TW202130363A

TW202130363A - 變異型ｒｓｖｆ蛋白質及其利用

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Publication number: TW202130363A
Application number: TW109145700A
Authority: TW
Inventors: 鳳桐智治; 岸田寛行; 武富啓; 大衛布蘭亞迪; 艾路德歐羅; 艾瑞克菲范得; 市原収
Original assignee: 日商田邊三菱製藥股份有限公司
Priority date: 2019-12-23
Filing date: 2020-12-23
Publication date: 2021-08-16
Also published as: AR120891A1; CA3165855A1; IL294059A; US20230086093A1; EP4083212A4; JP2024016234A; AU2020411873B2; JP7385680B2; BR112022012470A2; CN114929877A; JPWO2021132379A1; KR20220116516A; WO2021132379A1; MX2022007881A; EP4083212A1; AU2020411873A1

Abstract

根據本發明，係提供一種變異型RSV F蛋白質，其係具有變異之變異型RSV F蛋白質，前述變異為相當於序列編號1的胺基酸序列之141位的白胺酸之白胺酸或相當於142位的白胺酸之白胺酸取代成半胱胺酸，及相當於373位的白胺酸之白胺酸取代成半胱胺酸，在前述半胱胺酸間形成雙硫鍵。此外，係提供一種變異型RSV F蛋白質，其係具有變異之變異型RSV F蛋白質，前述變異為相當於序列編號1的胺基酸序列之60位的麩胺酸之麩胺酸取代成非酸性胺基酸。

Description

變異型ＲＳＶ　Ｆ蛋白質及其利用

本發明係關於變異型RSV F蛋白質及其利用。

呼吸道融合細胞病毒(RSV)感染症為呈現出世界性流行之呼吸道感染症。特定而言，在未滿5歲的兒童中，重症化風險較高，由於RSV感染，一年3千萬人以上發展成下呼吸道炎，一年3百萬人以上需要入院治療。於是，面對預防RSV感染症之疫苗的開發，迄今為止已進行許多努力。過去，在1965-66年的時期，已實施將經以福馬林去活化之病毒作為疫苗抗原之臨床試驗(對象為嬰兒)，但非但未減低感染症，相反地，呈現出將RSV感染所引發之入院率增加16倍之結果。作為原因之一，一般認為在去活化處理的過程中，會使屬於病毒的表面抗原之一之F抗原發生變性，由於僅誘導出RSV中和活性較低的抗體，反而妨礙免疫反應。隨後亦已進行各式各樣的努力，但尚未完成有效的疫苗的開發。

該種狀況中，係著眼於健康成人即便感染RSV亦幾乎不會重症化，並施行使用健康成人血清之調查。調查之結果，瞭解到在健康成人血清中有較高的病毒感染能力中和效果，又，該感染中和效果係起因於抗RSV F蛋白質抗體(非專利文獻1)。RSV F蛋白質的研究亦有進展，已知已成熟之F蛋白質擁有準安定的融合前構形(在本說明書中，有時稱為「pre-F」或「pre型F蛋白質」。)及最安定的融合後構形(在本說明書中，有時稱為「post-F」或「post型F蛋白質」。)，融合前構形係因其不安定性，在一般的疫苗製劑溶液中會有早期再摺疊成融合後構形之傾向。此外，由於已明確得知難以安定地取得之pre-F的結構(非專利文獻2)，便瞭解到pre型F蛋白質會形成三聚體，此外，存在於pre型F蛋白質之抗原決定位(抗原決定位Φ、I、II、III、IV、V等)之中，數個抗原決定位會由於向post-F之結構變化而喪失。

在更詳細地調查成人人類血清之研究中，已明確得知血清中所包含之抗F蛋白質抗體之中，病毒感染中和能力較高的抗體為特異性地結合至主要存在於pre型F蛋白質之抗原決定位Φ或抗原決定位V之抗體，該等持有特異性地辨識pre型F蛋白質而不結合至post-F之性質，雖然在上述血清中亦包含亦結合至post-F之抗體，但其病毒感染中和能力較低(非專利文獻3)。此外，免疫成熟不充分的嬰幼兒期在感染時症狀惡化之風險較高，其原因被認為是初次感染時或感染次數較少的兒童幾乎無法誘導出以抗原決定位Φ或V作為標靶之免疫(非專利文獻4)。在疫苗抗原中，效率佳地誘導出病毒感染中和能力較高的抗體實屬重要，一般認為理想的疫苗抗原為能夠優先地誘導出具有中和能力之針對於抗原決定位Φ或V之抗體之抗原。

已嘗試藉由將人工的雙硫鍵導入RSV F蛋白質中之變異等而將具有抗原決定位Φ或V之pre型F蛋白質予以安定化。已報導例如DS-Cav1變異體(專利文獻1、非專利文獻5、非專利文獻6)或其他變異體(專利文獻2)。然而，pre型F蛋白質的安定化稱不上充分，目前亦持續進行研究。 [先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]國際公開第2017／172890號 [專利文獻2]國際公開第2017／109629號 [非專利文獻]

[非專利文獻1]Ngwuta JO et al. Science Translational Medicine 2015; 309: 309ra162 [非專利文獻2]Jason S McLellan et al. Science 2013; 340: 1113 [非專利文獻3]Morgan S. A. Gilman et al. 2016. Science Immunology. 1(6). pii: eaaj1879 [非專利文獻4]Eileen Goodwin et al. Immunity 2018; 48(2): 339 [非專利文獻5]Jason S. McLellan et al. Science 2013; 342:592 [非專利文獻6]M Gordon Joyce et al. Nature structural and molecular biology 2016; 23(9): 811

[發明所欲解決之課題]

本發明之課題為提供用於效率佳地誘導出RSV感染中和能力較高的抗體之技術。 [解決課題之手段]

本發明者等人發現包含特定的胺基酸變異之變異型RSV F蛋白質係效率佳地誘導出RSV感染中和能力較高的抗體，遂完成本發明。本發明係如下。

[1] 一種變異型RSV F蛋白質，其係具有變異之變異型RSV F蛋白質，前述變異為相當於序列編號1的胺基酸序列之141位的白胺酸之白胺酸或相當於142位的白胺酸之白胺酸取代成半胱胺酸，及相當於373位的白胺酸之白胺酸取代成半胱胺酸，在前述半胱胺酸間形成雙硫鍵。 [2] 如[1]所記載之變異型RSV F蛋白質，其中，前述變異型RSV F蛋白質係源自於RSV亞型A或RSV亞型B。 [3] 如[2]所記載之變異型RSV F蛋白質，其中，前述RSV亞型A為RSV A2株或RSV Long株。 [4] 如[2]所記載之變異型RSV F蛋白質，其中，前述RSV亞型B為RSV 18537株。 [5] 如[1]～[4]中任一項所記載之變異型RSV F蛋白質，其係在與序列編號2具有85%以上的同一性之胺基酸序列中，包含相當於序列編號1的胺基酸序列之141位的白胺酸之白胺酸或相當於142位的白胺酸之白胺酸，及相當於373位的白胺酸之白胺酸被取代成半胱胺酸而得之胺基酸序列，在前述半胱胺酸間形成雙硫鍵，具有誘導出抗RSV的pre型F蛋白質之抗體之能力。 [6] 如[1]～[4]中任一項所記載之變異型RSV F蛋白質，其中，存在於pep27區域的C末端側之構成弗林蛋白酶(furin)辨識部位之胺基酸係進一步以前述弗林蛋白酶辨識部位不會受到弗林蛋白酶所辨識之方式被取代。 [7] 如[6]所記載之變異型RSV F蛋白質，其中，前述構成弗林蛋白酶辨識部位之胺基酸為選自由相當於序列編號1的胺基酸序列之133位的精胺酸之精胺酸、相當於135位的精胺酸之精胺酸及相當於136位的精胺酸之精胺酸所構成之群組之胺基酸，該胺基酸被取代成非鹼性胺基酸。 [8] 如[6]或[7]所記載之變異型RSV F蛋白質，其係在與序列編號3具有85%以上的同一性之胺基酸序列中，包含相當於序列編號1的胺基酸序列之141位的白胺酸之白胺酸或相當於142位的白胺酸之白胺酸，及相當於373位的白胺酸之白胺酸被取代成半胱胺酸，再者，選自由相當於序列編號1的胺基酸序列之133位的精胺酸之精胺酸、相當於135位的精胺酸之精胺酸及相當於136位的精胺酸之精胺酸所構成之群組之胺基酸被取代成非鹼性胺基酸而得之胺基酸序列，在前述半胱胺酸間形成雙硫鍵，具有誘導出抗RSV的pre型F蛋白質之抗體之能力。 [9] 如[7]或[8]所記載之變異型RSV F蛋白質，其中，前述非鹼性胺基酸為天冬醯胺酸。 [10] 如[1]～[9]中任一項所記載之變異型RSV F蛋白質，其中，相當於序列編號1的胺基酸序列之189位的蘇胺酸之蘇胺酸，及／或相當於190位的絲胺酸之絲胺酸進一步被取代成疏水性胺基酸。 [11] 如[10]所記載之變異型RSV F蛋白質，其中，前述疏水性胺基酸係各自獨立地選自由纈胺酸、異白胺酸及白胺酸所構成之群組。 [12] 如[1]～[11]中任一項所記載之變異型RSV F蛋白質，其中，進一步地，相當於序列編號1的胺基酸序列之42位的離胺酸之離胺酸被取代成精胺酸，及／或相當於384位的纈胺酸之纈胺酸被取代成蘇胺酸。 [13] 一種變異型RSV F蛋白質，其係具有變異之變異型RSV F蛋白質，前述變異為相當於序列編號1的胺基酸序列之60位的麩胺酸之麩胺酸取代成非酸性胺基酸。 [14] 如[13]所記載之變異型RSV F蛋白質，其中，前述非酸性胺基酸係選自由甲硫胺酸、苯丙胺酸、白胺酸、蘇胺酸及絲胺酸所構成之群組。 [15] 一種融合蛋白質，其包含[1]～[14]中任一項所記載之變異型RSV F蛋白質，及融合至前述變異型RSV F蛋白質的C末端之多聚體化結構域。 [16] 如[15]所記載之融合蛋白質，其中，前述多聚體化結構域為foldon結構域。 [17] 如[16]所記載之融合蛋白質，其包含序列編號10～13中之任一胺基酸序列。 [18] 一種多聚化體，其係[1]～[14]中任一項所記載之變異型RSV F蛋白質之多聚化體，其係[15]～[17]中任一項所記載之融合蛋白質經由前述多聚體化結構域進行締合而得。 [19] 如[18]所記載之多聚化體，其中，前述多聚化體為三聚體。 [20] 一種粒子化體，其係[1]～[14]中任一項所記載之變異型RSV F蛋白質或[15]～[17]中任一項所記載之多聚化體之粒子化體，前述變異型RSV F蛋白質或前述融合蛋白質包含粒子化結構域，前述變異型RSV F蛋白質或前述多聚化體係經由該粒子化結構域集合2個以上而形成粒子，前述粒子化結構域在變異型RSV F蛋白質或多聚化體的立體結構上，係存在於相較於抗原決定位Φ而言更接近於抗原決定位I之位置。 [21] 如[20]所記載之粒子化體，其中，前述粒子化體係粒子化結構域結合至前述變異型RSV F蛋白質或前述融合蛋白質的C末端而得之粒子化體製造用融合蛋白質經由前述粒子化結構域集合2個以上而得。 [22] 如[20]或[21]所記載之粒子化體，其中，前述多聚化體為由[16]所記載之融合蛋白質所構成之三聚體。 [23] 如[22]所記載之粒子化體，其中，前述粒子化結構域為由序列編號30的胺基酸序列所構成之Fc結構域，該粒子化體係藉由該粒子化結構域與固定化於源自改良型HBs抗原之VLP之蛋白A的Z結構域進行結合而集合而得。 [24] 如[22]所記載之粒子化體，其中，前述粒子化結構域為由序列編號42的胺基酸序列所構成之胜肽。 [25] 一種粒子化體製造用融合蛋白質，其包含[1]～[14]中任一項所記載之變異型RSV F蛋白質的C末端或[15]～[17]中任一項所記載之融合蛋白質，及融合至其C末端之粒子化結構域。 [26] 如[25]所記載之粒子化體製造用融合蛋白質，其中，前述粒子化結構域為由序列編號30的胺基酸序列所構成之Fc結構域。 [27] 如[25]所記載之粒子化體製造用融合蛋白質，其中，前述粒子化結構域為由序列編號42的胺基酸序列所構成之胜肽。 [28] 一種多核苷酸，其編碼出[1]～[14]中任一項所記載之變異型RSV F蛋白質、[15]～[17]中任一項所記載之融合蛋白質或[25]～[27]中任一項所記載之粒子化體製造用融合蛋白質。 [29] 一種表現單元，其包含[28]所記載之多核苷酸。 [30] 一種宿主細胞，其包含[29]所記載之表現單元。 [31] 一種免疫原，其包含[1]～[14]中任一項所記載之變異型RSV F蛋白質、[15]～[17]中任一項所記載之融合蛋白質、[18]～[19]中任一項所記載之多聚化體或[20]～[24]中任一項所記載之粒子化體。 [32] 一種醫藥組成物，其包含[29]所記載之表現單元或[31]所記載之免疫原。 [33] 一種RSV疫苗，其包含[29]所記載之表現單元或[31]所記載之免疫原。 [34] 如[32]所記載之醫藥組成物或[33]所記載之RSV疫苗，其係人類用。 [發明效果]

根據本發明，可提供用於效率佳地誘導出RSV感染中和能力較高的抗體之技術。可提供作為pre型F蛋白質之安定性相較於以往而言明顯提升之變異型RSV F蛋白質。本發明之變異型RSV F蛋白質，特定而言，在人類中，具有相較於被認為不怎麼有助於病毒中和之抗體群組而言，更優先地誘導出被認為對病毒中和持有較高的效果之抗體群組之效果(以下，稱為優先地誘導出被認為對病毒中和持有較高的效果之抗體群組之效果)。

本發明之一態樣為一種變異型RSV F蛋白質，其係具有變異之變異型RSV F蛋白質，前述變異為相當於序列編號1的胺基酸序列之141位的白胺酸之白胺酸或相當於142位的白胺酸之白胺酸取代成半胱胺酸，及相當於373位的白胺酸之白胺酸取代成半胱胺酸，在前述半胱胺酸間形成雙硫鍵。

天然的RSV F蛋白質最初係作為F0多肽(前驅物)進行表現。F0多肽在內質網移行訊息被切斷之後，會在二個部位由細胞內弗林蛋白酶樣蛋白酶進行加工，生成F1多肽、F2多肽及Pep27多肽。在此處，Pep27多肽被切除，因而不會形成成熟F蛋白質的一部分。F2多肽係源自於F0多肽的N末端側部分，經由2個雙硫鍵連結至F1多肽。F1多肽係源自於F0多肽的C末端側部分，經由跨膜結構域將成熟F蛋白質固定於膜。3個F2-F1異二聚體之原聚體(protomer)係作為三聚體而形成成熟F蛋白質，其係持有使病毒膜與標的細胞膜進行融合之機能之pre型F蛋白質。

本發明之變異型RSV F蛋白質從N末端側起包含F2多肽、F1多肽。該F1多肽較佳係使用不含跨膜區域及細胞內區域者(以下，有時稱為F1多肽(細胞外區域))。再者，由於因後述之變異而使弗林蛋白酶樣蛋白酶辨識部位中之一個消失，本發明之變異型RSV F蛋白質亦有在F1多肽的N末端側包含pep27多肽之情形。此外，各自地，在F2多肽的N末端側亦可包含訊息序列，在F1多肽與F2多肽之間亦可包含連結子，以及再者，在其C末端側亦可包含用於純化等之標籤等。再者，本發明之變異型RSV F蛋白質較佳為形成三聚體者。

本發明之變異型RSV F蛋白質較佳係源自於RSV亞型A或RSV亞型B。作為前述RSV亞型A，具體而言，可例示RSV A2株、RSV Long株、RSV S2株、RSV line 19株，在該等之中，較佳為RSV A2株或RSV Long株。作為前述RSV亞型B，具體而言，可例示RSV 18537株、RSV B1株、RSV 9320株，在該等之中，較佳為RSV 18537株。

