CN114929877A - 突变型rsv f蛋白及其利用 - Google Patents
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Abstract
根据本发明，提供突变型RSV F蛋白，其是具有突变的突变型RSV F蛋白，其中，前述突变为与序列号1的氨基酸序列的141位的亮氨酸相当的亮氨酸或与142位的亮氨酸相当的亮氨酸被取代成半胱氨酸、及与373位的亮氨酸相当的亮氨酸被取代成半胱氨酸，前述突变型RSV F蛋白在前述半胱氨酸间形成二硫键。另外，提供突变型RSV F蛋白，其是具有突变的突变型RSV F蛋白，其中，前述突变为与序列号1的氨基酸序列的60位的谷氨酸相当的谷氨酸被取代成非酸性氨基酸。
Description
技术领域
本发明涉及突变型RSV F蛋白及其利用。
背景技术
呼吸道合胞病毒(RSV)感染症是呈现出全球性流行的呼吸系统感染症。特别是在未满5岁的儿童中，重症化风险高，因RSV感染导致每年3千万人以上发展成下呼吸道炎症，每年3百万人以上需要住院治疗。因此，迄今为止为了开发预防RSV感染症的疫苗已做了很多努力。早在1965-66年的流行季即实施了将经福尔马林灭活的病毒作为疫苗抗原的临床试验(对象为婴儿)，然而结果非但没有使感染症减少，反而因RSV感染导致的入院率增加了16倍。作为原因之一，认为灭活处理的过程中使作为病毒的表面抗原之一的F抗原变性，只诱导出RSV中和活性低的抗体，因此反而妨碍了免疫反应。此后也进行了各种努力，但是尚未开发出有效的疫苗。
在这种情况下，注意到健康成人即使感染RSV也几乎不会重症化，进行了使用健康成人血清的研究。研究结果可知，健康成人血清具有高的病毒感染能力中和效果，并且该感染中和效果起因于抗RSV F蛋白抗体(非专利文献1)。RSV F蛋白的研究也得以推进，成熟的F蛋白具有亚稳定的融合前构象(本说明书中，有时称作“pre-F”、“pre型F蛋白”)与最稳定的融合后构象(本说明书中，有时称作“post-F”、“post型F蛋白”)，已知融合前构象由于其不稳定而在通常的疫苗制剂溶液中具有在早期重折叠成融合后构象的倾向。
另外，已明确了曾经难以稳定获取的pre-F的结构(非专利文献2)，由此发现：pre型F蛋白会形成三聚体；另外，存在于pre型F蛋白的表位(表位Φ、I、II、III、IV、V等)之中的一些表位会因结构变化为post-F而丢失。
在对成年人血清更详细的研究中发现，血清中所含的抗F蛋白抗体之中，病毒感染中和能力高的抗体是主要与存在于pre型F蛋白的表位Φ、表位V特异性结合的抗体，它们具有特异性识别pre型F蛋白但不与post-F结合的性质；上述血清中还含有也与post-F结合的抗体，但是其病毒感染中和能力低(非专利文献3)。另外，免疫尚不成熟的婴幼儿期感染时症状恶化的风险高，而其原因在于初次感染时或感染次数少的婴幼儿几乎不能诱导以表位Φ、V为靶标的免疫(非专利文献4)。在疫苗抗原中，重要的是效率良好地诱导病毒感染中和能力高的抗体，认为理想的疫苗抗原是能够优先诱导出具有中和能力、针对表位Φ、V的抗体的抗原。
已尝试了通过在RSV F蛋白中导入人造二硫键的突变等来稳定具有表位Φ、V的pre型F蛋白。例如，已报道了DS-Cav1突变体(专利文献1、非专利文献5、非专利文献6)、其他突变体(专利文献2)。然而，pre型F蛋白的稳定化并不能说是充分的，目前仍在持续研究。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2017/172890号
专利文献2：国际公开第2017/109629号
非专利文献
非专利文献1：
非专利文献1：Ngwuta JO等，Science Translational Medicine 2015；309:309ra162
非专利文献2：Jason S McLellan等，Science 2013；340:1113
非专利文献3：Morgan S.A.Gilman等，2016.Science Immunology.1(6).pii:eaaj1879
非专利文献4：Eileen Goodwin等，Immunity 2018；48(2):339
非专利文献5：Jason S.McLellan等，Science 2013；342:592
非专利文献6：M Gordon Joyce等，Nature structural and molecular biology2016；23(9):811
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于提供用于效率良好地诱导RSV感染中和能力高的抗体的技术。
用于解决课题的手段
本申请发明人发现包含特定氨基酸突变的突变型RSV F蛋白效率良好地诱导出RSV感染中和能力高的抗体，从而完成了本发明。
本发明如下所述。
[1]突变型RSV F蛋白，其是具有突变的突变型RSV F蛋白，其中，前述突变为与序列号1的氨基酸序列的141位的亮氨酸相当的亮氨酸或与142位的亮氨酸相当的亮氨酸被取代成半胱氨酸、及与373位的亮氨酸相当的亮氨酸被取代成半胱氨酸，在前述半胱氨酸间形成二硫键。
[2]如[1]所述的突变型RSV F蛋白，其中，前述突变型RSV F蛋白来源于RSV亚型A或RSV亚型B。
[3]如[2]所述的突变型RSV F蛋白，其中，前述RSV亚型A为RSV A2株或RSV Long株。
[4]如[2]所述的突变型RSV F蛋白，其中，前述RSV亚型B为RSV 18537株。
[5]如[1]～[4]中任一项所述的突变型RSV F蛋白，其包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列是在与序列号2具有85％以上的同一性的氨基酸序列中，与序列号1的氨基酸序列的141位的亮氨酸相当的亮氨酸或与142位的亮氨酸相当的亮氨酸、及与373位的亮氨酸相当的亮氨酸被取代成半胱氨酸而得的，前述突变型RSV F蛋白在前述半胱氨酸间形成二硫键，具有诱导针对RSV的pre型F蛋白的抗体的能力。
[6]如[1]～[4]中任一项所述的突变型RSV F蛋白，其中，进一步地，存在于pep27区域的C末端侧的、构成弗林蛋白酶识别位点的氨基酸以前述弗林蛋白酶识别位点不被弗林蛋白酶识别的方式被取代。
[7]如[6]所述的突变型RSV F蛋白，其中，前述构成弗林蛋白酶识别位点的氨基酸为选自由与序列号1的氨基酸序列的133位的精氨酸相当的精氨酸、与135位的精氨酸相当的精氨酸、及与136位的精氨酸相当的精氨酸组成的组的氨基酸，
该氨基酸被取代成非碱性氨基酸。
[8]如[6]或[7]所述的突变型RSV F蛋白，其包含下述氨基酸序列，前述氨基酸序列是在与序列号3具有85％以上的同一性的氨基酸序列中，与序列号1的氨基酸序列的141位的亮氨酸相当的亮氨酸或与142位的亮氨酸相当的亮氨酸、及与373位的亮氨酸相当的亮氨酸被取代成半胱氨酸，并且选自由与序列号1的氨基酸序列的133位的精氨酸相当的精氨酸、与135位的精氨酸相当的精氨酸、及与136位的精氨酸相当的精氨酸组成的组的氨基酸被取代成非碱性氨基酸而得的，前述突变型RSV F蛋白在前述半胱氨酸间形成二硫键，具有诱导针对RSV的pre型F蛋白的抗体的能力。
[9]如[7]或[8]所述的突变型RSV F蛋白，其中，前述非碱性氨基酸为天冬酰胺。
[10]如[1]～[9]中任一项所述的突变型RSV F蛋白，其中，进一步地，与序列号1的氨基酸序列的189位的苏氨酸相当的苏氨酸、及/或与190位的丝氨酸相当的丝氨酸被取代成疏水性氨基酸。
[11]如[10]所述的突变型RSV F蛋白，其中，前述疏水性氨基酸各自独立地选自由缬氨酸、异亮氨酸、及亮氨酸组成的组。
[12]如[1]～[11]中任一项所述的突变型RSV F蛋白，其中，进一步地，与序列号1的氨基酸序列的42位的赖氨酸相当的赖氨酸被取代成精氨酸、及/或与384位的缬氨酸相当的缬氨酸被取代成苏氨酸。
[13]突变型RSV F蛋白，其是具有突变的突变型RSV F蛋白，其中，前述突变为与序列号1的氨基酸序列的60位的谷氨酸相当的谷氨酸被取代成非酸性氨基酸。
[14]如[13]所述的突变型RSV F蛋白，其中，前述非酸性氨基酸选自由甲硫氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、苏氨酸、及丝氨酸组成的组。
[15]融合蛋白，其包含[1]～[14]中任一项所述的突变型RSV F蛋白、和融合于前述突变型RSV F蛋白的C末端的多聚化结构域。
[16]如[15]所述的融合蛋白，其中，前述多聚化结构域为折叠子结构域。
[17]如[16]所述的融合蛋白，其包含序列号10～13中任一者的氨基酸序列。
[18]多聚体，其是[1]～[14]中任一项所述的突变型RSV F蛋白的多聚体，是[15]～[17]中任一项所述的融合蛋白介由前述多聚化结构域缔合而成的。
[19]如[18]所述的多聚体，其中，前述多聚体为三聚体。
[20]粒子化体，其是[1]～[14]中任一项所述的突变型RSV F蛋白或[15]～[17]中任一项所述的多聚体的粒子化体，其中，前述突变型RSV F蛋白或前述融合蛋白包含粒子化结构域，前述突变型RSV F蛋白或前述多聚体介由该粒子化结构域聚集2个以上而形成粒子，前述粒子化结构域存在于突变型RSV F蛋白或多聚体的立体结构上较之表位Φ更靠近表位I的位置。
[21]如[20]所述的粒子化体，其中，前述粒子化体是粒子化体制备用融合蛋白介由粒子化结构域聚集2个以上而成的，所述粒子化体制备用融合蛋白在前述突变型RSV F蛋白或前述融合蛋白的C末端结合有前述粒子化结构域。
[22]如[20]或[21]所述的粒子化体，其中，前述多聚体为由[16]所述的融合蛋白形成的三聚体。
[23]如[22]所述的粒子化体，其中，前述粒子化结构域为由序列号30的氨基酸序列序列形成的Fc结构域，并且，其是该粒子化结构域与固定化于源自修饰型HBs抗原的VLP的蛋白A的Z结构域进行结合从而聚集而成的。
[24]如[22]所述的粒子化体，其中，前述粒子化结构域为由序列号42的氨基酸序列形成的肽。
[25]粒子化体制备用融合蛋白，其包含：[1]～[14]中任一项所述的突变型RSV F蛋白的C末端；或[15]～[17]中任一项所述的融合蛋白；和融合于其C末端的粒子化结构域。
[26]如[25]所述的粒子化体制备用融合蛋白，其中，前述粒子化结构域为由序列号30的氨基酸序列序列形成的Fc结构域。
[27]如[25]所述的粒子化体制备用融合蛋白，其中，前述粒子化结构域为由序列号42的氨基酸序列形成的肽。
[28]多核苷酸，其编码[1]～[14]中任一项所述的突变型RSV F蛋白、[15]～[17]中任一项所述的融合蛋白、或[25]～[27]中任一项所述的粒子化体制备用融合蛋白。
[29]表达单元，其包含[28]所述的多核苷酸。
[30]宿主细胞，其包含[29]所述的表达单元。
[31]免疫原，其包含[1]～[14]中任一项所述的突变型RSV F蛋白、[15]～[17]中任一项所述的融合蛋白、[18]～[19]中任一项所述的多聚体或[20]～[24]中任一项所述的粒子化体。
[32]医药组合物，其包含[29]所述的表达单元或[31]所述的免疫原。
[33]RSV疫苗，其包含[29]所述的表达单元或[31]所述的免疫原。
[34]如[32]所述的医药组合物或[33]所述的RSV疫苗，其用于人。
发明效果
根据本发明，可提供用于效率良好地诱导RSV感染中和能力高的抗体的技术。可提供作为pre型F蛋白的稳定性较之以往显著提高的突变型RSV F蛋白。本发明的突变型RSV F蛋白特别是在人类中具有下述效果：较之被认为不甚有助于病毒中和的抗体组，优先诱导被认为对病毒中和具有较高效果的抗体组(以下称作优先诱导被认为对病毒中和具有较高效果的抗体组的效果)。
附图说明
[图1]示出本发明的一个方式的实施例1中的表位Φ的保守性的图表。
[图2]示出本发明的一个方式的实施例2中的表位Φ的保守性的图表。
[图3]示出本发明的一个方式的实施例2中的三聚体化的图表。
[图4]示出本发明的一个方式的实施例3中的表位Φ的保守性的图表。
[图5]示出本发明的一个方式的实施例3中的三聚体化的图表。
[图6]示出本发明的一个方式的实施例3中的表达量的图表。
[图7]示出本发明的一个方式的实施例4中的表位Φ的保守性的图表。
[图8]示出本发明的一个方式的实施例4中的三聚体化的图表。
[图9]示出本发明的一个方式的实施例5中的表位Φ的保守性的图表。
[图10]示出本发明的一个方式的实施例5中的三聚体化的图表。
[图11]示出本发明的一个方式的实施例5中的表位I的识别性的图表。
[图12]示出本发明的一个方式的实施例5中的、人血清中的病毒中和抗体的吸附试验的结果的图表。
[图13]示出本发明的一个方式的实施例5中的、人血清中的病毒中和抗体的吸附试验的结果的图表。
[图14]示出本发明的一个方式的实施例5中的、以小鼠免疫诱导的抗体的验证结果的图表。
[图15]示出本发明的一个方式的实施例6中的表位Φ的保守性的图表。
[图16]示出本发明的一个方式的实施例6中的三聚体化的图表。
[图17]示出本发明的一个方式的实施例6中的表位I的识别性的图表。
[图18]示出本发明的一个方式的实施例6中的、以小鼠免疫诱导的抗体的验证结果的图表。
[图19]示出本发明的一个方式的实施例7中的表位Φ的保守性的图表。
[图20]示出本发明的一个方式的实施例7中的三聚体化的图表。
[图21]示出本发明的一个方式的实施例7中的表位I的识别性的图表。
[图22]示出本发明的一个方式的实施例7中的表位Φ的保守性的图表(插入接头的研究)。
[图23]示出本发明的一个方式的实施例7中的三聚体化的图表(插入接头的研究)。
[图24]示出本发明的一个方式的实施例7中的表位I的识别性的图表(插入接头的研究)。
[图25]示出本发明的一个方式的实施例7中的粒子直径的图表。
[图26]示出本发明的一个方式的实施例8中的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果的照片(其1)。
[图27]示出本发明的一个方式的实施例8中的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果的照片(其2)。
[图28]示出本发明的一个方式的实施例8中的表位Φ的保守性的图表。
[图29]示出本发明的一个方式的实施例8中的三聚体化的图表。
