）と類似のベクターを得る。ＰＨ０５遺伝子の兄
全発現および調節にはＣｌａｌ部位より上流のＤＮＡが
必要であるので、さらにＣｌａｌ断片（第１図）を挿入
し、ヘクｌｉ−ノコヒー数および安定性を増すために天
然の酵母２ミクロンプラスミド（２ｏ）を添加した。
最後に、一つのＲｃｏＢ　１部位（第１図に図示）を除
去した。得られるプラスミドｐＹＥ　４を第２Ａ図に示
す。開始コドンＡＴＧを含むクローン化遺伝子をｐＹＥ
　Ｊ中のＥｃｏＲＩ部に挿入した。りん酸制御の転写は
ＰＨ０５プロモータで開始し、挿入遺伝子を通して進行
し、挿入ＤＮＡの６′−側の非翻訳領域、またはＴＲＰ
　１遺伝子の終結部位で終結する。
もう一つのｐｐＹＥ７デラスミドも同様に造成した（第
６図）。この場合には２μＩ）Ｎ　ＡをＰＨ０５プロモ
ータとＴＲＰ　１断片の間に挿入し、プロモータの下流
のＥｃｏＲＩ部位を除去した。さらに、ＢａｍＨｌがら
Ｐｖｕ　Ｊｆ部位までの＠ＢＲ３２２配列（１６９０塩
基対）を除去した。
さらに具体的には、ＰＨ０，５プロモ一タ発現ベクター
は下記に記載するように造成した。既に単離している（
　７　）　８　ｋｂ　ＥＣ０Ｒ−Ｉ断片よりＰＨ０５プ
ロモータ（７，８）を含むＢａｍＨＩがらＳａｌ　Ｉ断
片を調製した（第６図）。
ＢａｍＨＩからＳａｌ　Ｉの断片をＴａｑ　、　■　で
部分消化し、５４０　ｂｐのＢａｍＨＩ／　ＴａｑＩ断
片を単離した（第６とｄＣ）ＴＰで充填した（第６図、
ステップ０２）。本断片を次にＢａｍ）］　］Ｉリンカ
ー←ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧ）で結合し、ＢａｍＨＩ
およびＣ１ａ　Ｉで切断した（第６図、ステップ６）。
次に２７０　ｂｐのＣ１ａ　ｌ　／　ＢａｍＨＪ断Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔ、Δｃａｄ、　Ｓｃｉ、７６巻、４９５
１−４９５５頁：１９７９年）のＢａｍＨＩ　／　ｃ　
ｌａ　Ｉ断片と結合した（第６図、ステップ４）。
次に、ｐｎ：１からのＤＮＡをＢａｍ１ｌ　Ｉで切断し
、ＢａｒｎＨｌの接着末端を８１ヌクレアーゼ処理によ
り除き、ＥｃｏＲｉリンカ−（ＧＧＡＡＴＴＣＣ）を結
合した。
ＤＮＡを次にＣ１ａ　ＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、Ｐ
Ｈ０５プロモータを有する２　７０　ｂｐの断片をＣＩ
＋ａＩおよびＥｃｏＲ（で切断したｐＢＴ（３２２（１
９）Ｋ結合した。
得られたプラスミド（第４図）をｇｃｏＲＩで切断し、
ＹＲｐ　１２　（酵母Ｔ）（Ｐ１遺伝子およびＡＲ８復
製開始点を含む）の１．４　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片を結
合した（第４図、ステップ１）。
得られたプラスミドを次にＨ，ｃｏＲＩで部分消化し、
−個のＥＣＯＲ”ｆＧＭ位のみが切断したプラスミドを
単離した。ＥｃｏＬ（Ｉの接着末端をＤＮＡポリメラー
ゼクレナウ断片およびｄＡ’Ｉ’Ｐ、ｃｌＴＴＰで填め
た。ＤＮＡを結合した後、（）内に示したｆｉｉｃｏｎ
　Ｉ部位を欠如するプラスミドを選択した（第４図、ス
テップ４）。
−２４頁：１９７９年）からの酵母２μプラスミドの１
８７５　ｂｐ　Ｎｒｕｌがら旧ｎｃｌｌ断片を挿入した
。得られるプラスミドをＣｌａｌで切断し、ＰＨ０５プ
ロモータ（’１３．１８’）の上流領域からの１．１ｋ
ｂ　Ｃｌａｌ断片を挿入してＰＩ（０５−ｆロモータ／