序列編號1的胺基酸序列為RSV A2株之F蛋白質之F0多肽的胺基酸序列，參照此，對F0多肽的各構成要素進行說明。在序列編號1中，訊息序列的胺基酸序列為1位～25位的胺基酸序列。在序列編號1中，F2多肽的胺基酸序列為26位～109位的胺基酸序列。在序列編號1中，pep27區域的胺基酸序列為110位～136位的胺基酸序列。在序列編號1中，F1多肽(細胞外區域)的胺基酸序列為137位～513位的胺基酸序列。在序列編號1中，F1多肽(跨膜區域及細胞內區域)的胺基酸序列為514位～574位的胺基酸序列。另外，F1多肽(跨膜區域及細胞內區域)的胺基酸序列可為與序列編號1之514位～574位的胺基酸序列具有85%以上、90%或95%以上同一性之序列。

RSV F蛋白質可包含F2多肽及F1多肽(細胞外區域)。包含F2多肽及F1多肽(細胞外區域)之RSV F蛋白質依序包含序列編號1之26位～109位的胺基酸序列及137位～513位的胺基酸序列，可例示序列編號2的胺基酸序列。 RSV F蛋白質可包含F2多肽及連結有pep27區域之F1多肽(細胞外區域)。依序包含F2多肽及連結有pep27區域之F1多肽(細胞外區域)之RSV F蛋白質包含序列編號1之26位～513位的胺基酸序列，可例示序列編號3的胺基酸序列。另外，此等多肽可為各別的多肽鏈，較佳係該等經雙硫鍵所連結。即，RSV F蛋白質可為此種多肽之複合體。

(將白胺酸取代成半胱胺酸之變異) 本發明之變異型RSV F蛋白質包含相當於序列編號1的胺基酸序列之141位的白胺酸之白胺酸或相當於142位的白胺酸之白胺酸取代成半胱胺酸，及相當於373位的白胺酸之白胺酸取代成半胱胺酸之變異。由於前述變異型RSV F蛋白質具有上述胺基酸變異，除了天然產生之雙硫鍵以外，在所導入之半胱胺酸間會形成新的雙硫鍵，藉此，發揮出提升抗原決定位Φ的保守性(維持pre型)之效果。為了形成三聚體，特定而言，較佳為相當於序列編號1之141位的白胺酸之白胺酸取代成半胱胺酸，相當於373位的白胺酸之白胺酸取代成半胱胺酸者。

另外，在本說明書中，變異型RSV F蛋白質的變異位置係以序列編號1所示之參照序列的胺基酸編號來表示。

所謂相當於序列編號1的胺基酸序列之141位的白胺酸之白胺酸、相當於142位的白胺酸之白胺酸及相當於373位的白胺酸之白胺酸，係指不限變異型RSV F蛋白質的來源，相當於序列編號1的胺基酸序列中所提及之141位的白胺酸之白胺酸、相當於142位的白胺酸之白胺酸及相當於373位的白胺酸之白胺酸。即，其係指針對應導入變異之RSV F蛋白質的胺基酸序列，在與序列編號1的胺基酸序列施行比對時，各自被定位於序列編號1的胺基酸序列之141位的白胺酸、142位的白胺酸、373位的白胺酸之白胺酸殘基。例如，在N末端側與序列編號1的胺基酸序列相比較而言較短1個胺基酸之變異型RSV F蛋白質的胺基酸序列之情況，序列編號1的胺基酸序列中之141位的白胺酸成為140位，該種白胺酸可稱為相當於序列編號1的胺基酸序列之141位的白胺酸之白胺酸。另外，針對應導入變異之RSV F蛋白質的胺基酸序列，在與序列編號1的胺基酸序列施行比對時，在相當於序列編號1的胺基酸序列之141位的白胺酸之白胺酸、相當於142位的白胺酸之白胺酸及／或相當於373位的白胺酸之白胺酸的位置存在白胺酸以外之胺基酸之情況，將該胺基酸取代成半胱胺酸之態樣亦包含在本發明之變異型RSV F蛋白質中。此外，在該白胺酸以外之胺基酸為半胱胺酸之情況，便不需要成為半胱胺酸之前述取代，可依原樣為半胱胺酸。

本發明之一態樣為一種變異型RSV F蛋白質，其包含由變異型F0多肽所生成之F2多肽及F1多肽(細胞外區域)，該變異型F0多肽係在序列編號1的胺基酸序列中，包含141位的白胺酸或142位的白胺酸，及373位的白胺酸被取代成半胱胺酸而得之胺基酸序列，在前述半胱胺酸間形成雙硫鍵。具體而言，在序列編號2的胺基酸序列中，包含89位的白胺酸或90位的白胺酸，及321位的白胺酸被取代成半胱胺酸而得之胺基酸序列。

本發明之一態樣為一種變異型RSV F蛋白質，其包含由變異型F0多肽所生成之F2多肽及F1細胞外區域多肽，該變異型F0多肽係在與序列編號1的胺基酸序列具有85%以上的同一性，較佳為90%以上的同一性，更佳為95%以上的同一性之胺基酸序列中，包含相當於序列編號1的胺基酸序列之141位的白胺酸之白胺酸或相當於142位的白胺酸之白胺酸，及相當於373位的白胺酸之白胺酸被取代成半胱胺酸而得之胺基酸序列，在前述半胱胺酸間形成雙硫鍵，具有誘導出抗RSV的pre型F蛋白質之抗體之能力。具體而言，在與序列編號2的胺基酸序列具有85%以上的同一性，較佳為90%以上的同一性，更佳為95%以上的同一性之胺基酸序列中，包含相當於序列編號1的胺基酸序列之141位的白胺酸之白胺酸(在序列編號2中為89位)或相當於142位的白胺酸之白胺酸(在序列編號2中為90位)，及相當於373位的白胺酸之白胺酸(在序列編號2中為321位)被取代成半胱胺酸而得之胺基酸序列。

在本說明書中，與胺基酸序列相關之所謂「百分比(%)同一性」，係定義為使序列進行排列，為了獲得最大的%同一性，若有需要則導入間隙，任何保守性取代皆不視為序列同一性的一部分之後，與特定的參照多肽序列的胺基酸殘基相同的候補序列中之胺基酸殘基的百分比。為了測定%同一性之目的之比對能夠藉由在熟習該項技術者的技能範圍中之各種方法，例如使用諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體般之能夠公開取得的電腦軟體而予以達成。只要是熟習該項技術者，即可決定用於比對序列之適切的參數，其包含相對於所比較之序列的全長而言達成最大的比對所需之任意的演算法。但是，為了在此處之目的，%同一性值係藉由在成對比對中使用序列比較電腦程式BLAST來獲得。在將BLAST用於胺基酸序列比較之狀況，所給予之胺基酸序列A與所給予之胺基酸序列B之%同一性係依下列方式予以計算：分率X／Y的100倍。在此處，X為藉由序列比對程式BLAST之A及B的程式比對而一致評分為相同之胺基酸殘基的數量，Y為B的總胺基酸殘基數。可理解的是，在胺基酸序列A的長度係與胺基酸序列B的長度不同之情況，A相對於B之%同一性係與B相對於A之%同一性不同。在沒有特別指明之前提下，在此處之所有%同一性值皆如正上方的段落所示，使用BLAST電腦程式來獲得。

所謂與預定的胺基酸序列具有預定的同一性之胺基酸序列，係在該預定的胺基酸序列中進行取代、缺失、插入或附加所得者。該取代較佳為保守性取代。所謂「保守性取代」，係以實質上不改變蛋白質的活性之方式，將胺基酸殘基以另一化學上類似的胺基酸殘基進行取代。例如，在將某個疏水性殘基以另一疏水性殘基進行取代之情況，可列舉將某個極性殘基以具有相同電荷之另一極性殘基進行取代之情形等。作為可施行此種取代之機能上類似的胺基酸之例，就非極性(疏水性)胺基酸而言，可列舉丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、脯胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸等。就極性(中性)胺基酸而言，可列舉甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、半胱胺酸等。就持有陽電荷(鹼性)之胺基酸而言，可列舉精胺酸、組胺酸、離胺酸等。此外，就持有負電荷(酸性)之胺基酸而言，可列舉天冬胺酸、麩胺酸等。

(60位的麩胺酸的變異) 本發明之變異型RSV F蛋白質之其他態樣為一種變異型RSV F蛋白質，其係具有變異之變異型RSV F蛋白質，前述變異為相當於序列編號1的胺基酸序列之60位的麩胺酸之麩胺酸取代成非酸性胺基酸。

在前述變異型RSV F蛋白質會發揮出提升抗原決定位Φ的保守性及促進三聚體化以及優先地誘導出被認為對病毒中和持有較高的效果之抗體群組之效果之前提下，前述非酸性胺基酸並無限定，具體而言，可例示中性胺基酸、鹼性胺基酸、非極性(疏水性)胺基酸。更具體而言，作為中性胺基酸，可例示甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、半胱胺酸，作為鹼性胺基酸，可例示精胺酸、組胺酸、離胺酸，作為非極性(疏水性)胺基酸，可例示丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、脯胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸。前述非酸性胺基酸較佳為中性胺基酸及／或非極性(疏水性)胺基酸。此外，在中性胺基酸之中，較佳為蘇胺酸、絲胺酸，在非極性(疏水性)胺基酸之中，較佳係選自由甲硫胺酸、苯丙胺酸、白胺酸所構成之群組，因而前述非酸性胺基酸較佳係選自由甲硫胺酸、苯丙胺酸、白胺酸、蘇胺酸及絲胺酸所構成之群組。

本發明之一態樣為一種變異型RSV F蛋白質，其包含由變異型F0多肽所生成之F2多肽及F1多肽(細胞外區域)，該變異型F0多肽包含序列編號1的胺基酸序列之60位的麩胺酸被取代成非酸性胺基酸而得之胺基酸序列。具體而言，在序列編號2的胺基酸序列中，包含35位的麩胺酸被取代成非酸性胺基酸而得之胺基酸序列。

本發明之一態樣為一種變異型RSV F蛋白質，其包含由變異型F0多肽所生成之F2多肽及F1多肽(細胞外區域)，該變異型F0多肽係在與序列編號1的胺基酸序列具有85%以上的同一性，較佳為90%以上的同一性，更佳為95%以上的同一性之胺基酸序列中，包含相當於序列編號1的胺基酸序列之60位的麩胺酸之麩胺酸被取代成非酸性胺基酸而得之胺基酸序列，具有誘導出抗RSV的pre型F蛋白質之抗體之能力。具體而言，在與序列編號2的胺基酸序列具有85%以上的同一性，較佳為90%以上的同一性，更佳為95%以上的同一性之胺基酸序列中，包含相當於序列編號1的胺基酸序列之60位的麩胺酸之麩胺酸(在序列編號2中為35位)被取代成非酸性胺基酸而得之胺基酸序列。

另外，60位的麩胺酸的變異亦可與上述將白胺酸取代成半胱胺酸之變異一併導入。

(弗林蛋白酶辨識部位的變異) 本發明之變異型RSV F蛋白質亦可為一種變異型RSV F蛋白質，其中，存在於pep27區域的C末端側之構成弗林蛋白酶辨識部位之胺基酸係進一步被取代成前述弗林蛋白酶辨識部位不會受到弗林蛋白酶所辨識之胺基酸。藉由具有此種胺基酸取代，變異型RSV F蛋白質便具有F2多肽及連結有pep27區域之F1多肽(細胞外區域)，藉此發揮出在保持抗原決定位Φ的保守性之情形下促進三聚體化之效果。

所謂pep27區域，係相當於序列編號1的胺基酸序列之110位～136位之區域，在細胞內，由於弗林蛋白酶，比其更N末端側之第1辨識部位及其C末端側之第2辨識部位會被切斷。從pep27區域起N末端側為F2多肽，C末端側為F1多肽，前述切斷之結果，生成F2多肽及F1多肽，此等在各多肽原本所具有之半胱胺酸殘基間形成雙硫鍵並複合體化。因此，通常在RSV F蛋白質中不含pep27區域，但由於該變異，第2辨識部位不會被切斷，僅有存在於F2多肽的C末端側與pep27區域之間之第1辨識部位會被弗林蛋白酶所切斷。該切斷之結果，生成包含連結pep27區域之F1多肽之多肽，以及F2多肽，此等在各多肽原本所具有之半胱胺酸殘基間形成雙硫鍵並複合體化。因此，本態樣可為一種複合體，其包含：包含連結pep27區域之F1多肽之多肽片段，以及F2多肽。

該取代可為前述構成弗林蛋白酶辨識部位之胺基酸中之一或複數個胺基酸的取代。具體而言，構成弗林蛋白酶辨識部位之胺基酸為選自由相當於序列編號1的胺基酸序列之133位的精胺酸之精胺酸、相當於135位的精胺酸之精胺酸及相當於136位的精胺酸之精胺酸所構成之群組之1個以上胺基酸，該胺基酸較佳係被取代成非鹼性胺基酸。相當於序列編號1的胺基酸序列之133位的精胺酸之精胺酸、相當於135位的精胺酸之精胺酸及相當於136位的精胺酸之精胺酸亦可各自獨立地被取代成非鹼性胺基酸。

前述非鹼性胺基酸在會發揮出在保持抗原決定位Φ的保守性之情形下促進三聚體化之效果之前提下，並無限定，具體而言，可例示中性胺基酸、酸性胺基酸、非極性(疏水性)胺基酸。更具體而言，作為中性胺基酸，可例示甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、半胱胺酸，作為酸性胺基酸，可例示天冬胺酸、麩胺酸，作為非極性(疏水性)胺基酸，可例示丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、脯胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸。在該等之中，較佳為中性胺基酸，更佳為天冬醯胺酸。

本發明之變異型RSV F蛋白質之一態樣係在序列編號3的胺基酸序列中，包含116位的白胺酸或117位的白胺酸，及348位的白胺酸被取代成半胱胺酸，且選自由108位的精胺酸、110位的精胺酸及111位的精胺酸所構成之群組之胺基酸被取代成非鹼性胺基酸而得之胺基酸序列。

本發明之變異型RSV F蛋白質之一態樣係在與序列編號3的胺基酸序列具有85%以上的同一性，較佳為90%以上的同一性，更佳為95%以上的同一性之胺基酸序列中，包含相當於序列編號1的胺基酸序列之141位的白胺酸之白胺酸(在序列編號3中為116位的白胺酸)或相當於142位的白胺酸之白胺酸(在序列編號3中為117位的白胺酸)，及相當於373位的白胺酸之白胺酸(在序列編號3中為348位的白胺酸)被取代成半胱胺酸，且選自由相當於序列編號1的胺基酸序列之133位的精胺酸之精胺酸(在序列編號3中為108位的精胺酸)、相當於135位的精胺酸之精胺酸(在序列編號3中為110位的精胺酸)及相當於136位的精胺酸之精胺酸(在序列編號3中為111位的精胺酸)所構成之群組之胺基酸被取代成非鹼性胺基酸而得之胺基酸序列。

本發明之變異型RSV F蛋白質之另一態樣係在序列編號3的胺基酸序列中，包含35位的麩胺酸被取代成非酸性胺基酸，且選自由108位的精胺酸、110位的精胺酸及111位的精胺酸所構成之群組之胺基酸被取代成非鹼性胺基酸而得之胺基酸序列。

本發明之變異型RSV F蛋白質之另一態樣係在與序列編號3的胺基酸序列具有85%以上的同一性，較佳為90%以上的同一性，更佳為95%以上的同一性之胺基酸序列中，包含相當於序列編號1的胺基酸序列之60位的麩胺酸之麩胺酸(在序列編號3中為35位的麩胺酸)被取代成非酸性胺基酸，且選自由相當於序列編號1的胺基酸序列之133位的精胺酸之精胺酸(在序列編號3中為108位的精胺酸)、相當於135位的精胺酸之精胺酸(在序列編號3中為110位的精胺酸)及相當於136位的精胺酸之精胺酸(在序列編號3中為111位的精胺酸)所構成之群組之胺基酸被取代成非鹼性胺基酸而得之胺基酸序列。

另外，在序列編號3或與序列編號3具有85%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上的同一性之胺基酸序列中，前述pep27區域亦可被取代成人工連結子。作為前述人工連結子，其序列並無特別限制，較佳係6～27個胺基酸殘基長，較佳為包含Gly及／或Ser之序列，更具體而言，可例示Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser(序列編號18)、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₂ (序列編號19)、 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₃ (序列編號20)。

