ES2267142T3 - Identificacion y clonacion de un antigeno micobacteriano que corresponde a una hemaglutinina de union a la heparina. - Google Patents
Identificacion y clonacion de un antigeno micobacteriano que corresponde a una hemaglutinina de union a la heparina. Download PDFInfo
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A SECUENCIAS PEPTIDICAS QUE PERMITEN LA ADHERENCIA DE MICOBACTERIAS A CELULAS HUESPEDES, PARTICULARMENTE A CELULAS EPILETIALES. LA INVENCION SE REFIERE, MAS CONCRETAMENTE, A UN ANTIGENO MICOBACTERIANO DE TIPO HEMAGLUTUNINA DE ENLACE CON LA HEPARINA (HBHA) OBTENIDO A PARTIR DE MYCOBACTERIUM BOVIS BCG O MICOBACTERIUM TUBERCULOSIS. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UNA SECUENCIA PEPTIDICA RECOMBINANTE QUE PERMITE LA ADHERENCIA DE MICOBACTERIAS A CELULAS HUESPEDES. LA INVENCION SE REFIERE CONCRETAMENTE AL PRODUCTO DE EXPRESION DE UNA CEPA ESCHERICHIA COLI TRANSFORMADA CON UNA SECUENCIA NUCLEOTIDICA QUE CODIFICA UNA PROTEINA QUE PERMITE LA ADHERENCIA DE MICOBACTERIAS A ESTAS CELULAS HUESPEDES. ESTAS SECUENCIAS PEPTIDICAS PUEDEN UTILIZARSE EN COMPOSICIONES INMUNOGENAS, PARA PREPARAR VACUNAS CONTRA LAS INFECCIONES MICOBACTERIANAS Y PARA EL DIAGNOSTICO SEROLOGICO DE INFECCIONES MICOBACTERIANAS.
Description
Identificación y clonación de un antígeno
micobacteriano que corresponde a una hemaglutinina de unión a la
heparina.
La presente invención se refiere a unas
secuencias peptídicas que permiten la adherencia de micobacterias a
unas células huéspedes, en particular a unas células epiteliales.
Más particularmente, la invención se refiere a un antígeno
micobacteriano de tipo hemaglutinina de unión a la heparina (HBHA)
obtenido a partir de Mycobacterium bovis BCG o
Mycobacterium tuberculosis. La invención se refiere asimismo
a una secuencia peptídica recombinante que permite la adherencia de
micobacterias a unas células huéspedes. La invención se refiere en
particular al producto de expresión de una cepa Escherichia
coli transformada con una secuencia nucleotídica que codifica
para una proteína que permite la adherencia de micobacterias a unas
células huéspedes. Estos polipéptidos pueden ser utilizados en unas
composiciones inmunógenas, para la preparación de vacunas contra las
infecciones micobacterianas, y para el diagnóstico serológico de
infecciones micobacterianas.
La invención se refiere asimismo a una secuencia
nucleotídica que codifica para una secuencia peptídica que permite
la adherencia de micobacterias a unas células huéspedes, y más
particularmente a una secuencia nucleotídica que codifica para un
antígeno micobacteriano de tipo hemaglutinina de unión a la heparina
(HBHA). La invención se refiere asimismo a unos vectores
recombinantes que comprenden dicha secuencia nucleotídica así como a
la utilización de estos vectores para la obtención de huéspedes
celulares recombinantes que pueden ser utilizados en terapia, en
particular en terapia anticancerosa.
Las micobacterias están entre los
microorganismos patógenos más importantes que causan enfermedades
tanto en el hombre como en el animal. Las infecciones
micobacterianas están siempre entre las primeras causas de
mortalidad en el mundo. La tuberculosis humana, causada por
Mycobacterium tuberculosis, produce por sí sola
aproximadamente tres millones de muertos cada año (1, 2).
Mycobacterium bovis causa la tuberculosis en los bovinos,
pero es también muy virulenta para el hombre. La lepra, causada por
el Mycobacterium leprae, continúa siendo un problema
importante de salud no resuelto en los países en vías de desarrollo
(3).
Las infecciones por los miembros del complejo
Mycobacterium avium-intracellulare causan
enfermedades en los pájaros y en el cerdo y están entre las
infecciones oportunistas más frecuentes que se encuentran en los
pacientes afectados por el síndrome de inmunodeficiencia adquirida
(SIDA) (4, 5). Además, la reciente reaparición dramática de la
tuberculosis en los países desarrollados así como la aparición y la
propagación de cepas de M. tuberculosis resistentes a los
medicamentos (6) subrayan la dificultad de controlar las
enfermedades micobacterianas.
La caracterización molecular de las diversas
etapas en la patogénesis de las enfermedades micobacterianas es
fundamental para el desarrollo de aproximaciones terapéuticas y
profilácticas racionales y optimizadas contra estas enfermedades.
Los factores de virulencia son a menudo buenos antígenos que pueden
ser utilizados a título de candidatos-vacunas. A
pesar de la importancia de las infecciones micobacterianas, se
conocen pocas cosas con respecto a los mecanismos moleculares de
base implicados en su patogénesis (7).
Un proteína de 28 kDa ha sido aislada
anteriormente a partir de extractos totales celulares, de
preparaciones membranarias o de cultivos de sobrenadante de
micobacterias (21, 22). Se ha demostrado en estas mismas
publicaciones que esta proteína era capaz de aglutinar los
eritrocitos o autoaglutinar las micobacterias. Los análisis por
inmonumarcas con ayuda de anticuerpos policlonales y monoclonales
han indicado que esta proteína es diferente de las proteínas del
complejo del antígeno 85 y representa por tanto una nueva proteína.
Menozzi et al. describen la identificación de una proteína
denominada HBHA y han demostrado que unos anticuerpos
anti-HBHA eran capaces de inhibir la fijación de
micobacterias a unas células epiteliales (23). En contrapartida,
ninguno de estos documentos da a conocer ningún antígeno o
polipéptido recombinante constituido por la parte
C-terminal de HBHA o de porciones de esta parte
C-terminal.
Uno de los sucesos iniciales y cruciales en la
patogénesis bacteriana es la adherencia del microorganismo a sus
tejidos diana. Las micobacterias presentan un tropismo para los
macrófagos pulmonares (8). Sin embargo, en la medida en que estos
microorganismos son fácilmente transmitidos por aerosol, las
primeras estructuras del huésped que encuentran en el curso de la
infección son las del epitelio respiratorio. Por consiguiente, las
interacciones con las células epiteliales o con la matriz
extracelular (MEC) durante las etapas iniciales y ulteriores de la
patogénesis pueden ser importantes (9), aunque no hayan sido aún
estudiadas de forma profundizada.