[图30]示出本发明的一个方式的实施例8中的表位I的识别性的图表。
[图31]示出本发明的一个方式的实施例8中的粒子直径的图表。
[图32]示出本发明的一个方式的实施例8中的、以小鼠免疫诱导的抗体的验证结果的图表。
[图33]示出本发明的一个方式的实施例9中的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果的照片。
[图34]示出本发明的一个方式的实施例9中的表位Φ的保守性的图表。
[图35]示出本发明的一个方式的实施例9中的表位I的识别性的图表。
具体实施方式
本发明的一个方式为突变型RSV F蛋白，其是具有突变的突变型RSV F蛋白，其中，前述突变为与序列号1的氨基酸序列的141位的亮氨酸相当的亮氨酸或与142位的亮氨酸相当的亮氨酸被取代成半胱氨酸、及与373位的亮氨酸相当的亮氨酸被取代成半胱氨酸，在前述半胱氨酸间形成二硫键。
天然的RSV F蛋白首先以作为F0多肽(前体)表达。F0多肽在内质网易位信号被切割后，于2个位点被细胞内弗林蛋白酶样蛋白酶加工，生成F1多肽、F2多肽、及Pep27多肽。此处，Pep27多肽被切除，因此不形成成熟F蛋白的一部分。F2多肽来源于F0多肽的N末端侧部分，介由2个二硫键与F1多肽连接。F1多肽来源于F0多肽的C末端侧部分，介由跨膜结构域将成熟F蛋白固定于膜。F2-F1异源二聚体的3个原聚体作为三聚体形成成熟F蛋白，其为具有使病毒膜与靶细胞膜融合的功能的pre型F蛋白。
本发明的突变型RSV F蛋白自N末端侧起包含F2多肽、F1多肽。该F1多肽优选使用不包含跨膜区及胞内区的多肽(以下有时称作F1多肽(胞外区))。此外，由于通过后述的突变而使弗林蛋白酶样蛋白酶识别位点之一消失，因此本发明的突变型RSV F蛋白有时在F1多肽的N末端侧包含pep27多肽。另外，也可在F2多肽的N末端侧包含信号序列，在F1多肽与F2多肽之间包含接头，以及在其C末端侧包含用于纯化等的标签等。此外，优选本发明的突变型RSV F蛋白形成三聚体。
优选本发明的突变型RSV F蛋白来源于RSV亚型A或RSV亚型B。
作为前述RSV亚型A，具体而言，可例示出RSV A2株、RSV Long株、RSV S2株、RSVLine 19株，其中，优选为RSV A2株或RSV Long株。
作为前述RSV亚型B，具体而言，可例示出RSV 18537株、RSV B1株、RSV 9320株，其中，优选为RSV 18537株。
序列号1的氨基酸序列为RSV A2株的F蛋白的F0多肽的氨基酸序列，参考此对F0多肽的各构成要素进行说明。
序列号1中，信号序列的氨基酸序列为1位～25位的氨基酸序列。
序列号1中，F2多肽的氨基酸序列为26位～109位的氨基酸序列。
序列号1中，pep27区域的氨基酸序列为110位～136位的氨基酸序列。
序列号1中，F1多肽(胞外区)的氨基酸序列为137位～513位的氨基酸序列。
序列号1中，F1多肽(跨膜区与胞内区)的氨基酸序列为514位～574位的氨基酸序列。需要说明的是，F1多肽(跨膜区与胞内区)的氨基酸序列可以是与序列号1的514位～574位的氨基酸序列具有85％以上、90％或95％以上同一性的序列。
RSV F蛋白可包含F2多肽和F1多肽(胞外区)。包含F2多肽和F1多肽(胞外区)的RSVF蛋白可例示出序列号2的氨基酸序列，其依次包含：序列号1的26位～109位的氨基酸序列、和137位～513位的氨基酸序列。
RSV F蛋白可包含F2多肽和连接有pep27区域的F1多肽(胞外区)。依次包含F2多肽和连接有pep27区域的F1多肽(胞外区)的RSV F蛋白可例示出序列号3的氨基酸序列，其包含序列号1的26位～513位的氨基酸序列。
需要说明的是，这些多肽可以是分开的多肽链，优选它们以二硫键连接。即，RSV F蛋白可以为这样的多肽的复合物。
(将亮氨酸取代成半胱氨酸的突变)
本发明的突变型RSV F蛋白包含：与序列号1的氨基酸序列的141位的亮氨酸相当的亮氨酸或与142位的亮氨酸相当的亮氨酸被取代成半胱氨酸、及与373位的亮氨酸相当的亮氨酸被取代成半胱氨酸的突变。通过使前述突变型RSV F蛋白具有上述氨基酸突变，除天然生成的二硫键以外，在导入的半胱氨酸间形成新的二硫键，由此，发挥表位Φ的保守性(维持pre型)提高这样的效果。为了形成三聚体，特别优选与序列号1的141位的亮氨酸相当的亮氨酸被取代成半胱氨酸、与373位的亮氨酸相当的亮氨酸被取代成半胱氨酸。
需要说明的是，本说明书中突变型RSV F蛋白的突变位置以序列号1所示的参考序列的氨基酸编号表示。
与序列号1的氨基酸序列的141位的亮氨酸相当的亮氨酸、与142位的亮氨酸相当的亮氨酸、及与373位的亮氨酸相当的亮氨酸是指，无论突变型RSV F蛋白的来源如何，与序列号1的氨基酸序列中提及的141位的亮氨酸相当的亮氨酸、与142位的亮氨酸相当的亮氨酸、及与373位的亮氨酸相当的亮氨酸。即，针对待导入突变的RSV F蛋白的氨基酸序列，与序列号1的氨基酸序列进行比对时，分别被定位至序列号1的氨基酸序列的141位的亮氨酸、142位的亮氨酸、373位的亮氨酸的亮氨酸残基。
例如，N末端侧与序列号1的氨基酸序列相比短1个氨基酸的突变型RSV F蛋白的氨基酸序列的情况下，序列号1的氨基酸序列中的141位的亮氨酸成为140位，这样的亮氨酸可称为与序列号1的氨基酸序列的141位的亮氨酸相当的亮氨酸。
需要说明的是，针对待导入突变的RSV F蛋白的氨基酸序列，与序列号1的氨基酸序列进行比对时，在与序列号1的氨基酸序列的141位的亮氨酸相当的亮氨酸、与142位的亮氨酸相当的亮氨酸、及/或与373位的亮氨酸相当的亮氨酸的位置存在亮氨酸以外的氨基酸的情况下，将该氨基酸取代成半胱氨酸的方式也包括在本发明的突变型RSV F蛋白中。另外，除该亮氨酸以外的氨基酸为半胱氨酸的情况下，无需前述成为半胱氨酸的取代，可保持为半胱氨酸。
本发明的一个方式为突变型RSV F蛋白，其包含由包含下述氨基酸序列的突变型F0多肽生成的F2多肽和F1多肽(胞外区)，前述氨基酸序列是在序列号1的氨基酸序列中141位的亮氨酸或142位的亮氨酸、及373位的亮氨酸被取代成半胱氨酸而得的，前述突变型RSVF蛋白在前述半胱氨酸间形成二硫键。具体而言，包含下述氨基酸序列，前述氨基酸序列是序列号2的氨基酸序列中89位的亮氨酸或90位的亮氨酸、及321位的亮氨酸被取代成半胱氨酸而得的。
本发明的一个方式为突变型RSV F蛋白，其包含由包含下述氨基酸序列的突变型F0多肽生成的F2多肽和F1胞外区多肽，前述氨基酸序列是在与序列号1的氨基酸序列具有85％以上的同一性、优选90％以上的同一性、更优选95％以上的同一性的氨基酸序列中，与序列号1的氨基酸序列的141位的亮氨酸相当的亮氨酸或与142位的亮氨酸相当的亮氨酸、及与373位的亮氨酸相当的亮氨酸被取代成半胱氨酸而得的，前述突变型RSV F蛋白在前述半胱氨酸间形成二硫键，具有诱导针对RSV的pre型F蛋白的抗体的能力。具体而言，包含下述氨基酸序列，前述氨基酸序列是在与序列号2的氨基酸序列具有85％以上的同一性、优选90％以上的同一性、更优选95％以上的同一性的氨基酸序列中，与序列号1的氨基酸序列的141位的亮氨酸相当的亮氨酸(序列号2中为89位)或与142位的亮氨酸相当的亮氨酸(序列号2中为90位)、及与373位的亮氨酸相当的亮氨酸(序列号2中为321位)被取代成半胱氨酸而得的。
本说明书中，关于氨基酸序列的“百分比(％)同一性”定义如下：在为了使序列对齐、获得最大的％同一性而根据需要引入空位、并不将任何保守性取代认作序列同一性的一部分后的、与特定参考多肽序列的氨基酸残基一致的候选序列中的氨基酸残基的百分比。出于测定％同一性目的的比对可通过本领域技术人员的技能范围内的各种方法、例如使用BLAST、BLAST-2、ALIGN、或Megalign(DNASTAR)软件这样的可公开获得的计算机软件来实现。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜的参数，包括相对于所比较的序列的全长而言实现最大比对所需的任意算法。然而，为了此处的目的，％同一性值可通过在双序列比对中使用序列比较计算机程序BLAST而得到。氨基酸序列比较中使用BLAST的情况下，给定的氨基酸序列A与给定的氨基酸序列B的％同一性可通过以下方式计算：
分率X/Y的100倍
此处，X为根据序列比对程序BLAST的A及B的程序比对而具有与“相同”一致的得分的氨基酸残基的数量，Y为B的氨基酸残基总数。可以理解，氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不同的情况下，A相对于B的％同一性与B相对于A的同一性不同。除非特别说明，此处的所有的％同一性值可使用上一段落所示的BLAST计算机程序而得到。
与规定的氨基酸序列具有规定的同一性的氨基酸序列是在该规定的氨基酸序列中进行了取代、缺失、插入、或添加而得的。该取代优选为保守性取代。“保守性取代”是指以不实质改变蛋白质的活性的方式将氨基酸残基用其余的化学上类似的氨基酸残基进行取代。例如可举出将某一疏水性残基通过其余的疏水性残基进行取代的情况、将某一极性残基通过具有相同电荷的其余的极性残基进行取代的情况等。就可进行这样的取代的功能的上类似的氨基酸的例子，作为非极性(疏水性)氨基酸，可举出丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸等。作为极性(中性)氨基酸，可举出甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作为带正电荷的(碱性)氨基酸，可举出精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。另外，作为带负电荷的(酸性)氨基酸，可举出天冬氨酸、谷氨酸等。
(60位的谷氨酸的突变)
本发明的突变型RSV F蛋白的另一方式为突变型RSV F蛋白，其是具有突变的突变型RSV F蛋白，其中，前述突变为与序列号1的氨基酸序列的60位的谷氨酸相当的谷氨酸被取代成非酸性氨基酸。
只要前述突变型RSV F蛋白可发挥表位Φ的保守性的提高、三聚体化的促进、及优先诱导被认为对病毒中和具有较高效果的抗体组这样的效果，则前述非酸性氨基酸没有特别限定，具体而言，可例示出中性氨基酸、碱性氨基酸、非极性(疏水性)氨基酸。更具体而言，作为中性氨基酸，可例示出甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸；作为碱性氨基酸，可例示出精氨酸、组氨酸、赖氨酸；作为非极性(疏水性)氨基酸，可例示出丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸。
前述非酸性氨基酸优选为中性氨基酸、及/或非极性(疏水性)氨基酸。
另外，中性氨基酸之中，优选苏氨酸、丝氨酸，非极性(疏水性)氨基酸之中，优选选自由甲硫氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸组成的组，因此前述非酸性氨基酸优选选自由甲硫氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、苏氨酸、及丝氨酸组成的组。
本发明的一个方式为突变型RSV F蛋白，其包含由包含下述氨基酸序列的突变型F0多肽生成的F2多肽和F1多肽(胞外区)，前述氨基酸序列是序列号1的氨基酸序列的60位的谷氨酸被取代成非酸性氨基酸而得的。具体而言，包含下述氨基酸序列，前述氨基酸序列是在序列号2的氨基酸序列中，35位的谷氨酸被取代成非酸性氨基酸而得的。
本发明的一个方式为突变型RSV F蛋白，其包含由包含下述氨基酸序列的突变型F0多肽生成的F2多肽和F1多肽(胞外区)，前述氨基酸序列是在与序列号1的氨基酸序列具有85％以上的同一性、优选90％以上的同一性、更优选95％以上的同一性的氨基酸序列中，与序列号1的氨基酸序列的60位的谷氨酸相当的谷氨酸被取代成非酸性氨基酸而得的，前述突变型RSV F蛋白具有诱导针对RSV的pre型F蛋白的抗体的能力。具体而言，包含下述氨基酸序列，前述氨基酸序列是在与序列号2的氨基酸序列具有85％以上的同一性、优选90％以上的同一性、更优选95％以上的同一性的氨基酸序列中，与序列号1的氨基酸序列的60位的谷氨酸相当的谷氨酸(序列号2中为35位)被取代成非酸性氨基酸而得的。
需要说明的是，60位的谷氨酸的突变可以与上述的将亮氨酸取代成半胱氨酸的突变一同被导入。
(弗林蛋白酶识别位点的突变)
对于本发明的突变型RSV F蛋白而言，进一步地，可以是存在于pep27区域的C末端侧的、构成弗林蛋白酶识别位点的氨基酸被取代成前述弗林蛋白酶识别位点不被弗林蛋白酶识别的氨基酸而得的突变型RSV F蛋白。通过具有这样的氨基酸取代，突变型RSV F蛋白具有F2多肽和连接有pep27区域的F1多肽(胞外区)，由此发挥以保持表位Φ的保守性的状态促进三聚体化这样的效果。
pep27区域是指与序列号1的氨基酸序列的110位～136位相当的区域，在细胞内，较之其更靠N末端侧的第1识别位点和其C末端侧的第2识别位点被弗林蛋白酶切割。较之pep27区域更靠N末端侧为F2多肽，C末端侧为F1多肽，前述切割的结果是，生成F2多肽和F1多肽，它们在各自的多肽原本所具有的半胱氨酸残基间形成二硫键而成为复合物。可见，通常RSV F蛋白不包含pep27区域，但由于该突变，第2识别位点未被切割，仅存在于F2多肽的C末端侧与pep27区域之间的第1识别位点被弗林蛋白酶切割。该切割的结果是，生成包含连接pep27区域的F1多肽的多肽、和F2多肽，它们在各自的多肽原本所具有的半胱氨酸残基间形成二硫键而成为复合物。可见，本方式可以为含有包含连接pep27区域的F1多肽的多肽片段、和F2多肽的复合物。
该取代为前述构成弗林蛋白酶识别位点的氨基酸之中的一个或多个氨基酸的取代即可。具体而言，构成弗林蛋白酶识别位点的氨基酸为选自由与序列号1的氨基酸序列的133位的精氨酸相当的精氨酸、与135位的精氨酸相当的精氨酸、及与136位的精氨酸相当的精氨酸组成的组的1个以上的氨基酸，优选该氨基酸被取代成非碱性氨基酸。
也可以与序列号1的氨基酸序列的133位的精氨酸相当的精氨酸、与135位的精氨酸相当的精氨酸、及与136位的精氨酸相当的精氨酸各自独立地被取代成非碱性氨基酸。