(其他變異) 本發明之變異型RSV F蛋白質亦可為一種變異型RSV F蛋白質，其係除了上述將相當於序列編號1的胺基酸序列之141位的白胺酸之白胺酸或相當於142位的白胺酸之白胺酸，及相當於373位的白胺酸之白胺酸取代成半胱胺酸之變異(以下，稱為將白胺酸取代成半胱胺酸之變異)、60位的麩胺酸的變異及／或弗林蛋白酶辨識部位的變異以外，進一步地，相當於序列編號1的胺基酸序列之189位的蘇胺酸之胺基酸及／或相當於190位的絲胺酸之胺基酸被取代成疏水性胺基酸。本態樣所涉及之變異型RSV F蛋白質係抗原決定位Φ的保守性優異，發揮出在保持促進三聚體化之效果及優先地誘導出被認為對病毒中和持有較高的效果之抗體群組之效果之情形下，在表現系統中表現量明顯提升之效果。相當於序列編號1的胺基酸序列之189位的蘇胺酸之胺基酸及／或相當於190位的絲胺酸之胺基酸亦可各自獨立地被取代成疏水性胺基酸。此外，包含該取代之變異型RSV F蛋白質係除了抗原決定位Φ的保守性優異，在保持促進三聚體化之效果及優先地誘導出被認為對病毒中和持有較高的效果之抗體群組之效果之情形下，在表現系統中表現量明顯提升之效果以外，亦不易受到對病毒感染的中和沒有或缺乏效果之抗體所辨識。相反地，若對病毒感染的中和沒有或缺乏效果之抗體被誘導出，則無助於或幾乎無助於病毒感染的中和之免疫細胞會活化，反而會設想到使症狀惡化之風險，由後述之實施例瞭解到，本態樣所涉及之變異型RSV F蛋白質不易受到對病毒感染的中和沒有或缺乏效果之抗體所辨識，因而相較於以往的疫苗而言，其風險較低。若列舉具體例，本態樣所涉及之變異型RSV F蛋白質不易受到辨識抗原決定位I之抗體所辨識。抗原決定位I會誘導出病毒感染的中和能力明顯較低的抗體，故若抗原決定位I受到抗體所辨識，則由於幾乎無助於病毒感染的中和之免疫細胞的活化，反而會設想到使症狀惡化之風險，由後述之實施例瞭解到，不易受到辨識抗原決定位I之抗體所辨識之本態樣所涉及之變異型RSV F蛋白質相較於以往的疫苗而言，其風險較低。

在前述變異型RSV F蛋白質係除了抗原決定位Φ的保守性優異，在保持促進三聚體化之效果及優先地誘導出被認為對病毒中和持有較高的效果之抗體群組之效果之情形下，在表現系統中表現量明顯提升之效果以外，亦發揮出不易受到對病毒感染的中和沒有或缺乏效果之抗體所辨識之效果之前提下，前述疏水性胺基酸並無限定，具體而言，可例示丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、脯胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸。在該等之中，較佳係選自由纈胺酸、異白胺酸及白胺酸所構成之群組。

另外，序列編號1中之189位為序列編號2之137位的胺基酸，序列編號1之190位為序列編號2之138位的胺基酸，在序列編號2或與其具有85%以上、90%以上或95%以上同一性之胺基酸序列中，除了上述將白胺酸取代成半胱胺酸之變異及／或60位的麩胺酸的變異以外，尚可導入此等中之一者或兩者的變異。此外，序列編號1中之189位為序列編號3之164位的胺基酸，序列編號1之190位為序列編號3之165位的胺基酸，在序列編號3或與其具有85%以上、90%以上或95%以上同一性之胺基酸序列中，除了上述將白胺酸取代成半胱胺酸之變異、60位的麩胺酸的變異及／或弗林蛋白酶辨識部位的變異以外，尚可導入此等中之一者或兩者的變異。

本發明之一態樣亦可為一種變異型RSV F蛋白質，其係除了上述將白胺酸取代成半胱胺酸之變異、60位的麩胺酸的變異及／或弗林蛋白酶辨識部位的變異以外，進一步地，相當於序列編號1的胺基酸序列之42位的離胺酸之胺基酸被取代成精胺酸，及／或相當於384位的纈胺酸之胺基酸被取代成蘇胺酸。本態樣所涉及之變異型RSV F蛋白質係抗原決定位Φ的保守性優異，發揮出在保持促進三聚體化之效果及優先地誘導出被認為對病毒中和持有較高的效果之抗體群組之效果之情形下，在表現系統中表現量明顯提升之效果。

另外，序列編號1中之42位為序列編號2之17位的胺基酸，序列編號1之384位為序列編號2之332位的胺基酸，在序列編號2或與其具有90%以上同一性之胺基酸序列中，除了上述將白胺酸取代成半胱胺酸之變異及／或60位的麩胺酸的變異，再者，上述189位及／或190位的變異以外，尚可導入此等中之一者或兩者的變異。此外，序列編號1中之42位為序列編號3之17位的胺基酸，序列編號1之384位為序列編號3之359位的胺基酸，在序列編號3或與其具有90%以上同一性之胺基酸序列中，除了上述將白胺酸取代成半胱胺酸之變異、60位的麩胺酸的變異及／或弗林蛋白酶辨識部位的變異，再者，上述189位及／或190位的變異以外，尚可導入此等中之一者或兩者的變異。

前述變異型RSV F蛋白質只要不會妨礙前述變異型RSV F蛋白質的效果，亦可進一步包含公知的變異。例如，亦可進一步包含用於在表現系統中提升表現量之變異。具體而言，可例示選自由相當於序列編號1的胺基酸序列之102位的脯胺酸之胺基酸被取代成丙胺酸、相當於379位的異白胺酸之胺基酸被取代成纈胺酸及相當於447位的甲硫胺酸之胺基酸被取代成纈胺酸所構成之群組之一個以上取代。

另外，序列編號1中之102位為序列編號2之77位的胺基酸，序列編號1之379位為序列編號2之327位的胺基酸，序列編號1之447位為序列編號2之395位的胺基酸，在序列編號2或與其具有85%、90%或95%以上同一性之胺基酸序列中，除了上述將白胺酸取代成半胱胺酸之變異及／或60位的麩胺酸的變異，再者，上述189位及／或190位或者42位及／或384位的變異以外，尚可導入此等中之一者或兩者的變異。此外，序列編號1中之102位為序列編號3之77位的胺基酸，序列編號1之379位為序列編號3之354位的胺基酸，序列編號1之447位為序列編號3之422位的胺基酸，在序列編號3或與其具有85%、90%或95%以上同一性之胺基酸序列中，除了上述將白胺酸取代成半胱胺酸之變異、60位的麩胺酸的變異及／或弗林蛋白酶辨識部位的變異，再者，上述189位及／或190位或者42位及／或384位的變異以外，尚可導入此等中之一者或兩者的變異。

本發明之變異型RSV F蛋白質之具體態樣為包含序列編號6～9中任一胺基酸序列之變異型RSV F蛋白質。具體而言，包含下述胺基酸變異。

序列編號6(FH_50中所包含之變異型RSV_F蛋白質)的胺基酸序列為在序列編號3中，序列編號1之141位的白胺酸被取代成半胱胺酸，序列編號1之373位的白胺酸被取代成半胱胺酸，序列編號1之135位的精胺酸被取代成天冬醯胺酸，序列編號1之136位的精胺酸被取代成天冬醯胺酸，序列編號1之189位的蘇胺酸被取代成纈胺酸，序列編號1之190位的絲胺酸被取代成纈胺酸，序列編號1之102位的脯胺酸被取代成丙胺酸，序列編號1之379位的異白胺酸被取代成纈胺酸，序列編號1之447位的甲硫胺酸被取代成纈胺酸而得之胺基酸序列。在此處，實際上，序列編號6的胺基酸序列可區分成F2多肽的胺基酸序列，及附加pep27之F1多肽(細胞外區域)的胺基酸序列，但在此處係以將該等進行結合而得之一個胺基酸序列的形式來表示。從而，在算出下述胺基酸序列的同一性之情況，係與依序結合對象蛋白質之F2多肽的胺基酸序列及附加pep27之F1多肽(細胞外區域)的胺基酸序列而得之胺基酸序列進行比較。以下皆相同。

序列編號7(FH_81中所包含之變異型RSV_F蛋白質)的胺基酸序列為在序列編號3中，序列編號1之141位的白胺酸被取代成半胱胺酸，序列編號1之373位的白胺酸被取代成半胱胺酸，序列編號1之135位的精胺酸被取代成天冬醯胺酸，序列編號1之136位的精胺酸被取代成天冬醯胺酸，序列編號1之189位的蘇胺酸被取代成纈胺酸，序列編號1之190位的絲胺酸被取代成纈胺酸，序列編號1之60位的麩胺酸被取代成甲硫胺酸，序列編號1之102位的脯胺酸被取代成丙胺酸，序列編號1之379位的異白胺酸被取代成纈胺酸，序列編號1之447位的甲硫胺酸被取代成纈胺酸而得之胺基酸序列。

序列編號8(FH_82中所包含之變異型RSV_F蛋白質)的胺基酸序列為在序列編號3中，序列編號1之141位的白胺酸被取代成半胱胺酸，序列編號1之373位的白胺酸被取代成半胱胺酸，序列編號1之135位的精胺酸被取代成天冬醯胺酸，序列編號1之136位的精胺酸被取代成天冬醯胺酸，序列編號1之189位的蘇胺酸被取代成纈胺酸，序列編號1之190位的絲胺酸被取代成纈胺酸，序列編號1之42位的離胺酸被取代成精胺酸，序列編號1之384位的纈胺酸被取代成蘇胺酸，序列編號1之102位的脯胺酸被取代成丙胺酸，序列編號1之379位的異白胺酸被取代成纈胺酸，序列編號1之447位的甲硫胺酸被取代成纈胺酸而得之胺基酸序列。

序列編號9(FH_85中所包含之變異型RSV_F蛋白質)的胺基酸序列為在序列編號3中，序列編號1之141位的白胺酸被取代成半胱胺酸，序列編號1之373位的白胺酸被取代成半胱胺酸，序列編號1之135位的精胺酸被取代成天冬醯胺酸，序列編號1之136位的精胺酸被取代成天冬醯胺酸，序列編號1之189位的蘇胺酸被取代成纈胺酸，序列編號1之190位的絲胺酸被取代成纈胺酸，序列編號1之60位的麩胺酸被取代成甲硫胺酸，序列編號1之42位的離胺酸被取代成精胺酸，序列編號1之384位的纈胺酸被取代成蘇胺酸，序列編號1之102位的脯胺酸被取代成丙胺酸，序列編號1之379位的異白胺酸被取代成纈胺酸，序列編號1之447位的甲硫胺酸被取代成纈胺酸而得之胺基酸序列。

本發明之一態樣為一種變異型RSV F蛋白質，其係在與序列編號6～9中任一胺基酸序列具有85%以上的同一性，較佳為90%以上的同一性，更佳為95%以上的同一性之胺基酸序列中，各自包含上述胺基酸的取代，在前述半胱胺酸間形成雙硫鍵，具有誘導出抗RSV的pre型F蛋白質之抗體之能力。另外，與預定的胺基酸序列具有預定的同一性之胺基酸序列的定義係與既述之內容相同。

(融合蛋白質) 本發明之其他態樣為一種融合蛋白質，其包含前述變異型RSV F蛋白質，及至少多聚體化結構域。融合蛋白質亦可包含變異型RSV F蛋白質及多聚體化結構域以外之多肽，該變異型RSV F蛋白質及多聚體化結構域以外之多肽只要不會妨礙前述變異型RSV F蛋白質的效果，即無特別限定，具體而言，可例示凝血酶切斷模體等模體、His標籤或Strep標籤II(StrepTagII)等純化用標籤。

多聚體化結構域只要是變異型RSV F蛋白質進行多聚體化所需之多肽，即無特別限制，可例示用於三聚體化之foldon結構域(Yizhi Tao et. al. 1997. Structure 5(6):789)(Frank S et. al. 2001. Journal of molecular biology 308(5):1081)。作為foldon結構域，可例示源自噬菌體T4纖蛋白(fibritin)之foldon結構域。作為其胺基酸序列，可例示序列編號21的胺基酸序列。

作為融合蛋白質之例，可列舉在具有序列編號6～9的胺基酸序列之變異型RSV F蛋白質的C末端連結有foldon結構域之融合蛋白質。具體而言，可列舉具有序列編號10～13的胺基酸序列者。實際上，序列編號10～13的胺基酸序列可區分成F2多肽的胺基酸序列，及在附加pep27之F1多肽(細胞外區域)的C末端連結有foldon結構域之胺基酸序列，但在此處係以將該等進行結合而得之一個胺基酸序列的形式來表示。

(多聚化體) 本發明之其他態樣為前述融合蛋白質之多聚化體。前述多聚化體係前述融合蛋白質經由foldon結構域等多聚體化結構域進行締合而得。多聚化體較佳為前述融合蛋白質之三聚化體。

(多核苷酸) 本發明之其他態樣為一種多核苷酸，其編碼出前述變異型RSV F蛋白質或前述融合蛋白質。編碼出前述變異型RSV F蛋白質之多核苷酸可將編碼出變異導入前之RSV F蛋白質之多核苷酸序列(序列編號74)作為參考，藉由標準的基因工程技術，製成已導入所期望的變異之多核苷酸而獲得。此外，編碼出前述融合蛋白質之多核苷酸亦可使用編碼出前述變異型RSV F蛋白質之多核苷酸及編碼出該變異型RSV F蛋白質以外之多肽之多核苷酸，藉由標準的基因工程技術而獲得。

具體而言，作為用於使本發明之融合蛋白質進行表現並在宿主中產生之多核苷酸序列，可例示序列編號14～17的多核苷酸序列。序列編號14為用於使具有序列編號10的胺基酸序列之融合蛋白質進行表現並在宿主中產生之多核苷酸序列，在編碼出該融合蛋白質之序列的5’末端側附加有編碼出訊息胜肽之序列。序列編號15為用於使具有序列編號11的胺基酸序列之融合蛋白質進行表現並在宿主中產生之多核苷酸序列，在編碼出該融合蛋白質之序列的5’末端側附加有編碼出訊息胜肽之序列。序列編號16為用於使具有序列編號12的胺基酸序列之融合蛋白質進行表現並在宿主中產生之多核苷酸序列，在編碼出該融合蛋白質之序列的5’末端側附加有編碼出訊息胜肽之序列。序列編號17為用於使具有序列編號13的胺基酸序列之融合蛋白質進行表現並在宿主中產生之多核苷酸序列，在編碼出該融合蛋白質之序列的5’末端側附加有編碼出訊息胜肽之序列。

另外，各密碼子只要會編碼出所意圖之胺基酸，則可使用任何者。例如，編碼出Gly之密碼子有GGT、GGC、GGA、GGG此4種，可使用其中之任何者。此外，各密碼子可經最適化，亦可未經最適化，較佳係經最適化。

編碼出變異型RSV F蛋白質之多核苷酸在包含上述特定的變異，編碼出具有誘導出抗RSV的pre型F蛋白質之抗體之能力之變異型RSV F蛋白質之前提下，亦可為與具有此等多核苷酸序列之互補序列之多核苷酸在嚴苛的條件下會進行雜交之多核苷酸。在此處，所謂嚴苛的條件，可列舉例如南方雜交(Southern hybridization)之後，以68℃，0.1×SSC，相當於0.1%SDS之鹽濃度施行洗淨之條件。

(表現單元) 本發明之其他態樣為一種表現單元，其包含前述多核苷酸。前述表現單元只要包含使前述多核苷酸進行表現之機構即可，例如，可包含啟動子序列或轉錄終結訊息序列等表現所需之要素，可為用於標準的基因工程技術之表現單元。表現單元可包含在例如重組載體中。作為重組載體，可例示質體載體或病毒載體，可列舉能夠在原核細胞中進行表現之載體或能夠在真核細胞中進行表現之載體、能夠在源自哺乳動物之細胞中進行表現之載體。

