RU2046140C1 - Способ выделения ферментного комплекса из культивируемых растительных клеток - Google Patents
Способ выделения ферментного комплекса из культивируемых растительных клеток Download PDFInfo
- Publication number
- RU2046140C1 RU2046140C1 SU5056097A RU2046140C1 RU 2046140 C1 RU2046140 C1 RU 2046140C1 SU 5056097 A SU5056097 A SU 5056097A RU 2046140 C1 RU2046140 C1 RU 2046140C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- activity
- protein
- sod
- complex
- enzyme
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Использование: в биотехнологии, медицине, пищевой промышленности и косметологии. Сущность изобретения: способ выделения активного ферментного комплекса предусматривает водно-спиртовую экстракцию культивируемых растительных клеток женьшеня или полисциола, деалкоголизацию полученной растворимой фракции гель-фильтрацию деалкоголизированного экстракта на сефадексе (Г 50, Г -75), элюцию комплекса фосфатным буфером рН 6,8 9. Полученный ферментный комплекс может найти широкое применение в медицинской практике в качестве противовоспалительного, радиотерапевтического средства, в онкологии, трансплантологии, а также в пищевой промышленности и ветеринарии. 2 табл.
Description
Изобретение относится к биотехнологии. Выделенный ферментный комплекс может найти применение как в медицинской практике, так и в косметологии и пищевой промышленности.
Известно, что в растительном сырье содержатся различные ферменты, в том числе каталаза, пероксидаза и супероксиддисмутаза (СОД). Известны способы выделения СОД [1] пероксидазы [2] Эти способы основаны на гомогенизации сырья, экстракции белков и тонкой очистке на полисахаридных сорбентах.
Эти способы позволяют выделить один индивидуальный ферментный препарат.
Известен способ выделения пероксидазы из растительной ткани полыни, согласно которому листья полыни гомогенизируют в дистиллированной воде в присутствии аскорбата натрия, осаждают белки сульфатом аммония, отделяют осадок фильтрацией и очищают хроматографией на сефадексе G-50 и элюируют фермент [3]
Однако этот способ достаточно сложен и позволяет выделить только пероксидазу.
Однако этот способ достаточно сложен и позволяет выделить только пероксидазу.
Цель изобретения простыми приемами выделить из биомассы культуры растительных клеток с высоким выходом стабильный комплексный ферментный препарат с высокой биологической активностью.
Цель достигается тем, что из биомассы культуры растительных клеток путем экстракции, центрифугирования, гель-фильтрации выделяют стабильный комплексный ферментный препарат. Причем экстракцию проводят водно-спиртовым раствором с последующей гель-фильтрацией деалкоголизированного экстракта с отбором наиболее активных фракций, полученные фракции объединяют и лиофилизируют. Лиофилизированный препарат оценивают по биологической активности, содержанию белка и иммунотоксичности в сравнении с коммерческим препаратом "Пероксинорм".
Способ осуществляется следующим образом.
П р и м е р 1. К 500 г биомассы женьшеня (штамм ИФРЖ-1) приливают 500 мл, например, 70% -ного пропилового спирта. Смесь гомогенизируют при 6000 об/мин в течение 3 мин, гомогенизат центрифугируют 30 мин при 3000 об/мин и температуре 20оС. Надосадочную жидкость деалкоголизируют до полного удаления спирта в пробе.
За процессом выделения ферментного комплекса следят по активности первого фермента CОД и концентрации белка. Активность СОД в деалкоголизированном экстракте составила 50 усл.опт.ед. Д460/мл, концентрация белка 4 мг/мл.
20 мл полученного экстракта вносят на колонку (450 x 25 мм) сефадексом Г-75. Элюцию ведут 0,01 М фосфатным буфером рН 8,8. Фракции со средней активностью 18 усл.опт.ед. Д460/мл и концентрацией белка 0,7 мг/мл объединяют и лиофилизируют.
Потеря антиоксидантной активности фермента составляет около 25% Лиофилизированную пробу анализируют на активность СОД, каталазы и пероксидазы, а также концентрацию белка. Выход белков составляет около 57% от внесенного на колонку. Удельная активность СОД 21,8 усл.опт.ед. Д460/мг белка, каталазы 0,16 мМ H2О2/мин˙мг белка, пероксидазы 0,63 усл.опт.ед. Д435/мг белка. Концентрация белка 0,7 мг/мл.