前述非碱性氨基酸只要发挥以保持表位Φ的保守性的状态促进三聚体化这样的效果，则没有特别限定，具体而言，可例示出中性氨基酸、酸性氨基酸、非极性(疏水性)氨基酸。更具体而言，作为中性氨基酸，可例示出甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸；作为酸性氨基酸，可例示出天冬氨酸、谷氨酸；作为非极性(疏水性)氨基酸，可例示出丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸。其中，优选中性氨基酸，更优选天冬酰胺。
本发明的突变型RSV F蛋白的一个方式包含下述氨基酸序列，前述氨基酸序列是在序列号3的氨基酸序列中，116位的亮氨酸或117位的亮氨酸、及348位的亮氨酸被取代成半胱氨酸、且选自由108位的精氨酸、110位的精氨酸、及111位的精氨酸组成的组中的氨基酸被取代成非碱性氨基酸而得的。
本发明的突变型RSV F蛋白的一个方式包含下述氨基酸序列，前述氨基酸序列是在与序列号3的氨基酸序列具有85％以上的同一性、优选90％以上的同一性、更优选95％以上的同一性的氨基酸序列中，与序列号1的氨基酸序列的141位的亮氨酸相当的亮氨酸(序列号3中为116位的亮氨酸)或与142位的亮氨酸相当的亮氨酸(序列号3中为117位的亮氨酸)、及与373位的亮氨酸相当的亮氨酸(序列号3中为348位的亮氨酸)被取代成半胱氨酸、且选自由与序列号1的氨基酸序列的133位的精氨酸相当的精氨酸(序列号3中为108位的精氨酸)、与135位的精氨酸相当的精氨酸(序列号3中为110位的精氨酸)、及与136位的精氨酸相当的精氨酸(序列号3中为111位的精氨酸)组成的组中的氨基酸被取代成非碱性氨基酸而得的。
本发明的突变型RSV F蛋白的另一个方式包含下述氨基酸序列，前述氨基酸序列是在序列号3的氨基酸序列中，35位的谷氨酸被取代成非酸性氨基酸、且选自由108位的精氨酸、110位的精氨酸、及111位的精氨酸组成的组中的氨基酸被取代成非碱性氨基酸而得的。
本发明的突变型RSV F蛋白的另一个方式包含下述氨基酸序列，前述氨基酸序列是在与序列号3的氨基酸序列具有85％以上的同一性、优选90％以上的同一性、更优选95％以上的同一性的氨基酸序列中，与序列号1的氨基酸序列的60位的谷氨酸相当的谷氨酸(序列号3中为35位的谷氨酸)被取代成非酸性氨基酸、且选自由与序列号1的氨基酸序列的133位的精氨酸相当的精氨酸(序列号3中为108位的精氨酸)、与135位的精氨酸相当的精氨酸(序列号3中为110位的精氨酸)、及与136位的精氨酸相当的精氨酸(序列号3中为111位的精氨酸)组成的组中的氨基酸被取代成非碱性氨基酸而得的。
需要说明的是，序列号3或与序列号3具有85％以上、优选90％以上、更优选95％以上的同一性的氨基酸序列中，前述pep27区域可以被取代成人造接头。作为前述人造接头，其序列没有特别限制，优选为6～27的氨基酸残基长度，优选为包含Gly及/或Ser的序列，更具体而言，可例示出Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser(序列号18)、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(序列号19)、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3(序列号20)。
(其他突变)
本发明的突变型RSV F蛋白可以为下述突变型RSV F蛋白，其中，除了将上述与序列号1的氨基酸序列的141位的亮氨酸相当的亮氨酸或与142位的亮氨酸相当的亮氨酸、及与373位的亮氨酸相当的亮氨酸取代成半胱氨酸的突变(以下称作将亮氨酸取代成半胱氨酸的突变)、60位的谷氨酸的突变、及/或弗林蛋白酶识别位点的突变以外，进一步地，与序列号1的氨基酸序列的189位的苏氨酸相当的氨基酸、及/或与190位的丝氨酸相当的氨基酸被取代成疏水性氨基酸。
本方式的突变型RSV F蛋白可发挥下述效果：以保持表位Φ的保守性优异、促进三聚体化这样的效果及优先诱导被认为对病毒中和具有较高效果的抗体组的效果的状态，使表达系统中表达量显著提高。
与序列号1的氨基酸序列的189位的苏氨酸相当的氨基酸、及/或与190位的丝氨酸相当的氨基酸可以各自独立地被取代成疏水性氨基酸。
另外，包含该取代的突变型RSV F蛋白除了以保持表位Φ的保守性优异、促进三聚体化这样的效果及优先诱导被认为对病毒中和具有较高效果的抗体组的效果的状态，使表达系统中表达量显著提高这样的效果以外，还不易被对病毒感染的中和没有或欠缺效果的抗体识别。反之，若对病毒感染的中和没有或欠缺效果的抗体被诱导，则无助于或几乎无助于病毒感染的中和的免疫细胞活化，推测反而有症状恶化的风险，根据后述的实施例可知，本方式的突变型RSV F蛋白不易被对病毒感染的中和没有或欠缺效果的抗体识别，因此其风险低于以往的疫苗。
若举出具体例，则本方式的突变型RSV F蛋白不易被识别表位I的抗体识别。表位I诱导病毒感染的中和能力显著低的抗体，因此推测若表位I被抗体识别，则由于几乎无助于病毒感染的中和的免疫细胞的激活，反而存在症状恶化的风险，根据后述的实施例可知，不易被识别表位I的抗体识别的本方式的突变型RSV F蛋白的其风险低于以往的疫苗。
只要前述突变型RSV F蛋白可发挥以保持表位Φ的保守性优异、促进三聚体化这样的效果及优先诱导被认为对病毒中和具有较高效果的抗体组的效果的状态，使表达系统中表达量显著提高这样的效果，以及不易被对病毒感染的中和没有或欠缺效果的抗体识别这样的效果，则前述疏水性氨基酸没有特别限定，具体而言，可例示出丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸。其中，优选选自由缬氨酸、异亮氨酸、及亮氨酸组成的组。
需要说明的是，序列号1中的189位为序列号2的137位的氨基酸，序列号1的190位为序列号2的138位的氨基酸，在序列号2或与其具有85％以上、90％以上或95％以上同一性的氨基酸序列中，这些氨基酸中的一者或两者的突变可以在上述将亮氨酸取代成半胱氨酸的突变、及/或60位的谷氨酸的突变的基础上进行导入。
另外，序列号1中的189位为序列号3的164位的氨基酸，序列号1的190位为序列号3的165位的氨基酸，在序列号3或与其具有85％以上、90％以上或95％以上同一性的氨基酸序列中，这些氨基酸中的一者或两者的突变可以在上述将亮氨酸取代成半胱氨酸的突变、60位的谷氨酸的突变、及/或弗林蛋白酶识别位点的突变的基础上进行导入。
本发明的一个方式可以为下述突变型RSV F蛋白，其中，除了上述将亮氨酸取代成半胱氨酸的突变、60位的谷氨酸的突变、及/或弗林蛋白酶识别位点的突变以外，进一步地，与序列号1的氨基酸序列的42位的赖氨酸相当的氨基酸被取代成精氨酸、及/或、与384位的缬氨酸相当的氨基酸被取代成苏氨酸。
本方式的突变型RSV F蛋白可发挥下述效果：以保持表位Φ的保守性优异、三聚体化促进这样的效果及优先诱导被认为对病毒中和具有较高效果的抗体组的效果的状态，使表达系统中表达量显著提高。
需要说明的是，序列号1中的42位为序列号2的17位的氨基酸，序列号1的384位为序列号2的332位的氨基酸，在序列号2或与其具有90％以上同一性的氨基酸序列中，这些氨基酸中的一者或两者的突变可在上述将亮氨酸取代成半胱氨酸的突变、及/或60位的谷氨酸的突变、以及上述189位及/或190位的突变的基础上进行导入。
另外，序列号1中的42位为序列号3的17位的氨基酸，序列号1的384位为序列号3的359位的氨基酸，在序列号3或与其具有90％以上同一性的氨基酸序列中，这些氨基酸中的一者或两者的突变可在上述将亮氨酸取代成半胱氨酸的突变、60位的谷氨酸的突变、及/或弗林蛋白酶识别位点的突变、以及上述189位及/或190位的突变的基础上进行导入。
对于前述突变型RSV F蛋白而言，只要不妨碍前述突变型RSV F蛋白的效果，还可以包含已知的突变。例如，还可以包含为了提高表达系统中表达量的突变。具体而言，可例示出选自由与序列号1的氨基酸序列的102位的脯氨酸相当的氨基酸被取代成丙氨酸、与379位的异亮氨酸相当的氨基酸被取代成缬氨酸、及与447位的甲硫氨酸相当的氨基酸被取代成缬氨酸组成的组中的一种以上的取代。
需要说明的是，序列号1中的102位为序列号2的77位的氨基酸，序列号1的379位为序列号2的327位的氨基酸，序列号1的447位为序列号2的395位的氨基酸，在序列号2或与其具有85％、90％或95％以上同一性的氨基酸序列中，这些氨基酸中的一者或两者的突变可在上述将亮氨酸取代成半胱氨酸的突变、及/或60位的谷氨酸的突变、以及上述189位及/或190位的突变、42位及/或384位的突变的基础上进行导入。
另外，序列号1中的102位为序列号3的77位的氨基酸，序列号1的379位为序列号3的354位的氨基酸，序列号1的447位为序列号3的422位的氨基酸，在序列号3或与其具有85％、90％或95％以上同一性的氨基酸序列中，这些氨基酸中的一者或两者的突变可在上述将亮氨酸取代成半胱氨酸的突变、60位的谷氨酸的突变、及/或弗林蛋白酶识别位点的突变、以及上述189位及/或190位的突变、42位及/或384位的突变的基础上进行导入。
本发明的突变型RSV F蛋白的具体的方式为包含序列号6～9中任一者的氨基酸序列的突变型RSV F蛋白。具体而言，包含下述的氨基酸突变。
序列号6(FH_50中所含的突变型RSV＿F蛋白)的氨基酸序列是在序列号3中，序列号1的141位的亮氨酸被取代成半胱氨酸、序列号1的373位的亮氨酸被取代成半胱氨酸、序列号1的135位的精氨酸被取代成天冬酰胺、序列号1的136位的精氨酸被取代成天冬酰胺、序列号1的189位的苏氨酸被取代成缬氨酸、序列号1的190位的丝氨酸被取代成缬氨酸、序列号1的102位的脯氨酸被取代成丙氨酸、序列号1的379位的异亮氨酸被取代成缬氨酸、序列号1的447位的甲硫氨酸被取代成缬氨酸而得的氨基酸序列。此处，实际上，序列号6的氨基酸序列被分为F2多肽的氨基酸序列、pep27添加F1多肽(胞外区)的氨基酸序列，此处表示为将它们结合而得的一个氨基酸序列。因此，计算下述的氨基酸序列的同一性的情况下，与依次结合对象蛋白的F2多肽的氨基酸序列和pep27添加F1多肽(胞外区)的氨基酸序列而得的氨基酸序列进行比较。以下同样。
序列号7(FH_81中所含的突变型RSV＿F蛋白)的氨基酸序列是在序列号3中，序列号1的141位的亮氨酸被取代成半胱氨酸、序列号1的373位的亮氨酸被取代成半胱氨酸、序列号1的135位的精氨酸被取代成天冬酰胺、序列号1的136位的精氨酸被取代成天冬酰胺、序列号1的189位的苏氨酸被取代成缬氨酸、序列号1的190位的丝氨酸被取代成缬氨酸、序列号1的60位的谷氨酸被取代成甲硫氨酸、序列号1的102位的脯氨酸被取代成丙氨酸、序列号1的379位的异亮氨酸被取代成缬氨酸、序列号1的447位的甲硫氨酸被取代成缬氨酸而得的氨基酸序列。
序列号8(FH_82中所含的突变型RSV＿F蛋白)的氨基酸序列是在序列号3中，序列号1的141位的亮氨酸被取代成半胱氨酸、序列号1的373位的亮氨酸被取代成半胱氨酸、序列号1的135位的精氨酸被取代成天冬酰胺、序列号1的136位的精氨酸被取代成天冬酰胺、序列号1的189位的苏氨酸被取代成缬氨酸、序列号1的190位的丝氨酸被取代成缬氨酸、序列号1的42位的赖氨酸被取代成精氨酸、序列号1的384位的缬氨酸被取代成苏氨酸、序列号1的102位的脯氨酸被取代成丙氨酸、序列号1的379位的异亮氨酸被取代成缬氨酸、序列号1的447位的甲硫氨酸被取代成缬氨酸而得的氨基酸序列。
序列号9(FH_85中所含的突变型RSV＿F蛋白)的氨基酸序列是在序列号3中，序列号1的141位的亮氨酸被取代成半胱氨酸、序列号1的373位的亮氨酸被取代成半胱氨酸、序列号1的135位的精氨酸被取代成天冬酰胺、序列号1的136位的精氨酸被取代成天冬酰胺、序列号1的189位的苏氨酸被取代成缬氨酸、序列号1的190位的丝氨酸被取代成缬氨酸、序列号1的60位的谷氨酸被取代成甲硫氨酸、序列号1的42位的赖氨酸被取代成精氨酸、序列号1的384位的缬氨酸被取代成苏氨酸、序列号1的102位的脯氨酸被取代成丙氨酸、序列号1的379位的异亮氨酸被取代成缬氨酸、序列号1的447位的甲硫氨酸被取代成缬氨酸而得的氨基酸序列。
本发明的一个方式为突变型RSV F蛋白，其中，在与序列号6～9中任一者的氨基酸序列具有85％以上的同一性、优选90％以上的同一性、更优选95％以上的同一性的氨基酸序列中，各自包含上述的氨基酸的取代，前述突变型RSV F蛋白在前述半胱氨酸间形成二硫键，具有诱导针对RSV的pre型F蛋白的抗体的能力。
需要说明的是，与规定的氨基酸序列具有规定的同一性的氨基酸序列的定义与上述的内容相同。
(融合蛋白)
本发明的另一方式为融合蛋白，其包含前述突变型RSV F蛋白和至少多聚化结构域。
融合蛋白可以包含除突变型RSV F蛋白及多聚化结构域以外的多肽，除该突变型RSV F蛋白及多聚化结构域以外的多肽只要不妨碍前述突变型RSV F蛋白的效果，则没有特别限定，具体而言，可例示出凝血酶切割基序等基序、His-标签、StrepTagII等纯化用标签。
多聚化结构域只要为突变型RSV F蛋白进行多聚化所需的多肽，则没有特别限制，可例示出用于三聚体化的折叠子结构域(Yizhi Tao等，1997.Structure 5(6):789)(FrankS等，2001.Journal of molecular biology 308(5):1081)。
作为折叠子结构域，可例示出源自T4噬菌体的次要纤维蛋白(fibritin)的折叠子结构域。作为其氨基酸序列，可例示出序列号21的氨基酸序列。
作为融合蛋白的例子，可举出在具有序列号6～9的氨基酸序列的、突变型RSV F蛋白的C末端连接折叠子结构域而得的融合蛋白。
具体而言，可举出具有序列号10～13的氨基酸序列的融合蛋白。
实际上，序列号10～13的氨基酸序列被分为F2多肽的氨基酸序列、和pep27添加F1多肽(胞外区)的C末端连接折叠子结构域而得的氨基酸序列，此处表示为将它们结合而得的一个氨基酸序列。
(多聚体)
本发明的另一方式为前述融合蛋白的多聚体。前述多聚体是前述融合蛋白介由折叠子结构域等多聚化结构域缔合而成的。优选多聚体为前述融合蛋白的三聚体。
(多核苷酸)
本发明的另一方式为多核苷酸，其编码前述突变型RSV F蛋白、或前述融合蛋白。