(宿主細胞) 本發明之其他態樣為一種宿主細胞，其包含前述表現單元。較佳為以包含前述表現單元之重組載體進行轉形而得之宿主細胞。作為前述宿主細胞，只要由前述表現單元表現出前述多核苷酸所編碼出之蛋白質，即無特別限定，可為用於標準的基因工程技術者。具體而言，可例示諸如大腸菌、枯草菌般之原核細胞或真核細胞、源自哺乳動物之細胞。多核苷酸向宿主細胞之導入可使用磷酸鈣法、DEAE葡聚糖法、電穿孔法、脂轉染法等公知的手段來施行。藉由將宿主細胞在適當的條件下進行培養，便可使前述變異型RSV F蛋白質或融合蛋白質進行表現，生產出前述變異型RSV F蛋白質、融合蛋白質或該等之多聚化體。所生產出之前述變異型RSV F蛋白質、融合蛋白質或該等之多聚化體可藉由公知的手段予以純化。

(免疫原) 本發明之其他態樣為一種免疫原，其包含前述變異型RSV F蛋白質、前述融合蛋白質、前述多聚化體或下述粒子化體。即，前述變異型RSV F蛋白質、前述融合蛋白質、前述多聚化體或前述粒子化體可使用作為免疫原。該免疫原在不會妨礙前述變異型RSV F蛋白質的效果之前提下，可包含前述變異型RSV F蛋白質、前述融合蛋白質、前述多聚化體或前述粒子化體中之任1種，亦可包含任2種，亦可包含全部。其中，多聚化體，特定而言，三聚體係較佳，此外，粒子化體係較佳被用作免疫原。針對多聚化體的製造，係如上述，針對粒子化體，係於以下詳細地進行說明。另外，本發明之免疫原亦可包含：包含標準的免疫原之保存劑或賦形劑等。

(粒子化體) 本發明之其他態樣為前述變異型RSV F蛋白質或前述多聚化體之粒子化體。粒子化體為變異型RSV F蛋白質或多聚化體集合2個以上而形成粒子而得者，只要是可效率佳地誘導出中和能力較高的抗體者，即無特別限制，例如為前述變異型RSV F蛋白質或前述多聚化體經由粒子化結構域集合2個以上而形成粒子而得者。在此處，粒子化體及粒子的形狀不一定限於球狀，只要朝向一定方向進行集合即足夠。即，較佳為進一步使粒子化結構域融合至前述變異型RSV F蛋白質或前述融合蛋白質，前述變異型RSV F蛋白質或前述融合蛋白質之多聚化體經由該粒子化結構域進行集合而形成粒子而得者。較佳係使用粒子化結構域結合至前述變異型RSV F蛋白質或前述融合蛋白質的C末端而得之粒子化體製造用融合蛋白質來進行粒子化。針對粒子化體製造用融合蛋白質，係予以後述。

在粒子化體中，前述粒子化結構域在變異型RSV F蛋白質或多聚化體的立體結構上，較佳係存在於相較於抗原決定位Φ而言更接近於抗原決定位I之位置。即，較佳為由於粒子化結構域發生集合而構成核，變異型RSV F蛋白質或多聚化體之抗原決定位I存在於內側，抗原決定位Φ露出於外側之粒子化體。從而，本發明之一態樣所涉及之粒子化體為變異型RSV F蛋白質或多聚化體經由粒子化結構域以至少露出RSV F蛋白質之抗原決定位Φ，至少不露出RSV F蛋白質之抗原決定位I之方式集合2個以上而得之粒子化體。在此處，所謂「以不露出抗原決定位I之方式」，並不需要抗原決定位I完全不露出，只要是抗體或各種免疫細胞對抗原決定位I之可及性(accessibility)降低之程度即可。

在本發明之粒子化體之一態樣中，因變異型RSV F蛋白質之抗原決定位Φ及抗原決定位I在該蛋白質的立體結構上係位於兩極，故可採取下列結構：由於形成核之粒子化結構域相較於抗原決定位Φ而言更接近於抗原決定位I，屬於不需要的抗原決定位之抗原決定位I作為抗原會被遮蔽，屬於有用的抗原決定位之抗原決定位Φ作為抗原會易於產生機能。在此處，所謂不需要的抗原決定位，係意味在將該變異型RSV F蛋白質、其融合蛋白質、該等之多聚化體或該等之粒子化體用作免疫原時，在人類中一般而言會誘導出RSV病毒感染中和能力較低的抗體之抗原決定位，具體而言，可列舉抗原決定位I。另一方面，所謂有用的抗原決定位，係意味在將該變異型RSV F蛋白質、其融合蛋白質、該等之多聚化體或該等之粒子化體用作免疫原時，在人類中一般而言會誘導出RSV病毒感染中和能力較高的抗體之抗原決定位，具體而言，可列舉抗原決定位Φ或抗原決定位V。藉由採取此結構，便可發揮出藉由立體障礙效果使抗體或各種免疫細胞對不需要的抗原決定位之可及性降低之效果。

用於粒子化之粒子化結構域為使變異型RSV F蛋白質或多聚化體進行粒子化之多肽，可列舉可結合至支架粒子者(例如：支架粒子結合胜肽)、可疏水集合者(例如：疏水性胜肽鏈)或具有自締合性者(例如：自締合性胜肽)等。

首先，針對使用支架粒子之粒子化之態樣進行說明。即，變異型RSV F蛋白質或多聚化體結合至支架粒子之態樣。作為支架粒子之材料，並無特別限制，可列舉具有粒子形成能力之蛋白質、脂質雙層膜、套膜、脂質體、非離子體(niosome)、病毒小體(virosome)、鐵小體(ferrosome)、金奈米粒子、樹脂、氧化矽、高分子微胞、凝膠等。作為具有粒子形成能力之蛋白質之例，可列舉形成VLP(virus-like particle)或VP(virus particle)之病毒蛋白質或病毒蛋白質之改良體(例如日本專利特開2004-2313號公報)。可列舉例如以欠缺原本對肝細胞之感染能力之方式進行改良，並進一步以展示出支架分子之方式進行改良而得之B型肝炎病毒表面抗原蛋白質，若使該蛋白質在真核細胞中進行表現，則會在內質網膜等膜上作為膜蛋白質進行表現，蓄積，並作為VLP被釋放。作為支架粒子，更具體而言，可列舉將蛋白A之Fc結合結構域(Z結構域)插入B型肝炎病毒表面抗原(HBs抗原)蛋白質之PreS區域中所製作而得之源自蛋白質之VLP，可使用例如Bionanocapsule-ZZ(Beacle公司型號：BCL-DC-002)。在支架粒子的表面，較佳係固定化有會與作為粒子化結構域之支架粒子結合胜肽進行結合之分子(支架分子)。可列舉例如蛋白A之Fc結合結構域，可經由支架粒子結合胜肽而使變異型RSV F蛋白質或其多聚化體進行結合。

另外，支架分子與支架粒子結合胜肽之結合可為共價鍵結、非共價鍵結中之任何者。作為共價鍵結之例，可列舉總稱為點擊化學(click chemistry)之手法(可例示炔(乙炔等)-疊氮化物鍵結、半胱胺酸-馬來醯亞胺鍵結、一級胺-NHS酯鍵結)、產生電荷轉移結合之手法(可例示醯肼-醛鍵結)、依多肽而產生共價鍵結之手法(使用SpyTag-SpyCatcher之方法等)等。作為非共價鍵結之例，可列舉離子性相互作用、疏水結合、氫鍵等。具體而言，可列舉蛋白標籤與蛋白標籤結合分子之組合(可例示生物素-抗生物素蛋白、Fc-蛋白A、GST(glutathione S-transferase)-麩胱甘肽、MBP(maltose binding protein)-麥芽糖、His標籤-鎳、SBP標籤-鏈黴卵白素)、抗體與抗原之組合等。作為支架分子與支架粒子結合胜肽之組合，較佳為IgG1之Fc結構域(序列編號30)與蛋白A之Fc結合結構域(Z結構域)之組合。可將IgG1之Fc結構域使用於支架分子，並將蛋白A之Fc結合結構域使用於支架粒子結合胜肽，亦可將IgG1之Fc結構域使用於支架粒子結合胜肽，並將蛋白A之Fc結合結構域使用於支架分子。另外，上述支架分子或支架粒子結合胜肽在彼此可進行共價鍵結或非共價鍵結之前提下，可使用該等之部分片段，或者加以改良。

其次，針對使用疏水性胜肽鏈作為粒子化結構域之粒子化之態樣進行說明。在此態樣中，疏水性胜肽鏈係結合至變異型RSV F蛋白質或融合蛋白質，變異型RSV F蛋白質或融合蛋白質係經由該疏水性胜肽鏈而形成粒子。疏水性胜肽鏈係意味包含疏水性胺基酸，會進行自集合而形成該粒子化體之胺基酸殘基數5～50，較佳為10～30的胜肽鏈。在此處，作為疏水性較強的胺基酸，可列舉纈胺酸、白胺酸、苯丙胺酸、異白胺酸等，更佳為白胺酸或異白胺酸。疏水性胜肽鏈中之疏水性胺基酸的比例較佳為20～60%。在疏水性胜肽鏈中，疏水性胺基酸較佳係顯現於疏水性胜肽鏈的表面。表面之疏水性胺基酸的比例較佳為10%以上，但若比率過高，則會在細胞內發生凝集而不進行分泌，因而表面之疏水性胺基酸較佳為50%以下、30%以下、20%以下。另一方面，內側之疏水性胺基酸的比率較高，疏水性胜肽鏈的結構會較安定，因而較佳。疏水性胺基酸以外之胺基酸係任何者皆可，特定而言，為了提高分泌效果，較佳係包含20%以上組胺酸。藉由將疏水性胜肽鏈製成由7個胺基酸所構成之胜肽之重複序列，便會形成螺旋結構，且上述設計係易於施行，因而可較佳地使用。例如，疏水性胜肽鏈較佳為由疏水性胺基酸配置於第1、3、5個之7個胺基酸所構成之胜肽序列之重複序列。重複數係例如為2～5，較佳為2～3。作為疏水性胜肽鏈之較佳例，可列舉CC02、CC03、CC07、CC08(依序為序列編號40、41、42、43)，在此等之中，更佳為CC07(序列編號42)。

其次，針對使用自締合性蛋白質結構域作為粒子化結構域之粒子化之態樣進行說明。在此態樣中，自締合性蛋白質結構域係結合至變異型RSV F蛋白質或融合蛋白質，變異型RSV F蛋白質或融合蛋白質係經由該自締合性蛋白質結構域而形成粒子。作為具有自締合性之蛋白質(self-assembly protein)之例，可列舉B型肝炎病毒之核心抗原(HBcAg)、人類乳頭狀瘤病毒之衣殼蛋白(HPV L1)、E型肝炎病毒之衣殼蛋白(HEV capsid)、噬菌體Qβ外殼蛋白、諾瓦克病毒(Norwalk virus)(諾羅病毒，NoV)衣殼、小病毒B19衣殼、苜蓿花葉病病毒(alfalfa mosaic virus)、鐵蛋白(ferritin)、膠囊蛋白(encapsulin)等。具有自締合性之蛋白質可為具有自締合性之部分片段，亦可為改良體。在使用HBcAg之情況，在與本發明之RSV F蛋白質或多聚化體進行結合時，較佳係使HBcAg之遠離用於自締合之締合面之部位且經自締合者之外側之部位與RSV F蛋白質或多聚化體進行結合。再者，在施行此種結合之情況，為了採取HBcAg原本的立體結構，較佳係在α3結構域的螺旋與α4結構域的螺旋之間插入連結子。連結子係例如為10～30個胺基酸的多肽，例如為GS連結子。作為在此種HBcAg之改良體上結合有FLAG標籤之序列，可列舉序列編號54。

＜粒子化體製造用融合蛋白質＞粒子化體製造用融合蛋白質為使用於製作上述粒子化體之蛋白質，其包含融合至本發明之變異型RSV F蛋白質的C末端或融合蛋白質的C末端之上述之支架粒子結合胜肽、疏水性胜肽鏈、自締合性蛋白質結構域等粒子化結構域。本粒子化體製造用融合蛋白質係藉由經由粒子化結構域進行集合而成為粒子化體。另外，在構成本發明之多聚化體之融合蛋白質的C末端間之距離會由於與粒子化結構域進行結合而發生變化之情況，可藉由在粒子化結構域與該C末端(多聚體化結構域)之間插入連結子，而減小對上述C末端間之距離之影響。連結子並無特別限制，較佳為5～20個胺基酸的胜肽，更佳為5～10個胺基酸的胜肽。序列在不會阻礙融合蛋白質的疫苗效果之前提下，並無特別限制，例如為由甘胺酸及絲胺酸所構成之GS連結子。連結子的位置只要是在變異型RSV F蛋白質或融合蛋白質之多聚體化結構域與粒子化結構域之間即可，在連結子之前後亦可包含標籤序列。標籤序列並無特別限制，較佳係使用通常用於蛋白質的純化之標籤序列，可例示例如FLAG標籤(序列編號28)、His標籤(序列編號25)、Strep標籤II(序列編號26)等。

粒子化體製造用融合蛋白質可藉由將編碼出粒子化結構域之DNA，再者，視需要地，編碼出連結子或標籤之DNA併入讀框(reading frame)並連結至編碼出變異型RSV F蛋白質或融合蛋白質之DNA，使其在宿主中進行表現而獲得。表現及純化方法可依與前述變異型RSV F蛋白質或融合蛋白質的表現及純化同樣的方式施行。

作為粒子化體製造用融合蛋白質之具體例，可列舉支架粒子結合胜肽結合至變異型RSV F蛋白質而得之態樣(該等之前驅物蛋白質的序列：序列編號31～39，此外，編碼出該等之多核苷酸序列：序列編號57～65)、疏水性胜肽鏈結合至變異型RSV F蛋白質而得之態樣(該等之前驅物蛋白質的序列：序列編號44～49，此外，編碼出該等之多核苷酸序列：序列編號66～71)、自締合性蛋白結構域結合至變異型RSV F蛋白質而得之態樣(該等之前驅物蛋白質的序列：序列編號55～56，此外，編碼出該等之多核苷酸序列：序列編號72～73)。另外，粒子化體製造用融合蛋白質亦可包含FLAG標籤(DYKDDDDK：序列編號28)、3個胺基酸(GGS)附加至FLAG標籤而得之標籤(GGSDYKDDDDK：序列編號29)等標籤序列。

(粒子化體製造方法) 粒子化體可藉由使用上述所獲得之粒子化體製造用融合蛋白質並使其進行粒子化之後，視需要將粒子化體進行純化而獲得。在使用支架粒子之情況，粒子化步驟可藉由將粒子化體製造用融合蛋白質與支架粒子進行混合並使其進行粒子化之後，除去未經粒子化之變異型RSV F蛋白質或其產物，將粒子化體進行純化而予以施行。作為支架粒子，可使用例如HBsAg VLP(Beacle公司型號：BCL-DC-002)。在使用包含疏水性胜肽鏈之粒子化體製造用融合蛋白質之情況，粒子化步驟可藉由經由疏水性胜肽鏈使粒子化體製造用融合蛋白質進行締合並進行粒子化之後，除去未經粒子化之變異型RSV F蛋白質或其產物，將粒子化體進行純化而予以施行。在使用包含自締合性蛋白結構域之粒子化體製造用融合蛋白質之情況，粒子化步驟可藉由經由自締合性蛋白結構域使粒子化體製造用融合蛋白質進行締合並進行粒子化之後，除去未經粒子化之變異型RSV F蛋白質或其產物，將粒子化體進行純化而予以施行。

在本發明之粒子化體中，較理想係每1粒子化體，例如以三聚體的形式結合2個以上，較佳為10個以上，更佳為20個以上。此外，在本發明之粒子化體中，較理想係每1nm² 粒子化體表面積，例如以三聚體的形式結合0.0001個以上，較佳為0.0005個以上，更佳為0.001個以上。在此處，所謂粒子化體表面積，係將粒子化體假定為以藉由動態光散射法測定而得之理論直徑作為直徑之球體時之表面積。每粒子化體表面積之個數可藉由例如將每1粒子化體之個數除以粒子化體表面積之方法來予以算出。藉由生成粒子化體，並選擇對抗原決定位I之結合能力較低且對抗原決定位Φ之結合能力較高者，熟習該項技術者可選擇最適合的每1粒子化體之個數或每1nm² 粒子化體表面積之個數。