En el contexto de la presente invención, los
inventores han obtenido un nuevo antígeno micobacteriano implicado
en la adherencia de micobacterias a unas células huéspedes de tipo
epitelial. Se trata de la parte C-terminal de una
hemaglutinina de unión a la heparina (heparin binding hemagglutinin
o HBHA) de 28 kDa que ha sido obtenida a partir del sobrenadantes
de cultivo y de preparación de las paredes celulares de
Mycobacterium bovis BCG y de Mycobacterium
tuberculosis. A partir de esta parte
C-terminal, los inventores han podido evaluar y
proponer el desarrollo de una serie de polipéptidos que pueden ser
utilizados en diagnóstico, en terapia y en profilaxis.
La invención se refiere por tanto a una
secuencia peptídica que permite la adherencia de micobacterias a
unas células huéspedes, en particular unas células epiteliales. Más
particularmente, la secuencia peptídica de la invención está
caracterizada porque se trata de un antígeno micobacteriano de tipo
hemaglutinina de unión a la heparina (HBHA), en particular un
antígeno obtenido a partir de Mycobacterium bovis BCG o
Mycobacterium tuberculosis.
En una de las realizaciones preferidas de la
presente invención, la secuencia peptídica está caracterizada
porque consiste en la parte C-terminal de la
secuencia correspondiente a la secuencia de la figura 10.
En el conjunto del texto, el término secuencia
polipeptídica o polipéptido representa la totalidad o parte de la
secuencia de la figura 10, que ha su vez representa el ADN y la
proteína HBHA como tal. El término "proteína" designa de hecho
la secuencia polipeptídica completa modificada o no.
De forma preferida, la invención se refiere más
particularmente a una secuencia peptídica que consiste en una
región implicada en las interacciones con los glicoconjugados
sulfatados y en la unión a la heparina. Esta secuencia peptídica es
la siguiente:
KKAAPAKKAAPAKKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKKVTQK
La invención se refiere por tanto a una
secuencia peptídica que consiste en la porción
C-terminal de la secuencia de la figura 10 y más
particularmente a la secuencias que comprenden aproximadamente los
30 a 50 últimos aminoácidos de la porción
C-terminal de la secuencia de la figura 10. Esta
región de la secuencia de la figura 10 está implicada en la
interacción de la proteína con la heparina aunque una secuencia más
corta, en particular de 10 a 20 aminoácidos, puede ser
suficiente.
Los inventores han reflejado asimismo la
secuencia nucleotídica que codifica para la secuencia peptídica de
la invención en E. coli. El polipéptido obtenido presenta un
peso molecular menor que el de la proteína purificada a partir de
M. bovis BCG o M. tuberculosis. Estas diferencias son
el resultado de modificaciones post-traduccionales
no realizadas en E. coli.
La invención se refiere por tanto asimismo a una
secuencia peptídica recombinante, caracterizada porque permite la
adherencia de micobacterias a unas células huéspedes. Más
particularmente, la secuencia recombinante de la presente invención
es el producto de expresión de una secuencia nucleotídica que
codifica para una secuencia peptídica que permite la adherencia de
micobacterias a unas células huéspedes y en particular una secuencia
antigénica obtenida a partir de M. bovis BCG y M.
tuberculosis, siendo dicha secuencia recombinante por ejemplo
el producto de expresión de una cepa E. coli transformada con
una secuencia nucleotídica apropiada.
La invención se refiere asimismo a la
utilización de una de las secuencias peptídicas descritas
anteriormente, ya sea recombinante o no, y más particularmente en
su forma nativa para el diagnóstico serológico de la presencia de
micobacterias. La invención se refiere asimismo a una composición
inmunógena caracterizada porque comprende una de las secuencias
peptídicas descritas anteriormente así como la utilización de esta
secuencia peptídica para la preparación de vacunas contra las
infecciones micobacterianas, particularmente las infecciones
causadas por M. bovis o M. tuberculosis.
Los inventores han descubierto asimismo que la
adherencia de micobacterias a unas células epiteliales podía ser
inhibida específicamente por unos glúcidos sulfatados. La invención
se refiere por tanto a la utilización de un glúcido sulfatado para
inhibir la adherencia de micobacterias a unas células epiteliales.
Los glúcidos sulfatados particularmente interesantes comprenden la
heparina, la chondroitina sulfato y el dextran sulfato así como sus
derivados sintéticos.
Los inventores han aislado asimismo el conjunto
del gen que codifica para el HBHA del ADN de M. bovis BCG.
La invención se refiere por tanto a una secuencia nucleotídica
caracterizada porque codifica para la secuencia peptídica que
permite la adherencia de micobacterias a unas células huéspedes. Más
particularmente, la secuencia nucleotídica de la invención codifica
para un antígeno micobacteriano de tipo hemaglutinina de unión a la
heparina (HBHA) en particular la parte C-terminal de
la secuencia peptídica de la figura 10.
La invención se refiere asimismo a un huésped
celular recombinante, caracterizado porque comprende en su genoma
una de las secuencias nucleotídicas descritas anteriormente. En una
de las realizaciones preferidas de la invención, el huésped celular
recombinante pero no exclusivo es el BCG para el cual se han
desarrollado unos vectores de expresión directamente utilizables
para el desarrollo de BCG recombinantes utilizables en el hombre o
el animal.
El BCG es utilizado en terapia, más
particularmente en terapia anticancerosa y en particular contra los
cánceres superficiales de la vejiga. En este tipo de aplicación
terapéutica, parecía existir una correlación entre la facultad de
adherencia del BCG y su poder antitumoral. En el contexto de la
presente invención, la identificación de la HBHA y el clonado de su
gen hacen posible un aumento de la capacidad de adherencia a través
de una sobreexpresión del gen que codifica la HBHA.
La descripción de la presente invención se
efectuará con referencia a las figuras siguientes:
- la figura 1 representa el efecto de glúcidos
sulfatados y no sulfatados sobre la adherencia micobacteriana a las
células CHO y a los macrófagos;
- la figura 2 representa los datos que
demuestran la purificación de una proteína de enlace de heparina
M. bovis BCG;
- la figura 3 representa una comparación de la
proteína de enlace a la heparina de M. bovis con el complejo
del antígeno 85;
- la figura 4 representa el efecto de glúcidos
sulfatados y no sulfatados sobre la hemaglutinación inducida por
HBHA;
- la figura 5 representa la inhibición de la
adherencia de BCG a las células CHO por anticuerpos
anti-HBHA;
- la figura 6 representa unos análisis por
inmunomarcas efectuados con unos antisueros de tuberculosos;
- la figura 7 representa la secuencia
nucleotídica y la secuencia de aminoácidos de un fragmento de HBHA
deducida a partir de un fragmento PCR del ADN cromosómico del
BCG;
- la figura 8 representa un análisis por
transferencia de Southern del ADN cromosómico de BCG;
- la figura 9 representa la estrategia de
secuenciado del gen que codifica para HBHA;
- la figura 10 representa la secuencia de ADN
del gen de BCG que codifica para HBHA;
- la figura 11 representa el análisis por
electroforesis en gel poliacrilamida y por inmunotransferencia de
la expresión de la HBHA en E. coli.