レギュレータ領域を再構成した。得られるプラスミドが
ｐｙｇ　４である（第５図）。
ベクターｐＹＥ７もｐ、ＹＢ２と同様に構成されたが、
２μＤＮＡは２．２　ｋｂのＥｃｏＲＩ断片でＥｃｏＲ
Ｉ部位に挿入した。１）ＹＢ２の際はゾロモータ末端Ｅ
ｃｏＲ１部位は除去した。プラスミドを次にＢａｍ１（
Ｉで切断し、接着末端をＤＮＡ　ｆ：リメラーゼのフレ
ナラ断片でうめた。Ｐｖｕ　ＩＩで切断した後、残るプ
ラスミドを結合して第６図に示すｐＹＥ７を得た。Ｂａ
ｍＨＩ部位とＰｖｕ１１部位をうめて結合するとＢ’ａ
ｍＨＩ認識部位が再び出来ることに注目して下さい。
これらのベクターを試験するため、γＩＦＮ−αＤ（１
）を含む５６０　ｂｐのＥｃｏＲＩ断片をｐＹＥ４の特
有のＥｃｏＲ１部位に正しい方向に先ず挿入し、γＩＦ
Ｎ−αＤ遺伝子をＰＨ０５プロモータから正しい方向に
発現するように含んだｐＹｇ　４−　Ｄと命名したプラ
スミドが得られた。第２Ｂ図に元のＰＨ０５遺伝子の５
′末端の非コード領域のヌクレオチド配列とｐＹＥ　４
−　Ｄに融合したＰＨＯ５／　ｒＩＦＮ−ａＤの配列と
を比較しである。ｐＹＥ　４−　Ｄ中で元のＴａｑ　Ｉ
部位（ＴＣＧＡ　）とＥｃＯＲＩ部位（Ｉ）ＡＡＴＴＣ
）の間の余分のｃｃＧａ配列は合成リンカ−由来のもの
である。
次に酵母細胞をｐｙｇ　４−　Ｄにより、当業者により
酵母のプラスミドによる形質転換法として知られる方法
により形質転換した。
一般的には、インタフエロン生産の望ましい方法は以下
より成る。
ａ）　ヒトインタフエロン、好ましくは白血球インクフ
エロンの構造遺伝子をＰＨ０５ｆロモータ／レギュレー
タと有効に結合して含有する発現ベクターで酵母を形質
転換し、 ｂ）微生物の生背に必須な栄養分と無機りん酸とを含む
培地中で転換株を培養し、 Ｃ）該転換株がインクフエが１生を誘導されるまで培地
中に存在する無機りん酸の濃度を低下させ、 ｄ）転換株を溶菌し、さらに、 ｅ）得られる溶菌液よりインクフエロンを回収する。
実施例中でさらに記載するように、形質転換株を高りん
酸培地中、６０℃で細胞濃度が約３　ｘ　１０６ｃｅｌ
ｌｓ　／　ｍｌ　（０，Ｄ、６０（＞、、ｎ＝、　０１
−５　）となるまで増殖させ、培養物の半分を取って遠
心分離により集菌し、滅菌水で洗滌後りん酸無添加培地
にけん濁した。増殖を約３０℃で続け１．−３時間毎に
サンプルを取Ｏて細胞濃度（ＯＤ６ＣＩＯｎｍ　６００
ｎｍ単位当りの細胞当りの６０分間の測定によるＡ４２
０ｎｍ単位で表わすＡ、Ｐａｇｅ活性（１３）の測定を
行なった。
ＲＮＡ　（１４）およびインクフエロン測定のだめの細
胞抽出物も調製した。
インクフエロン生産の好ましい方法のもう一つは以下の
とおりである。
ａ）ヒトインクフエロン、好ましくは白血秤インタフエ
ロンの構造遺伝子を、”ＰＨ０５プロモータ／レイユレ
ータと有効に結合して含有する発現ベクターで、温度感
受性酵母細胞を形質転換し、ｂ）培養培地中、約３０−
３５℃の温度で形質転換株を培養し、 Ｃ）培養の温度を約２０−５０℃に低下してインタフエ
ロン生産を誘導し、 ｄ）転換株を溶菌し、そして ｅ）溶菌液よりインクフエロンを回収する。
温度感受性酵母細胞がＳａｃ　ｃｈａｒ　ｏｍｙ　Ｃｅ
８　ＣＱｒｅＶｌｓｌａｅの酸性フォスファターゼ調節
変異株であることが望ましい。
さらに実施例中に示すように、本発明の温度シフト転換
株は高りん酸培地中、約６５℃でＯＤ６ｏｏｎｍが約１
になるまで増殖させた。培養物をそこで２分し、半分は