编码前述突变型RSV F蛋白的多核苷酸可参考编码突变导入前的RSV F蛋白的多核苷酸序列(序列号74)，利用标准的基因工程技术，以导入所期望的突变的多核苷酸的形式获得。
另外，编码前述融合蛋白的多核苷酸也可使用编码前述突变型RSV F蛋白的多核苷酸、及编码除该突变型RSV F蛋白以外的多肽的多核苷酸，利用标准的基因工程技术获得。
具体而言，作为用于使本发明的融合蛋白表达并在宿主中产生的多核苷酸序列，可例示出序列号14～17的多核苷酸序列。
序列号14为用于使具有序列号10的氨基酸序列的融合蛋白表达并在宿主中产生的多核苷酸序列，在编码该融合蛋白的序列的5’末端侧添加有编码信号肽的序列。
序列号15为用于使具有序列号11的氨基酸序列的融合蛋白表达并在宿主中产生的多核苷酸序列，在编码该融合蛋白的序列的5’末端侧添加有编码信号肽的序列。
序列号16为用于使具有序列号12的氨基酸序列的融合蛋白表达并在宿主中产生的多核苷酸序列，在编码该融合蛋白的序列的5’末端侧添加有编码信号肽的序列。
序列号17为用于使具有序列号13的氨基酸序列的融合蛋白表达并在宿主中产生的多核苷酸序列，在编码该融合蛋白的序列的5’末端侧添加有编码信号肽的序列。
需要说明的是，只要可编码预期的氨基酸，各密码子可任意使用。例如，编码Gly的密码子有GGT、GGC、GGA、GGG这4种，可以使用其中的任一种。另外，各密码子可以进行优化，也可以不优化，优选进行了优化。
对于编码突变型RSV F蛋白的多核苷酸而言，只要编码包含上述特定的突变、具有诱导针对RSV的pre型F蛋白的抗体的能力的突变型RSV F蛋白，则可以为与具有这些多核苷酸序列的互补序列的多核苷酸在严格条件下进行杂交的多核苷酸。此处，严格条件例如可举出Southern杂交之后，以68℃、0.1×SSC、与0.1％SDS相当的盐浓度进行洗涤的条件。
(表达单元)
本发明的另一方式为表达单元，其包含前述多核苷酸。
前述表达单元只要包含使前述多核苷酸表达的机构即可，例如，可包含启动子序列、转录终止信号序列等表达所需的要素，可以为用于标准的基因工程技术的表达单元。表达单元例如可以包含在重组载体中。作为重组载体，可例示出质粒载体、病毒载体，可举出能够在原核细胞中表达的载体、能够在真核细胞中表达的载体、能够在源自哺乳动物的细胞中表达的载体。
(宿主细胞)
本发明的另一方式为宿主细胞，其包含前述表达单元。优选为用包含前述表达单元的重组载体转化而得的宿主细胞。
作为前述宿主细胞，只要由前述表达单元表达前述多核苷酸所表达的蛋白质，则没有特别限定，可以为用于标准的基因工程技术的宿主细胞。具体而言，可例示出大肠杆菌、枯草芽孢杆菌这样的原核细胞、真核细胞、源自哺乳动物的细胞。
向宿主细胞导入多核苷酸可使用磷酸钙法、DEAE葡聚糖法、电穿孔法、脂质体转染法等已知的手段而进行。
通过以适宜的条件培养宿主细胞，能够表达前述突变型RSV F蛋白或融合蛋白，产生前述突变型RSV F蛋白、融合蛋白或它们的多聚体。所产生的前述突变型RSV F蛋白、融合蛋白或它们的多聚体可利用已知的手段进行纯化。
(免疫原)
本发明的另一方式为免疫原，其包含前述突变型RSV F蛋白、前述融合蛋白、前述多聚体、或下述粒子化体。
即，前述突变型RSV F蛋白、前述融合蛋白、前述多聚体、或前述粒子化体可作为免疫原而使用。该免疫原只要不妨碍前述突变型RSV F蛋白的效果，可以包含前述突变型RSVF蛋白、前述融合蛋白、前述多聚体、或前述粒子化体中的任1种，可以包含任意2种，也可以包含全部。其中，优选多聚体，特别优选三聚体，还优选粒子化体，可用作免疫原。多聚体的制造如上所述，以下对粒子化体进行详细说明。需要说明的是，本发明的免疫原可以包含标准的免疫原所含的防腐剂、赋形剂等。
(粒子化体)
本发明的另一方式为前述突变型RSV F蛋白或前述多聚体的粒子化体。
粒子化体只要是突变型RSV F蛋白或多聚体聚集2个以上形成粒子而得的、能够效率良好地诱导中和能力高的抗体，则没有特别限制，例如，是前述突变型RSV F蛋白或前述多聚体介由粒子化结构域聚集2个以上形成粒子而得的。此处，粒子化体及粒子的形状并非一定限于球状，只要朝向一定方向聚集足矣。
即，优选的是：进一步地使粒子化结构域与前述突变型RSV F蛋白或前述融合蛋白融合，前述突变型RSV F蛋白或前述融合蛋白的多聚体介由该粒子化结构域聚集而形成粒子。
优选使用前述突变型RSV F蛋白或前述融合蛋白的C末端结合有粒子化结构域而得的粒子化体制备用融合蛋白，使其粒子化。粒子化体制备用融合蛋白在后文进行叙述。
粒子化体中，优选前述粒子化结构域存在于突变型RSV F蛋白或多聚体的立体结构上较之表位Φ更靠近表位I的位置。即优选的是：通过粒子化结构域聚集而构成核心(core)，突变型RSV F蛋白或多聚体的表位I存在于内侧，表位Φ暴露于外侧而得的粒子化体。
因此，本发明的一个方式的粒子化体是突变型RSV F蛋白或多聚体介由粒子化结构域以至少RSV F蛋白的表位Φ暴露、至少RSV F蛋白的表位I不暴露的方式聚集2个以上而得的粒子化体。此处，“表位I不暴露的方式”是指无需表位I完全不暴露，只要为抗体、各种免疫细胞对表位I的可及性降低的程度即可。
本发明的粒子化体的一个方式中，突变型RSV F蛋白的表位Φ与表位I处于该蛋白质的立体结构上的两极，通过使形成核心的粒子化结构域较之表位Φ更靠近表位I，可形成作为不需要的表位的表位I作为抗原被掩盖，而作为有用表位的表位Φ容易作为抗原发挥功能的结构。此处，不需要的表位意味着，将该突变型RSV F蛋白、其融合蛋白、它们的多聚体、或它们的粒子化体用作免疫原时，在人类中通常诱导RSV病毒感染中和能力低的抗体的表位，具体而言，可举出表位I。另一方面，有用表位意味着，将该突变型RSV F蛋白、其融合蛋白、它们的多聚体、或它们的粒子化体用作免疫原时，在人类中通常诱导RSV病毒感染中和能力高的抗体的表位，具体而言，可举出表位Φ、表位V。通过成为该结构，发挥通过空间位阻效应降低抗体、各种免疫细胞对不需要的表位的可及性的效果。
用于粒子化的粒子化结构域是使突变型RSV F蛋白或多聚体粒子化的多肽，可举出可结合于支架粒子的多肽(例：支架粒子结合肽)、可疏水聚集的多肽(例：疏水性肽链)、或具有自缔合性的多肽(例：自缔合性肽)等。
首先，对使用了支架粒子的粒子化的方式进行说明。即，支架粒子结合突变型RSVF蛋白或多聚体而得的方式。
作为支架粒子的材料，没有特别限制，可举出具有粒子形成能力的蛋白质、脂质双层膜、包膜、脂质体、Niosomes、病毒小体(virosome)、ferrosome、金纳米粒子、树脂、二氧化硅、高分子胶束、凝胶等。
作为具有粒子形成能力的蛋白质的例子，可举出形成VLP(病毒样颗粒，Virus-like particle)、VP(病毒颗粒，Virus Particle)的、病毒蛋白、病毒蛋白的修饰体(例如，日本特开2004-2313号公报)。例如，可举出以丧失原本对肝细胞的感染能力的方式被修饰、进而以呈递支架分子的方式被修饰而得的B型肝炎病毒表面抗原蛋白，若该蛋白质于真核细胞中表达，则在内质网膜等膜上作为膜蛋白表达、蓄积，以VLP的形式释放。
作为支架粒子，更具体而言，可举出源自在B型肝炎病毒表面抗原(HBs抗原)蛋白的PreS区域插入蛋白A的Fc结合结构域(Z结构域)而制作的蛋白质的VLP，例如，可使用Bionanocapsule-ZZ(Beacle公司商品目录编号：BCL-DC-002)。
优选支架粒子的表面固定化有与作为粒子化结构域的支架粒子结合肽进行结合的分子(支架分子)。
例如，可举出蛋白A的Fc结合结构域，可介由支架粒子结合肽使突变型RSV F蛋白或其多聚体结合。
需要说明的是，支架分子与支架粒子结合肽的结合可以为共价结合、非共价结合中的任一种。作为共价结合的例子，可举出被统称为点击化学的手法(可例示出炔(乙炔等)-叠氮键、半胱氨酸-马来酰亚胺键、伯胺-NHS酯键)、产生电荷转移键的手法(可例示出酰肼-醛键)、利用多肽产生共价键的手法(使用SpyTag-SpyCatcher的方法等)等。作为非共价结合的例子，可举出离子相互作用、疏水键、氢键等。
具体而言，可举出蛋白质标签与蛋白质标签结合分子的组合(可例示出生物素-抗生物素蛋白、Fc-蛋白A、GST(谷胱甘肽S转移酶，Glutathione S-transferase)-谷胱甘肽、MBP(麦芽糖结合蛋白，Maltose binding protein)-麦芽糖、His标签-镍、SBP标签-链亲和素)、抗体与抗原的组合等。
作为支架分子与支架粒子结合肽的组合，优选为IgG1的Fc结构域(序列号30)与蛋白A的Fc结合结构域(Z结构域)的组合。可以将IgG1的Fc结构域用于支架分子，将蛋白A的Fc结合结构域用于支架粒子结合肽，也可以将IgG1的Fc结构域用于支架粒子结合肽，将蛋白A的Fc结合结构域用于支架分子。
需要说明的是，上述支架分子或支架粒子结合肽只要可彼此共价结合或非共价结合，则可使用他们的部分片段，或者进行修饰。
接着，作为粒子化结构域，对使用了疏水性肽链的粒子化的方式进行说明。
该方式中，突变型RSV F蛋白或融合蛋白结合有疏水性肽链，介由该疏水性肽链，突变型RSV F蛋白或融合蛋白形成粒子。
疏水性肽链意味着包含疏水性氨基酸，进行自组装而形成该粒子化体的、氨基酸残基数为5～50、优选为10～30的肽链。此处，作为疏水性强的氨基酸，可举出缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸等，更优选为亮氨酸或异亮氨酸。疏水性肽链中的疏水性氨基酸的比例优选为20～60％。
疏水性肽链中，优选疏水性氨基酸出现在疏水性肽链的表面。表面的疏水性氨基酸的比例优选为10％以上，但若比率过高，则于细胞内凝集而不被分泌，因此表面的疏水性氨基酸优选为50％以下、30％以下、20％以下。另一方面，内侧的疏水性氨基酸的比率高的情况下，疏水性肽链的结构稳定，故而优选。
除疏水性氨基酸以外的氨基酸可以是任意的，但为了提高分泌效果，特别优选包含20％以上的组氨酸。
通过将疏水性肽链形成为由7氨基酸形成的肽的重复序列，形成螺旋结构，且容易进行上述设计，故而优选使用。例如，疏水性肽链优选为疏水性氨基酸配置于第1位、第3位、第5位的7个氨基酸形成的肽序列的重复序列。重复数例如为2～5，优选为2～3。
作为疏水性肽链的优选例，可举出CC02、CC03、CC07、CC08(依次为序列号40、41、42、43)，其中，更优选CC07(序列号42)。
接着，作为粒子化结构域，对使用了自缔合性蛋白结构域的粒子化的方式进行说明。
该方式中，突变型RSV F蛋白或融合蛋白结合有自缔合性蛋白结构域，介由该自缔合性蛋白结构域，突变型RSV F蛋白或融合蛋白形成粒子。
作为具有自缔合性的蛋白质(自组装蛋白，Self-assembly protein)的例子，可举出B型肝炎病毒的核心抗原(HBcAg)、人乳头瘤病毒的衣壳蛋白(HPV L1)、E型肝炎病毒的衣壳蛋白(HEV capsid)、噬菌体Qβ包被蛋白、诺沃克病毒(诺如病毒、NoV)衣壳、细小病毒(Parvovirus)B19衣壳、苜蓿花叶病毒、Feritin、encapsulin等。具有自缔合性的蛋白质可以为具有自缔合性的部分片段，也可以为修饰体。
使用HBcAg的情况下，优选的是：与本发明的RSV F蛋白或多聚体进行结合时，使距离用于HBcAg的自缔合的缔合面远的部位、且为自缔合后的外侧的部位与RSV F蛋白或多聚体进行结合。此外，进行了这样的结合的情况下，优选为了获得HBcAg的原本的立体结构而在α3结构域的螺旋与α4结构域的螺旋之间插入接头。接头例如为10～30氨基酸的多肽，例如，为GS接头。作为这样的HBcAg的修饰体结合有FLAG标签的序列，可举出序列号54。
＜粒子化体制备用融合蛋白＞
粒子化体制备用融合蛋白为用于制作上述的粒子化体的蛋白质，其包含融合于本发明的突变型RSV F蛋白的C末端、或融合蛋白的C末端的、上述支架粒子结合肽、疏水性肽链、自缔合性蛋白结构域等粒子化结构域。
本粒子化体制备用融合蛋白介由粒子化结构域进行聚集从而成为粒子化体。
需要说明的是，构成本发明的多聚体的融合蛋白的C末端间的距离因与粒子化结构域结合而发生变化的情况下，可通过在粒子化结构域与该C末端(多聚化结构域)之间插入接头来减小对上述C末端间的距离的影响。接头没有特别限制，优选为5～20氨基酸的肽，更优选为5～10氨基酸的肽。序列只要不妨碍融合蛋白的疫苗效果，则没有特别限制，例如，为由甘氨酸和丝氨酸形成的GS接头。
接头的位置只要在突变型RSV F蛋白或融合蛋白的多聚化结构域与粒子化结构域之间即可，可以在接头的前后包含标签序列。标签序列没有特别限制，优选使用蛋白质的纯化中常用的标签序列，例如，可例示出FLAG标签(序列号28)、His-标签(序列号25)、Strep-Tag II(序列号26)等。
粒子化体制备用融合蛋白可通过下述方式获得：对于编码突变型RSV F蛋白或融合蛋白的DNA，将编码粒子化结构域的DNA、以及根据需要的编码接头、标签的DNA对齐阅读框而进行连接，并于宿主中使其表达。表达及纯化方法可以与前述突变型RSV F蛋白或融合蛋白的表达及纯化同样的方式进行。
作为粒子化体制备用融合蛋白的具体的例子，可举出突变型RSV F蛋白结合有支架粒子结合肽的方式(它们的前体蛋白的序列：序列号31～39、及编码其的多核苷酸序列：序列号57～65)、突变型RSV F蛋白结合有疏水性肽链的方式(它们的前体蛋白的序列：序列号44～49、及编码其的多核苷酸序列：序列号66～71)、突变型RSV F蛋白结合有自缔合性蛋白结构域的方式(它们的前体蛋白的序列：序列号55～56、或编码其的多核苷酸序列：序列号72～73)。
需要说明的是，粒子化体制备用融合蛋白可以包含FLAG标签(DYKDDDDK：序列号28)、在FLAG标签添加有3个氨基酸(GGS)而得的标签(GGSDYKDDDDK：序列号29)等标签序列。
(粒子化体制备方法)
粒子化体可通过使用上述中得到的粒子化体制备用融合蛋白使其粒子化之后、根据需要对粒子化体进行纯化而获得。
使用支架粒子的情况下，粒子化步骤可通过下述方式进行：将粒子化体制备用融合蛋白与支架粒子混合使其粒子化之后，去除未被粒子化的突变型RSV F蛋白或其产物，对粒子化体进行纯化。作为支架粒子，例如，可使用HBsAg VLP(Beacle公司商品目录编号：BCL-DC-002)。