另外，在本發明中，用於粒子化之RSV F蛋白質或多聚化體並不限於本發明之變異型RSV F蛋白質或多聚化體，只要是能夠使用作為RSV疫苗者，即無特別限制，亦可使用本發明之變異型RSV F蛋白質以外之變異型RSV F蛋白質或其多聚化體。例如，可為國際公開第2017／172890號或國際公開第2017／109629號所記載者。即，本發明之粒子化技術可一般地使用在RSV F蛋白質或其多聚化體的粒子化，在本發明之粒子化體中，包含RSV F蛋白質或其多聚化體之粒子化體，其係RSV F蛋白質或其多聚化體經由粒子化結構域集合2個以上而形成粒子而得之粒子化體，粒子化結構域或粒子化之方法可應用上述變異型RSV F蛋白質或多聚化體的粒子化中所說明之粒子化結構域或粒子化法。

(醫藥組成物) 本發明之其他態樣為一種醫藥組成物，其包含前述表現單元或前述免疫原作為有效成分。前述表現單元或前述免疫原可作為用於預防或治療RS病毒感染症之醫藥組成物。此外，本發明之其他態樣為一種RSV疫苗，其包含前述表現單元或前述免疫原。此亦為前述態樣所涉及之醫藥組成物為RSV疫苗之態樣。

前述醫藥組成物(包含RSV疫苗，以下相同)的投予途徑並無特別限定，可以非經口投予(例如皮內、肌肉內、皮下、經皮、黏膜)及經口投予中之任一投予途徑投予至哺乳動物。作為哺乳動物，可例示人類、小鼠、大鼠、兔、犬、貓、牛、豬、猴、黑猩猩等，較佳為人類。

前述醫藥組成物的劑型及其調製方法屬熟習該項技術者所周知，可藉由將前述表現單元或前述免疫原與藥學上可容許的藥載體等進行摻合而製造醫藥組成物。

所謂藥學上可容許的藥載體，可列舉例如固形製劑中之賦形劑、潤滑劑、黏合劑及崩解劑，或者液狀製劑中之溶劑、溶解輔助劑、懸浮化劑、等張化劑、緩衝劑及無痛化劑等。再者，亦可視需要適宜適量使用通常的防腐劑、抗氧化劑、著色劑、甜味劑、吸附劑、濕潤劑等添加物。

醫藥組成物亦可包含佐劑。作為佐劑，可例示凝膠型、菌體型、油乳濁液型、高分子奈米粒子型、合成型、細胞介素型等。作為凝膠型，可例示氫氧化鋁、磷酸鋁、磷酸鈣等。作為菌體型，可例示CpG、霍亂毒素、大腸菌易熱性毒素、百日咳毒素、胞壁醯二肽(muramyl dipeptide；MDP)等。作為油乳濁液型，可例示Freund不完全佐劑、MF59、SAF等。作為高分子奈米粒子型，可例示免疫刺激複合體、脂質體、生物分解性微球、源自皂苷之QS-21等。作為合成型，可例示非離子性嵌段共聚物、胞壁醯肽(muramyl peptide)類似物、聚磷腈、合成多核苷酸等。作為細胞介素型，可例示IFN-γ、IL-2、IL-12等。

用於非經口投予之劑型可例示注射用製劑(例如點滴注射劑、靜脈注射劑、肌肉注射劑、皮下注射劑、皮內注射劑、腦內投予製劑、脊髓內投予製劑)、外用劑(例如軟膏劑、糊劑、洗劑)、栓劑、吸入劑、眼劑、眼軟膏劑、點鼻劑、點耳劑、脂質體劑等。用於經口投予之劑型可例示固體或液體的劑型，具體而言，錠劑、被覆錠劑、丸劑、細粒劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑、糖漿劑、乳劑、懸浮劑、口含錠劑等。本發明之醫藥組成物較佳為液體的劑型，較佳為注射劑。

前述醫藥組成物的有效投予量係例如以投予途徑、疾患的種類、症狀的程度、患者的年齡、性別、體重、疾患的嚴重度、藥物動態及毒物學特徵等藥理學見解、有無利用藥物送達系統以及是否作為其他藥物之組合的一部分來進行投予等各式各樣的因子為基礎，由醫師加以決定。 [實施例]

以下記載實施例，但所有實施例皆並非解釋為限定的意義之實施例。

[實施例1] 就蛋白質的結構的安定化而言，形成使用半胱胺酸之共價鍵結(雙硫鍵)實屬有用。在先前研究中，已報導在RSV F蛋白質(以下，有時稱為「F蛋白質」)中將pre-F結構加以安定化之各式各樣的二硫化物變異(國際公開第2017／172890號、國際公開第2017／109629號)，但由於將屬於二級結構的成員之胺基酸取代成半胱胺酸，或者在距離較遠的部分使二硫化物形成，因而所獲得之變異體成為與天然結構(被認為是天然型F蛋白質在蛋白質表現時所採取之融合前結構)不同的結構之風險較大。於是，決定藉由將未採取二級結構且取代成半胱胺酸時之S原子間之距離比5Å更近之胺基酸對取代成半胱胺酸而實施結構的安定化。在距離的計算中，係使用已公開之結構模型(PDB登錄編號：4MMS)，將任意2個胺基酸取代成半胱胺酸而使其產生二面角N-Ca-Cb-S在能量上安定的構形，算出成為最短之S原子間之距離(表1)。其結果，可列舉後述之抗原FH_08及FH_09中所包含之變異型RSV F蛋白質(在本說明書中，有時稱為「變異蛋白質」。)之變異處作為候補。此2個候補係在變異處之變異前之胺基酸的側鏈無具極性之官能基，因而沒有起因於失去存在於天然型F蛋白質之極性基間相互作用(氫鍵等)之結構不安定化之風險，就此方面而言，被認為較優異。另外，表1中之「L141C」表示序列編號1的胺基酸序列中之141位的白胺酸變異成半胱胺酸。以下，在表中係使用同樣的標示。另外，F_native抗原之前驅物蛋白質(序列編號4)為在從A2株之天然型F0蛋白質去除F1多肽之跨膜區域及細胞內區域而得之多肽(序列編號1的胺基酸編號1～513)中，依序將foldon結構域(序列編號21)、凝血酶(thrombin)辨識序列、His標籤及包含Strep標籤II之序列(序列編號22)融合至具有P102A、I379V及M447V的變異之多肽的C末端側而得之多肽。在本實施例中，所有變異體皆以F_native抗原之前驅物蛋白質為基礎而製作，因而具有P102A、I379V及M447V的變異。另外，F_native前驅物蛋白質係在表現過程中經受加工，訊息胜肽及pep27區域會脫落。

上述F_native抗原係使編碼出F_native抗原之前驅物蛋白質(序列編號4)之多核苷酸(序列編號5)以哺乳類細胞作為宿主進行表現所製造而得。F_native抗原係F_native抗原之前驅物蛋白質(序列編號4)經受表現過程的加工後形成四級結構而得。訊息胜肽及pep27區域係由於加工而脫落，殘留的F2多肽序列及F1多肽(細胞外區域)、foldon結構域、凝血酶辨識序列、His標籤、包含Strep標籤II之序列係藉由雙硫鍵進行結合，再者，經預測主要藉由foldon結構域所產生之結合力來形成同源三聚體。將F native抗原之具體的製造方法示於下。將上述多核苷酸(序列編號5)藉由標準的基因工程技術插入pcDNA3.4載體(Thermo Fisher Scientific公司)中。藉由鹼基序列解析確認目標DNA序列插入，構築表現出F_native抗原之前驅物蛋白質之哺乳類細胞用表現載體。將用於導入細胞中之載體藉由標準的質體載體純化方法進行純化。

F_native抗原的表現係藉由使用Expi293 Expression System(Thermo Fisher Scientific公司)之哺乳類細胞分泌表現予以實施。使用屬於同套組的基因導入試劑之Expi Fectamin 293 Reagent將所純化而得之上述載體導入Expi293細胞中，藉由培養5日左右而使所編碼出之F_native抗原進行分泌表現，使用離心分離及孔徑0.22μm的過濾器僅取得上清液成分。

F_native抗原的純化係藉由使用Ni Sepharose High Performance(GE Healthcare公司)之親和層析予以實施。使Ni藥載體與將上述培養上清液成分以結合緩衝液(20mmol／L Tris-HCl pH7.4、500mmol／L NaCl、20mmol／L咪唑)稀釋約3倍左右而得之物進行反應一晝夜後，供予洗提緩衝液(20mmol／L Tris-HCl pH7.4、500mmol／L NaCl、500mmol／L咪唑)而使各抗原溶出。然後，使用超過濾膜將溶劑置換成PBS(pH7.4)，用作F_native抗原。

與上述同樣地準備編碼出抗原FH_08之前驅物蛋白質之多核苷酸，該抗原FH_08之前驅物蛋白質係將L141C及L373C此雙重變異導入F_native抗原之前驅物蛋白質中而得。此外，與上述同樣地準備編碼出抗原FH_09之前驅物蛋白質之多核苷酸，該抗原FH_09之前驅物蛋白質係將L142C及L373C此雙重變異導入F_native抗原之前驅物蛋白質中而得。將此等藉由上述方法進行表現、純化，而製造抗原FH_08及FH_09。

各抗原對各抗體之結合性係使用Octet QK384(ForteBio公司)，在PBS(pH7.4)，25℃，1000 rpm之條件下予以測定。藉由對經PBS(pH7.4)平衡化之蛋白A感測晶片(ForteBio公司)供給各抗體溶液180秒而使各抗體結合至感測晶片，繼而將供給各抗原溶液180秒時之檢出值的上升量定為各抗原對各抗體之結合訊號之值。就供予感測晶片之抗體而言，係使用能夠特異性地檢測出抗原決定位Φ之D25抗體。結合訊號之值係藉由求出與使用能夠不管F抗原的構形變化而進行結合之Palivizumab(Synagis肌肉注射液，AbbVie)時之結合訊號之值之比而予以正規化。

藉由以上操作，獲得下列結果：包含為了形成雙硫鍵而在2處導入半胱胺酸點變異而得之變異蛋白質之抗原FH_08及FH_09相比於包含該變異導入前之F蛋白質之F_native抗原而言，顯示出抗原決定位Φ的保守性明顯提升(圖1)。

[實施例2] 有報導指出天然型F蛋白質係藉由先經受第1弗林蛋白酶辨識部位的切斷而採取單體結構後，經受第2弗林蛋白酶辨識部位的切斷而使pep27區域消失，來促進三聚體化(Anders Krarup et al. 2015. Nature communications 6:8143)。但是，pep27區域在從天然中單離出之病毒株間係序列的長度及胺基酸的種類高度地保守，因而毋寧考慮到其對抗原的立體結構形成有不可或缺的效果之可能性。於是，決定將變異導入第2弗林蛋白酶辨識部位中而阻礙pep27區域的切斷，同時調查該變異對三聚體形成之效果。下述所製作而得之各抗原之前驅物蛋白質的變異內容係總結於表2。表2中之「FH_08+R135N，R136N」表示在抗原FH_08之前驅物蛋白質中，進一步地，序列編號1的胺基酸序列中之135位的精胺酸變異成天冬醯胺酸，且136位的精胺酸變異成天冬醯胺酸。「FH_09+R135N，R136N」表示在抗原FH_09之前驅物蛋白質中，進一步地，序列編號1的胺基酸序列中之135位的精胺酸變異成天冬醯胺酸，且136位的精胺酸變異成天冬醯胺酸。另外，在抗原FH23～25中，將抗原FH08之前驅物蛋白質中之pep27(p27)序列取代成各種GS連結子。GS連結子係使用GSGSGS(序列編號18)、(GGGGS)₂ (序列編號19)、(GGGGS)₃ (序列編號20)。

將編碼出上述各抗原之前驅物蛋白質之多核苷酸藉由標準的基因工程技術插入pcDNA3.4載體(Thermo Fisher Scientific公司)中。藉由鹼基序列解析確認目標DNA序列插入，構築表現出各抗原之前驅物蛋白質之各哺乳類細胞用表現載體。將用於導入細胞中之載體藉由標準的質體載體純化方法進行純化。

各抗原的表現及純化係藉由與實施例1同樣的操作予以實施。各抗原對各抗體之結合性亦藉由與實施例1同樣的操作予以測定，但作為供予感測晶片之抗體，係追加能夠檢測出pre-F的三聚體形成之AM14抗體。D25抗體及AM14抗體的結合訊號之值係藉由求出與使用能夠不管F抗原的構形變化而進行結合之Synagis抗體(AbbVie，Synagis肌肉注射液)時之結合訊號之值之比而予以正規化。

藉由以上操作，獲得下列結果：包含在第2弗林蛋白酶辨識部位追加變異而得之變異蛋白質之抗原FH_21、FH_24、FH_25相比於變異追加前之抗原FH_08而言，顯示出在保持抗原決定位Φ的保守性之情形下，三聚體的形成提升。在該等之中，相比於將pep27區域取代成人工連結子者(FH_24、FH_25)而言，在更接近於F_native抗原之pep27區域之抗原FH_21中，三聚體形成的提升較顯著(圖2、圖3)。

[實施例3] F_native抗原之前驅物蛋白質之189位及190位的胺基酸為蘇胺酸及絲胺酸，就在側鏈持有羥基之方面而言屬親水性胺基酸。但是，存在於189～190位的胺基酸的立體結構上之近位之胺基酸為57位的異白胺酸、167位的異白胺酸、171位的白胺酸、179位的纈胺酸、260位的白胺酸等，該等皆為疏水性胺基酸，因而考慮到有損及結構的安定性之可能性。於是，考慮到藉由使189～190位的胺基酸變異成疏水性胺基酸(纈胺酸、白胺酸、異白胺酸)而使結構安定化，有助於提升表現量之可能性。下述所製作而得之各抗原之前驅物蛋白質的變異內容係總結於表3。表3中之「FH_21+T189I」表示在抗原FH_21之前驅物蛋白質中，進一步地，序列編號1的胺基酸序列中之189位的蘇胺酸變異成異白胺酸。「FH_21+T189V」表示在抗原FH_21之前驅物蛋白質中，進一步地，序列編號1的胺基酸序列中之189位的蘇胺酸變異成纈胺酸。「FH_21+T189I，S190V」表示在抗原FH_21之前驅物蛋白質中，進一步地，序列編號1的胺基酸序列中之189位的蘇胺酸變異成異白胺酸，190位的絲胺酸變異成纈胺酸。「FH_21+T189L，S190V」表示在抗原FH_21之前驅物蛋白質中，進一步地，序列編號1的胺基酸序列中之189位的蘇胺酸變異成白胺酸，190位的絲胺酸變異成纈胺酸。「FH_21+T189V，S190V」表示在抗原FH_21之前驅物蛋白質中，進一步地，序列編號1的胺基酸序列中之189位的蘇胺酸變異成纈胺酸，190位的絲胺酸變異成纈胺酸。「FH_50+K42R，V384T」表示在抗原FH_50之前驅物蛋白質中，進一步地，序列編號1的胺基酸序列中之42位的離胺酸變異成精胺酸，384位的纈胺酸變異成蘇胺酸。再者，抽取天然的病毒單離株中所產生之點變異，施行各單獨變異的探討，結果由於2個點變異(K42R、V384T)而可看出使表現量提升之效果，因而決定亦一併導入此變異並施行探討。

各抗原的表現及純化係藉由與實施例2同樣的操作予以實施。各抗原的表現量係藉由使用標準的分光光度計之吸光度測定予以測定。使用純化後之抗原溶液的吸光度(280nm)A280、由胺基酸一級序列資訊所推定出之莫耳吸光度係數ε及分子量M、純化後之抗原溶液量Vp、表現培養液量Vc，算出每體積表現培養之表現量y(y=A280×M／ε×Vp／Vc)。

各抗原對D25抗體及AM14抗體之結合性係藉由與實施例2同樣的操作予以測定。藉由以上操作，獲得下列結果：追加189～190位的成為疏水性胺基酸(V、I、L)之變異而得之各抗原FH_50、FH_51、FH_52、FH_53、FH_55相比於變異追加前之抗原FH_21而言，顯示出在保持抗原決定位Φ的保守性及三聚體的形成之情形下，表現量明顯提升。再者，獲得下列結果：追加抽取自可能由自然界的病毒所引起之天然變異之2個點變異(K42R、V384T)而得之抗原FH_82顯示出在保持抗原決定位Φ的保守性及三聚體的形成之情形下，表現量進一步明顯提升(圖4、圖5、圖6)。

