KR100374307B1 - 재조합효모로부터발현된감마인터페론의정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 효모로부터 발현된 감마 인터페론을 정제하는 방법에 관한 것으로, 감마 인터페론을 발현하는 형질전환된 재조합 효모세포를 저온에서 배양하고, 배양된 효모 세포를 파쇄하여 불용성 물질을 제거하고, 가용성 부분을 양이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피하고 투석하는 단계를 포함하는 방법에 의하면 고순도 및 고역가의 감마 인터페론을 얻을 수 있다.

Description

재조합 효모로부터 발현된 감마 인터페론의 정제 방법{A PURIFICATION METHOD OF GAMMA INTERFERON FROM RECOMBINANT YEAST}

본 발명은 유전자 재조합 효모로부터 수용성 상태로 발현된 감마 인터페론을 정제하는 방법에 관한 것이다.

인터페론은 세포의 여러 기능을 조절해 주는 작용을 갖고 있는 단백질의 한 부류로서 그 기능이 매우 다양한데, 예를 들면 바이러스로부터 세포 보호, 조직 배양에서나 골수에서의 세포 분열 억제, T세포 작용의 조절, 자연 면역 세포(NK cell)의 항진 기능 유도에 의한 식균 작용 상승, 또는 특수 암세포의 분열 억제 기능이 있는 것으로 알려져 있으며, 특히 항바이러스제와 항암제로서 유용하다. 이들 인터페론에는 알파-, 베타-, 감마-인터페론 및 그 밖의 다양한 종류의 인터페론이 알려져 있으나, 그 중에서도 특히 감마 인터페론은 항바이러스제 및 항암제로 유용한 것으로 알려져 있다.

감마 인터페론은 다른 인터페론과는 달리 T 림프구에서 생성되며 항원이나 세포 분열 촉진 물질(mitogen)에 의해 그의 생성이 유도된다. 또 면역 활성적인 측면에 있어서도 다른 인터페론과는 전혀 다른 특성을 갖는다[Wheelock et al., Science, 149, 310-311(1965); Esptein et al., J. Infect. Dis., 133, A56(1976)], 또한 감마 인터페론은 강력한 항분아성 기능 및 면역 활성 조절 기능을 갖고 있으며[Basham, Merigan, J. Immunol., 130, 1492-1494(1983); Rubin & Gupta, PNAS, USA, 77, 5928-5932(1980)], 항관절염 및 항암제로서의 유용성에 대하여 많은 임상연구가 이루어지고 있다.

1982 년 더블유. 그레이(W. Gray)등에 의해 감마 인터페론 유전자의 염기 서열이 밝혀진 후, 감마 인터페론은 미생물을 이용한 유전자 재조합 기법에 의해 제조되어 많은 나라에서 상업적으로 시판되고 있다. 본 발명자들도 효모 세포로부터 봉입체(inclusion body)로 발현되는 감마 인터페론을 고순도로 분리정제하는 방법을 특허 출원한 바 있다(대한민국 특허 제 41832 호).

유전자 재조합 기술을 이용하여 미생물에서 재조합 단백질을 발현시킬 때, 단백질이 봉입체의 형태로 발현되는 현상은 비록 그 형성 메카니즘에 대한 정보는 한정되어 있지만 많이 알려져 있는 현상이다[Williams, D. C. et al, Science, 215, 687-689(1982)]. 이러한 현상은 미생물에서 이성 단백질(heterogeneous protein)의 발현을 유도할 때 뿐만 아니라, 세포질 단백질(cytoplasmic protein)을 발현시키는 경우에도 배양조건에 따라 발생된다고 보고되었다[Cheng, Y. Y., Biochem. Biophys. Res. Commun., 111, 104-111(1983); Bowen, G. A., J. Biol. Chem. 265, 16760-16766(1990)]. 또한 배양 온도를 올려 줌으로써 봉입체의 형성을 증가시킬 수 있음도 보고되어 있다[Schein, C. H. and Noteborn, M., Bio/Technology, 6, 291-294(1988); schein, C. H. Curr. Opinnion Biotechnol., 2, 746-750(1991)].