Inhibición de la adherencia micobacteriana a las
células epiteliales por unos glúcidos sulfatados.
La invención se refiere a la utilización de
glúcidos sulfatados para inhibir la adherencia de micobacterias a
unas células epiteliales. Para demostrar que las micobacterias
pueden adherirse por medio de los glúcidos sulfatados, los
inventores han ensayado si unos polisacaridos sulfatados solubles
son capaces de reducir la adherencia de M. bovis BCG a las
células epiteliales.
Unas M. bovis (BCG) (cepa 1173 P2, OMS,
Estocolmo, Suecia, párrafos 3 a 8) en crecimiento exponencial han
sido marcados cultivando las micobacterias durante tres días en
medio de Sauton que contiene 5 \muCi/ml [6^{-3}H] uracilo (New
England Nuclear, 24 Ci/mmol). Las micobacterias han sido a
continuación recogidas por centrifugación (3000 x g durante 5
min.), lavadas dos veces con tapón fosfato salino de Dulbecco
(DPBS) y puestas de nuevo en suspensión en medio de cultivo RPMI
1640 que contiene 300 mg/l de L-glutamina (GIBCO),
desprovisto de suero de ternera fetal (RPMI).
La víspera del ensayo de adherencia, los
pocillos de las placas de cultivo de tejidos con 24 pocillos
(Nunclon, Nunc, Dinamarca) han sido inoculados con 10^{5} células
de ovarios de hámsters chinos (CHO) cultivadas extemporáneamente
(ver figuras 1A y 1B, barras grises) o unos macrófagos J744A.1 (ATCC
TIB67) (ver figura 1B, barras negras) puestos de nuevo en
suspensión en 2 ml de RPMI adicionados con 10% (v/v) de suero de
ternera fetal descomplementado (RPMI-SVF). Justo
antes del ensayo, las células han sido lavadas tres veces con 2 ml
de RPMI, y se ha añadido a cada pocillo 1 ml de suspensión
micobacteriana en RPMI para obtener una multiplicidad de infección
de 10 bacterias por célula eucariota.
El ensayo de adherencia ha sido realizado en
presencia de concentraciones crecientes de D(+)galactosa (Sigma)
(ver figura 1A, círculos negros) o de heparina de la mucosa
intestinal porcina (M_{r} 6 kDa, Sigma) (ver figura 1A, círculos
blancos), o con 20 \mug/ml de los glúcidos indicados (Sigma) (ver
figura 1B). Después de 6 horas de incubación a 37ºC en una
atmósfera que contiene 5% de CO_{2}, las células han sido lavadas
tres veces con 2 ml de DPBS, y finalmente lisadas por la adición de
1 ml de agua destilada que contiene 0,1% (p/v) de desoxicolato de
sodio. La radioactividad asociada a los lisados celulares ha sido
contada utilizando un contador de escintilación líquida (Beckman,
modelo LS 6000SC). La adherencia residual está expresada en
porcentaje de golpes radioactivos por minuto con respecto a los
golpes obtenidos en ausencia del glúcido. Los datos de las figuras
1A y 1B representan las medias de experimentos realizados en
cuádruple, y están representadas las barras de desviación
típica.
Como muestra la figura 1A, pequeñas
concentraciones de heparina han inhibido sustancialmente la
adherencia a las células CHO de las BCG marcadas por [^{3}H]
uracilo, mientras que la galactosa hasta 100 \mug/ml no ha tenido
efectos significativos. El dextran sulfato, fucoidano y la
condroitina sulfato han podido reducir la adherencia, pero no se ha
podido observar ninguna inhibición significativa con mannosa o
dextrano no sulfatado, incluso a las más altas concentraciones
ensayadas (1 mg/ml).
Estos resultados conducen a proponer que las
micobacterias poseen en su superficie una adhesina principal de
enlace con los glúcidos sulfatados. Sin embargo, como la inhibición
de la adherencia no ha sobrepasado el 70%, otras componentes están
versenblantemente implicados en este proceso. De forma interesante,
las interacciones de BCG con los macrófagos J774A.1 no han sido
afectados por los glúcidos sulfatados, ni por los azúcares no
sulfatados (figura 1B), incluso a concentraciones que van hasta 1
mg/ml (resultados no representados). Eso está de acuerdo con
informes anteriores que ponen en cuestión los receptores al
complemento CR1, CR3 y CR4 como ligandos micobacterianos en la
superficie de los monocitos sanguíneos y de los macrófagos
alveolares (10-12).
La invención se refiere a una secuencia
peptídica que permite la adherencia de micobacterias a unas células
huéspedes. La inhibición de la adherencia de BCG a las células
epiteliales por los azúcares sulfatados sugería ya que las
micobacterias expresan una adhesina que interactúa con unos
glicoconjugados sulfatados, tales como unas glicoproteínas o
glicolípidos sulfatados, presentes en la superficie de las células
huéspedes. Para identificar las adhesinas en cuestión, unos
sobrenadantes de cultivo de BCG han sido fraccionados por
cromatografía sobre heparina-Sefarosa.
Unas M. bovis BCG han sido cultivadas a
37ºC en cultivos estáticos en unos matraces de Roux de 175 cm^{2}
(Falcon, Becton-Dickinson) que contiene
aproximadamente 150 ml de medio de Sauton. En la fase estacionaria,
los cultivos han sido centrifugados (10000 x g durante 20 minutos),
y se han cargado 500 ml de sobrenadante en una columna (1 x 5 cm)
de heparina-Sefarosa CL-6B
(Pharmacia) equilibrada con DPBS. La columna ha sido lavada a
continuación con 100 ml de DPBS, y las moléculas retenidas han sido
eludidas por un gradiente lineal de NaCl 0-500 mM
en 100 ml de DPBS. El caudal durante todas las etapas se ha
mantenido a 1,5 ml/min., y se ha seguido en continuo la absorbancia
a 280 nm del eluido que fue recogido por fracciones de 1 ml. Estas
fracciones fueron analizadas por SDS-PAGE (13)
utilizando un gel con 12% seguido de una coloración en Azul
Brillante de Coomassie R-250.
Las fracciones analizadas después del inicio del
gradiente están representadas en las pistas 1-8 de
la figura 2. Las pistas de la derecha muestran la proteína de unión
a la heparina purificada a partir de una preparación de paredes
celulares de M. bovis BCG. Los tamaños de los marcadores de
M_{r} expresados en kDa se dan en el margen de la derecha.
Como muestra la figura 2, una proteína única de
28 kDa es eluida aproximadamente a 350 nM de NaCl. La interacción
entre esta proteína y la heparina depende de la sulfatación del
azúcar puesto que ésta podía también ser purificada utilizando unas
bolas de dextran sulfato, pero no unas bolas de dextrano (no
representado). La misma proteína de enlace con la heparina ha sido
también purificada a partir de los filtrados de cultivo de M.
tuberculosis.