[實施例4] F_native之前驅物蛋白質之60位的胺基酸為麩胺酸，由於隸屬於酸性胺基酸，一般已知溶劑在中性的條件下帶有負電荷。此胺基酸在立體結構上係與在相同的中性條件下帶有負電荷之194位的天冬胺酸鄰接，便考慮到由於負電荷相鄰而結構不安定化之可能性。於是，決定實施在F_native之前驅物蛋白質的胺基酸序列中，將60位的胺基酸變更成酸性胺基酸以外之胺基酸之變異。惟，將60位的胺基酸變更成天冬醯胺酸時，為了避免60～62位的胺基酸成為一般已知的N型糖鏈結合模體(Asn-X-Ser／Thr)，便決定同時將62位的胺基酸從絲胺酸變更成丙胺酸。下述所製作而得之抗原之前驅物蛋白質的變異內容係總結於表4。

各抗原的表現及純化係藉由與實施例2同樣的操作予以實施。各抗原對D25抗體及AM14抗體之結合性係藉由與實施例2同樣的操作予以測定。藉由以上操作，獲得下列結果：將60位變更成M、F、L、S、T時，顯示出抗原決定位Φ的保守性及三聚體的形成提升(圖7、圖8)。

[實施例5]與先前品之比較作為使F抗原之pre-F安定化之技術，最被充分報導之變異之一，有DS-Cav1變異(S155C、S290C、S190F、V207L)(Jason S. McLellan et al. 2013. Science 342: 592)。於是，決定將前述實施例中所發現之有用的抗原FH_50及將有用的變異進一步導入抗原FH_50中而得之表5所記載之抗原與導入DS-Cav1變異而得之抗原F_DS-Cav1進行比較。此外，決定亦一併製作已知採取post-F三聚體結構之抗原ΔFP furin_wt F_ecto (Kurt A. Swanson et al. 2014. Journal of Virology. 88(20): 11802)，用於抗原的評估。將下述所製作而得之抗原之前驅物蛋白質的變異內容總結於表5。抗原FH_81～85之前驅物蛋白質係在抗原FH_50之前驅物蛋白質中各自導入E60M、K42R+V384T或E60M+K42R+ V384T的變異而得。

將編碼出上述各抗原之前驅物蛋白質之多核苷酸藉由標準的基因工程技術插入pcDNA3.4載體(Thermo Fisher Scientific公司)中。抗原F_DS-Cav1之前驅物蛋白質係設為由序列編號23所構成之胺基酸序列，ΔFP furin_wt F_ecto 之前驅物蛋白質係設為由序列編號24所構成之胺基酸序列。藉由鹼基序列解析確認目標DNA序列插入，構築表現出各抗原之前驅物蛋白質之各哺乳類細胞用表現載體。將用於導入細胞中之載體藉由標準的質體載體純化方法進行純化。

各抗原的表現及純化係藉由與實施例2同樣的操作予以實施。各抗原的表現量係藉由與實施例3同樣的操作予以實施。

(抗體結合性試驗) 各抗原對各抗體之結合性係藉由與實施例2同樣的操作予以測定，但作為供予感測晶片之抗體，係追加辨識抗原決定位I之131-2A抗體。D25抗體、AM14抗體及131-2A抗體的結合訊號之值係藉由求出與使用能夠不管F抗原的構形變化而進行結合之Synagis抗體(AbbVie，Synagis肌肉注射液)時之結合訊號之值之比而予以正規化。

藉由以上操作，獲得下列結果：抗原FH_50、FH_81、FH_82、FH_85相比於先前文獻之抗原F_DS-Cav1而言，顯示出抗原決定位Φ的保守性及三聚體的形成不怎麼變，在另一方面，已知會誘導出病毒感染中和能力明顯較低的抗體之抗原決定位I不怎麼被檢測出(圖9、圖10、圖11)。此暗示在疫苗中，存在由於幾乎無助於病毒中和之免疫細胞的活化，反而使症狀惡化之風險，但新穎地發現之變異的導入相比於DS-Cav1變異的導入而言，其風險較低。

(人類血清中之病毒中和抗體的吸附試驗) 藉由先前的操作，顯示出抗原FH_50、FH_81、FH_82、FH_85有抑制無助於病毒中和之免疫的誘導之效果之可能性。為了更詳細地探討該效果，便決定使用健康成人血清，針對抗原FH_50、FH_81、FH_82、FH_85及F_DS-Cav1，驗證其會結合至健康成人血清中之何種抗體。

對3人份的健康成人血清，實施使用磁珠Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown(Thermo Fisher Scientific，10103D)之抗原吸附操作。首先，以PBS(pH7.4)洗淨2次，對珠粒液45μL份的珠粒供給20μg的抗原F_DS-Cav1、FH_50、FH_81、FH_82或FH_85並使其進行結合後，以牛血清白蛋白進行阻斷。其次，對將各健康成人血清100μL以PBS(pH7.4)稀釋10倍而得之物添加珠粒並進行保溫培養(4℃，1小時，旋轉)後，藉由清除珠粒而實施結合至抗原之抗體的除去。

為了確認會何種程度地結合到結合至Post-F之抗體(被認為病毒感染中和能力比較低的抗體)，係實施將抗原ΔFP furin_wt F_ecto 進行固相化之ELISA試驗。就抗原結合緩衝液而言，係使用碳酸重碳酸緩衝液(Sigma-Aldrich，C3041-50CAP)，就樣品的稀釋及盤的洗淨而言，係使用TBS(TaKaRa，T9142)。對96半孔盤添加2.0pmol的抗原ΔFP furin_wt F_ecto 並直接固相化，以牛血清白蛋白進行阻斷。藉由對健康成人血清或抗原吸附操作後之健康成人血清適當地添加緩衝液而製作4倍稀釋系列，添加至盤中並進行保溫培養(室溫，1小時，靜置)。然後，除去稀釋血清，使過氧化酶結合抗人類IgG抗體(Jackson Immuno Research，709-035-149)進行結合，進一步以標準的過氧化酶檢測試劑使其進行顯色後，以經由標準的盤讀取儀之吸光度測定求出顯色的強度。藉由測定點間進行分段線性內插而求出血清的稀釋率與吸光度之關係，將吸光度成為0.2之稀釋率之倒數定為結合至post-F之抗體的抗體力價，將吸附操作前之血清的抗體力價設為100%時，將吸附操作後之血清的抗體力價的減少量之相對值定為吸附率(圖12)。

為了確認由於吸附操作，持有病毒感染中和能力之抗體會被何種程度地去除，係實施使用RS病毒(ATCC，VR-1540)及Vero細胞(ATCC，CCL-81)之感染評估。藉由對健康成人血清或抗原吸附操作後之健康成人血清適當地添加PBS(pH7.4)而製作5倍稀釋系列，混合RS病毒並進行保溫培養(室溫，30分鐘，靜置)後，添加至將4×10⁴ 個細胞量接種至96孔盤之各孔中並培養1日而得之Vero細胞中，進行保溫培養(37℃，潮濕，2小時，靜置)。然後，除去病毒液後，每1孔添加100μL將Sodium Pyruvate Solution(Nacalai，06977-34)及Antibiotic-Antimycotic Mixed Stock Solution(Nacalai，09366-44)各添加1%(v／v)至DMEM, High Glucose(Thermo Fisher Scientific，11965)中而得之培養基，進一步進行保溫培養(37℃，潮濕，16小時，靜置)。其次，以多聚甲醛將細胞進行固定，對經以Triton X-100(Nacalai，35501-15)進行通透處理之細胞，使用Anti-RSV Antibody, fusion protein, all type A, B strains, clone 133-1H, Alexa Fluor 488(Merck，MAB8262X)及Heochst33258(Dojindo，343-07961)將感染細胞及全細胞的核進行染色，使用成像儀IN Cell Analyzer(GE Healthcare公司)對感染細胞區域中之核的數量加以計數並定為病毒感染細胞數。各血清的稀釋率x與感染數y之關係係藉由將西格瑪曲線(sigmoid curve)(y=Y_max ／(1+(x／IC₅₀ )^C ))擬合(經由最小平方誤差法之擬合)至實驗結果而予以求出，將IC₅₀ 之倒數定為病毒感染中和力價。將吸附操作前之血清的病毒感染中和力價設為100%時，將吸附操作後之病毒感染中和力價的減少量之相對值定為吸附率(圖13)。

藉由以上操作，顯示出抗原FH_50、FH_81、FH_82、FH_85相比於先前文獻之抗原F_DS-Cav1而言，存在於健康成人血清中之post-F辨識抗體的結合性較低，在吸附操作中，僅可一半程度地結合抗體。儘管如此，亦顯示出有助於病毒感染中和能力之抗體係與F_DS-Cav1同樣地大致全部進行結合，在吸附操作中殘留的抗體中，幾乎沒有病毒感染中和能力。以上結果暗示新穎地發現之變異相比於DS-Cav1變異的導入而言，對病毒感染中和沒有效果之抗體的結合較少，使用作為疫苗抗原時，誘導出無助於病毒感染防禦之抗體之風險較低。

(小鼠免疫所誘導出之抗體的驗證) 藉由先前的操作，暗示變異蛋白質有抑制無助於病毒中和之免疫的誘導之效果。為了進一步詳細地探討該效果，係實施以抗原FH_50、FH_81、FH_82、FH_85或F_DS-Cav1對小鼠進行免疫所誘導出之抗體的分析。

小鼠免疫血清係藉由以各變異蛋白質對BALB／cAnNCrlCrlj(日本Charles River)(雌，7週齡)進行免疫而取得。將溶解於PBS(pH7.4)中之抗原FH_50、FH_81、FH_82、FH_85或F_DS-Cav1(抗原濃度：0.80mg／mL)與氫氧化鋁(InvivoGen，vac-alu-250)各等量充分進行混合而得之液在飼育第0日及飼育第21日對小鼠的後肢大腿部進行50μL肌肉內投予(每1組設為5隻。)。在飼育第42日從後大靜脈取得血液，將所取得之血液進行保溫培養(室溫，約2小時，靜置)後，進行離心分離並回收血清，進行去活化(55℃，30分鐘)，而製成小鼠免疫血清。

為了確認會誘導出何種程度比例的結合至融合後構形之抗體，係對各小鼠免疫血清實施使用磁珠Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown(Thermo Fisher Scientific，10103D)之抗原吸附操作。首先，以PBS (pH7.4)洗淨2次，對珠粒液45μL份的珠粒供給20μg的ΔFP furin_wt F_ecto 並使其進行結合後，以牛血清白蛋白進行阻斷。其次，對將各小鼠免疫血清50μL以PBS(pH7.4)稀釋20倍而得之物添加珠粒並進行保溫培養(4℃，1小時，旋轉)後，藉由清除珠粒而實施結合至抗原之抗體的除去。

其次，實施將抗原F_DS-Cav1進行固相化之ELISA試驗，測定經由抗原吸附操作之抗F抗原抗體的減少率。就抗原結合緩衝液而言，係使用碳酸重碳酸緩衝液(Sigma-Aldrich，C3041-50CAP)，就樣品的稀釋及盤的洗淨而言，係使用PBS(TaKaRa，T9183)。對96半孔盤添加2.0pmol的抗原F_DS-Cav1並直接固相化，以牛血清白蛋白進行阻斷。藉由對小鼠免疫血清或抗原吸附操作後之小鼠免疫血清適當地添加緩衝液而製作5倍稀釋系列，添加至盤中並進行保溫培養(室溫，2小時)。然後，除去稀釋血清，使過氧化酶結合抗小鼠抗體抗體(DaKo，P0161)進行結合，進一步以標準的過氧化酶檢測試劑使其進行顯色後，以經由標準的盤讀取儀之吸光度測定求出顯色的強度。藉由測定點間進行分段線性內插而求出血清的稀釋率與吸光度之關係，將吸光度成為0.2之稀釋率之倒數定為所檢測出之抗F抗原抗體的抗體力價，將吸附操作前之血清的抗體力價設為100%時，將吸附操作後之血清的抗體力價的減少量之相對值定為吸附率(圖14)。

藉由以上操作，顯示出抗原FH_50、FH_81、FH_82、FH_85相比於先前文獻之抗原F_DS-Cav1而言，post-F辨識抗體的誘導比例較少。亦即，呈下列結果：暗示在將抗原FH_50、FH_81、FH_82、FH_85用作疫苗抗原之情況，誘導出無助於病毒感染防禦之抗體之風險較低。

[實施例6]與先前品之比較2 實施例5中所實施之抗原FH_50、FH_81、FH_82、FH_85之F蛋白質部分皆包含L141C及L373C的變異。該變異為在實施例1中為了導入雙硫鍵所導入之變異，在先前專利(國際公開第2017／109629號)中，已探討將雙硫鍵導入至比較近的部位(Mutant ID：pXCS524。L142C、N371C)，並已探討進一步加入變異而得之最適化抗原(Mutant ID：pXCS881。L142C、N371C、S55C、L188C、T54H、V296I、D486S、E487Q、D489S)。於是，決定將前述實施例中所發現之有用的抗原與導入pXCS524變異或pXCS881變異而得之抗原Pf524或Pf881進行比較。將下述所製作而得之抗原之前驅物蛋白質的變異內容總結於表6。

抗原FH_08、FH_82及FH85係各自使用實施例1、實施例3及實施例5所記載者。Pf524及Pf881係將編碼出此等前驅物蛋白質之多核苷酸藉由標準的基因工程技術插入pcDNA3.4載體(Thermo Fisher Scientific公司)中，藉由鹼基序列解析確認目標DNA序列插入，構築表現出各抗原之前驅物蛋白質之各哺乳類細胞用表現載體。將用於導入細胞中之載體藉由標準的質體載體純化方法進行純化。

各抗原的表現及純化係藉由與實施例2同樣的操作予以實施。各抗原的表現量係藉由與實施例3同樣的操作予以測定。

(抗體結合性試驗) 各抗原對各抗體之結合性係藉由與實施例5同樣的操作予以測定，結合訊號之值係定為從供給各抗原溶液180秒時之檢出值減去供給PBS(pH7.4)180秒時之檢出值而得之值(圖15、圖16、圖17)。

藉由以上操作，獲得下列結果：抗原FH_08相比於導入先前專利的變異而得之抗原Pf524而言，顯示出抗原決定位Φ的保守性及三聚體的形成優異，在另一方面，已知會誘導出病毒感染中和能力明顯較低的抗體之抗原決定位I不怎麼被檢測出。再者，獲得下列結果：經最適化之抗原FH_82、FH_85相比於經相同的最適化之導入先前專利的變異而得之抗原Pf881而言，顯示出抗原決定位Φ的保守性及三聚體的形成優異，在另一方面，已知會誘導出病毒感染中和能力明顯較低的抗體之抗原決定位I不怎麼被檢測出。此暗示上述實施例中所發現之有用的二硫化物的導入變異相比於先前專利中之二硫化物的導入變異(L142C、N371C)而言，為優先地誘導出被認為對病毒中和持有較高的效果之抗體群組之變異。

(小鼠免疫所誘導出之抗體的驗證) 藉由上述實驗，暗示抗原FH_82、FH_85有相比於導入先前專利的變異而得之變異體Pf881而言，無助於病毒中和之免疫的誘導較低之效果。為了進一步詳細地探討該效果，係實施以抗原FH_82、FH_85或Pf881對小鼠進行免疫所誘導出之抗體的分析。

誘導抗體的分析係藉由與實施例5同樣的操作予以實施，測定經由利用ΔFP furin_wt F_ecto 之吸附操作所得之抗體力價的吸附率(圖18)。

藉由以上操作，顯示出抗原FH_82、FH_85相比於導入先前專利的變異而得之抗原Pf881而言，post-F辨識抗體的誘導比例較少。亦即，呈下列結果：暗示在將抗原FH_82、FH_85用作疫苗抗原之情況，與Pf881相比較而言，亦優先地誘導出被認為對病毒中和持有較高的效果之抗體群組。