３５℃で増殖を続け、もう半分は２６℃で増殖させた。
サンプルを経時的にとって分析に供した。
各時間でおよそ１０８コの細胞を遠心分離で集め、１−
の７Ｍ塩酸グアニジン、１ｍＭジチオスライトールおよ
び１蜆のフェニルメチルスルボニルフロリドにけん濁し
た。酸で洗った等量のガラスピーズを加え、３０秒、４
回攪拌混合した。６゜分間氷冷した後、遠心分離により
細胞残渣および　。
ガラスピーズを除去し、サンプルを一２０’Ｏで保存し
た。インタフェロンの測定には、サンプルを０．１５　
Ｍ　ＮａＣ１、２０ｍＭ　ＮａＰｏ４、ｐＨ７，９（Ｐ
ＢＳ　）にて１：１００に希釈するか、ＰＢＳ’、に対
して透析を行なった。インタフェロン活性は細胞毒性効
果の阻止測定（１５）により検出した。活性はＯＤ６ｏ
ｏｎｍが１である培養液１リットル当りの単位　□で表
示している。
各時間に於ける全ＲＮＡをグリオキサルにより変性（１
６）させた後、１．４％アガロースデルにて電気泳動に
かけ、ニトロセルロース上に移した（１７）。ハイブリ
ダイゼーションは””ｐ−標識デロープを用い、（１６
）に記載される方法で行なった。
実施例　１ りん酸濃度によるイノタフエロン生産の調節ｐｙｇ　４
−　Ｄを有するＷ２Ｏ３−１８ＡのＴｒｐ＋形質転換株
を高りん酸培地中、６０°Ｃで０Ｄ６ｏｏｎ□がおよそ
０．５になるまで増殖させ、半分の培養液をりん酸無添
加培地に移した。約６時間毎に各培養物よりサンプルを
取り、ＡＰａｓｅ活性を測定し、インクフエロン活性測
定のための抽出物を調製した。第７図は、インクフエロ
ン活性が無りん酸培地に移して６時間から６時間の間に
急激に増加し、およそ９時間目に最高に達することを示
している。
この誘導は培養物に見られるＡＰａｓｅの誘導に対応し
ており、高りん酸培地中で増殖させた細胞で認められる
インクフエロン活性の１００〜２００倍の増加であった
。
インクフエロン測定用の抽出物調製と同時に培養物より
ＲＮＡ試料を調製した。グリオキサルによる不活化（１
６）の後、ＲＮＡをアガロースデル上で分画し、ニトロ
セルロース（１７）上に移した。第８図に放射標識した
γＩＦＮ−αＤ７″ロープで行なつたハイブリダイゼー
ションの結果を示す。γＩＦＮαＤ　に特異的転写の出
現は細胞抽出物中σ）インタフエロン活性の出現と対応
している。従−フて、ここで見るインクフエロン合成の
調節は、ＡＰａｓｅ　Ｌ）−’）Ｒ１１節（６，７）と
同様に転写レベルのものである。
さらに、７ＩＦＮ　−ａＤ　ＩｆＣＩ＋！ｊ異的］（Ｎ
Ａは約１．５　ｋｂ　’Ｃ”あり、ＰＨ０５−ｙ°ロモ
ータで開始し、γ工ＦＮ−αＤ遺伝子を通ってＦＲＰ　
１遺伝子の末端で終る転写で計算される大きさである。
０Ｄ６ｏｏｎ１Ｔｌが１の培養物１リットル当り２〜５
Ｘ’、１０’ユニツトまでのレベルのインクフエロン活
性が得られた。
実施例　２ 温度によるインクフエロン合成の調節 温度による調節ＡＰａ−ｓｅ誘導の出来る酵母株を造成
するためＫは、先ず低りん酸によ誘導の要求性を排除す
ることが望ましい。ＡＰａｇｅ合成σ）リプレッサー、
ＰＨ０８０（従来ＰＨ０Ｒと呼ばれてｌ、−た）遺伝子
の変異株はＡ、Ｐａ５ｅを構成的に生産する（９゜２１
）。従ってｐｈｏ　８０株（Ａ１３８）を界！μｍで使
用したｔｒｐ　１株（ｗ３０１−１８Ａ）とクロスした
。ｐｈｏ　８０　ｔｒｐ　１株（Ｐ、１−２２）が得ら
れ、これは高りん酸培地中でもＡＰａｓｅを生産した。
次にｐｌ−２２をＰＨＯ’、４　’（従来のＰＨ０Ｄ　
）遺伝子に温度感受性変異を有する株（Ｒ６−３Ａ）と