La obtención de dos proteínas de enlace con la
heparina semejantes a partir de dos cepas micobacterianas diferentes
confirma que unas proteínas de este tipo están presentes en la
mayor parte de las cepas micobacterianas patógenas. Unos
porcentajes de homología inferiores al 100% pueden conducir a
diferencias estructurales, aunque las propiedades fundamentales de
estas proteínas no sean afectadas. La invención se refiere por tanto
asimismo a las proteínas de enlace con la heparina que tienen una
estructura emparentada con la proteína aislada y que pueden ser
obtenidas a partir de sus propiedades de adherencia a unos glúcidos
sulfatados. Estas proteínas pueden distinguirse de la proteína de
la invención por unas adiciones, sustituciones y deleciones de
aminoácidos sin que ello afecte de forma sustancial a sus
propiedades de adherencia a las células epiteliales.
Para determinar si esta proteína es una proteína
estrictamente secretada o si puede estar asociada a la superficie
micobacteriana, unas fracciones de paredes celulares han sido
preparadas a partir de PCG, y después sometidas a una cromatografía
sobre heparina-Sefarosa.
Para las preparaciones de paredes celulares, las
micobacterias han sido cultivadas en 2 litros de medio de Sauton o
también de medio sintético de Long (Quality Biological Inc.,
Gaithersburg, MD) durante 12 a 14 días. Las bacterias han sido a
continuación recogidas por centrifugación, lavadas una vez en DPBS
que contiene 0,05% (v/v) de Tween 80 (DPBS/Tw), puestas de nuevo en
suspensión en 100 ml de PBS/Tw y calentadas a 80ºC durante 1 hora.
Las bacterias han sido centrifugadas a 13.000 x g durante 20 min.,
lavadas con DPBS/Tw, puestas de nuevo en suspensión en 25 ml de
DPBS/Tw que contiene 5 mM de inhibidor de proteasa AEBSF, ARNasa A y
ADNasa I, sonicadas de forma intermitente durante 25 min., y
después centrifugadas a 13.000 x g durante 20 min. Esta etapa ha
sido repetida, y los sobrenadantes han sido reunidos y centrifugados
a 34.000 x g durante 3 horas a 4ºC. El residuo ha sido desechado y
el sobrenadante final diluido 1:2 en DPBS y cromatografiado sobre
heparina-Sefarosa CL-6B.
Como muestra la figura 2, la proteína de enlace
con la heparina de 28 kDa estaba también presente en estas
preparaciones, lo que confirma que está asociada a la superficie. La
misma estaba también presente en unas fracciones de paredes
celulares de M. tuberculosis y unas preparaciones de
tuberculina (derivado proteico purificado antígeno para
cutirreacción) derivados de M. tuberculosis.
La capacidad de las adhesinas bacterianas para
aglutinar los glóbulos rojos es a menudo utilizada como modelo para
estudiar la fijación microbacteriana a la manera de las lectinas al
receptor de las células eucariotas. Los inventores han ensayado por
consiguiente la proteína de enlace con la heparina purificada para
su capacidad de aglutinar unos eritrocitos.
La actividad de hemaglutinación de la proteína
de enlace con la heparina purificada de sobrenadantes de cultivo ha
sido dosificada en unas placas de microtitulación en U (Falcon) en
ausencia o en presencia de heparina (Figura 4, cuadrados negros) de
la mucosa intestinal porcina, de dextran sulfato (figura 4, círculos
negros) o de dextrano (Figura 4, círculos blancos) a unas
concentraciones que van desde 0 a 50 \mug/ml. Unos ensayos
estándar contenían 70 \mul de una suspensión fresca de eritrocitos
de conejo preparada en DPBS y 70 \mul de HBHA purificada que
corresponde a 1 \mug de proteína. Los títulos de hemaglutinación
han sido leídos después de 5 horas de incubación a temperatura
ambiente. Los datos representan unas medias para unos experimentos
en cuádruple, y están representadas las barras de desviación
típica.
Menos de 0,1 \mug de proteína purificada ha
podido inducir la hemaglutinación de eritrocitos de conejo, pero no
de eritrocitos de humano, de cordero, de oca o de pollo (datos no
representados). Es por esta razón que los inventores han designado
esta proteína como una hemaglutinina de unión a la heparina (HBHA).
La hemaglutinación inducida por HBHA ha sido inhibida por la
heparina o el dextran sulfato, pero no por el dextrano (ver figura
4), lo que es similar a los resultados obtenidos en el ensayo de
adherencia de las micobacterias a las células CHO. La actividad de
hemaglutinación es sensible al calor en la medida en que la
incubación de la proteína durante 60 min. a 80ºC ha abolido la
hemaglutinación.
En la medida en que por una parte la adherencia
micobacteriana a las células epiteliales es inhibida por unos
glúcidos sulfatados, y por otra parte una proteína de 28 kDa
era purificada por cromatografía sobre
heparina-Sefarosa, era importante establecer si la
adherencia micobacteriana provenía de la mediación por HBHA.
Por consiguiente, se han preparado unos
anticuerpos policlonales de rata anti-HBHA de la
manera siguiente: 200 \mug de HBHA de BCG purificada han sido
sometidos a electroforesis preparativa sobre un gel de
poliacrylamida al 15% en presencia de SDS, y después
electrotransferidos sobre una membrana de nitrocelulosa. Después de
una coloración rápida con rojo ponceau, las bandas correspondientes
a la HBHA han sido excindidas con precaución, recortadas en
pequeños cuadrados y sonicadas brevemente en 1,5 ml de PBS estéril.
Después de la adición de 1 ml de una solución de
monofosforilo-lípido A (MPL + Sistema Adyuvante TDM,
Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) preparada según la recomendación
del fabricante, dos ratas Fischer han sido inmunizadas cada una con
UML de la suspensión del antígeno. Para cada inmunización, se ha
administrado 400 \mul por vía intraperitoneal y dos
veces 300 \mul por vía subcutánea. Los animales han recibido un
recuerdo de la misma manera con la misma cantidad de antígeno un
mes más tarde, y el suero ha sido recuperado 3 semanas después del
recuerdo.
El BCG ha sido marcado por [6^{-3}H] uracilo
como se ha descrito anteriormente. Aproximadamente 4·10^{6} BCG
radiomarcados han sido puestos de nuevo en suspensión en 1 ml de PBS
y preincubados con los volúmenes indicados de líquidos ascéticos de
anticuerpo monoclonal 3921 E4 (14) anti-HBHA (figura
5, panel A), o con 250 \mul de antisuero policlonal de rata
anti-HBHA (suero inmunitario, figura 5, panel B) o
de suero (figura 5, suero testigo, panel B) durante 30 min. a
temperatura ambiente. Las suspensiones bacterianas han sido a
continuación lavadas dos veces con 2 ml de DPBS para eliminar los
anticuerpos no ligados, y después utilizadas en el ensayo de
adherencia de células CHO con una multiplicidad de infección de 10,
como se ha descrito anteriormente.