그러나 이와 같이 세포내에서 봉입체 형태로 발현되는 단백질은 원래의 구조를 갖지 못하게 되며, 동시에 활성도 잃어버리게 되므로[Kiefhaber, T., Roudolph et al., Bio/Technology 9, 825-829 (1991)], 봉입체 형태로 발현되는 단백질을 정제하는데에는 원상화(refolding) 과정이 반드시 요구되고 있다. 봉입체의 형태로 발현되어 정제되는 단백질의 원상화는 투석이나 희석 방법을 주로 사용하는데, 이 때 원래의 구조로 원상화되는 비율은 그 사용방법에 따라 크게 다르며, 정제 과정의 수율과 직결된다. 또한 이 때 발생되는 비정상적으로 원상화된 (mis-folded) 단백질은 분리 제거하기가 매우 어렵다. 이에 따라 목적 단백질이 봉입체로 발현되는것을 막기 위한 여러 연구가 이루어져 왔다[Catherine H. Schein, Bio/Technology, 6, 291-294(1988); Bio/Technology 7, 112-149(1989); John T. Moore et al., Protein Expression & Purification 4, 160-164(1993); 및 Andreas J. Schulze et al., Journal of Biotechnology 32, 231-238(1994)].

본 발명자들은 감마 인터페론을 봉입체 형태가 아닌 원래의 구조를 갖도록 발현시켜 정제할 수 있도록 연구한 결과, 저온에서 재조합 효모세포를 배양하여 감마 인터페론을 수용성 상태로 발현시켜 정제함으로써 고순도 및 고활성도를 갖는 감마인터페론을 대량 생산할 수 있게 되어 발명의 완성에 이르게 되었다.

즉, 본 발명의 목적은 재조합 효모에서 봉입체 형태가 아니라 원래의 구조를 갖는 감마 인터페론을 발현시켜 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 감마 인터페론을 발현하는 형질전환된 재조합 효모세포를 저온에서 배양하고, 배양된 효모 세포를 파쇄하여 불용성 물질을 제거하고, 가용성 부분을 양이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피하고 투석하는 단계를 포함하는 재조합 효모로부터 발현된 감마 인터페론의 정제방법을 제공한다.

이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

먼저 인간 감마 인터페론을 발현할 수 있도록 유전자 조작된 효모 세포, 예를 들어 대한민국 특허 제 38694 호(출원공고 제 90-7867 호)에 기재된 방법으로 제조된 효모를 적절한 배지에서 종배양한 후 본 배양을 행한다. 약 30 ℃에서 배양하다가 흡광도가 5.0 에 이르렀을 때 배양온도를 15±2 ℃로 낮추어 재조합 감마인터페론이 수용성(soluble)상태로 발현되도록 유도하고, 홉광도가 16에 도달하였을 때 배양을 종결시킨다. 배양물을 원심분리하여 감마인터페론이 발현된 효모를 회수하고, 이를 완충용액에 현탁시켜 세포를 파쇄한 후 원심분리하여 상등액을 회수한다.

상기의 상등액을 완충용액으로 희석시켜 동일한 완충 용액으로 평형화한 양이온 교환 수지 컬럼에 흘려보내 결합시킨 다음, 컬럼내 유리상태로 존재하는 오염 단백질은 염용액으로 씻어내고 결합된 단백질은 0.2 내지 0.8 M 선형 농도 구배의 염화나트륨을 함유하는 완충용액으로 용출시킨다. 용출된 각 부분을 SDS-PAGE하여 감마 인터페론을 포함하는 분획만 수집한다. 이 때 양이온 교환 수지로는 SP-세파덱스 또는 CM-세파덱스를 사용하는 것이 바람직하며, SP-세파덱스를 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 양이온 교환 크로마토그래피 수행시 완충액의 pH는 6.5 내지 8.5 범위가 바람직하고, pH 7.5가 더욱 바람직하다.

수집한 분획들을 농축한 후 완충용액으로 미리 평형화시킨 겔 여과 컬럼으로 용출시킨다. 수집한 분획들을 SDS-PAGE하여 감마 인터페론을 포함하는 분획들만을 수집한다. 겔 여과 크로마토그래피의 수지로는 분획 가능 단백질 범위(fractional range)가 10 kDa 이상인 세파크릴(Sephacryl)-100, 200 또는 300을 사용하는 것이 바람직하며, 세파크릴-200이 더욱 바람직하다. 완충액의 pH는 7.5-8.5의 범위가 바람직하다.

마지막으로 상기에서 수집한 감마 인터페론을 2.5 % 덱스트로스가 들어 있는 용액에서 투석함으로써 고순도 및 고역가의 감마 인터페론을 얻을 수 있다. 감마인터페론의 순도는 은염색후 공지의 희석방법으로 계산할 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 정제된 유전자 재조합 감마 인터페론의 순도는 95 % 이상이고 역가는 6.0 x 10⁷I.U/mg 이상으로, 봉입체로부터 정제된 감마 인터페론의 역가 3 x 10⁷I.U/mg 보다 2 배 정도 높았다.

이상과 같이 재조합 효모로부터 발현된 감마 인터페론을 분리정제하는 과정의 흐름도를 제 1 도에 단계별로 나타내었다.

이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 본 발명의 범위가 하기 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.