クロスした。ＰＨ０４はＡｐａｇｅ合成の陽性制御因子
をコードしく２１）、従ってｐｈｏ　４株は低りん酸下
でもＡＰａｓｅを生産することが出来ない。温度感受性
のｐｈｏ　４株は許容温度でのみＡＰａｓｅ生産の誘導
を受ける。
ｐｈｏ　４ｔＳｐｈｏ　８０　ｔｒｐ　１宿主（２９Ｂ
５）をｐＹＫ４Ｄで形質転換し、転換株についてインク
フエロンの温度による調節生産を試験した。菌を６５℃
でＯＤ　が約１となるまで増殖し、培養００ｎｍ 物を２つに分ける。１つはそのまま６５℃で培養を続け
、もう１つは許容温度（２６°Ｇ）にシフトした。およ
そ２時間毎にサンプルをとり、インクフエロン活性の測
定をした。第９図は、インクフエロン活性六′−２３℃
で生育した細胞の方が少なくとも５０倍高いことを示し
ている。
有意なインタフエロン活性は許容温度でのみ観察され、
誘導レベルは第５図に示す最終活性、ＯＤ６ｏｏｎｍ当
り１リットル当りおよそ３　Ｘ　１１１６　単位、の約
２倍に達する。
実施例　３ ｐＹＥ７を有する酵母によるインクフエロンの合成ｙＩ
ＦＮ　−ａＤ遺伝子を含む５６０　ｂｐのＥｃｏＲＩ断
片、をｐｙＥ７のＥｃｏＲ１部位に正しい方向に挿入し
℃ｐＹＥ　７−　Ｄを得た。もう一つの方法として、８
６５　ｂｐのｍｃｏＲＩ／ｐｓｔＩ断片上のＩＩＦＮ−
ａＡ遺伝子（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ　２８　
’７巻、４１１−４１５頁：１９８０年）をＰｓｔ　Ｉ
部位を合成オリビヌクレオチドリンカーでＥｃｏＲ７部
位に変換した後ｐＹＥ７のＥｃｏＲｉ部位に挿入した。
得られたシラスミドでγＩＦＮ−αＡ遺伝子がゾロモー
タと相対的に正しい方向に挿入されたものをｐＹＥ　、
７−　Ａと命名した。
プラスミドｐＹＥ　７−　ＡおよびｇＹＥ７Ｄを酵母株
Ｗ３０１−１８Ａに導入いそれぞれのＴｒｐ＋転換を実
施例１と同様に誘導した。りん酸無添加培地に移してお
よそ８時間後に、ＩＦＮ活性を測定した。ｐ’ＹＥ　７
−　ＤではｏＤ６ｏｏｎｍ当りの１リットル当り５−７
Ｘ１０７単位、１）ＹＥ　７−　Ａでは１．０−１．５
　Ｘ　１０８単位の活性が得られた。γＩＦＮ−αＡが
いくらか高い活性を示すのは、本測定系でｒＩＦＮ−α
への方がやや高い比活性を有するためと考えられる。
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およびアンプルセン（ｋｎ６ｅｒｌｌｅｐ、　、Ｎ、）
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８　トーエ（Ｔｏｈ−ｅ、　Ａ、）ｌ　ウエダ（ｔｒｅ
、ａａ＋　Ｙ、）＋カキモト（Ｋａｋｉｍｏｔｏ、　、
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１１、スチ、ンクコン（Ｓｔｉｎｃｈ、ｃｏｍｂ、　Ｄ
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よび、デービス（Ｄａｖｉｓ、Ｒｏ、Ｗ、）ネ、イチャ
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１２、ヒンネン（Ｈｌｎｎｅｎ、　Ａ、）、ヒツクス（
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１６、アンプルセン（Ａｎｄｅｒａｅｎ、　Ｎ、）、チ