Como muestra la figura 5, la adherencia de BCG a
las células CHO ha sido sustancialmente inhibida de una manera
dosis-dependiente por la presencia de anticuerpos
anti-HBHA. Los líquidos de ascitis que contienen
unos cuerpos monoclonales no pertinentes o unos antisueros simples
no han tenido ningún efecto. Estas observaciones indican que la
adherencia de las micobacterias a las células epiteliales proviene
en parte de la mediación por HBHA.
Como el tamaño de esta proteína es próximo al de
las proteínas de enlace de fibronectina del complejo de antígeno 85
(15), unos análisis de transferencia Western han sido utilizados
para determinar si estaban emparentadas.
La proteína de enlace con la heparina purificada
de una preparación de pared celular de M. bovis BCG (figura
3, pistas 1) o de sobrenadante de cultivo (pistas 2) ha sido
comparada con el complejo de antígeno 85 purificado (pistas 3) por
análisis de inmuno marcado (paneles A, B, C) y coloración con azul
de Coomassie (panel D) y después SDS-Page. El
análisis por inmunomarcado ha sido efectuado utilizando unos
anticuerpos policlonales dirigidos contra la proteína de enlace con
la heparina purificada (panel A), el anticuerpo monoclonal 4057D2
(panel B) o los anticuerpos policlonales dirigidos contra el
complejo de antígeno 85 (panel C). Las pistas 1 y 2 de los paneles
A, B y C contienen 2 \mug de proteína purificada, las
pistas 3 de los paneles A, B y C contienen 7 \mug de proteína
purificada, las pistas 2 y 3 del panel D contienen 4 \mug y 15
\mug de proteína purificada respectivamente. Los tamaños de los
marcadores de M_{r} se dan en el margen.
La figura 3 muestra que unos anticuerpos
policlonales dirigidos contra la proteína de enlace con la heparina
de 28 kDa purificada de BCG no han reconocido las proteínas del
complejo de antígeno 85 purificadas. A la inversa, unos anticuerpos
policlonales y monoclonales (no representados) dirigidos contra el
complejo de antígeno 85 de BCG no han conseguido reconocer la
proteína de enlace con la heparina, lo que implica que se trata de
proteínas distintas. Este resultado está también apoyado por los
diferentes perfiles de migración de estas proteínas durante la
SDS-PAGE (figura 3, panel D).
Las proteínas de enlace con la heparina
purificada de M. tuberculosis H37Ra y de BCG han sido
sometidas a un secuenciado de los aminoácidos
N-terminales. Para ello, 25 \mug de HBHA han sido
sometidos a electroforesis sobre gel de
poliacrilamida-SDS utilizando un gel de
poliacrilamida al 15%. Después de la electroforesis, el material ha
sido transferido sobre una membrana PVDF (ProBlott, ABI) por
electromarcado. Después de coloración con azul de Coomassie, la
banda correspondiente a la HBHA ha sido escindida y sometida a una
degradación de Edman automatizada. Los 16 primeros aminoácidos eran
Ala-Glu-Asn-Ser-Asn-Ile-Asp-Asp-Ile-Lys-Ala-Pro-Leu-Leu-Ala-Ala.
Los 16 primeros aminoácidos de la proteína de enlace con la
heparina de BCG han sido también determinados y han resultado
idénticos a los de M. tuberculosis. Una búsqueda de
similaridad en las bases de datos de las proteínas ha puesto en
evidencia que la proteína de enlace con la heparina no había sido
identificada previamente, y que representa por consiguiente un
nueva proteína micobacteriana. Además, los 16 primeros aminoácidos
no han presentado ninguna similaridad de secuencias significativa
con respecto a otras secuencias de proteínas conocidas.
Para el clonado del gen que codifica para HBHA,
se han determinado en primer lugar las secuencias
N-terminales de los fragmentos internos de HBHA.
Para ello, la HBHA purificada ha sido sometida a electroforesis como
se ha descrito anteriormente. Después de la electroforesis, la
proteína ha sido digerida por la tripsina en el interior del gel.
Los péptidos resultantes han sido entonces aislados por HPLC en fase
inversa, y después sometidos a la degradación de Edman. Cuatro
péptidos han permitido la determinación de secuencia:
- El péptido S 1441:
- Lys-Ala-Glu-Gly-Tyr-Leu-Glu-Ala-Ala-Thr
- El péptido S 1443:
- Xxx-Glu-Gly-Tyr-Val-Asp-Gln-Ala-Val-Glu-Leu-Thr-Gln-Glu-Ala-Leu-Gly-Lys
- El péptido S 1446:
- Xxx-Gln-Glu-Xxx-Leu-Pro-Glu-Xxx-Leu
- El péptido S 1447:
- Phe-Thr-Ala-Glu-Glu-Leu-Arg
La secuencia de dos pares de oligonucleótidos
era derivada de las secuencias peptídicas internas de HBHA. El
contenido en G + C generalmente alto del ADN micobacteriano ha
conducido a los inventores a favorecer G o C en la tercera posición
de los codones ("wobble"). El primer par de oligonucleótidos
prevenía del péptido S 1441 y tenía las secuencias siguientes:
5'AAG GC(G/C) GAG GG(G/C) TAC CT 3' (oligo S 1441) y
5' AGG TA(G/C) CCC TC(G/C) GCC TT 3' (oligo S 1441
inverso). El segundo par de oligonucleótidos provenía del péptido S
1443 y tenía las secuencias siguientes: : 5' GAC CAG GC(G/C)
GT(G/C) GAG CT 3' (oligo S 1443) y 5' AGC TC(G/C)
AC(G/C) GCC TGG TC 3' (oligo S 1443 inverso).
El ADN cromosómico de BCG ha sido extraído como
se ha descrito por Kremer et al. (16). Las reacciones de
polimerización en cadena (PCR) utilizando 50 ng de ADN cromosómico
de BCG y 1 \mug o bien unos oligo S 1441 y S 1443, o bien unos
oligo S 1443 y S 1441 inverso han sido efectuadas a una temperatura
de hibridación de 50ºC y con un número de ciclos de PCR de 30.
Solamente la reacción por PCR efectuada con los oligonucleótidos S
1441 y S 1443 inverso ha dado un fragmento de ADN amplificado
específico de aproximadamente 150 pb. Este fragmento amplificado
todavía era observado cuando la temperatura de hibridación ha sido
aumentada a 57ºC.
El fragmento amplificado ha sido insertado en el
lugar Hindll de pUC18 (Boehringer, Mannheim) e introducido en
Escherichia coli XL1-BLUE (New England
Biolabs). El contenido de plásmido de E. coli recombianante
ha sido a continuación analizado por unos procedimientos estándar
(17), y el plásmido que contenía el fragmento esperado ha sido
llamado pClone5.