[實施例7]使用支架粒子之抗原的粒子化為了使誘導出無助於病毒感染防禦之抗體之風險進一步減少，一般認為藉由立體障礙效果使抗體或各種免疫細胞對受到抗原決定位I辨識抗體等post-F辨識抗體所辨識之抗原部位之可及性降低實屬有效。於是，考慮到藉由以post-F辨識抗體的辨識部位成為內側之方式使抗原固定於適當的支架粒子上，而可獲得該立體障礙效果之可能性。但是，考慮到若使抗原展示於適當的支架粒子上時，由於抗原之間隔長達某一定以上而密度較疏，或者在支架粒子與抗原之間導入一定以上長度的可撓性連結子，則無法獲得前述立體障礙效果之可能性。於是，決定使用被認為能夠實現比較高密度的抗原展示之HBsAg VLP，對複數種長度的GS連結子進行探討。

(粒子化抗原的調製) 作為支架粒子，係使用能夠結合Fc融合蛋白之Bionanocapsule-ZZ(Beacle公司，BCL-DC-002)。作為抗原之前驅物蛋白質，係製作將前述F_DS-Cav1、FH_82、FH_85之前驅物蛋白質中之凝血酶辨識序列、His標籤、包含Strep標籤II之序列(序列編號22)取代成Fc序列(序列編號30)而得之抗原F_DS-Cav1-Fc之前驅物蛋白質(序列編號31)、FH_82-Fc之前驅物蛋白質(序列編號32)、FH_85-Fc之前驅物蛋白質(序列編號33)。再者，針對於針對抗原F_DS-Cav1-Fc之前驅物蛋白質、FH_85-Fc之前驅物蛋白質，在Fc序列之正前方插入GS連結子(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(序列編號75)、GGGGSGGGGS (序列編號19)或GGGGS(序列編號27))而得之物，係以所對應之前驅物蛋白質(序列編號34～39)為基礎，藉由以下方法予以製作。

將編碼出上述各前驅物蛋白質之多核苷酸藉由標準的基因工程技術插入pcDNA3.4載體(Thermo Fisher Scientific公司)中。藉由鹼基序列解析確認目標DNA序列插入，構築表現出各抗原之前驅物蛋白質之各哺乳類細胞用表現載體。將用於導入細胞中之載體藉由標準的質體載體純化方法進行純化。

各抗原之前驅物蛋白質的表現係藉由使用Expi293 Expression System(Thermo Fisher Scientific公司)之哺乳類細胞分泌表現予以實施。使用屬於同套組的基因導入試劑之Expi Fectamin 293 Reagent將所純化而得之各載體導入Expi293細胞中，藉由培養4～5日左右而使所編碼出之各抗原進行分泌表現，使用離心分離及孔徑0.22μm的過濾器僅取得上清液成分。各抗原的純化係藉由使用蛋白A純化管柱之標準的親和純化法予以實施。純化後係藉由使用超過濾膜而將溶劑置換成PBS(pH7.4)。所製作而得之各抗原係以HBsAg VLP每1粒子平均成為約135個分子(形成三聚體則約45個分子)之比率與HBsAg VLP進行混合，藉由於室溫靜置1小時而使其固定化於支架粒子。此時，藉由施行Blue Native PAGE來確認未經固定化之抗原幾乎不存在。

將本實施例中用於評估之抗原及將該抗原固定化於支架粒子而得之粒子化體(以下，有時稱為「粒子化抗原」)總結於表7。

(抗體結合性試驗) 屬於抗原或粒子化抗原之F_DS-Cav1、F_DS-Cav1-VLP、FH_82、FH_82-VLP、FH_85及FH_85-VLP對各抗體之結合性係藉由與實施例6同樣的操作予以測定(圖19、圖20、圖21)。藉由以上操作，顯示出不拘於F抗原區域之pre安定化方法(用於pre安定化之胺基酸變異的內容)，若將pre-F經由附加至其胺基酸序列的C末端之結構域固定化於支架粒子，則在保持抗體對抗原決定位Φ之結合性之情形下，三聚體的形成提升。再者，顯示出已知會誘導出病毒感染中和能力明顯較低的抗體之抗原決定位I的檢出值減弱。以上結果暗示將本粒子化抗原用作疫苗抗原時，會優先地誘導出被認為對病毒中和持有較高的效果之抗體群組。

(插入連結子的探討) 屬於抗原或粒子化抗原之F_DS-Cav1、F_DS-Cav1-4GS-VLP、F_DS-Cav1-2GS-VLP、F_DS-Cav1-1GS-VLP、F_DS-Cav1-VLP、FH_85、FH_85-4GS-VLP、FH_85-2GS-VLP、FH_85-1GS-VLP及FH_85-VLP對各抗體之結合性係藉由與實施例6同樣的操作予以測定(圖22、圖23、圖24)。藉由以上操作，顯示出無論受到所實施之任何GS連結子的插入，皆有在保持抗體對抗原決定位Φ之結合性之情形下提升三聚體的形成，減弱抗原決定位I的檢出值之效果。惟，顯示出若在支架粒子與抗原之間插入過長的GS連結子，則抗原決定位I的檢出減弱之效果會降低。具體而言，若是GGGGSGGGGS(序列編號19)左右的長度，並不會見到顯著的影響，但若成為更長的GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(序列編號75)的長度，則可見到使抗原決定位I的檢出減弱之效果降低。以上結果暗示若在支架粒子與抗原之間插入一定以上長度的可撓性連結子，則藉由立體障礙效果使post-F辨識抗體對辨識部位之可及性降低之效果會減弱。

(抗原密度的估算) 藉由使用Zetasizer μV(Malvern)之動態光散射法估算粒子化抗原FH_85-VLP的理論直徑，結果為89.28nm(圖25)。由於每1粒子平均展示約135個分子(三聚體約45個分子)，故每1nm² 理論表面積之平均分子密度可計算為約0.005個分子(就三聚體而言，約0.0018個分子)。另外，在此處，球體的表面積S係設為使用其半徑r，藉由以下式予以求出。 S=4πr²

即，暗示只要是藉由動態光散射法所估算出之每1nm² 理論表面積最低存在約0.005個分子以上的抗原分子之程度的密度，即可實現目標的立體障礙效果。在DS-Cav1-VLP及FH_82-VLP中，亦為同樣的結果(圖25)。

(小鼠免疫所誘導出之抗體的驗證) 藉由上述實驗，暗示結合至支架粒子HBsAg VLP之pre-F抗原有抑制無助於病毒中和之免疫的誘導之效果。為了進一步詳細地探討該效果，係實施以F_DS-Cav1、F_DS-Cav1-VLP、FH_82、FH_82-VLP、FH_85或FH_85-VLP對小鼠進行免疫所誘導出之抗體的分析。小鼠免疫血清係藉由以各粒子化抗原對BALB／c(雌，5～8週齡)進行免疫而取得。作為各粒子化抗原的溶劑組成，係使用PBS或將PBS與氫氧化鋁(InvivoGen，vac-alu-250)各等量充分進行混合而得之液。抗原係以約3週間隔對小鼠的後肢大腿部進行肌肉內投予2次，從第2次投予起再約3週後，取得血液。所取得之血液係於室溫進行保溫培養後，進行離心分離並回收血清。為了確認會在血清中何種程度地誘導出結合至pre-F或post-F之抗體，係實施將各構形的抗原進行固相化之ELISA試驗。此外，為了算出post-F辨識抗體的誘導比例，係實施抗原吸附操作及經由抗原吸附操作之抗原辨識抗體的減少率的測定。方法係按照實施例5中所示之方法。就結論而言，藉由本粒子化，可確認到優先地誘導出被認為對病毒中和持有較高的效果之抗體群組之效果。

[實施例8]使用疏水性胜肽鏈之抗原的粒子化考慮到實施例7中所示之藉由立體障礙效果使抗體或各種免疫細胞對受到post-F辨識抗體所辨識之抗原部位之可及性降低之效果亦可藉由不使用支架粒子之方法予以實現之可能性。於是，在本實施例中，決定對經由使用疏水性胜肽鏈(包含疏水性胺基酸之多肽鏈)之疏水集合之粒子化進行探討。

(疏水性胜肽鏈的探討) 所使用之疏水性胜肽鏈必須具有在疫苗製劑或於生體內之條件下會進行疏水集合之性質，就明顯降低經由細胞之抗原的分泌表現效率之序列而言係難以實用。一般而言，已知在將包含大量疏水性胺基酸之多肽鏈融合至蛋白之情況，該蛋白在細胞中之生產效率會降低，因而決定進行適切的疏水性多肽鏈的探討。以將前述抗原F_DS-Cav1之前驅物蛋白質中之凝血酶辨識序列、His標籤、包含Strep標籤II之序列(序列編號22)取代成由各種疏水性胜肽鏈(序列編號40～43)及屬於純化用標籤之FLAG標籤所構成之序列而得之前驅物蛋白質(序列編號44～47)為基礎，製作抗原。將所探討之疏水性胜肽序列總結於表8-1。

將編碼出上述各前驅物蛋白質之多核苷酸藉由標準的基因工程技術插入pcDNA3.4載體(Thermo Fisher Scientific公司)中。藉由鹼基序列解析確認目標DNA序列插入，構築表現出各前驅物蛋白質之各哺乳類細胞用表現載體。將用於導入細胞中之載體藉由標準的質體載體純化方法進行純化。

各抗原的表現係藉由與實施例7同樣的操作予以實施。各抗原的純化係藉由使用ANTI-FLAG M2 Affinity Gel (Sigma，A2220)之親和純化予以實施。就親和純化的溶出而言，係使用FLAG胜肽，藉由使用超過濾膜來施行各抗原樣品中之FLAG胜肽的除去。就溶劑而言，係使用PBS(pH7.4)。抗原分泌表現的可否可藉由在純化後施行一般的SDS-PAGE，確認是否可高純度地分離純化出目標蛋白而予以施行。此外，粒子化的可否可藉由在純化後施行一般的Blue Native PAGE而予以確認。

對F_DS-Cav1-CC02及F_DS-Cav1-CC03分泌表現的可否及粒子化的可否進行探討，結果瞭解到儘管F_DS-Cav1-CC03會進行分泌表現，但不會發生粒子化，在另一方面，F_DS-Cav1-CC02無法順利進行分泌表現(圖26)。於是，可認為所使用之疏水性胜肽鏈的最適合的疏水度係在兩者的疏水度之間。 F_DS-Cav1-CC02與F_DS-Cav1-CC03之疏水性胜肽鏈之差異為下列方面：屬於非親水性的胺基酸之丙胺酸取代成屬於親水性胺基酸之離胺酸或麩胺酸。於是，首先，考慮到將F_DS-Cav1-CC02之丙胺酸變更成持有中程度的親水性，pK為pH6左右之組胺酸。已知製劑時之溶劑的pH為中性附近，相對於此，細胞的分泌路徑中之pH為更低的pH，因而期待包含組胺酸之胜肽鏈在分泌表現時呈比較親水的性質，在製劑時呈比較疏水的性質。此外，若假定所設計出之疏水性胜肽鏈形成捲曲螺旋(coiled coil)結構，則可預想到接續於foldon結構域之正下方之疏水性胜肽鏈之21個胺基酸的位相依序成為defgabcdefgabcdefgabc。在將白胺酸及異白胺酸配置於三聚體中進行疏水相互作用之a、d位之情況，依據對天然蛋白的胺基酸序列進行探討之先前研究(Joel P Schneider et al. 1998. Folding & Design. 3:R29)，將異白胺酸作為a位，將白胺酸作為d位者係頻率更高，因而考慮到將F_DS-Cav1-CC02之a位及d位的白胺酸、異白胺酸進行調換。由以上，新設計出F_DS-Cav1-CC07，對分泌表現的可否及粒子化的可否進行探討，結果分泌表現及粒子化兩者皆可達成(圖27)。就將組胺酸、離胺酸、麩胺酸的位置進行變更而得之F_DS-Cav1-CC08而言，則變得難以分泌表現，故亦暗示不僅只是胺基酸的組成之問題，立體結構上之配置亦屬重要。

(引用自Folding & Design 1998, 3:R29)

(粒子化抗原的調製) 以將前述抗原FH_82及FH_85之前驅物蛋白質中之凝血酶辨識序列、His標籤、包含Strep標籤II之序列(序列編號22)取代成由最適合的疏水性胜肽鏈(序列編號42)及屬於純化用標籤之FLAG標籤所構成之序列而得之前驅物蛋白質(序列編號48、49)為基礎，製作抗原。

將編碼出上述前驅物蛋白質之多核苷酸藉由標準的基因工程技術插入pcDNA3.4載體(Thermo Fisher Scientific公司)中。藉由鹼基序列解析確認目標DNA序列插入，構築表現出各前驅物蛋白質之各哺乳類細胞用表現載體。將用於導入細胞中之載體藉由標準的質體載體純化方法進行純化。

各抗原的表現係藉由與疏水性胜肽鏈的探討同樣的操作予以實施。各抗原的純化係藉由與疏水性胜肽鏈的探討同樣的操作予以實施。

將本實施例中以下使用於評估之抗原(有時稱為「粒子化抗原」)總結於表8-2。

(抗體結合性試驗) 所製作而得之各粒子化抗原對各抗體之結合性係藉由與實施例6同樣的操作予以測定(圖28、圖29、圖30)。藉由以上操作，獲得下列結果：不拘於F抗原區域之pre安定化方法(用於pre安定化之胺基酸變異的內容)，使pre-F藉由附加至其胺基酸序列的C末端之疏水性胜肽鏈進行集合而得之粒子化抗原顯示出在保持抗體對抗原決定位Φ之結合性之情形下，三聚體的形成提升。再者，獲得下列結果：已知會誘導出病毒感染中和能力明顯較低的抗體之抗原決定位I的檢出顯示出減弱。以上結果暗示將本抗原用作疫苗抗原時，藉由本粒子化，優先地誘導出被認為對病毒中和持有較高的效果之抗體群組之效果提升。

(抗原密度的估算) 藉由使用DynaPro Plate Reader III(Wyatt)之動態光散射法估算抗原FH_85及粒子化抗原FH_85-CC07的理論直徑，結果為13.8nm及60.0nm(圖31)。2個粒子的分子量之比在一般的蛋白質中係與其理論直徑之比的2～3次方成正比，因而FH_85-CC07的分子量係估算為呈FH_85的分子量的20～80倍左右。亦即，可認為FH85-CC07係每1粒子展示60～240個分子左右(就三聚體而言，20～80個分子左右)，每1nm² 理論表面積之平均分子密度可計算為0.005～0.022個分子左右(就三聚體而言，0.0017～0.0073個分子左右)。在FH_82-CC07中，亦為同樣的結果(圖31)。從而，使用疏水性胜肽鏈之粒子化抗原相比於實施例6中所示之使用支架粒子之粒子化抗原而言，可估算到同等程度或其以上的抗原密度。

(小鼠免疫所誘導出之抗體的驗證) 藉由先前的操作，暗示結合有疏水性胜肽鏈之抗原的粒子化有抑制無助於病毒中和之免疫的誘導之效果。為了進一步詳細地探討該效果，係實施以前述抗原或粒子化抗原F_DS-Cav1F_DS-Cav1-CC07、FH_82-CC07或FH_85-CC07對小鼠進行免疫所誘導出之抗體的分析。

小鼠免疫血清係藉由以各抗原及粒子化抗原對BALB／cAnNCrlCrlj(日本Charles River)(雌，6週齡)進行免疫而取得。將溶解於PBS(pH7.4)中之抗原或粒子化抗原F_DS-Cav1、F_DS-Cav1-CC07、FH_82-CC07或FH_85-CC07(抗原濃度：0.40mg／mL)在飼育第0日及飼育第21日對小鼠的後肢大腿部進行50μL肌肉內投予(每1組設為5隻。)。在飼育第42日從後大靜脈取得血液，將所取得之血液進行保溫培養(室溫，約2小時，靜置)後，進行離心分離並回收血清，進行去活化(55℃，30分鐘)，而製成小鼠免疫血清。

為了確認會誘導出何種程度比例的結合至融合後構形之抗體，係藉由與實施例6同樣的方法對各小鼠免疫血清施行使用已結合ΔFP furin_wt F_ecto 之磁珠或不結合任何抗原而僅實施阻斷操作而得之磁珠之抗原吸附操作。再者，針對吸附操作後之各血清，係藉由與實施例6同樣的方法實施將F_DS-Cav1進行固相化之ELISA試驗並算出吸附率。惟，吸附率係定為將無抗原之吸附操作後之血清的抗體力價設為100%時，從無抗原之吸附操作後之血清的抗體力價減去經由ΔFP furin_wt F_ecto 之吸附操作後之血清的抗體力價而得之值之相對值(圖32)。