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１４、ボスチアン（Ｂｏａｔｉａｎ、　Ｋ、　Ａ、）、
ホッパー（Ｈｏｐｐｅｒ、　、ｒ、　ｘ、ン　ロジャー
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１５、　ファミレツチ（Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ、　Ｐ、
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ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｆｉｎｚ、−？ニー８　、　５８７−
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１６　マックマスター（ＭｃＭａｓｔｅｒ、　Ｇ、に、
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１７　トーツス（Ｔｈｏｍａｓ、　Ｐ、　Ｓ、）　Ｐｒ
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）０ １８　チル（Ｔｈｉｌｌ、　Ｇ、　Ｐ、）、クラマー（
１（ｒａｒｎｅｒ、　Ｒ。
Ａ、）、ターナ−（Ｔｕｒｎｅｒ、　Ｋ、：Ｊ’、）お
よびｓｒ、ｒ、チア７　（Ｂｏｓｔｉａｎ、　Ｋ、　Ａ
、）　Ｍｏ１ｅｃ、０ｅｌｌｕｌａｒ　Ｅｉｏｌ。
３．５７０−５７９（１９８３年）。
１９　ポリパー（Ｂｏｌｉｖａｒ、　Ｆ、）、ロドリデ
ーズ（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、　ＲｏＬ、）、グリーン（
ｏｒｅｅｎｅ、　Ｐ−Ｌ−）。
ベトラフ（Ｂｅｔｌａｃｈ、　Ｍ、　Ｄ、）、　ヘイネ
ヶル（Ｈｅｙｎｅｋｅｒ、　Ｈ，Ｌ、）、ボイヤー（Ｂ
ｏｙｅｒ、　Ｈ，Ｖｉ、）。
クロサ（Ｏｒｏｓ＆、　Ｊ、１Ｌ、）　およびファルコ
ー（Ｆａｌｋｏｗ、　ｓ、）　Ｇｅｎｅ　２　＋　９５
−１１５（１９７７年）。
２０、ブローチ（Ｅｒｏａｃｈ＋　Ｊ、Ｒ，）ｌ　イー
−Ｘ）　’？ッカロマイセスの分子的生物学（Ｔｈｅ　
ＭｏｌθｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙ
ｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）中の「ライフ
　サイクルおよび遺伝Ｊ　（Ｌｉｆｅ　０ｙｃｌｅａｎ
ｄ　Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ）＋ストラサ゛−ン（Ｓｔ
ｒａｔｈｅｒ：ｎＩＪ、　Ｎ、）、ジョンズ（、’ＪＯ
ｎｅｌｉｌ　Ｅ、　Ｗ、）およびブローチ（Ｂｒｏａｃ
ｈ＋　Ｊ、Ｒ，）　＠集〔コールド　スプリング　ハー
バ−研究所（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒｂ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ）　）　（コールド　スプリング　
ハーバ−、ニューヨーク）、４４５−４７［］頁。
２１、ウエダ（Ｕｅｄａ＋　Ｙ、）ｒ　トーエ（Ｔｏｈ
−ｅ＋　Ａ、）およびオーシーｒ　（Ｏｓｈｉｍａ＋　
ＹＪ　、Ｔ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
１２２．９１１−９２２（１９７５年）。