Después de purificación por cromatografía sobre
una columna de Nucleobond AX (Macherey-Nagel) según
las instrucciones del proveedor, un fragmento de ADN bicatenario de
aproximadamente 150 pb ha sido secuenciado por el procedimiento de
determinación de elongación de cadena didesoxirribunucleotídica
utilizando [alpha^{-35}S]dCTP
(1,000 Ci/mmol; Amersham) y el kit de secuenciado de ADN de T7
(Pharmacia) según las instrucciones del fabricante. La secuencia
obtenida está representada en la figura 7 en la cual la secuencia de
los dos oligonucleótidos utilizados para la PCR está subrayada. La
secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de ADN ha
resultado corresponder a las secuencias de aminoácidos determinadas
para los péptidos S1441 y S1443. Esto indicaba que el fragmento PCR
amplificado corresponde a una parte interna del gen de BCG que
codifica para HBHA.
Para clonar el conjunto del gen que codifica
para HBHA, el fragmento de 150 pb de pClone5 ha sido escindido por
digestión por las enzimas de restricción BamHI y
HindIII. El fragmento ha sido a continuación purificado por
electroforesis sobre un gel de poliacrilamida al 7% y escindido del
gel por electroelución. El fragmento purificado ha sido marcado con
la digoxigenina utilizando el kit de detección y de marcado de ADN
por DIG (Boehringer) como se ha recomendado por el fabricante. El
fragmento marcado ha sido a continuación utilizado en unos
experimentos de transferencia Southern para sondear el ADN
cromosómico de BCG digerido por BamHI (figura 8, vía 1),
EcoRI (figura 8, vía 2), PstI (figura 8, vía 3),
Smal (figura 8, vía 4), Accl (figura 8, vía 5),
Ncol (figura 8, vía 6), Notl (figura 8, vía 7),
Sacl (figura 8, vía 8) o Sphl (figura 8, vía 9),
sometidos a una electroforesis sobre agarosa y transferidos a una
membrana de nilón. La membrana ha sido a continuación sondeada con
el fragmento BamHl/Hindll de aproximadamente 150 pb de pClone5. Los
tamaños de marcadores están presentados en el margen de la derecha.
Unos análisis de transferencia Southern han sido efectuados
utilizando unos protocolos estándar (17). Como muestra la figura 8,
la digestión por Sphl del ADN cromosómico de BCG a dado un
fragmento único de aproximadamente 2,5 kb que se hibridaba con la
sonda.
Los fragmentos de restricción Sphl del ADN
cromosómico de BCG de 2,8 y a 2,7 kb han sido entonces
purificados por electroforesis preparativa y electroelución, e
insertados en el lugar Sphl de pUC18. Los plásmidos recombinantes
han sido utilizados para transformar E. coli
XL1-Blue. Unas colonias blancas cultivadas sobre
gelosa LB (17) a las que se ha añadido ampicilina (150 \mug/ml) de
isopropil-tiogalactopiranosido (IPTG, 40 \mug/ml)
y X-gal (40 \mug/ml) han sido analizadas por
hibridación sobre colonias utilizando la sonda marcada con la
digoxigenina. Entre aproximadamente 300 colonias analizadas, una se
ha hibridado con la sonda. El análisis por restricción del plásmido
aislado de estos clones ha indicado que contenía un fragmento Sphl
de 2,5 kb que se ha hibridado con la sonda en transferencia
Southern.
El gen que codifica para HBHA contenido en el
fragmento Sphl de 2,5 kb ha sido secuenciado utilizando el
procedimiento de terminación de elongación de cadena
didesoxirribonucleótidica descrito anteriormente. La secuencias de
los oligonucleótidos sintéticos utilizados para el secuenciado están
representadas en una tabla 1, y la estrategia de secuenciado está
representada en la figura 9. El fragmento Sphl de 2,5 kb clonado
está representado por el trazo negro. Los punteados representan el
ADN vector. Las flechas gruesas representan el marco abierto de
lectura de HBHA. Las flechas finas indican la dirección y la
longitud del fragmento de ADN secuenciado para cada oligonucleótido
indicado encima de su flecha respectiva.
| Nombre del oligonucleótido | Secuencia |
| HBHA Sec 1 | 5'AGC CGG TAC AAC GAG CTG CTC 3' |
| HBHA Sec 1 Inv | 5'GAC CAG CTC GTT GTA CCG GCT 3' |
| HBHA Sec 2 | 5' CAT CCA ACA CGT CGA CTC C 3' |
| HBHA Sec 3 | 5' TTG ATG TCA TCA ATG TTC G 3' |
| HBHA Sec 4 | 5' CGT GGA CCA GGC GGT GGA G 3' |
| HBHA Sec 5 | 5' GAC GAT CAG GAG GTT TCC CCG 3' |
| Iniciador inverso | 5' AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA 3' |
El conjunto del gen que codifica para HBHA está
localizado en el interior del fragmento Sphl de 2,5 kb, en un
extremo del fragmento, y ha sido totalmente secuenciado a partir de
las dos ramas.
La secuencia nucleotídica así como la secuencia
proteica derivada está representada en la figura 10. El marco
abierto de lectura ha sido puesto en evidencia entre los nucleótidos
331 y 927. Los 16 primeros codones después del eventual codón de
iniciación ATG 331-333 se han traducido en una
secuencia de aminoácidos idéntica a la determinada después del
secuenciado N-terminal de la proteína HPHA
purificada. Corriente arriba del eventual codón de iniciación, en
los residuos 331-333, se ha encontrado un codón de
paro TAG en fase en las posiciones 310 a 312. Esto sugiere en gran
manera que el marco abierto de lectura de HBHA no contiene
secuencias que codifican para el péptido señal clásico, y 331333
representa por tanto probablemente el codón de iniciación. Esto
está sostenido por la presencia de un lugar putativo de enlace de
los ribosomas AGGAA que se encuentra de 10 a 6 nucleótidos
corriente arriba del codón de iniciación.
La secuencia proteica deducida presenta un peso
molecular calculado de 21390, lo que es inferior al peso molecular
aparente estimado por SDS-PAGE. La proteína citada
está compuesta por 198 aminoácidos y no contiene cisteína,
metionina, histidina o triptofano. Las cinco secuencias peptídicas
determinadas han sido encontradas de nuevo en la secuencia proteica
citada de HBHA (subrayada en la figura 10). Unas búsquedas de
homología en las bases de datos de proteínas han confirmado que
HBHA es una proteína micobacteriana no identificada hasta el
presente.
Los inventores han identificado una región de la
proteína susceptible de estar implicada en las interacciones con
los glicoconjugados sulfatados. Esta región está comprendida en la
secuencia siguiente:
- KKAAPAKKAAPAKKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKKVTQK
\newpage
Unos péptidos particularmente susceptible de
estar implicados en las interacciones son los siguientes:
- KKAAPA
- KKAAAKK
Las repeticiones en el extremo
C-terminal de la proteína, ricas en prolinas,
alaninas y lisinas, podrían explicar la diferencia entre los pesos
moleculares aparentes y calculados de la proteína que sufre unas
modificaciones traduccionales tales como la glicosilación.