藉由以上操作，顯示出會被粒子化前之抗原F_DS-Cav1一半程度地誘導出之post-F辨識抗體幾乎不會被藉由疏水性胜肽鏈進行粒子化而得之抗原F_DS-Cav1-CC07所誘導出。此外，FH_82-CC07、FH_85-CC07亦同樣地幾乎不會誘導出post-F辨識抗體。由以上，暗示藉由本粒子化，優先地誘導出被認為對病毒中和持有較高的效果之抗體群組之效果提升。

[實施例9]使用自締合性蛋白結構域之抗原的粒子化考慮到實施例7、8中所示之藉由立體障礙效果使抗體或各種免疫細胞對受到post-F辨識抗體所辨識之抗原部位之可及性降低之效果亦可藉由將自締合性蛋白結構域融合至抗原的C末端側而予以實現之可能性。特定而言，考慮到藉由使用自締合性蛋白結構域使抗原按規則排列，而獲得相較於實施例8中所示之經由疏水集合之粒子化而言更高的立體障礙效果之可能性。於是，在本實施例中，決定對利用B型肝炎病毒之核心抗原(HBcAg)的自締合性之粒子化進行探討。惟，就將前述抗原F_DS-Cav1中之凝血酶辨識序列、His標籤、包含Strep標籤II之序列(序列編號22)取代成由GS連結子(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)(序列編號75)、HBcAg的自締合結構域(序列編號50)及His標籤所構成之胜肽序列(序列編號51)而得者而言，儘管會進行表現，但並未見到自締合(經由Blue Native PAGE之驗證結果)。HBcAg之自締合結構域的N末端係存在於接近HBcAg彼此進行自締合時之結合面之位置，便考慮到藉由將較大的蛋白質融合至N末端而妨礙自締合之可能性。於是，為了將RSV F抗原部分配置於遠離進行自締合時之結合面之位置，便決定從HBcAg進行自締合時粒子向外突出之部位(存在於α3結構域及α4結構域之螺旋之間之部分)起分割成C末側及N末側。此外，為了減少未設想到之雙硫鍵的生成風險，便決定導入被認為對自締合沒有影響之2個點變異(C48S及C107A)。具體而言，以將前述抗原F_DS-Cav1及FH_85之前驅物蛋白質中之凝血酶辨識序列、His標籤、包含Strep標籤II之序列(序列編號22)取代成GS連結子(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)(序列編號75)、HBcAg之自締合結構域的C末側(序列編號52)及GS連結子(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)(序列編號75)、HBcAg之自締合結構域的N末側(序列編號53)以及FLAG標籤依序結合而得之序列(序列編號54)而得之F_DS-Cav1-HBcCN之前驅物蛋白質(序列編號55)及FH_85-HBcCN之前驅物蛋白質(序列編號56)為基礎，製作抗原(有時稱為「粒子化抗原」)。針對F_DS-Cav1-HBcCN，藉由與實施例8同樣的操作進行表現、純化並對分泌表現的可否及粒子化的可否進行探討，結果分泌表現及粒子化兩者皆可達成(圖33)。惟，表現量比較低，因而期望改良表現方法。於是，針對編碼出DS-Cav1-HBcCN或FH_85-HBcCN之前驅物之多核苷酸，係使用GS Xceed Gene Expression System(Lonza公司)建立安定表現之CHO株。將所建立之細胞株進行培養，使各抗原進行分泌表現後，取得培養上清液成分。各粒子化抗原的純化係藉由與實施例8同樣的操作予以實施。為了確認各粒子化抗原對各抗體之結合性，係實施各自將Palivizumab(Synagis肌肉注射液，AbbVie)、131-2A抗體、D25抗體進行固相化之ELISA試驗。就抗體結合緩衝液而言，係使用碳酸重碳酸緩衝液(Sigma-Aldrich，C3041-50CAP)，就樣品的稀釋及盤的洗淨而言，係使用TBS(TaKaRa，T9142)。對96半孔盤添加10μg／mL的Palivizumab或131-2A抗體或D25抗體並直接固相化，以牛血清白蛋白進行阻斷。藉由對各抗原適當地添加緩衝液而製作10倍稀釋系列，添加至盤中並進行保溫培養(室溫，2小時，靜置)。然後，除去所添加之抗原溶液，使過氧化酶結合抗FLAG M2抗體(Sigma-Aldrich，A8592)進行結合，進一步以標準的過氧化酶檢測試劑使其進行顯色後，以經由標準的盤讀取儀之吸光度測定求出顯色的強度。藉由測定點間進行分段線性內插而求出抗原的稀釋率與吸光度之關係，將吸光度成為0.2之稀釋率之倒數定為所添加之抗原對經固相化之抗體之結合力。將對D25抗體之結合力除以對Palivizumab之結合力而得之值定為抗原決定位Φ檢出訊號，將對131-2A抗體之結合力除以對Palivizumab之結合力而得之值定為抗原決定位I檢出訊號(圖34、圖35)。藉由以上操作，獲得下列結果：使pre-F藉由附加至其胺基酸序列的C末端之自締合性蛋白結構域進行集合而得之粒子化抗原相較於經由疏水性胜肽鏈之粒子化而言，顯示出使抗體對抗原決定位Φ之結合性進一步提升，並減弱已知會誘導出病毒感染中和能力明顯較低的抗體之抗原決定位I的檢出。以上結果暗示藉由本粒子化，優先地誘導出被認為對病毒中和持有較高的效果之抗體群組之效果提升。

[圖1]示出本發明之一態樣所涉及之實施例1中之抗原決定位Φ的保守性(conservation)之圖。 [圖2]示出本發明之一態樣所涉及之實施例2中之抗原決定位Φ的保守性之圖。 [圖3]示出本發明之一態樣所涉及之實施例2中之三聚體化之圖。 [圖4]示出本發明之一態樣所涉及之實施例3中之抗原決定位Φ的保守性之圖。 [圖5]示出本發明之一態樣所涉及之實施例3中之三聚體化之圖。 [圖6]示出本發明之一態樣所涉及之實施例3中之表現量之圖。 [圖7]示出本發明之一態樣所涉及之實施例4中之抗原決定位Φ的保守性之圖。 [圖8]示出本發明之一態樣所涉及之實施例4中之三聚體化之圖。 [圖9]示出本發明之一態樣所涉及之實施例5中之抗原決定位Φ的保守性之圖。 [圖10]示出本發明之一態樣所涉及之實施例5中之三聚體化之圖。 [圖11]示出本發明之一態樣所涉及之實施例5中之抗原決定位I的辨識性之圖。 [圖12]示出本發明之一態樣所涉及之實施例5中之人類血清中之病毒中和抗體的吸附試驗之結果之圖。 [圖13]示出本發明之一態樣所涉及之實施例5中之人類血清中之病毒中和抗體的吸附試驗之結果之圖。 [圖14]示出本發明之一態樣所涉及之實施例5中之小鼠免疫所誘導出之抗體的驗證之結果之圖。 [圖15]示出本發明之一態樣所涉及之實施例6中之抗原決定位Φ的保守性之圖。 [圖16]示出本發明之一態樣所涉及之實施例6中之三聚體化之圖。 [圖17]示出本發明之一態樣所涉及之實施例6中之抗原決定位I的辨識性之圖。 [圖18]示出本發明之一態樣所涉及之實施例6中之小鼠免疫所誘導出之抗體的驗證之結果之圖。 [圖19]示出本發明之一態樣所涉及之實施例7中之抗原決定位Φ的保守性之圖。 [圖20]示出本發明之一態樣所涉及之實施例7中之三聚體化之圖。 [圖21]示出本發明之一態樣所涉及之實施例7中之抗原決定位I的辨識性之圖。 [圖22]示出本發明之一態樣所涉及之實施例7中之抗原決定位Φ的保守性之圖(插入連結子的探討)。 [圖23]示出本發明之一態樣所涉及之實施例7中之三聚體化之圖(插入連結子的探討)。 [圖24]示出本發明之一態樣所涉及之實施例7中之抗原決定位I的辨識性之圖(插入連結子的探討)。 [圖25]示出本發明之一態樣所涉及之實施例7中之粒子直徑之圖。 [圖26]示出本發明之一態樣所涉及之實施例8中之聚丙烯醯胺凝膠電泳結果之照片(其1)。 [圖27]示出本發明之一態樣所涉及之實施例8中之聚丙烯醯胺凝膠電泳結果之照片(其2)。 [圖28]示出本發明之一態樣所涉及之實施例8中之抗原決定位Φ的保守性之圖。 [圖29]示出本發明之一態樣所涉及之實施例8中之三聚體化之圖。 [圖30]示出本發明之一態樣所涉及之實施例8中之抗原決定位I的辨識性之圖。 [圖31]示出本發明之一態樣所涉及之實施例8中之粒子直徑之圖。 [圖32]示出本發明之一態樣所涉及之實施例8中之小鼠免疫所誘導出之抗體的驗證之結果之圖。 [圖33]示出本發明之一態樣所涉及之實施例9中之聚丙烯醯胺凝膠電泳結果之照片。 [圖34]示出本發明之一態樣所涉及之實施例9中之抗原決定位Φ的保守性之圖。 [圖35]示出本發明之一態樣所涉及之實施例9中之抗原決定位I的辨識性之圖。

Claims

一種變異型RSV F蛋白質，其係具有變異之變異型RSV F蛋白質，前述變異為相當於序列編號1的胺基酸序列之141位的白胺酸之白胺酸或相當於142位的白胺酸之白胺酸取代成半胱胺酸，及相當於373位的白胺酸之白胺酸取代成半胱胺酸，在前述半胱胺酸間形成雙硫鍵。
如請求項1之變異型RSV F蛋白質，其中，前述變異型RSV F蛋白質係源自於RSV亞型A或RSV亞型B。
如請求項2之變異型RSV F蛋白質，其中，前述RSV亞型A為RSV A2株或RSV Long株。
如請求項2之變異型RSV F蛋白質，其中，前述RSV亞型B為RSV 18537株。
如請求項1至4中任一項之變異型RSV F蛋白質，其係在與序列編號2具有85%以上的同一性之胺基酸序列中，包含相當於序列編號1的胺基酸序列之141位的白胺酸之白胺酸或相當於142位的白胺酸之白胺酸，及相當於373位的白胺酸之白胺酸被取代成半胱胺酸而得之胺基酸序列，在前述半胱胺酸間形成雙硫鍵，具有誘導出抗RSV的pre型F蛋白質之抗體之能力。
如請求項1至4中任一項之變異型RSV F蛋白質，其中，存在於pep27區域的C末端側之構成弗林蛋白酶(furin)辨識部位之胺基酸係進一步以前述弗林蛋白酶辨識部位不會受到弗林蛋白酶所辨識之方式被取代。
如請求項6之變異型RSV F蛋白質，其中，前述構成弗林蛋白酶辨識部位之胺基酸為選自由相當於序列編號1的胺基酸序列之133位的精胺酸之精胺酸、相當於135位的精胺酸之精胺酸及相當於136位的精胺酸之精胺酸所構成之群組之胺基酸，該胺基酸被取代成非鹼性胺基酸。
如請求項6或7之變異型RSV F蛋白質，其係在與序列編號3具有85%以上的同一性之胺基酸序列中，包含相當於序列編號1的胺基酸序列之141位的白胺酸之白胺酸或相當於142位的白胺酸之白胺酸，及相當於373位的白胺酸之白胺酸被取代成半胱胺酸，再者，選自由相當於序列編號1的胺基酸序列之133位的精胺酸之精胺酸、相當於135位的精胺酸之精胺酸及相當於136位的精胺酸之精胺酸所構成之群組之胺基酸被取代成非鹼性胺基酸而得之胺基酸序列，在前述半胱胺酸間形成雙硫鍵，具有誘導出抗RSV的pre型F蛋白質之抗體之能力。
如請求項7或8之變異型RSV F蛋白質，其中，前述非鹼性胺基酸為天冬醯胺酸。
如請求項1至9中任一項之變異型RSV F蛋白質，其中，相當於序列編號1的胺基酸序列之189位的蘇胺酸之蘇胺酸，及／或相當於190位的絲胺酸之絲胺酸進一步被取代成疏水性胺基酸。
如請求項10之變異型RSV F蛋白質，其中，前述疏水性胺基酸係各自獨立地選自由纈胺酸、異白胺酸及白胺酸所構成之群組。
如請求項1至11中任一項之變異型RSV F蛋白質，其中，進一步地，相當於序列編號1的胺基酸序列之42位的離胺酸之離胺酸被取代成精胺酸，及／或相當於384位的纈胺酸之纈胺酸被取代成蘇胺酸。
一種變異型RSV F蛋白質，其係具有變異之變異型RSV F蛋白質，前述變異為相當於序列編號1的胺基酸序列之60位的麩胺酸之麩胺酸取代成非酸性胺基酸。
如請求項13之變異型RSV F蛋白質，其中，前述非酸性胺基酸係選自由甲硫胺酸、苯丙胺酸、白胺酸、蘇胺酸及絲胺酸所構成之群組。
一種融合蛋白質，其包含如請求項1至14中任一項之變異型RSV F蛋白質，及融合至前述變異型RSV F蛋白質的C末端之多聚體化結構域。
如請求項15之融合蛋白質，其中，前述多聚體化結構域為foldon結構域。
如請求項16之融合蛋白質，其包含序列編號10～13中之任一胺基酸序列。
一種多聚化體，其係如請求項1至14中任一項之變異型RSV F蛋白質之多聚化體，其係如前述請求項15至17中任一項之融合蛋白質經由前述多聚體化結構域進行締合而得。
如請求項18之多聚化體，其中，前述多聚化體為三聚體。
一種粒子化體，其係如請求項1至14中任一項之變異型RSV F蛋白質或如請求項15至17中任一項之多聚化體之粒子化體，前述變異型RSV F蛋白質或前述融合蛋白質包含粒子化結構域，前述變異型RSV F蛋白質或前述多聚化體係經由該粒子化結構域集合2個以上而形成粒子，前述粒子化結構域在變異型RSV F蛋白質或多聚化體的立體結構上，係存在於相較於抗原決定位Φ而言更接近於抗原決定位I之位置。
如請求項20之粒子化體，其中，前述粒子化體係粒子化結構域結合至前述變異型RSV F蛋白質或前述融合蛋白質的C末端而得之粒子化體製造用融合蛋白質經由前述粒子化結構域集合2個以上而得。
如請求項20或21之粒子化體，其中，前述多聚化體為由如請求項16之融合蛋白質所構成之三聚體。
如請求項22之粒子化體，其中，前述粒子化結構域為由序列編號30的胺基酸序列所構成之Fc結構域，該粒子化體係藉由該粒子化結構域與固定化於源自改良型HBs抗原之VLP之蛋白A的Z結構域進行結合而集合而得。
如請求項22之粒子化體，其中，前述粒子化結構域為由序列編號42的胺基酸序列所構成之胜肽。
一種粒子化體製造用融合蛋白質，其包含如請求項1至14中任一項之變異型RSV F蛋白質的C末端或如請求項15至17中任一項之融合蛋白質，及融合至其C末端之粒子化結構域。
如請求項25之粒子化體製造用融合蛋白質，其中，前述粒子化結構域為由序列編號30的胺基酸序列所構成之Fc結構域。
如請求項25之粒子化體製造用融合蛋白質，其中，前述粒子化結構域為由序列編號42的胺基酸序列所構成之胜肽。
一種多核苷酸，其編碼出如請求項1至14中任一項之變異型RSV F蛋白質、如請求項15至17中任一項之融合蛋白質或如請求項25至27中任一項之粒子化體製造用融合蛋白質。
一種表現單元，其包含如請求項28之多核苷酸。
一種宿主細胞，其包含如請求項29之表現單元。
一種免疫原，其包含如請求項1至14中任一項之變異型RSV F蛋白質、如請求項15至17中任一項之融合蛋白質、如請求項18至19中任一項之多聚化體或如請求項20至24中任一項之粒子化體。
一種醫藥組成物，其包含如請求項29之表現單元或如請求項31之免疫原。
一種RSV疫苗，其包含如請求項29之表現單元或如請求項31之免疫原。
如請求項32之醫藥組成物或如請求項33之RSV疫苗，其係人類用。