２２、ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ、　Ｍ、Ｊ、）　およ
びポランド（Ｈｏｌｌａｎｄ、’　Ｊ’、Ｐ、）　バイ
オヶミストリイ（ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ上１．４
９００−４９０７（１９７８年９゜ ２６、アメレアー（Ａｍｍｅｒｅｒ＋　Ｇ、）＋　ヒッ
ツェマン（Ｈ１ｔｚｅｍａｎ＋　Ｒ，）＋　バギー（Ｈ
ａｇｉｅ、　Ｆ、）、バルク（Ｂａｒｔａ、　Ａ、）お
よびハル（Ｈａｌｌ、　Ｂ、　Ｄ、）、組換えＤＮＡ　
（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ）　「巨大分子に関
する第６回クリーブランド　シンポジウムの会議録Ｊ　
（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔｈ１ｒｄ
　ＯｌｅｖｅｌａｎｃｌＳｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｍ
ａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、ウオルトン（Ｗａ］、
ｔｏｎ、　Ａ、　Ｇ、）編（エシスバイヤー、アムステ
ルダム）１１：１５−１９７頁。
２４、ミャノハラ（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ、　Ａ、）、
　トーエ（Ｔｏｈ−ｅ。
Ａ、）、ノずキ（Ｎｏｚａｋｉ、　Ｏｏ）、　ハマダ（
Ｈａｍａｄａ。
Ｆ、）、オートモ（Ｏｈｔｏｍｏ、　Ｎ、）　およびマ
ツパラ（Ｍａｔｅｕｂａｒａ、Ｋ、）　Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、米国８１Ｊ、１−５（１９
８３年）。
２５、ヒツツエマン（Ｈｌｔｚｅｍａｎ、　Ｒ，’に、
）、ロング（Ｌｅｕｎｇ、　Ｄ、　Ｗ、）、ベリイ（Ｆ
ｅｒｒｙ、　Ｌ、　Ｊ、）、　＝＋−（Ｋｏｌｌｒ、　
Ｖｉ、　Ｊ、）、レビン（Ｌｅｖｉｎｅ、　ＨｏＬ、）
およＯ・ゴーデル（Ｇｏｅ４ｄｅｌ、　Ｄ、　Ｖ、）　
サイエンス（Ｓａｊ、ｅｎｃｅ）　’２１９　、６２０
−６２．５　（１９８３年）。
【図面の簡単な説明】
第１図はＰＨ０５プロモータの５′−領域の地図である
。ＲＮＡＪ）５’末端部位および翻訳開始コドン、さら
にＰＨ０５遺伝子の制限溝素切断部位も示す。 発現ベクターではＲＮＡ　５’末端とＡＴＧの間のＴａ
ｑ部位（ＡＴＧから−１１の部位）をＥｃｏＲＩ部位に
変換した。ＰＨ０５転写の主要ＲＮＡ　５’−末端は−
４１および−６５にある。 第２Ａ図は１）ＹＥ４発現ベクターを示す。ＰＨ’０５
転写開始部位を含むＣ１ａＩからＥｃｏＲＩの断片を前
もってカッコ内に示すＥｃｏ　ＲＩ部位を削除しである
酵母／大腸菌のシャトルベクターＹＲｐ７　（１１）に
挿入した。さらに、ＰＨ０５プロモータ（第１図）から
の１．１　ｋｂ　Ｃ１ａ　Ｉ断片および酵母２μプラス
ミドからの配列を加えた。ＰＨ０５型制御下に発現しよ
うとする遺伝子を残るＥｃｏＪ’＋１部位に挿入する。 （口＝コ＝Ｉ）ＳＲ３２２ＤＮＡ、■■園＝酵母ＤＮＡ
。 努〃刀＝２μプラスミドＤＮＡ　） 、″ 第２Ｂ図は元のＰＨ０５遺伝子および１′市）５／γＴ
　Ｉｉ’Ｎ−αＤにおける翻訳開始コドンＡＴＧの前の
ヌクレオチド配列を示す。 第６図はｐＹＥ　４の構築を図示している。 第４図にｐＹＥ　４を構築するために使用したプラスミ