П р и м е р 2. К 400 г биомассы культуры ткани полисциаса папоротниколистного Polyscias filicifolia Bailey (ВСКККВР N 24) добавляют 700 г 80%-ного, например, изопропилового спирта. Смесь гомогенизируют при 6000 об/мин в течение 3 мин при комнатной температуре. Затем для отделения растворимой фракции центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин при температуре 20оС. Осадок отбрасывают. Проводят диалкоголизацию растворимой фракции до полного отсутствия спирта в пробе.
За процессом выделения комплексного препарата по стадиям судят по активности первого фермента CОД и концентрации белка. Активность СОД в деалкоголизированном экстракте составляет 60 усл.опт.ед. Д460/мл и концентрация белка 4,5 мг/мл.
18 мл этого экстракта вносят на колонку (450x25 мм) с сефадексом Г-50, элюцию ведут 0,01 М фосфатным буфером при рН 7,0.
Фракции со средней активностью СОД 16,5 усл.опт.ед. Д460/мл и концентрацией белка 0,6 мг/мл объединяют и лиофилизируют. Потеря активности ферментов составляет около 23% Лиофильно высушенную пробу анализируют на активность трех ферментов: CОД, каталазы, пероксидазы. Удельная активность СОД 18,2 усл. опт.ед. Д460/мг белка, каталазы 0,12 мМ H2О2/мин ˙мг белка, пероксидазы 0,57 усл.опт.ед. Д435/мг белка. Концентрация белка 0,55 мг/мл.
Выход белков суммарно составляет около 58% от внесенного на колонку.
П р и м е р 3. К 500 г биомассы культуры ткани селективного штамма женьшеня 1. Х 13 (ВСКККBР N 26) добавляют 800 г 80%-ного этилового спирта, гомогенизируют при 6000 об/мин в течение 3 мин при комнатной температуре, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин при температуре 20оC, отбрасывая осадок. Растворимую фракцию деалкоголизируют до полного отсутствия спирта.
За процессом выделения комплексного препарата по стадиям судят по активности первого фермента СОД и концентрации белка. Активность СОД в деалкоголизированном экстракте составляет 80 усл.опт.ед. Д460/мл и концентрация белка 6 мг/мл.
20 мл этого экстракта вносят на колонку (450x25 мм) с сефадексом Г-75 и элюируют 0,01 М фосфатным буфером рН 7,2. Фракции со средней активностью СОД 20 усл.опт.ед. Д460/мл и концентрацией белка 0,7 мг/мл объединяют и лиофилизируют.
Потеря активности ферментов составляет около 25% Лиофильно высушенную пробу анализируют на активность трех ферментов комплекса: СОД, каталазы и пероксидазы. Удельная активность СОД 20 усл.опт.ед. Д460/мг белка, каталазы 0,143 мМ Н2О2/мин˙мг белка, пероксидазы 0,6 усл.опт.ед. Д435/мг белка. Концентрация белка 0,57 мг/мл.
Выход белков суммарно составляет около 57% от внесенного на колонку экстракта.
П р и м е р 4. К 500 г шрота от биомассы культивируемых клеток штамма женьшеня ИФРЖ-1 добавляют 500 г 96%-ного, например, этилового спирта, гомогенизируют при 6000 об/мин в течение 3 мин при комнатной температуре. Гомогенизат центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин при температуре 20оС, отбрасывая осадок. Растворимую фракцию деалкоголизируют до полного отсутствия спирта.
За процессом выделения комплексного препарата по стадиям судят по активности первого фермента СОД и концентрации белка. Активность СОД в деалкоголизированном экстракте составляет 30 усл.опт.ед. Д460/мл, концентрация белка 3 мг/мл.
20 мл этого экстракта вносят на колонку с сефадексом Г-50. Размер колонки 450x25 мм. Элюцию ведут 0,01 М фосфатным буфером рН 6,8.