하기 실시예에서 사용된 완충 용액의 조성은 특별한 언급이 없는 한 다음과 같다:

완충 용액 1: 20 mM 트리스, 5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 150 mM 염화나트륨, 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF), pH 8.0

완충 용액 2: 25 mM 트리스, 1 mM EDTA, 1mM PMSF, pH 7.5

완충 용액 3: 25 mM 트리스, 200 mM 염화나트륨, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, pH 7.5

완충 용액 4: 2.5 % 덱스트로스 주사제 용액(중외제약, 대한민국)

(실시예)

(단계 1) 재조합 효모 세포의 배양

감마 인터페론을 발현하는 형질전환된 효모 균주(대한민국 특허 제 38694호(출원공고 제 90-7867 호)에 기재된 방법으로 제조된 효모)의 종균 1 ml를 100 ml의 1 차 종배양액(8 % 글루코스, 10 % 루이신 결핍 아미노산 최소 배지)에서 30 ℃에서 15 시간 배양한 후 800 ml의 배지로 옮겨 15 시간 배양하고, 다시 30 L의 배양액(8 % 글루코스, 1.5 % 효모 추출물, 4 % 콘 스팁 리커)에서 24 시간 배양한 후 200 L의 배양액이 들어있는 발효기에 접종하여 배양하였다. 접종 후 흡광도(O.D. 600)가 5.0 에 이르렀을 때 배양온도를 30 ℃에서 15 ℃로 낮추어 주었고, 흡광도가 16 에 이르렀을 때 수확하여 정제 과정에 사용하였다.

감마 인터페론의 발현 상태를 확인하기 위하여 배양후 2, 4, 6, 8, 10 및 12 시간 경과시 세포를 파쇄하여 원심분리한 다음 상등액 및 침전물 각각을 분석하였으며 그 결과를 제 2 도에 나타내었다. 제 2 도에서 제 1, 3, 5, 7, 9 및 11 열은 각각 배양후 2, 4, 6, 6, 10 및 12 시간 경과시 세포를 파쇄하고 원심분리하여 얻은 침전물을, 제 2, 4, 6, 8, 10 및 12 열은 각각 배양후 2, 4, 6, 8 ,10 및 12 시간 경과시 세포를 파쇄하고 원심분리하여 얻은 상등액을, 15 % SDS-PAGE한 결과이다. 여기에서 보면 상등액 부분에서 감마 인터페론의 존재를 확인할 수 있으며, 따라서 감마인터페론이 수용성 상태로 발현됨을 알 수 있다.

(단계 2) 세포 파쇄 및 불용성 물질의 제거

단게 1에서 얻은 효모 세포 1 kg(젖은 무게)을 4 L의 완충용액 1에 현탁시켜 직경 0.6 nm의 유리구슬로 다이노밀(Dynomil)에서 파쇄시킨 후, 원심분리기(Beckman J2-21M, U. S. A.)로 8,500 rpm(Rotor JA-10)에서 30 분간 고속 원심분리하여 상등액을 얻었다.

(단계 3) 양이온 교환 크로마토그래피

단계 2에서 얻은 상등액 4 L를 4 L의 완충용액 2로 희석시킨 후, 동일 완충용액으로 평형화한 SP-세파덱스 컬럼(Pharmacia, BP 100/60)에 분당 1.0 ml의 속도로 통과시켜 컬럼에 결합시켰다. 이어서 0.2 M의 염화나트륨을 함유하는 4 L의 완충용액 2를 컬럼에 흘려주어 이온 교환 수지에 흡착되어 있지 않은 단백질들을 제거하였다. 다음에는 0.2 내지 0.8 M의 선형 농도 구배의 염화나트륨을 포함하는 5 L의 완충용액 2를 가하여 수지에 흡착되어 있던 단백질을 분당 10 ml의 속도로 용출시켜 각 50 ml의 분획들로 수집하였다. 수집된 분획들을 15 % SDS-PAGE한 후 쿠마시 블루로 염색하여 감마 인터페론 단백질을 포함하는 특정분획들만 별도로 수집하였다.

제 3 도는 이와 같이 양이온 교환 크로마토그래피로 얻은 분획들의 전기 영동 결과로서, 제 1 열은 단계 1에서 세포파쇄후의 전체 단백질을, 제 2 열은 단계 1에서 세포파쇄물로부터 불용성 물질을 원심분리로 제거한 후에 컬럼에 투입되는 단백질 용액을, 제 3 열들은 컬럼으로부터 용출되는 각 분획들을 나타낸다.