ドの構成を図示する。 第５図はｐＹＥ　４を制限酵素部位と共に図示している
。 第６図はｐＹＥ　７を制限酵素部位を併せて図示してい
る。 第７図は酵母におけるγＩＦＮ−αＤの調節発現をグラ
フで示す。ｐＹＫ４’−Ｄを有する形質転換株を高りん
酸培地（黒塗り記号）又はりん酸無添加培地（白わき記
号）中で増殖した。菌の生育（・、Ｏ）、ＡＰａｇｅ　
（酸性フォスファターゼ）活性（１１２口）および抽出
物中のインクフエロン活性（ム、Δ）を追跡した。Ｔ＝
０は培養物を高りん酸培地と無りん酸培地に分割した時
点である。 第８図はインクフエロンＲＮＡ０量を示ス。ＲＮＡ標品
は第３図に記載する細胞（＋＝高りん酸、−＝無りん酸
）より示した時間に調製し、ｒル・プロット分析により
分析した（１７）。 第９図は温度制御のインタフエロン合成をグラフで示す
。ｐＹＥ　４−　Ｄで形質転換したｐｈｏ　８０ｐｈｏ
　４ｔｓ２９　Ｂ　５　株ヲ３５℃でＯＤ　１まで増０
０ｎｍ 殖させ、そこで（ｔ＝０）培養物の半分を２３℃（白ぬ
き記号）にシフトし、残りの半分を６５８Ｃ（黒塗り記
号）に保った。細胞増殖（・、Ｃ））、ＡＰａ８ｅ活性
（−１口）およびインタフエロン活性を追跡した。 代理人　棧　村　皓 □第８図　゛ ６　９　１４５　２４ 手続補正書（睦） 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭０１５９年持ｒ１願第　９０８６２　と２、発明の名
称 新規インターフェロン発現ベクター ３、補正をする者 ミＩｌ’ｌとの関１糸　持Ｔｒ出騨１人ｆＩＩすｆ 昭和　イＩ　月　、Ｈ ６、補ｊ１−により増加する発明の数 ７、補１「の対象 明細書 手続補正書（方式） 昭和に０年　４−月　７２日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和ｔ’７年持許願第　％Ｎλ　号 ２、発明の名称 Ａ臼や１Ａンダーカ田ｄ＃Ｌべ″ツター３、補正をする
者 事件との関係　特許出願人 ４、代理人 ５、補正命令の日付 ８、補正の内容　別紙のとおり 図面の浄、り（内容に哀史なし）

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）　ＤＮＡ配列より成り、該配列が酵母の抑制酸性
    フォスファターゼ遺伝子（ＰＨ０５）に由来するプロモ
    ータ／レギュレータＤＮＡ領域およびインタフエロンを
    コードするＤＮＡを有する発現ベクター。
  2. （２）　プロモータ／レギュレータＤＮＡ領域が酵母の
    抑制酸性フォスファターゼ遺伝子の５７−フランキング
    領域に由来する、特許請求の範囲第１項記載の発現ベク
    ター。
  3. （３）プロモータ／レギュレータがＰＨ０５遺伝子であ
    る特許請求の範囲第２項記載の発現ベクター。
  4. （４）　インターフェロンがヒト白血球インクフエロン
    である特許請求の範囲第１項記載の発現ベクタ０
  5. （５）　インクフエロンが組換えヒト坤血球インクフエ
    ロン種Ａである特許請求の範囲第１項記載の発現ベクタ
    ー。
  6. （６）　インタフエロンが組換えヒト白血球インターフ
    ロン種りである特許請求の範囲第１項記載の発現ベクタ
    ー。
  7. （７）上記第１項乃至第６項のいずれかによる発現ベク
    ターにより形質転換された宿主。
  8. （８）宿主が酵母である特許請求の範囲第７項記載許請