Фракции со средней активностью СОД 7 усл.опт.ед. Д460/мл и концентрацией белка 0,4 мг/мл объединяют и лиофилизируют. Потеря активности ферментов составляет около 30%
Лиофильно высушенную пробу анализируют на активность трех ферментов комплекса. Удельная активность СОД 10 усл.опт.ед. Д460/мг белка, каталазы 0,1 мМ Н2О2/мин˙мг белка, пероксидазы 0,3 усл.опт.ед. Д435/мг белка. Концентрация белка 0,23 мг/мл.
Лиофильно высушенную пробу анализируют на активность трех ферментов комплекса. Удельная активность СОД 10 усл.опт.ед. Д460/мг белка, каталазы 0,1 мМ Н2О2/мин˙мг белка, пероксидазы 0,3 усл.опт.ед. Д435/мг белка. Концентрация белка 0,23 мг/мл.
Выход белков суммарно составляет около 57% от внесенного на колонку экстракта шрота.
П р и м е р 5. К 300 г продукта сырой биомассы штамма женьшеня (ИФРЖ-5) добавляют, например, 80% -ного этилового спирта, гомогенизируют при 6000 об/мин в течение 3 мин при комнатной температуре. Гомогенизат центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин при температуре 20оС, отбрасывая осадок. Растворимую фракцию деалкоголизируют до полного отсутствия спирта.
За процессом выделения комплексного препарата по стадиям судят по активности первого ферменте-CОД и концентрации белка. Активность СОД в деалкоголизированном экстракте составляет 68 усл.опт.ед. Д460/мл и концентрация белка 7,2 мг/мл.
20 мл этого экстракта вносят на колонку (420x25 мм) с сефадексом Г-75, элюируют 0,01 М фосфатным буфером рН 9. Фракции со средней активность СОД 18,5 усл.опт.ед. Д460/мл и концентрацией белка 0,68 мг/мл объединяют и лиофилизурют.
Потеря активности ферментов составляет около 27% Лиофильно высушенную пробу анализируют на активность трех ферментов комплекса CОД, каталазу, пероксидазу.
Удельная активность СОД 20,9 усл.опт.ед. Д460/мг белка, каталазы 0,15 мМ H2О2/мин˙мг белка, пероксидазы 0,58 усл.опт.ед. Д435/мг белка. Концентрация белка 0,59 мг/мл.
Выход белков суммарно составляет около 54% от внесенного на колонку экстракта.
В табл.1 приведено сравнение известного метода выделения СОД и комплексного ферментного препарата. В табл.2 приведены данные СОД, комплексного ферментного препарата "Пероксинорм" и ферментного комплекса, выделенного и культивируемых клеток растений.
Таким образом, предложенная совокупность признаков позволила достаточно просто и быстро выделить комплексный ферментный препарат, который оказался гораздо эффективней и стабильней индивидуального ферментного препарата.
Предложенный способ позволяет получить стабильный ферментный комплекс с определенной биологической активностью, не обладающий иммунотоксичностью, сократить время всех операций на 30% снизить трудоемкость и материалоемкость процесса, повысить в сотни раз выход продукта, который не требует включения других ферментов и может быть использован в качестве субстанции для разработки новых лекарственных форм, косметических препаратов и продуктов лечебного питания.