使用包含疏水性肽链的粒子化体制备用融合蛋白的情况下，粒子化步骤可通过下述方式进行：使粒子化体制备用融合蛋白介由疏水性肽链缔合而进行粒子化之后，去除未被粒子化的突变型RSV F蛋白或其产物，对粒子化体进行纯化。
使用包含自缔合性蛋白结构域的粒子化体制备用融合蛋白的情况下，粒子化步骤可通过下述方式进行：使粒子化体制备用融合蛋白介由自缔合性蛋白结构域缔合而进行粒子化之后，去除未被粒子化的突变型RSV F蛋白或其产物，对粒子化体进行纯化。
本发明的粒子化体中，期望每1个粒子化体结合有例如按三聚体计为2个以上、优选10个以上、更优选20个以上。
另外，本发明的粒子化体中，期望每1nm2粒子化体表面积结合有例如按三聚体计为0.0001个以上、优选0.0005个以上、更优选0.001个以上。此处，粒子化体表面积是指将粒子化体假设为以利用动态光散射法测得的理论直径作为直径的球体时的表面积。每单位粒子化体表面积的个数可通过例如用每1粒子化体的个数除以粒子化体表面积的方法而算出。
生成粒子化体，选择对表位I的结合能力低、且对表位Φ的结合能力高的粒子化体，由此本领域技术人员可选择最优的每1粒子化体的个数、每1nm2粒子化体表面积的个数。
需要说明的是，本发明中，用于粒子化的RSV F蛋白或多聚体不限于本发明的突变型RSV F蛋白或多聚体，只要能够作为RSV疫苗而使用，则没有特别限制，也可使用除本发明的突变型RSV F蛋白以外的突变型RSV F蛋白、其多聚体。例如可以为国际公开第2017/172890号、国际公开第2017/109629号中记载的物质。即，本发明的粒子化技术可常规用于RSV F蛋白或其多聚体的粒子化，本发明的粒子化体包含RSV F蛋白或其多聚体的粒子化体，其是RSV F蛋白或其多聚体介由粒子化结构域聚集2个以上形成粒子而得的粒子化体，粒子化结构域、粒子化的方法可适用上述的突变型RSV F蛋白或多聚体的粒子化中进行说明的粒子化结构域、粒子化法。
(医药组合物)
本发明的另一方式为医药组合物，其包含前述表达单元或前述免疫原作为有效成分。
前述表达单元或前述免疫原可作为用于RS病毒感染症的预防或治疗的医药组合物。
另外，本发明的另一方式为RSV疫苗，其包含前述表达单元或前述免疫原。这也是前述方式的医药组合物为RSV疫苗的方式。
前述医药组合物(包含RSV疫苗，以下相同)的施予途径没有特别限定，可用非经口施予(例如，皮内、肌内、皮下、经皮、粘膜)、及经口施予中任一者的施予途径施予至哺乳动物。作为哺乳动物，可例示出人、小鼠、大鼠、兔、犬、猫、牛、猪、猴、黑猩猩等，优选人。
前述医药组合物的剂型及其制备方法是本领域技术人员已知的，可通过将前述表达单元或前述免疫原与药学上允许的担载体等配合而制备医药组合物。
所谓药学上允许的担载体，例如可举出固体制剂中的赋形剂、润滑剂、粘结剂及崩解剂、或液体制剂中的溶剂、助溶剂、混悬剂、等渗剂、缓冲剂及镇痛剂等。也可根据需要进一步适宜、适量地使用通常的防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂、吸附剂、润湿剂等添加剂。
医药组合物可以包含佐剂。作为佐剂，可例示出凝胶型、菌体型、油乳浊液型、高分子纳米粒子型、合成型、细胞因子型等。
作为凝胶型，可例示出氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙等。
作为菌体型，可例示出CpG、霍乱毒素、大肠杆菌热敏毒素、百日咳毒素、胞壁酰二肽(Muramyl dipeptide；MDP)等。
作为油乳浊液型，可例示出弗氏不完全佐剂、MF59、SAF等。
作为高分子纳米粒子型，可例示出免疫刺激复合物、脂质体、生物降解性微球、源自皂苷的QS-21等。
作为合成型，可例示出非离子性嵌段共聚物、胞壁酰肽(muramyl peptide)类似物、聚磷腈(polyphosphazene)、合成多核苷酸等。
作为细胞因子型，可例示出IFN-γ、IL-2、IL-12等。
用于非经口施予的剂型可例示出注射用制剂(例如，滴注剂、静脉注射剂、肌肉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、脑内施予制剂、椎管内施予制剂)、外用制剂(例如，软膏剂、巴布剂、洗剂(Lotion))、栓剂吸入剂、眼用制剂、眼软膏剂、滴鼻剂、滴耳剂、脂质体剂等。
用于经口施予的剂型可例示出固体或液体测定剂型，具体而言，片剂、包衣片剂、丸剂、细粒剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、糖浆剂、乳剂、悬浮剂、含片剂等。
本发明的医药组合物优选为液体的剂型，优选注射剂。
前述医药组合物的有效施予量可由医师以例如施予途径、疾病的种类、症状的程度、患者的年龄、性别、体重、疾病的重症度、药代动力学及毒理学特征等药理学见解、有无利用药物递送系统、以及是否作为与其他药物的组合的一部分而施予等各种因素为基础而确定。
实施例
以下记载了实施例，但任一实施例均不是作为限制性意义来解释的实施例。
〔实施例1〕
使用了半胱氨酸的共价键(二硫键)的形成对蛋白质的结构的稳定化是有用的。现有研究中报道了RSV F蛋白(以下有时称作“F蛋白”)中将pre-F结构稳定化的各种二硫键突变(国际公开第2017/172890号、国际公开第2017/109629号)，但由于将作为二级结构成员的氨基酸替换成半胱氨酸、或者在距离远的部分形成二硫键，因此得到的突变体成为与天然结构(可认为是天然型F蛋白在蛋白质表达时所呈的融合前结构)不同的结构的风险大。因此通过将不形成二级结构、且替换成半胱氨酸时的S原子间的距离小于
的氨基酸对替换成半胱氨酸来实施结构的稳定化。距离的计算中，使用已公开的结构模型(PDB登录号：4MMS)，将任意的2个氨基酸替换成半胱氨酸而产生二面角N-Ca-Cb-S在能量上稳定的构象，算出最短的S原子间的距离(表1)。其结果是，后述的抗原FH_08及FH_09中所含的突变型RSVF蛋白(本说明书中，有时称作“突变蛋白”)的突变点被列为候选。这2个候选由于突变点处的突变前的氨基酸侧链上没有具极性的官能团，因此可认为在没有因丧失天然型F蛋白中存在的极性基团间相互作用(氢键等)而导致结构变得不稳定的风险这一点上也是优异的。需要说明的是，表1中的“L141C”表示序列号1的氨基酸序列中的141位的亮氨酸突变成半胱氨酸。以下，表中使用同样的标记。需要说明的是，F_天然抗原的前体蛋白(序列号4)是在从A2株的天然型F0蛋白中去除了F1多肽的跨膜区与胞内区而得的多肽(序列号1的氨基酸编号1～513)中具有P102A、I379V及M447V的突变的多肽的C末端侧依次融合折叠子结构域(序列号21)、包含凝血酶识别序列、His标签及Strep标签II的序列(序列号22)而得的多肽。本实施例中所有突变体均是以F_天然抗原的前体蛋白为基础制作的，因此具有P102A、I379V及M447V的突变。需要说明的是，F_天然前体蛋白在表达过程中受到加工，信号肽和pep27区域脱落。
[表1]
上述F_天然抗原是以哺乳类细胞为宿主表达编码F_天然抗原的前体蛋白(序列号4)的多核苷酸(序列号5)而制备的。F_天然抗原是F_天然抗原的前体蛋白(序列号4)受到表达过程的加工之后形成四级结构而得的。可以预测，通过加工，信号肽和pep27区域脱落，剩下的F2多肽序列与F1多肽(胞外区)、折叠子结构域、包含凝血酶识别序列、His标签、Strep-Tag II的序列通过二硫键结合，进而主要基于折叠子结构域产生的结合力而形成同源三聚体。
以下示出F天然抗原的具体的制备方法。利用标准的基因工程技术将上述多核苷酸(序列号5)插入pcDNA3.4载体(Thermo Fisher Scientific公司)。通过碱基序列分析来确认已插入目标DNA序列，构建表达F_天然抗原的前体蛋白的哺乳类细胞用表达载体。利用标准的质粒载体纯化方法对用于导入至细胞的载体进行纯化。
F_天然抗原的表达通过使用了Expi293 Expression System(Thermo FisherScientific公司)的哺乳类细胞分泌表达来实施。使用作为同试剂盒的基因导入试剂的Expi Fectamin 293Reagent将经纯化的上述载体导入至Expi293细胞，进行5天左右培养，从而分泌表达编码的F_天然抗原，使用离心分离及孔径0.22μm的过滤器仅获取上清液成分。
F_天然抗原的纯化可通过使用了镍-琼脂糖凝胶HP(Ni Sepharose HighPerformance)(GE Healthcare公司)的亲和层析来实施。使Ni担载体与用结合缓冲液(20mmol/L Tris-HCl pH7.4,500mmol/L NaCl,20mmol/L咪唑)对上述培养上清液成分进行约3倍左右稀释而得的物质彻夜反应之后，供于洗脱缓冲液(20mmol/L Tris-HCl pH7.4,500mmol/L NaCl,500mmol/L咪唑)使各抗原洗脱。然后，使用超滤膜来将溶剂置换成PBS(pH7.4)，作为F_天然抗原使用。
与上述同样地准备编码抗原FH_08的前体蛋白的多核苷酸，前述FH_08的前体蛋白是在F_天然抗原的前体蛋白中导入L141C和L373C的双重突变而得的。另外，与上述同样地准备编码抗原FH_09的前体蛋白的多核苷酸，前述抗原FH_09的前体蛋白是在F_天然抗原的前体蛋白中导入L142C和L373C的双重突变而得的。用上述的方法表达、纯化这些前体蛋白，制备抗原FH_08、及FH_09。
各抗原对各抗体的结合性使用Octet QK384(ForteBio公司)、在PBS(pH7.4)、25℃、1000rpm的条件下进行测定。将各抗体溶液供给于用PBS(pH7.4)平衡化的蛋白A传感器芯片(ForteBio公司)180sec，从而使各抗体结合于传感器芯片，然后将供给各抗原溶液180sec时的检测值的上升量作为各抗原针对各抗体的结合信号的值。供给至传感器芯片的抗体使用了能够特异性检测表位Φ的D25抗体。结合信号的值通过求出与使用了能够不依赖于F抗原的构象变化而进行结合的帕利珠单抗(Palivizumab)(Synagis肌肉注射液、艾伯维)时的结合信号的值之比来进行标准化。
通过以上操作，得到下述结果：显示包含在2处导入半胱氨酸点突变以形成二硫键的突变蛋白的抗原FH_08及FH_09与包含该突变导入前的F蛋白的F_天然抗原相比，表位Φ的保守性显著提高(图1)。
〔实施例2〕
已报道了天然型F蛋白首先受到第1弗林蛋白酶识别位点的切割而形成单体结构，然后受到第2弗林蛋白酶识别位点的切割而使pep27区域消失，从而促进三聚体化(AndersKrarup等，2015.Nature communications 6:8143)。然而，认为在从自然中分离的病毒株间，pep27区域的序列长度及氨基酸的种类高度保守，因此其反而可能会对抗原的立体结构形成具有不可欠缺的效果。因此，决定在第2弗林蛋白酶识别位点导入突变以抑制pep27区域的切割，并研究该突变对三聚体形成的效果。下述中制作的各抗原的前体蛋白的突变内容归纳于表2中。表2中的“FH_08+R135N,R136N”表示在抗原FH_08的前体蛋白中，进一步地，序列号1的氨基酸序列中的135位的精氨酸突变成天冬酰胺、且136位的精氨酸突变成天冬酰胺。“FH_09+R135N,R136N”表示在抗原FH_09的前体蛋白中，进一步地，序列号1的氨基酸序列中的135位的精氨酸突变成天冬酰胺、且136位的精氨酸突变成天冬酰胺。需要说明的是，抗原FH23～25中，将抗原FH08的前体蛋白中的pep27(p27)序列取代成各种GS接头。GS接头使用了GSGSGS(序列号18)、(GGGGS)2(序列号19)、(GGGGS)3(序列号20)。
[表2]
利用标准的基因工程技术将编码上述各抗原的前体蛋白的多核苷酸插入pcDNA3.4载体(Thermo Fisher Scientific公司)。通过碱基序列分析来确认已插入目标DNA序列，构建表达各抗原的前体蛋白的各哺乳类细胞用表达载体。利用标准的质粒载体纯化方法对用于导入至细胞的载体进行纯化。
各抗原的表达及纯化以与实施例1同样的操作来实施。
各抗原对各抗体的结合性与也以与实施例1同样的操作来测定，但作为供给至传感器芯片的抗体，追加能够检测pre-F的三聚体形成的AM14抗体。D25抗体及AM14抗体的结合信号的值通过求出与使用了能够不依赖于F抗原的构象变化而进行结合的Synagis抗体(艾伯维、Synagis肌肉注射液)时的结合信号的值之比来进行标准化。
通过以上操作，得到下述结果：显示包含在第2弗林蛋白酶识别位点追加突变而得的突变蛋白的抗原FH_21、FH_24、FH_25与追加突变前的抗原FH_08相比，以保持表位Φ的保守性的状态，三聚体的形成提高。其中，与将pep27区域取代成人造接头的抗原(FH_24，FH_25)相比，更接近F_天然抗原的pep27区域的抗原FH_21的三聚体形成显著提高(图2、图3)。
〔实施例3〕
F_天然抗原的前体蛋白的189位与190位的氨基酸为苏氨酸和丝氨酸，鉴于在侧链具有羟基这一点，为亲水性氨基酸。然而，存在于189～190位的氨基酸的立体结构上的近端的氨基酸为57位的异亮氨酸、167位的异亮氨酸、171位的亮氨酸、179位的缬氨酸、260位的亮氨酸等，它们均为疏水性氨基酸，因此认为可能会损害结构的稳定性。为此，考虑了通过使189～190位的氨基酸突变成疏水性氨基酸(缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)来使结构稳定化、有助于提高表达量的可能性。下述中制作的各抗原的前体蛋白的突变内容归纳于表3中。表3中的“FH_21+T189I”表示在抗原FH_21的前体蛋白中，进一步地，序列号1的氨基酸序列中的189位的苏氨酸突变成异亮氨酸。“FH_21+T189V”表示在抗原FH_21的前体蛋白中，进一步地，序列号1的氨基酸序列中的189位的苏氨酸突变成缬氨酸。“FH_21+T189I,S190V”表示在抗原FH_21的前体蛋白中，进一步地，序列号1的氨基酸序列中的189位的苏氨酸突变成异亮氨酸、190位的丝氨酸突变成缬氨酸。“FH_21+T189L,S190V”表示在抗原FH_21的前体蛋白中，进一步地，序列号1的氨基酸序列中的189位的苏氨酸突变成亮氨酸、190位的丝氨酸突变成缬氨酸。“FH_21+T189V,S190V”表示在抗原FH_21的前体蛋白中，进一步地，序列号1的氨基酸序列中的189位的苏氨酸突变成缬氨酸、190位的丝氨酸突变成缬氨酸。“FH_50+K42R,V384T”表示在抗原FH_50的前体蛋白中，进一步地，序列号1的氨基酸序列中的42位的赖氨酸突变成精氨酸、384位的缬氨酸突变成苏氨酸。进一步地，提取天然的病毒分离株中发生的点突变，分别进行各个突变的研究，结果观察到基于2个点突变(K42R，V384T)提高表达量的效果，因此决定也一并导入该突变进行研究。