(단계 4) 겔 여과 크로마토그래피

단계 3에서 수집한 단백질 용액 300 ml를 한외 여과 농축기(Amicon사)로 50 ml로 농축한 후, 그 중 25 ml를 완충용액 3으로 평형화시킨 세파크릴-200 수지 컬럼(Pharmacia Sweden, XK 50/100)에 분당 1 ml의 속도로 통과시키면서 겔 여과 크로마토그래피를 수행하였다. 용출되는 단백질 용액을 각 10 ml의 분획들로 수집하였다. 수집된 분획들을 15 % SDS-PAGE한 후 은염색하여 감마 인터페론을 포함하는특정 분획들만을 별도로 수집하였다.

제 4 도는 이와 같이 겔 여과 크로마토그래피로 얻은 분획들의 전기영동 결과로서, 제 1 열은 겔 여과 컬럼에 투입되는 단백질을, 제 2 열들은 용출되는 각 분획들을 나타낸다.

(단계 5) 투석

단계 4에서 수집한 감마 인터페론 단백질 용액을 투석막(Spectrum USA, Molecular Cut Off 10000-12000)에 넣은 후, 20 L의 완충용액 4가 들어있는 용기에서 6 시간 동안 투석하여 고역가의 순수한 감마 인터페론을 얻었다.

본발명의 방법에 따라 정제된 유전자 재조합 감마 인터페론의 순도는 은염색을 하여 공지의 희석 방법[John A. Armstrong, Methods in Enzymology, vol 78. 381-387 1981]으로 계산한 결과 95 % 이상이었으며, 역가는 6.0 x 10⁷I.U/mg이었다. 이 값은 봉입체로부터 정제된 감마 인터페론의 역가인 3 x 10⁷I. U/mg 보다 2 배 정도 높은 값이었다.

(단계 6) 정제된 감마 인터페론의 확인

상기 단계 4에서 수집한 단백질을 약 1.0 mg/ml의 농도에서 전개 완충액인 25 mM 트리스, 1.0 M 염화나트륨(pH 7.5)으로 투석시켰다. 100 ㎕의 단백질 용액을 슈퍼로즈 6(HR 10/30) FPLC 컬럼(Pharmacia)에 투입한 후, 60 분간 아래와 같은 조건에서 전개시켰으며 그 결과를 제 5 도에 나타내었다:

전개 속도: 0.4 ml/min;

크로마토그램 전개 속도: 0.5 cm/min;

빛파장: 280 nm;

빛흡수도: 0.05 AUFS.

제 5 도에서 볼 수 있는 바와 같이 정제된 감마 인터페론이 고순도의 단일 형태로 존재함을 확인할 수 있었다.

상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 정제 방법에 의하면 감마 인터페론을 발현할 수 있는 재조합 효모로부터 고순도 및 고역가의 감마 인터페론을 분리정제할 수 있다.

제 1도는 재조합 효모로부터 발현된 감마 인터페론을 분리정제하는 과정의 흐름도이고;

제 2 도는 재조합 효모세포의 배양후 각 시간별 세포파쇄물의 전기 영동 결과이고;

제 3 도는 본 발명의 정제과정중 양이온 교환 크로마토그래피 단계에서의 전기영동 결과이고;

제 4 도는 본 발명의 정제과정중 겔 여과 크로마토그래피 단계에서의 전기영동 결과이고;

제 5 도는 본 발명의 방법에 따라 정제된 감마인터페론을 분석용 고성능 단백질 분리용 컬럼을 이용하여 겔 여과 크로마토그래피한 크로마토그램이다.

Claims (5)

1. 감마 인터페론을 발현하는 형질전환된 재조합 효모세포를 저온에서 배양하고, 배양된 효모 세포를 파쇄하여 불용성 물질을 제거하고, 가용성 부분을 양이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피하고 투석하는 단계를 포함하는 재조합 효모로부터 발현된 감마 인터페론의 정제 방법.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 재조합 효모세포를 15±2 ℃에서 배양하는 것을 특징으로 하는

   방법.
3. 제 1 항에 있어서,

   상기 양이온 교환 크로마토그래피에서 양이온 교환 수지로 SP-세파덱스 또는 CM-세파덱스를 사용하고, 트리스를 포함하는 pH 6.5 내지 8.5의 완충용액중 0.2 내지 0.8 M의 선형 농도 구배의 염화나트륨 용액으로 용출시키는 것을 특징으로 하는

   방법.
4. 제 1 항에 있어서,

   상기 겔 여과 크로마토그래피에서 수지로는 세파그릴-100, 200 또는 300을 사용하고, pH 75 내지 8.5 의 완충용액으로 용출시키는 것을 특징으로 하는

   방법.
5. 제 1 항에 있어서,

   상기 투석을 2.5 %의 덱스트로스 수용액에서 실시하는 것을 특징으로 하는

   방법.