La invención se refiere por tanto más
particularmente a la porción C-terminal de la
secuencia de la figura 10 y más particularmente la secuencia que
comprende aproximadamente los 50 últimos aminoácidos entre los
aminoácidos 150 y 199 de la secuencia de la figura 10. De forma
particularmente preferida, la invención se refiere al extremo
C-terminal de la proteína de la figura 10, y más
particularmente al extremo
C-terminal que comprende las repeticiones ricas en
prolina, alanina y lisina, o sea los 50 últimos aminoácidos de la
secuencia de la figura 10.
Se puede prever también cualquier variante de
las secuencias descritas anteriormente obtenida por adición,
sustitución o deleción de uno o varios aminoácidos sin modificar de
forma sustancial las propiedades de la región de interés. Entre las
modificaciones previstas, se observan muy particularmente a las
mutaciones silenciosas a nivel de la secuencias nuecleotídicas que
no modifican la secuencia peptídica de la proteína o del fragmento
de interés así como las mutaciones conservadoras que consisten en
sustituir uno o varios aminoácidos que presentan las mismas
características funcionales que el aminoácido de la secuencia
nativa. Unas adiciones o deleciones de aminoácidos sin que las
propiedades de las regiones de interés sean sustancialmente
modificadas forman asimismo parte de la invención. Algunos de los
residuos pueden ser eliminados o modificados expresando un gen
modificado de esta manera en E. coli como se ha descrito para
el gen completo. Si esta proteína fija la heparina con la misma
afinidad que la HBHA entera, esto significa que las secuencias
repetidas no están implicadas en esta fijación. En contrapartida,
si la proteína modificada pierde la capacidad de interactuar con la
heparina, la región modificada de la proteína desempeña un papel en
esta interacción.
La invención se refiere asimismo a un huésped
celular recombinante, caracterizado porque comprende en su genoma
una de las secuencias nucleotídicas descritas anteriormente. Más
particularmente, la invención se refiere a la transformación de
huéspedes celulares tales como E. coli con una de las
secuencias nucleotídicas de la invención a fin de producir el
antígeno micobacteriano HBHA que permite la adherencia de las
micobacterias a los glúcidos sulfatados de las células epiteliales.
La cepa bacteriana a transformar puede comprender la secuencia
nucleotídica que codifica para la porción
C-terminal del polipéptido HBHA de la figura 10,
que codifica para los 50 últimos aminoácidos del polipéptido HBHA o
que codifica para los 30 a 50 últimos aminoácidos del polipéptido
HBHA.
A fin de producir la HBHA de BCG en
Escherichia coli, el plásmido derivado de pU18 que contiene
el fragmento Sphr de 2,5 kb que comprende el gen completo de la
HBHA de BCG fue restringido simultáneamente por Nco l y
Kpn l. El fragmento de 705 pares de bases salido de esta
doble restricción fue purificado por electroelución después de
migración en un gel de agarosa de 1% según los procedimientos
estándar (17) y finalmente clonado en el vector de expresión
pKK388-1 (Clontech, Palo Alto, Ca., USA) previamente
restringido por Nco l y Kpn l. El plásmido recombinante fue a
continuación introducido en E. coli XL1-Blue
mediante técnicas clásicas de transformación (17).
El análisis fenotípico de la cepa que lleva este
plásmido de expresión fue realizado cultivando ésta en un medio LB
líquido y estimulando la producción de la HBHA recombinante por la
adición de isopropiltiogalactopiranósido (IPTG) según unos
procedimientos estándar (17). Prácticamente, dos cultivos en
erlenmeyers de 500 ml que contienen cada uno 100 ml de medio
líquido suplementado con ampicilina a razón de 150
\mug/ml, fueron respectivamente inoculados con 4 ml de precultivo
E. coli XL1-Blue que contiene el plásmido de
expresión de la HBHA o el plásmido pKK388-1 que
representa el cultivo controlado. El crecimiento de los dos cultivos
fue seguido por medición de la densidad óptica a 600 nm. Cuando
ésta fue de 0,6, se añadió IPTG a los cultivos a razón de 1 mM
final y los cultivos fueron prolongados durante 4 horas. Unas
muestras de cultivo fueros extraídas antes de la adición de IPTG y
al término de las 4 horas de cultivo en presencia del inductor a fin
de analizar por electroforesis en gel de poliacrilamida y por
inmunotransferencia la producción de HBHA recombinante.
Los resultados de estos diferentes análisis
están representados en la figura 11.
Las pistas A y B representan unos lisados
totales antes de la inducción de E. coli
XL1-Blue transformado respectivamente por
pKK388-1 y el derivado de pKK3588-1
que contiene el gen que codifica la HBHA. Las pistas C y D
representan unos lisados totales después de inducción con el IPTG
de E. coli XL1-Blue transformado
respectivamente por pKK388-1 y el derivado de
pKK388-1 que contiene el gen que codifica la HBHA.
Las pistas E contienen 1 \mug de HBHA purificada a partir de las
paredes de BCG. De izquierda a derecha, los diferentes paneles
representan respectivamente la coloración con azul de Coomassie
R-250 del gen de poliacrilamida y las
inmunotransferencias sondeadas por un suero murino controlado, un
suero murino dirigido contra la HBHA de BCG, el anticuerpo
monoclonal murino 3921E4 y el anticuerpo monoclonal murino 4057D2.
Los pesos moleculares de referencia están inscritos a la izquierda
de panel que presenta la coloración con azul de Coomassie del gel de
poliacrilamida.
El análisis en gel de poliacrilamida coloreado
con azul de Coomassie muestra la síntesis de un polipéptido de
aproximadamente 27 kDa en E. coli XL1-Blue
que lleva el vector de expresión de la HBHA y desreprimido por el
IPTG. Este polipéptido reconocido en inmunotransferencia por un
antisuero murino dirigido contra la proteína HBHA purificada de un
sobrenadante de cultivo de BCG no es producido por E. coli
XL1-Blue que lleva el vector
pKK388-1 sin inserción, que muestra que su síntesis
depende de la secuencia de ADN de BCG clonado en el vector de
expresión. Como ésta es íntegramente la secuencia codificante de la
HBHA de BCG, fue sorprendente observar que el polipéptido
recombinante presenta un peso molecular aparente más bajo que el de
la HBHA purificada de BCG y que es de 28 kDa en el sistema de gel
considerado.