[表3]
利用标准的基因工程技术将编码上述各抗原的前体蛋白的多核苷酸插入pcDNA3.4载体(Thermo Fisher Scientific公司)。通过碱基序列分析来确认已插入目标DNA序列，构建表达各抗原的前体蛋白的各哺乳类细胞用表达载体。利用标准的质粒载体纯化方法对用于导入至细胞的载体进行纯化。
各抗原的表达及纯化以与实施例2同样的操作来实施。
各抗原的表达量通过使用了标准的分光光度计的吸光度测定来进行测定。使用纯化后的抗原溶液的吸光度(280nm)A280、由氨基酸一级序列信息推算的摩尔吸光系数ε和分子量M、纯化后的抗原溶液量Vp、表达培养液量Vc，算出每单位表达培养体积的表达量y(y＝A280xM/εxVp/Vc)。
各抗原对D25抗体及AM14抗体的结合性以与实施例2同样的操作来测定。
通过以上操作，得到下述结果：显示追加189～190位向疏水性氨基酸(V、I、L)的突变而得的各抗原FH_50、FH_51、FH_52、FH_53、FH_55与追加突变前的抗原FH_21相比，以保持表位Φ的保守性和三聚体的形成的状态，表达量显著提高。还得到下述结果：显示追加从自然界的病毒中可能发生的天然突变中提取的2个点突变(K42R、V384T)而得的抗原FH_82以保持表位Φ的保守性和三聚体的形成的状态，表达量进一步显著提高(图4、图5、图6)。
〔实施例4〕
已知F_天然的前体蛋白的60位的氨基酸为谷氨酸，属于酸性氨基酸，因此通常在溶剂为中性的条件下带负电荷。认为该氨基酸在立体结构上与同样在中性条件下带负电荷的194位的天冬氨酸邻接，可能由于负电荷的接近而使结构变得不稳定。因此决定在F_天然的前体蛋白的氨基酸序列中，实施将60位的氨基酸变更为除酸性氨基酸以外的氨基酸的突变。其中，将60位的氨基酸变更为天冬酰胺时，为了避免使60～62位的氨基酸成为通常已知的N型糖链结合基序(Asn-X-Ser/Thr)，同时将62位的氨基酸由丝氨酸变更为丙氨酸。下述中制作的抗原的前体蛋白的突变内容归纳于表4。
[表4]
利用标准的基因工程技术将编码上述各抗原的前体蛋白的多核苷酸插入pcDNA3.4载体(Thermo Fisher Scientific公司)。通过碱基序列分析来确认已插入目标DNA序列，构建表达各抗原的前体蛋白的各哺乳类细胞用表达载体。利用标准的质粒载体纯化方法对用于导入至细胞的载体进行纯化。
各抗原的表达及纯化以与实施例2同样的操作来实施。
各抗原对D25抗体及AM14抗体的结合性以与实施例2同样的操作来测定。
通过以上操作，得到下述结果：显示将60位变更为M、F、L、S、T时，表位Φ的保守性和三聚体的形成提高(图7、图8)。
〔实施例5〕与现有产品的比较
作为使F抗原的pre-F稳定化的技术而最多报道的突变之一，有DS-Cav1突变(S155C、S290C、S190F、V207L)(Jason S.McLellan等，2013.Science 342:592)。因此，对前述的实施例中发现的有用的抗原FH_50及抗原FH_50中进一步导入有用的突变而得的表5中记载的抗原、与导入DS-Cav1突变而得的抗原F_DS-Cav1进行比较。另外，也一并制作已知形成post-F三聚体结构的抗原ΔFP furinwtFecto(Kurt A.Swanson等，2014.Journal ofVirology.88(20):11802)，用于抗原的评价。将下述中制作的抗原的前体蛋白的突变内容归纳于表5。抗原FH_81～85的前体蛋白是在抗原FH_50的前体蛋白中分别导入E60M、K42R+V384T或E60M+K42R+V384T的突变而得的。
[表5]
利用标准的基因工程技术将编码上述各抗原的前体蛋白的多核苷酸插入pcDNA3.4载体(Thermo Fisher Scientific公司)。抗原F_DS-Cav1的前体蛋白设为由序列号23形成的氨基酸序列，ΔFP furinwt Fecto的前体蛋白设为由序列号24形成的氨基酸序列。通过碱基序列分析来确认已插入目标DNA序列，构建表达各抗原的前体蛋白的各哺乳类细胞用表达载体。利用标准的质粒载体纯化方法对用于导入至细胞的载体进行纯化。
各抗原的表达及纯化以与实施例2同样的操作来实施。
各抗原的表达量以与实施例3同样的操作来实施。
(抗体结合性试验)
各抗原对各抗体的结合性以与实施例2同样的操作来测定，作为供给至传感器芯片的抗体，追加识别表位I的131-2A抗体。D25抗体、AM14抗体及131-2A抗体的结合信号的值通过求出与使用了能够不依赖于F抗原的构象变化而进行结合的Synagis抗体(艾伯维、Synagis肌肉注射液)时的结合信号的值之比来进行标准化。
通过以上操作，得到下述结果：显示抗原FH_50、FH_81、FH_82、FH_85与现有文献的抗原F_DS-Cav1相比，表位Φ的保守性和三聚体的形成变化不大，而另一方面，不太能检测到已知诱导病毒感染中和能力显著较低的抗体的表位I(图9、图10、图11)。这暗示了，虽然疫苗存在由于激活几乎无助于病毒中和的免疫细胞反而使症状恶化的风险，但新发现的突变的导入与DS-Cav1突变的导入相比，其风险较低。
(人血清中的病毒中和抗体的吸附试验)
通过先前的操作，显示抗原FH_50、FH_81、FH_82、FH_85可能具有抑制无助于病毒中和的免疫的诱导的效果。为了进一步详细研究该效果，使用健康成人血清，针对抗原FH_50、FH_81、FH_82、FH_85及F_DS-Cav1，就与健康成人血清中的何种抗体结合进行了研究。
针对3人份的健康成人血清，实施使用了磁珠Dynabeads His-Tag Isolation andPulldown(Thermo Fisher Scientific,10103D)的抗原吸附操作。首先，将20μg的抗原F_DS-Cav1、FH_50、FH_81、FH_82或FH_85供给至用PBS(pH7.4)洗涤了2次的、珠液45μL份量的珠子并使其结合后，用牛血清白蛋白封闭。接着向用PBS(pH7.4)对各健康成人血清100μL进行10倍稀释而得的物质添加珠子进行孵育(4℃、1小时、旋转)后，取出珠子，由此实施结合于抗原的抗体的去除。
为了确认结合于Post-F的抗体(被认为病毒感染中和能力比较低的抗体)以何种程度进行了结合，实施将抗原ΔFP furinwt Fecto固相化的ELISA试验。抗原结合缓冲液使用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(Carbonate-Bicarbonate Buffer)(Sigma-Aldrich,C3041-50CAP)，样品的稀释及培养板的洗涤使用TBS(TaKaRa,T9142)。向96半孔板添加2.0pmol的抗原ΔFP furinwt Fecto添加直接进行固相化，用牛血清白蛋白封闭。向健康成人血清或抗原吸附操作后的健康成人血清适当地添加缓冲液，从而制作4倍稀释系列，添加于培养板中进行孵育(室温、1小时、静置)。然后去除稀释血清，使过氧化物酶结合抗人IgG抗体(Jackson Immuno Research,709-035-149)结合，进一步用标准的过氧化物酶检测试剂显色后，用利用标准的微孔板检测仪进行的吸光度测定来求出显色的强度。测定点间进行分段线性插值从而求出血清的稀释率与吸光度的关系，将吸光度成为0.2的稀释率的倒数作为结合于Post-F的抗体的抗体效价，将吸附操作前的血清的抗体效价设为100％时的吸附操作后的血清的抗体效价的减少量的相对值作为吸附率(图12)。
为了确认通过吸附操作以何种程度去除了具有病毒感染中和能力的抗体，实施使用了RS病毒(ATCC,VR-1540)及Vero细胞(ATCC,CCL-81)的感染评价。向健康成人血清或抗原吸附操作后的健康成人血清适当地添加PBS(pH7.4)，从而制作5倍稀释系列，将RS病毒混合并进行孵育(室温、30分钟、静置)后，在96孔板的各孔中以4×104细胞量接种，添加进行了1天培养的Vero细胞，进行孵育(37℃、湿度、2小时、静置)。然后，去除病毒液后，每1孔中添加100μL的下述培养基，继续进行孵育(37℃、湿度、16小时、静置)，所述培养基是在DMEM,高葡萄糖(Thermo Fisher Scientific,11965)中添加各为1％(v/v)的丙酮酸钠溶液(Nacalai、06977-34)及抗菌-抗真菌剂混合原液(Antibiotic-Antimycotic Mixed StockSolution)(Nacalai、09366-44)而得的。接着，用多聚甲醛固定细胞，对于已用Triton X-100(Nacalai、35501-15)进行了透过处理的细胞，使用抗-RSV抗体，融合蛋白，所有A型、B型毒株，克隆133-1H，Alexa Fluor 488(Merck,MAB8262X)及Heochst33258(Dojindo,343-07961)对感染细胞及全部细胞的核进行染色，使用成像仪IN Cell Analyzer(GEHealthcare公司)对感染细胞区域中的核的数量进行计数，作为病毒感染细胞数。各血清的稀释率x与感染数y的关系通过以S形曲线(y＝Ymax/(1+(x/IC50)C))来对实验结果进行拟合(基于最小平方误差法适用)而求出，将IC50的倒数作为病毒感染中和效价。将吸附操作前的血清的病毒感染中和效价设为100％时的吸附操作后的病毒感染中和效价的减少量的相对值作为吸附率(图13)。
通过以上操作，显示抗原FH_50、FH_81、FH_82、FH_85与现有文献的抗原F_DS-Cav1相比，存在于健康成人血清中的post-F识别抗体的结合性低，吸附操作中只能结合一半左右的抗体。尽管如此，还显示对于有助于病毒感染中和能力的抗体，与F_DS-Cav1同样地几乎全部进行了结合，吸附操作中剩余的抗体几乎没有病毒感染中和能力。以上的结果暗示了，新发现的突变与DS-Cav1突变的导入相比，对病毒感染中和没有效果的抗体的结合少，作为疫苗抗原使用时，诱导无助于病毒感染防御的抗体的风险低。
(以小鼠免疫诱导的抗体的验证)
通过先前的操作，暗示了突变蛋白具有抑制无助于病毒中和的免疫的诱导的效果。为了进一步详细研究该效果，实施通过用抗原FH_50、FH_81、FH_82、FH_85或F_DS-Cav1对小鼠进行免疫而诱导的抗体的分析。
小鼠免疫血清通过用各突变蛋白对BALB/cAnNCrlCrlj(Charles RiverLaboratories Japan,Inc.)(雌性、7周龄)进行免疫而获取。将溶解于PBS(pH7.4)的抗原FH_50、FH_81、FH_82、FH_85或F_DS-Cav1(抗原浓度：0.80mg/mL)与氢氧化铝(InvivoGen,vac-alu-250)各自以等量充分混合，将得到的液体于饲养第0天及饲养第21天以50μL肌内施予至小鼠的后肢大腿部(每1组设为5只)。饲养第42天，从后大静脉获取血液，获取的血液在进行孵育(室温、约2小时、静置)后进行离心分离，回收血清，进行灭活(55℃、30min)，制成小鼠免疫血清。
为了确认以何种程度的比例诱导了与融合后构象结合的抗体，针对各小鼠免疫血清，实施使用了磁珠Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown(Thermo FisherScientific,10103D)的抗原吸附操作。首先，将20μg的ΔFP furinwt Fecto供给至用PBS(pH7.4)洗涤了2次的、珠液45μL份量的珠子并使其结合后，用牛血清白蛋白封闭。接着向用PBS(pH7.4)对各小鼠免疫血清50μL进行20倍稀释而得的物质添加珠子并进行孵育(4℃、1小时、旋转)后，取出珠子，由此实施结合于抗原的抗体的去除。
接着，实施将抗原F_DS-Cav1固相化的ELISA试验，对抗原吸附操作导致的抗F抗原抗体的减少率进行测定。抗原结合缓冲液使用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(Sigma-Aldrich,C3041-50CAP)，样品的稀释及培养板的洗涤使用PBS(TaKaRa,T9183)。向96半孔板添加2.0pmol的抗原F_DS-Cav1直接进行固相化，用牛血清白蛋白封闭。向小鼠免疫血清或抗原吸附操作后的小鼠免疫血清适当地添加缓冲液，从而制作5倍稀释系列，添加于培养板中进行孵育(室温、2小时)。然后去除稀释血清，使过氧化物酶结合抗小鼠抗体抗体(DaKo,P0161)结合，进一步用标准的过氧化物酶检测试剂显色后，用利用标准的微孔板检测仪进行的吸光度测定来求出显色的强度。测定点间进行分段线性插值从而求出血清的稀释率与吸光度的关系，将吸光度成为0.2的稀释率的倒数作为所检测的抗F抗原抗体的抗体效价，将吸附操作前的血清的抗体效价设为100％时的吸附操作后的血清的抗体效价的减少量的相对值作为吸附率(图14)。
通过以上操作，显示抗原FH_50、FH_81、FH_82、FH_85与现有文献的抗原F_DS-Cav1相比，post-F识别抗体的诱导比例少。即结果暗示了，将抗原FH_50、FH_81、FH_82、FH_85用作疫苗抗原的情况下，诱导无助于病毒感染防御的抗体的风险低。
〔实施例6〕与现有产品的比较2
实施例5中实施的抗原FH_50、FH_81、FH_82、FH_85的F蛋白部分均包含L141C及L373C的突变。该突变为实施例1中为导入二硫键而导入的突变，现有专利(国际公开第2017/109629号)中研究了向比较接近的位点导入二硫键(Mutant ID:pXCS524.L142C、N371C)，还研究了加入了突变的优化抗原(Mutant ID:pXCS881.L142C、N371C、S55C、L188C、T54H、V296I、D486S、E487Q、D489S)。因此，决定对前述的实施例中发现的有用的抗原与导入pXCS524突变或pXCS881突变而得的抗原Pf524或Pf881进行比较。将下述中制作的抗原的前体蛋白的突变内容归纳于表6。
[表6]