Claims (1)
- СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА ИЗ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК, предусматривающий гомогенизацию, отделение балластных белков с получением растворимой фракции ферментов, последующую хроматографию на сефадексе и элюцию, отличающийся тем, что гомогенизации подвергают культивируемые растительные клетки женьшеня или полисциаса после проведения экстракции 70-80% водно-спиртовым раствором, полученную растворимую фракцию деалколизируют, а элюцию комплекса ведут 0,01 М фосфатным буфером pH 6,8 - 9,0, при этом наиболее активные фракции объединяют и лиофильно высушивают.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU5056097 RU2046140C1 (ru) | 1992-07-08 | 1992-07-08 | Способ выделения ферментного комплекса из культивируемых растительных клеток |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU5056097 RU2046140C1 (ru) | 1992-07-08 | 1992-07-08 | Способ выделения ферментного комплекса из культивируемых растительных клеток |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2046140C1 true RU2046140C1 (ru) | 1995-10-20 |
Family
ID=21610292
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU5056097 RU2046140C1 (ru) | 1992-07-08 | 1992-07-08 | Способ выделения ферментного комплекса из культивируемых растительных клеток |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2046140C1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1997038095A1 (fr) * | 1996-04-03 | 1997-10-16 | Coletica | Produit complexe a base de superoxyde dismutase |
WO2002053722A1 (fr) * | 2000-12-29 | 2002-07-11 | Fengxie Jin | Ginsenoside glycosidase hydrolisant le ginsenoside glycosyle et son utilisation |
-
1992
- 1992-07-08 RU SU5056097 patent/RU2046140C1/ru active
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
1. Авторское свидетельство НРБ N 38722, кл. C 12N 9/04, 1987. * |
2. Авторское свидетельство ПНР N 258436, кл. C 12N 1/10, 1989. * |
3. Авторское свидетельство СССР N 1108102, кл. C 12N 9/08, 1984. * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1997038095A1 (fr) * | 1996-04-03 | 1997-10-16 | Coletica | Produit complexe a base de superoxyde dismutase |
WO2002053722A1 (fr) * | 2000-12-29 | 2002-07-11 | Fengxie Jin | Ginsenoside glycosidase hydrolisant le ginsenoside glycosyle et son utilisation |
US7759101B2 (en) | 2000-12-29 | 2010-07-20 | Fengxie Jin | Ginsenoside glycosidases hydrolyzing ginsenoside sugar moieties and uses thereof |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Eisen et al. | Human skin collagenase. The role of serum alpha-globulins in the control of activity in vivo and in vitro | |
Galzigna et al. | Physical and biochemical changes of thermal mud after maturation | |
Brew et al. | Studies on the biosynthesis of protein by lactating guinea-pig mammary gland: Characteristics of the synthesis of α-lactalbumin and total protein by slices and cell-free systems | |
KR950014592B1 (ko) | 화장료용 유산균제재 | |
Groves et al. | Polymorphism in the red protein isolated from milk of individual cows | |
US4468460A (en) | Method of human cell culture | |
US4349540A (en) | Process for preparing vaccines based on antigenic ribosomal fractions | |
Tavares et al. | Schistosoma mansoni: evidence for a role of serum factors in protecting artificially transformed schistosomula against antibody-mediated killing in vitro | |
EP0101063A2 (de) | Neues Polypeptid mit Wirkung auf das Immunsystem, Verfahren zu seiner Isolierung und Reinigung, seine Verwendung und dieses enthaltende Mittel | |
RU2046140C1 (ru) | Способ выделения ферментного комплекса из культивируемых растительных клеток | |
Zerner et al. | Acetoacetate decarboxylase. Preparation of the enzyme | |
OSMUNDSVAG et al. | Cellulases from Sporocytophaga myxococcoides: Purification and properties | |
US20210393501A1 (en) | Preparation method and application of recombinant mutant collagenase | |
CN114989248B (zh) | 一种具有抗炎抗氧化活性的忧遁草多肽及其制备方法和应用 | |
RU2148636C1 (ru) | Способ получения дрожжевого низкомолекулярного экстракта и вещество, получаемое этим способом | |
RU2230325C2 (ru) | Способ приготовления очищенного препарата ботулинического токсина типа а | |
CA1165707A (en) | Method of tissue culture | |
RU2102478C1 (ru) | Способ выделения и очистки ферментного комплекса из культивируемых растительных клеток | |
Fiddler et al. | Enzyme therapy: Differential in vivo retention of bovine hepatic, renal, and splenic β-glucuronidases and evidence for enzyme stabilization by intermolecular exchange | |
RU2236460C1 (ru) | Способ получения препарата коллагеназы | |
CN111004305B (zh) | 姬松茸小肽及其制备方法和应用 | |
Hager et al. | [67] The preparation and properties of cytochrome b562 from Escherichia coli | |
KR100374307B1 (ko) | 재조합효모로부터발현된감마인터페론의정제방법 | |
CN108623669B (zh) | 一种发酵乳中免疫活性肽及其富集方法和应用 | |
Kilpatrick | Datura stramonium lectin: Agglutinating and mitogenic activities of a purified preparation |