    求の範囲第７項記載の宿主。 ａＱ　培養培地中の無機りん酸非存在によりインタフェ
    ロン生産が誘導出来るような特許請求の範囲第９項記載
    の宿主。 αυ　培養培地中に無機りん酸が存在することによりイ
    ンターフロン生産を抑制し得る特許請求の範囲第９項記
    載の宿主。 Ｑの　ぼりペプチドをコードする異種真核細胞ＤＮＡと
    、酵母の抑制酸性フォスファターゼ遺伝子（ＰＨ０５）
    に由来するプロモータ、／レギュレータＤＮＡ領域とを
    正しく結合して含有する発現ベクターにより形質転換し
    、プロモータ／レギュレータの抑制および誘導、並びに
    異種真核細胞ＤＮＡの発現が温α梼　プロモータ／レギ
    ュレータおよび異種真核細胞ＤＮＡの発現が約２０℃か
    ら約６０℃で誘導される特許請求の範囲第１２項記載の
    宿主。 αぐ　プロモータ／レギュレータがＰＨ０５遺伝子であ
    る特許請求の範囲第１３項記載の宿主。 （至）異種真核細胞ＤＮＡがインクフエロンを特徴とす
    る特許請求の範囲第１４項記載の宿主。 ０６　異種真核細胞ＤＮＡが白血球インクフエロンを特
    徴とする特許請求の範囲第１４項記載の宿主。 ＜１７１　白血球インタフエロンが組換えヒト白血球イ
    ンタフエロン種Ａである特許請求の範囲第１６項記載の
    宿主。 （至）　白血球インタフエロンが組換えヒト白血球イン
    タフエロン種りである特許請求の範囲第１６項記載の宿
    主。 ０９　以下より成るインクフエロンの生産方法。 ａ）　ヒトインタフエロンの構造遺伝子とＰＨＯ５プロ
    モータ／レギユレータとを正しく結合して含有する発現
    ベクターで酵母を形質転換し、ｂ）形質転換微生物を、
    無機りん酸および生育に必須な栄養素を含有する培地中
    で培養し、Ｃ）該形質転轡株のインタフェロン生産が誘
    導されるまで培地中に存在す、る無機りん酸の濃度を低
    下させ、 ｄ）形質転換株を溶菌し、 ｅ）　得られる溶菌液よりインクフェロンを回収許、請
    求の範囲第１９項記載の方法。 ６２０　インタフエロンがヒト白血球インタフェロンで
    ある特許請求の範囲第１９項記載の方法・（イ）　昼下
    より成るインタフェロンの生産！、テ法。 ａ）　ヒトインタフエロン、の構造遺伝子とＦ’ＨＯ５
    プロモータ／レギユレータを正しく結合して含有する発
    現ベクターで温度枠受性酵母を形質転換し、ｂ）形質転
    換微生物を培地中、約３０−３５°Ｃの温度で培養し、 Ｃ）　インタフエロン生産が誘導されるように温度を約
    ２０−３０℃に低下せしめ、 ｄ）　宿主細胞を溶菌し、 ｅ）　得られる溶菌液よりインタフエロンを回収５ｉａ
    ｅ）の酸性フォスファターゼ遺伝子の調節変異株である
    特許請求の範囲第２２項記載の方法。 （ハ）　インタフエロンがヒト白血球インタフエロンで
    ある特許請求の範囲第２２項記載の方法。
JP59090862A 1983-05-05 1984-05-07 新規インタ−フエロン発現ベクタ− Pending JPS60186288A (ja)

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IL (1) IL71745A0 (ja)
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