抗原FH_08、FH_82、及FH85分别使用实施例1、实施例3、及实施例5中记载的抗原。对于Pf524及Pf881，利用标准的基因工程技术将编码它们的前体蛋白的多核苷酸插入pcDNA3.4载体(Thermo Fisher Scientific公司)，通过碱基序列分析来确认已插入目标DNA序列，构建表达各抗原的前体蛋白的各哺乳类细胞用表达载体。利用标准的质粒载体纯化方法对用于导入至细胞的载体进行纯化。
各抗原的表达及纯化以与实施例2同样的操作来实施。
各抗原的表达量以与实施例3同样的操作来测定。
(抗体结合性试验)
各抗原对各抗体的结合性以与实施例5同样的操作来测定，结合信号的值设为从供给各抗原溶液180sec时的检测值中减去供给PBS(pH7.4)180sec时的检测值而得的值(图15、图16、图17)。
通过以上操作，得到下述结果：显示抗原FH_08与导入了现有专利的突变的抗原Pf524相比，表位Φ的保守性和三聚体的形成优异，另一方面，不太能检测到已知诱导病毒感染中和能力显著较低的抗体的表位I。还得到下述结果：显示经优化的抗原FH_82、FH_85与同样经优化的导入了现有专利的突变的抗原Pf881相比，表位Φ的保守性和三聚体的形成优异，另一方面，不太能检测到已知诱导病毒感染中和能力显著较低的抗体的表位I。这暗示了，上述实施例中发现的有用的二硫键的导入突变与现有专利中的二硫键的导入突变(L142C、N371C)相比，是优先诱导被认为对病毒中和具有较高效果的抗体组的突变。
(以小鼠免疫诱导的抗体的验证)
通过上述实验，暗示了，抗原FH_82、FH_85具有无助于病毒中和的免疫的诱导与导入了现有专利的突变的突变体Pf881相比更低的效果。为了进一步详细研究该效果，实施通过用抗原FH_82、FH_85或Pf881对小鼠进行免疫而诱导的抗体的分析。
诱导抗体的分析以与实施例5同样的操作来实施，对基于ΔFP furinwt Fecto的吸附操作而得到的抗体效价的吸附率进行测定(图18)。
通过以上操作，显示抗原FH_82、FH_85与导入了现有专利的突变的抗原Pf881相比，post-F识别抗体的诱导比例少。即结果暗示了，将抗原FH_82、FH_85用作疫苗抗原的情况下，即使与Pf881比较，也优先诱导被认为对病毒中和具有较高效果的抗体组。
〔实施例7〕使用了支架粒子的抗原的粒子化
可以认为，为了进一步降低诱导无助于病毒感染防御的抗体的风险，通过空间位阻效应来降低抗体、各种免疫细胞对被表位I识别抗体等post-F识别抗体识别的抗原部位的可及性是有效的。因此，认为通过以post-F识别抗体的识别位点处于内侧的方式使抗原固定于适宜的支架粒子上，可能能够得到该空间位阻效应。
然而，认为将抗原呈递至适宜的支架粒子上时，若抗原的间隔长于一定长度而使得密度稀疏、或者在支架粒子与抗原之间导入了一定以上的长度的柔性接头，则可能无法得到前述的空间位阻效应。因此，决定使用被认为能够实现较高密度的抗原呈递的HBsAgVLP，对多种长度的GS接头进行研究。
(粒子化抗原的制备)
作为支架粒子，使用能够结合Fc融合蛋白的Bionanocapsule-ZZ(Beacle公司、BCL-DC-002)。
作为抗原的前体蛋白，制作将前述的F_DS-Cav1、FH_82、FH_85的前体蛋白中的包含凝血酶识别序列、His标签、Strep-Tag II的序列(序列号22)取代成Fc序列(序列号30)而得的抗原F_DS-Cav1-Fc的前体蛋白(序列号31)、FH_82-Fc的前体蛋白(序列号32)、FH_85-Fc的前体蛋白(序列号33)。此外，对于抗原F_DS-Cav1-Fc的前体蛋白、FH_85-Fc的前体蛋白，在紧接Fc序列之前插入GS接头(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(序列号75)、GGGGSGGGGS(序列号19)或者GGGGS(序列号27))而得的序列，是以对应的前体蛋白(序列号34～39)为基础用以下方法而制作的。
利用标准的基因工程技术将编码上述各前体蛋白的多核苷酸插入pcDNA3.4载体(Thermo Fisher Scientific公司)。通过碱基序列分析来确认已插入目标DNA序列，构建表达各抗原的前体蛋白的各哺乳类细胞用表达载体。利用标准的质粒载体纯化方法对用于导入至细胞的载体进行纯化。
各抗原的前体蛋白的表达通过使用了Expi293 Expression System(ThermoFisher Scientific公司)的哺乳类细胞分泌表达来实施。使用作为同试剂盒的基因导入试剂的Expi Fectamin 293Reagent将经纯化的各载体入至Expi293细胞，进行4～5天左右培养，从而分泌表达编码的各抗原，使用离心分离及孔径0.22μm的过滤器仅获取上清液成分。
各抗原的纯化通过使用了蛋白A纯化柱的标准的亲和纯化法来实施。纯化后通过使用超滤膜来将溶剂置换成PBS(pH7.4)。
制作的各抗原以每1粒子的HBsAg VLP平均为约135分子(形成三聚体则为约45分子)的比率与HBsAg VLP混合，于室温静置1小时，从而固定化于支架粒子。此时，通过进行Blue Native PAGE，确认到几乎不存在未固定化的抗原。
将本实施例中用于评价的抗原、及该抗原固定化于支架粒子而得的粒子化体(以下有时称作“粒子化抗原”)归纳于表7。
[表7]
(抗体结合性试验)
抗原或粒子化抗原F_DS-Cav1、F_DS-Cav1-VLP、FH_82、FH_82-VLP、FH_85及FH_85-VLP对各抗体的结合性以与实施例6同样的操作来测定(图19、图20、图21)。
通过以上操作，显示不依赖于F抗原区域的pre稳定化方法(用于pre稳定化的氨基酸突变的内容)、将pre-F介由添加于其氨基酸序列的C末端的结构域而固定化于支架粒子时，以保持抗体对表位Φ的结合性的状态，三聚体的形成提高。还显示了已知诱导病毒感染中和能力显著较低的抗体的表位I的检测值减弱。以上的结果暗示了，将本粒子化抗原用作疫苗抗原时，优先诱导被认为对病毒中和具有较高效果的抗体组。
(插入接头的研究)
抗原或粒子化抗原F_DS-Cav1、F_DS-Cav1-4GS-VLP、F_DS-Cav1-2GS-VLP、F_DS-Cav1-1GS-VLP、F_DS-Cav1-VLP、FH_85、FH_85-4GS-VLP、FH_85-2GS-VLP、FH_85-1GS-VLP及FH_85-VLP对各抗体的结合性以与实施例6同样的操作来测定(图22、图23、图24)。
通过以上操作，显示实施的任何GS接头的插入均具有下述效果：以保持抗体对表位Φ的结合性的状态，提高三聚体的形成，表位I的检测值降低。其中，显示若在支架粒子与抗原之间插入过长的GS接头，则表位I检测减弱的效果会降低。具体而言，若为GGGGSGGGGS(序列号19)水平的长度，则不会观察到显著的影响，但若为更长的GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(序列号75)的长度，则观察到使表位I检测减弱的效果降低。
以上的结果暗示了，若在支架粒子与抗原之间插入一定以上的长度的柔性接头，则通过空间位阻效应来降低对post-F识别抗体的识别位点的可及性的效果会减弱。
(抗原密度的估算)
通过使用了ZetasizerμV(Malvern)的动态光散射法来估算粒子化抗原FH_85-VLP的理论直径，结果为89.28nm(图25)。由于呈递每1粒子平均约135分子(三聚体约45分子)，因此每1nm2理论表面积的平均分子密度可计算为约0.005分子(按三聚体计约0.0018分子)。需要说明的是，此处，球体的表面积S使用其半径r通过以下公式而求出。
S＝4πr2
即暗示了，只要为通过动态光散射法而估算的理论表面积每1nm2存在最低约0.005分子以上的抗原分子的水平的密度，即可实现目标空间位阻效应。
DS-Cav1-VLP及FH_82-VLP也为同样的结果(图25)。
(以小鼠免疫诱导的抗体的验证)
通过上述实验，暗示了结合于支架粒子HBsAg VLP的pre-F抗原具有抑制无助于病毒中和的免疫的诱导的效果。为了进一步详细研究该效果，实施通过用F_DS-Cav1、F_DS-Cav1-VLP、FH_82、FH_82-VLP、FH_85或FH_85-VLP对小鼠进行免疫而诱导的抗体的分析。
小鼠免疫血清通过用各粒子化抗原对BALB/c(雌性、5～8周龄)进行免疫而获取。作为各粒子化抗原的溶剂组成，使用将PBS或PBS与氢氧化铝(InvivoGen、vac-alu-250)各自以等量充分混合而得的液体。以约3周间隔将抗原2次肌内施予至小鼠的后肢大腿部，在第2次的施予后的约3周后获取血液。获取的血液于室温进行孵育后，进行离心分离，回收血清。
为了确认血清中以何种程度诱导结合于pre-F或者Post-F的抗体，实施将各构象的抗原固相化的ELISA试验。
另外，为了算出post-F识别抗体的诱导比例，实施抗原吸附操作及基于抗原吸附操作的抗原识别抗体的减少率的测定。方法以实施例5中示出的方法为基准。
作为结论，确认到通过该粒子化，优先诱导被认为对病毒中和具有较高效果的抗体组的效果。
〔实施例8〕使用了疏水性肽链的抗原的粒子化
认为即使通过不使用支架粒子的方法，也可能实现实施例7中示出的通过空间位阻效应来降低抗体、各种免疫细胞对被post-F识别抗体识别的抗原部位的可及性的效果。因此，本实施例中，对使用了疏水性肽链(包含疏水性的氨基酸的多肽链)的疏水聚集引起的粒子化进行研究。
(疏水性肽链的研究)
所使用的疏水性肽链需要具有在疫苗制剂或者生物体内的条件下进行疏水聚集的性质，但显著降低基于细胞的抗原的分泌表达效率的序列很难用于实际使用。已知通常将富含疏水性氨基酸的多肽链融合于蛋白质的情况下，该蛋白质在细胞中的产生效率会降低，因此，对适宜的疏水性多肽链进行研究。
以将前述抗原F_DS-Cav1的前体蛋白中的包含凝血酶识别序列、His标签、Strep-Tag II的序列(序列号22)取代成包含各种疏水性肽链(序列号40～43)及作为纯化用标签的FLAG标签的序列(序列号44～47)的前体蛋白为基础，制作抗原。将研究的疏水性肽序列归纳于表8-1。
利用标准的基因工程技术将编码上述各前体蛋白的多核苷酸插入pcDNA3.4载体(Thermo Fisher Scientific公司)。通过碱基序列分析来确认已插入目标DNA序列，构建表达各前体蛋白的各哺乳类细胞用表达载体。利用标准的质粒载体纯化方法对用于导入至细胞的载体进行纯化。
各抗原的表达以与实施例7同样的操作来实施。
各抗原的纯化通过使用了ANTI-FLAG M2 Affinity Gel(Sigma，A2220)的亲和纯化来实施。亲和纯化的洗脱使用FLAG肽，通过使用超滤膜从而进行各抗原样品中的FLAG肽的去除。溶剂使用PBS(pH7.4)。
对于是否可分泌表达抗原，可通过在纯化后是否能够使用通常的SDS-PAGE以高纯度分离纯化目标蛋白来进行确认。另外，对于是否可粒子化，可通过在纯化后进行通常的BlueNativePAGE来确认。
[表8-1]
注)
为疏水性强的氨基酸
对F_DS-Cav1-CC02及F_DS-Cav1-CC03是否可分泌表达、及是否可粒子化进行了研究，结果，虽然F_DS-Cav1-CC03分泌表达，但是未发生粒子化，另一方面，可知F_DS-Cav1-CC02的分泌表达进行得并不顺利(图26)。因此，可认为所使用的疏水性肽链的最优的疏水度介于两者的疏水度之间。
F_DS-Cav1-CC02与F_DS-Cav1-CC03的疏水性肽链在作为非亲水性氨基酸的丙氨酸被替换成作为亲水性氨基酸的赖氨酸或者谷氨酸这一点不同。因此，考虑首先将F_DS-Cav1-CC02的丙氨酸变更为具有中等程度的亲水性、pK为pH6左右的组氨酸。已知制剂时的溶剂的pH在中性附近，相对于此，细胞的分泌途径中的pH为更低的pH，因此可期待包含组氨酸的肽链在分泌表达时成为比较亲水的性质，在制剂时成为比较疏水的性质。
另外，若假设所设计的疏水性肽链形成卷曲螺旋结构，则可预期直接连接于折叠子结构域正下方的疏水性肽链的21个的氨基酸的相位依次为defgabcdefgabcdefgabc。将亮氨酸与异亮氨酸配置于三聚体中发生疏水相互作用的a、d位的情况下，根据研究了天然蛋白的氨基酸序列的现有研究(Joel P Schneider等，1998.Folding&Design.3:R29)，将异亮氨酸配置于a位、将亮氨酸配置于d位频率更高，因此考虑将F_DS-Cav1-CC02的a位与d位的亮氨酸、异亮氨酸互换。
根据以上内容，重新设计F_DS-Cav1-CC07，研究是否可分泌表达及是否可粒子化，结果实现了分泌表达与粒子化这两者(图27)。由于变更了组氨酸、赖氨酸、谷氨酸的位置而得的F_DS-Cav1-CC08难以分泌表达，因此暗示了这并非仅是单纯的氨基酸的组成的问题，立体结构上的配置也是重要的。
[化学式1]
(引用自Folding&Design 1998，3：R29)
(粒子化抗原的制备)
以将前述抗原FH_82及FH_85的前体蛋白中的包含凝血酶识别序列、His标签、Strep标签II的序列(序列号22)取代成包含最优的疏水性肽链(序列号42)及由作为纯化用标签的FLAG标签的序列而得的前体蛋白(序列号48、49)为基础，制作抗原。
利用标准的基因工程技术将编码上述前体蛋白的多核苷酸插入pcDNA3.4载体(Thermo Fisher Scientific公司)。通过碱基序列分析来确认已插入目标DNA序列，构建表达各前体蛋白的各哺乳类细胞用表达载体。利用标准的质粒载体纯化方法对用于导入至细胞的载体进行纯化。
各抗原的表达以与疏水性肽链的研究同样的操作来实施。
各抗原的纯化以与疏水性肽链的研究同样的操作来实施。
将本实施例中后续评价中使用的抗原(有时称作“粒子化抗原”)归纳于表8-2。
[表8-2]
(抗体结合性试验)
制作的各粒子化抗原对各抗体的结合性以与实施例6同样的操作来测定(图28、图29、图30)。
通过以上操作，得到下述结果：显示对于不依赖于F抗原区域的pre稳定化方法(用于pre稳定化的氨基酸突变的内容)、使pre-F介由添加于其氨基酸序列的C末端的疏水性肽链聚集得到的粒子化抗原而言，以保持抗体对表位Φ的结合性的状态，三聚体的形成提高。还得到下述结果：显示已知诱导病毒感染中和能力显著较低的抗体的表位I的检测减弱。以上的结果暗示了，将本抗原用作疫苗抗原时，通过该粒子化，优先诱导被认为对病毒中和具有较高效果的抗体组的效果提高。
(抗原密度的估算)
通过使用了DynaPro Plate Reader III(Wyatt)的动态光散射法来估算抗原FH_85及粒子化抗原FH_85-CC07的理论直径，结果为13.8nm及60.0nm(图31)。对于2个粒子的分子量之比而言，通常的蛋白质中，与其理论直径之比的2～3次方成正比，因此估算FH_85-CC07的分子量为FH_85的分子量的20～80倍左右。即，认为FH85-CC07每1粒子呈递60～240分子左右(按三聚体计为20～80分子左右)，每1nm2理论表面积的平均分子密度可计算为0.005～0.022分子左右(按三聚体计为0.0017～0.0073分子左右)。
FH_82-CC07中也为同样的结果(图31)。
因此，估计使用了疏水性肽链的粒子化抗原与实施例6中示出的使用了支架粒子的粒子化抗原相比，抗原密度为同等或以上的水平。
(以小鼠免疫诱导的抗体的验证)
通过先前的操作，暗示了结合有疏水性肽链的抗原的粒子化具有抑制无助于病毒中和的免疫的诱导的效果。为了进一步详细研究该效果，实施通过用前述抗原或者粒子化抗原F_DS-Cav1F_DS-Cav1-CC07、FH_82-CC07或FH_85-CC07对小鼠进行免疫而诱导的抗体的分析。
小鼠免疫血清通过用各抗原及粒子化抗原对BALB/cAnNCrlCrlj(Charles RiverLaboratories Japan,Inc.)(雌性、6周龄)进行免疫而获取。将溶解于PBS(pH7.4)的抗原或粒子化抗原F_DS-Cav1、F_DS-Cav1-CC07、FH_82-CC07或FH_85-CC07(抗原浓度：0.40mg/mL)于饲养第0天及饲养第21天以50μL肌内施予至小鼠的后肢大腿部(每1组设为5只)。饲养第42天，从后大静脉获取血液，获取的血液在进行孵育(室温、约2小时、静置)后进行离心分离，回收血清，进行灭活(55℃、30min)，制成小鼠免疫血清。
为了确认以何种程度的比例诱导了与融合后构象结合的抗体，针对各小鼠免疫血清，使用了以与实施例6同样的方法结合有ΔFP furinwt Fecto的磁珠或不结合任何抗原而仅实施封闭操作的磁珠，进行抗原吸附操作。进一步，对吸附操作后的各血清，以与实施例6同样的方法，实施将F_DS-Cav1固相化的ELISA试验，算出吸附率。其中，吸附率设为：将没有抗原的吸附操作后的血清的抗体效价设为100％时的、从没有抗原的吸附操作后的血清的抗体效价中减去基于ΔFP furinwtFecto的吸附操作后的血清的抗体效价而得的值的相对值(图32)。
通过以上操作，显示会被粒子化前的抗原F_DS-Cav1诱导一半左右的post-F识别抗体几乎不被通过疏水性肽链进行了粒子化的抗原F_DS-Cav1-CC07诱导。另外，FH_82-CC07、FH_85-CC07也同样地几乎不诱导post-F识别抗体。以上暗示了，通过该粒子化，优先诱导被认为对病毒中和具有较高效果的抗体组的效果提高。
〔实施例9〕使用了自缔合性蛋白结构域的抗原的粒子化
认为通过将自缔合性蛋白结构域融合于抗原的C末端侧，也可能实现实施例7、8中示出的通过空间位阻效应降低抗体、各种免疫细胞对被post-F识别抗体识别的抗原部位的可及性的效果。特别是，认为可能通过使用自缔合性蛋白结构域使抗原以正确的规则排列，从而可得到较之实施例8中示出的基于疏水聚集的粒子化而言更高的空间位阻效应。
因此，本实施例中，对利用了B型肝炎病毒的核心抗原(HBcAg)的自缔合性的粒子化进行研究。
其中，将前述抗原F_DS-Cav1中的包含凝血酶识别序列、His标签、Strep-Tag II的序列(序列号22)替换成包含GS接头(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)(序列号75)、HBcAg的自缔合结构域(序列号50)、及His标签的肽序列(序列号51)而得的抗原虽然表达，但是并未观察到自缔合(基于BlueNativePAGE的验证结果)。认为HBcAg的自缔合结构域的N末端存在于接近HBcAg彼此进行自缔合时的结合面的位置，有可能由于将大的蛋白质融合于N末端而妨碍自缔合。
因此，为了将RSV F抗原部分配置在远离进行自缔合时的结合面的位置，决定自HBcAg进行自缔合时粒子的向外突出的部位(α3结构域与α4结构域中存在的螺旋之间的部分)分割成C末端侧与N末端侧。另外，为了减小意料外的二硫键的生成风险，决定导入被认为对自缔合没有影响的2个点突变(C48S及C107A)。具体而言，以将前述抗原F_DS-Cav1及FH_85的前体蛋白中的包含凝血酶识别序列、His标签、StrepTag II的序列(序列号22)替换成依次结合有GS接头(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)(序列号75)、HBcAg的自缔合结构域的C末端侧(序列号52)、以及GS接头(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)(序列号75)、HBcAg的自缔合结构域的N末端侧(序列号53)、及FLAG标签的序列(序列号54)而得的F_DS-Cav1-HBcCN的前体蛋白(序列号55)及FH_85-HBcCN的前体蛋白(序列号56)为基础，制作抗原(有时称作“粒子化抗原”)。
针对F_DS-Cav1-HBcCN，以与实施例8同样的操作进行表达、纯化，对是否可分泌表达及是否可粒子化进行研究，结果，实现了分泌表达与粒子化这两者(图33)。其中，由表达量比较低，因此期望改良表达方法。因此，针对编码DS-Cav1-HBcCN或者FH_85-HBcCN的前体的多核苷酸，使用GS Xceed Expression System(Lonza公司)建立稳定表达CHO株。对建立的细胞株进行培养，分泌表达各抗原后，获取培养上清液成分。
各粒子化抗原的纯化以与实施例8同样的操作来实施。
为了确认各粒子化抗原对各抗体的结合性，实施分别将帕利珠单抗(Synagis肌肉注射液、艾伯维)、131-2A抗体、D25抗体固相化的ELISA试验。抗体结合缓冲液使用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(Sigma-Aldrich,C3041-50CAP)，样品的稀释及培养板的洗涤使用TBS(TaKaRa,T9142)。向96半孔板添加10μg/mL的帕利珠单抗或131-2A抗体或D25抗体，直接进行固相化，用牛血清白蛋白封闭。向各抗原适当地添加缓冲液，从而制作10倍稀释系列，添加于培养板中进行孵育(室温、2小时、静置)。然后去除添加的抗原溶液，使过氧化物酶结合抗FLAG M2抗体(Sigma-Aldrich,A8592)结合，进一步用标准的过氧化物酶检测试剂显色后，用利用标准的微孔板检测仪进行的吸光度测定来求出显色的强度。测定点间进行分段线性插值从而求出抗原的稀释率与吸光度的关系，将吸光度成为0.2的稀释率的倒数作为添加的抗原针对经固相化的抗体的结合力。将用对D25抗体的结合力除以对帕利珠单抗的结合力而得的值作为表位Φ检测信号，将用对131-2A抗体的结合力除以对帕利珠单抗的结合力而得的值作为表位I检测信号(图34、图35)。
通过以上操作，得到下述结果：显示使pre-F通过添加于其氨基酸序列的C末端的自缔合性蛋白结构域聚集而成的粒子化抗原与基于疏水性肽链的粒子化相比，进一步提高抗体对表位Φ的结合性，减弱已知诱导病毒感染中和能力显著较低的抗体的表位I的检测。以上的结果暗示了，通过该粒子化，优先诱导被认为对病毒中和具有较高效果的抗体组的效果提高。
Claims (34)
1.突变型RSV F蛋白，其是具有突变的突变型RSV F蛋白，其中，所述变异为与序列号1的氨基酸序列的141位的亮氨酸相当的亮氨酸或与142位的亮氨酸相当的亮氨酸被取代成半胱氨酸、及与373位的亮氨酸相当的亮氨酸被取代成半胱氨酸，在所述半胱氨酸间形成二硫键。
2.如权利要求1所述的突变型RSV F蛋白，其中，所述突变型RSV F蛋白来源于RSV亚型A或RSV亚型B。
3.如权利要求2所述的突变型RSV F蛋白，其中，所述RSV亚型A为RSV A2株或RSV Long株。
4.如权利要求2所述的突变型RSV F蛋白，其中，所述RSV亚型B为RSV 18537株。
5.如权利要求1～4中任一项所述的突变型RSV F蛋白，其包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列是在与序列号2具有85％以上的同一性的氨基酸序列中，与序列号1的氨基酸序列的141位的亮氨酸相当的亮氨酸或与142位的亮氨酸相当的亮氨酸、及与373位的亮氨酸相当的亮氨酸被取代成半胱氨酸而得的，所述突变型RSV F蛋白在所述半胱氨酸间形成二硫键，具有诱导针对RSV的pre型F蛋白的抗体的能力。
6.如权利要求1～4中任一项所述的突变型RSV F蛋白，其中，进一步地，存在于pep27区域的C末端侧的、构成弗林蛋白酶识别位点的氨基酸以所述弗林蛋白酶识别位点不被弗林蛋白酶识别的方式被取代。
7.如权利要求6所述的突变型RSV F蛋白，其中，所述构成弗林蛋白酶识别位点的氨基酸为选自由与序列号1的氨基酸序列的133位的精氨酸相当的精氨酸、与135位的精氨酸相当的精氨酸、及与136位的精氨酸相当的精氨酸组成的组的氨基酸，
该氨基酸被取代成非碱性氨基酸。
8.如权利要求6或7所述的突变型RSV F蛋白，其包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列是在与序列号3具有85％以上的同一性的氨基酸序列中，与序列号1的氨基酸序列的141位的亮氨酸相当的亮氨酸或与142位的亮氨酸相当的亮氨酸、及与373位的亮氨酸相当的亮氨酸被取代成半胱氨酸，并且选自由与序列号1的氨基酸序列的133位的精氨酸相当的精氨酸、与135位的精氨酸相当的精氨酸、及与136位的精氨酸相当的精氨酸组成的组的氨基酸被取代成非碱性氨基酸而得的，所述突变型RSV F蛋白在所述半胱氨酸间形成二硫键，具有诱导针对RSV的pre型F蛋白的抗体的能力。
9.如权利要求7或8所述的突变型RSV F蛋白，其中，所述非碱性氨基酸为天冬酰胺。
10.如权利要求1～9中任一项所述的突变型RSV F蛋白，其中，进一步地，与序列号1的氨基酸序列的189位的苏氨酸相当的苏氨酸、及/或与190位的丝氨酸相当的丝氨酸被取代成疏水性氨基酸。
11.如权利要求10所述的突变型RSV F蛋白，其中，所述疏水性氨基酸各自独立地选自由缬氨酸、异亮氨酸、及亮氨酸组成的组。
12.如权利要求1～11中任一项所述的突变型RSV F蛋白，其中，进一步地，与序列号1的氨基酸序列的42位的赖氨酸相当的赖氨酸被取代成精氨酸、及/或与384位的缬氨酸相当的缬氨酸被取代成苏氨酸。
13.突变型RSV F蛋白，其是具有突变的突变型RSV F蛋白，其中，所述突变为与序列号1的氨基酸序列的60位的谷氨酸相当的谷氨酸被取代成非酸性氨基酸。
14.如权利要求13所述的突变型RSV F蛋白，其中，所述非酸性氨基酸选自由甲硫氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、苏氨酸、及丝氨酸组成的组。
15.融合蛋白，其包含权利要求1～14中任一项所述的突变型RSV F蛋白、和融合于所述突变型RSV F蛋白的C末端的多聚化结构域。
16.如权利要求15所述的融合蛋白，其中，所述多聚化结构域为折叠子结构域。
17.如权利要求16所述的融合蛋白，其包含序列号10～13中任一者的氨基酸序列。
18.多聚体，其是权利要求1～14中任一项所述的突变型RSV F蛋白的多聚体，是所述权利要求15～17中任一项所述的融合蛋白介由所述多聚化结构域缔合而成的。
19.如权利要求18所述的多聚体，其中，所述多聚体为三聚体。
20.粒子化体，其是权利要求1～14中任一项所述的突变型RSV F蛋白或权利要求15～17中任一项所述的多聚体的粒子化体，其中，所述突变型RSV F蛋白或所述融合蛋白包含粒子化结构域，所述突变型RSV F蛋白或所述多聚体介由该粒子化结构域聚集2个以上而形成粒子，所述粒子化结构域存在于突变型RSV F蛋白或多聚体的立体结构上较之表位Φ更靠近表位I的位置。
21.如权利要求20所述的粒子化体，其中，所述粒子化体是粒子化体制备用融合蛋白介由粒子化结构域聚集2个以上而成的，所述粒子化体制备用融合蛋白在所述突变型RSV F蛋白或所述融合蛋白的C末端结合有所述粒子化结构域。
22.如权利要求20或21所述的粒子化体，其中，所述多聚体为由权利要求16所述的融合蛋白形成的三聚体。
23.如权利要求22所述的粒子化体，其中，所述粒子化结构域为由序列号30的氨基酸序列形成的Fc结构域，并且，其是通过该粒子化结构域与固定化于源自修饰型HBs抗原的VLP的蛋白A的Z结构域进行结合从而聚集而成的。
24.如权利要求22所述的粒子化体，其中，所述粒子化结构域为由序列号42的氨基酸序列形成的肽。
25.粒子化体制备用融合蛋白，其包含：权利要求1～14中任一项所述的突变型RSV F蛋白的C末端、或权利要求15～17中任一项所述的融合蛋白；和融合于其C末端的粒子化结构域。
26.如权利要求25所述的粒子化体制备用融合蛋白，其中，所述粒子化结构域为由序列号30的氨基酸序列序列形成的Fc结构域。
27.如权利要求25所述的粒子化体制备用融合蛋白，其中，所述粒子化结构域为由序列号42的氨基酸序列形成的肽。
28.多核苷酸，其编码权利要求1～14中任一项所述的突变型RSV F蛋白、权利要求15～17中任一项所述的融合蛋白、或权利要求25～27中任一项所述的粒子化体制备用融合蛋白。
29.表达单元，其包含权利要求28所述的多核苷酸。
30.宿主细胞，其包含权利要求29所述的表达单元。
31.免疫原，其包含权利要求1～14中任一项所述的突变型RSV F蛋白、权利要求15～17中任一项所述的融合蛋白、权利要求18～19中任一项所述的多聚体、或权利要求20～24中任一项所述的粒子化体。
32.医药组合物，其包含权利要求29所述的表达单元、或权利要求31所述的免疫原。
33.RSV疫苗，其包含权利要求29所述的表达单元、或权利要求31所述的免疫原。
34.如权利要求32所述的医药组合物或权利要求33所述的RSV疫苗，其用于人。
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