Por tanto la invención se refiere asimismo a una
secuencia peptídica recombinante caracterizada porque permite la
adherencia de micobacterias a unas células huéspedes. Más
particularmente, la invención se refiere a una secuencia peptídica
que comprende un polipéptido de aproximadamente 27 kDa reconocido
por el anticuerpo monoclonal 3921E4 (14) y no reconocido por el
anticuerpo monoclonal 4057D2 (14). De manera preferida, la secuencia
peptídica recombinante de la invención es el producto de expresión
de una cepa E. coli transformada con una de las secuencias
nucleotídicas descritas anteriormente y que codifica para una
secuencia peptídica que permite la adherencia de micobacterias a
unas células huéspedes, más particularmente una secuencia
nucleotídica obtenida a partir de M. bovis BCG o M.
tuberculosis.
Como el peso molecular de la HBHA deducido a
partir de la secuencia de su gen es significativamente inferior a
su peso molecular aparente observado después de migración
electroforética y que esta diferencia es el resultado de
modificaciones postraduccionales de la HBHA, estas modificaciones
no se han realizado en E. coli. Esta conclusión está apoyada
por el hecho de que se observa una inmunorreactividad diferencial de
la HBHA recombinante con los dos anticuerpos monoclonales 3921E4 y
4057D2. Si estos dos anticuerpos monoclonales reconocen de forma
equivalente en inmunotransferencia la HBHA purificada de BCG,
solamente 3921E4 es inmunoreactivo con la HBHA recombinante
producida en E. coli. Esta observación muestra en primer
lugar que los epítopos de estos dos anticuerpos monoclonales son
diferentes y que el epítopo reconocido por 4057D2 sobre la HBHA ya
no está presente cuando ésta es producida en E. coli, que
está localizado sobre un elemento molecular resultante de una
modificación postraduccional no realizada por E. coli.
Esta modificación postraduccional es una
glicosilación en la medida en que ha sido ya demostrado que la parte
sacarídica de una glicoproteína podía ser inmunogénica. El motivo
sacarídico es muy inmunogénico en la medida en que el análisis por
inmunotransferencia que utiliza suero murino
anti-HBHA da lugar a una señal más baja con la HBHA
recombinante con respecto a la observada con la HBHA purificada de
BCG. Esta observación es tanto más interpelante que la cantidad de
HBHA recombinante puesta en juego en este análisis es ampliamente
superior a la de la HBHA natural, como atestigua la coloración con
azul de Coomassie del gel de poliacrilamida. Por otra parte, como
la inmunorreactividad de 3921E4 es próxima a la observada con el
suero murino, el epítopo reconocido por este anticuerpo monoclonal
es por tanto parcialmente dependiente de la modificación
postraduccional sospechada.
Varios enfoques experimentales han sido
previstos para elucidar la naturaleza exacta de esta modificación
postraduccional. En primer lugar, la HBHA purificada a partir de BCG
es sometida a la acción de diferentes endoglicosidasas o
exoglicosidasas a fin de ver si el peso molecular aparente de esta
proteína disminuye después de la acción de estas enzimas. Una
migración electroforética más rápida observada después de la
digestión con una o varias de estas enzimas, informa directamente
sobre la naturaleza química de la modificación sacarídica.
Paralelamente, unos cultivos de BCG realizados en presencia de
inhibidores de glicosilación (por ejemplo tunicamicina que inhibe
la N-glicosilación en las
bacterias gram-positivas) constituyen un enfoque
interesante para elucidar la naturaleza de las modificaciones
postraduccionales de la HBHA.
Como se ha demostrado que la HBHA tiene una
función directa en la interacción entre el BCG y las células
epiteliales, interacción que se puede inhibir por la heparina, es
importante identificar la región que está implicada en la
interacción del BCG con las células epiteliales a través de los
polisacaridos sulfatados.
La HBHA producida en forma recombinante por
E. coli es el objeto de una proteolisis que afecta a su
extremo carboxiterminal y provoca una disminución de afinidad para
le heparina.
La HBHA producida en E. coli WL 1 Blue se
acumula en el citoplasma pero permanece soluble puesto que una
sonicación de los colibacilos seguida de una centrifugación de
clarificación (10.000 g durante 15 minutos) permite encontrar de
nuevo la totalidad de la HBHA detectable en inmunoblot en la
fracción soluble del lisado. Cuando esta última es incubada a
temperatura ambiente, la HBHA recombinante sufre una degradación
rápida hasta el término de una incubación de 2 horas, su peso
molecular aparente pasa de 27 kDa a 19 kDa. La forma de 19 kDa que
ya no es reconocida por el anticuerpo monoclonal 3921E4 muestra sin
embargo una buena resistencia a la degradación ulterior puesto que
esta forma permanece estable al término de una incubación de 18
horas a temperatura ambiente. Como la degradación de la HBHA
recombinante ha podido ser parada por adición de 1 mM de AEBSF que
es un inhibidor de proteasas de serina, es probable que esta
degradación sea el resultado de un proteolisis. Debe observarse que
la HBHA nativa incubada en un lisado de E. coli
XL1-Blue no sufre semejante degradación, sugiriendo
así que la modificación postraduccional soportada por la HBHA
nativa le confiere una resistencia con respecto a la proteolisis
observada con la HBHA recombinante.
El análisis cromatográfico sobre
heparina-Sefarosa de un sonicado clarificado de
E. coli XL1-Blue que produce la HBHA
recombinante y suplementado con 1 mM de AEBSF, ha revelado que la
HBHA recombinante fija la heparina con la misma afinidad que la
HBHA nativa puesto que eluye a 350 mM NaCl en PBS. Por lo contrario,
la HBHA degradada en polipéptido de 19 kDa ya no fija la heparina
lo que muestra que la parte escindida es indispensable para el
reconocimiento de los polisacaridos sulfatados. La HBHA recombinante
purificada sobre heparina-Sefarosa se ha revelado
además incapaz de aglutinar los eritrocitos de conejo. Otras
observaciones muestran que la modificación postraduccional de la
HBHA no está implicada en su actividad de fijación a la heparina
pero es importante para su actividad de hemaglutinación.
El análisis de la HBHA recombinante por
cromatografía sobre matriz de heparina inmovilizada ha resultado
también interesante para la cartografía del campo proteico
implicado en el reconocimiento de la heparina
(Heparin-binding site). En efecto, tres formas de
HBHA recombinante que presentan unos pesos moleculares de 27, 26, 25
kDa fueron eluidas por un gradiente lineal de NaCl que varía de 0 a
500 mM y aplicado al tampón de lavado de la columna (PBS). Las
formas de 26 y 25 kDa, productos de degradación de la proteína
recombinante completa de 27 kDa, eluyen respectivamente
aproximadamente 310 y 280 mM NaCl. Como estas dos formas presentan
un descenso de afinidad para la heparina con respecto a la proteína
recombinante completa, era importante conocer la región en la que
se efectúan las truncaduras. Para ello, los extremos aminoterminales
de las 3 formas purificadas sobre heparina-Sefarosa
fueron microsecuenciadas. El análisis de los 10 primeros aminoácidos
revela que las 3 especies moleculares presentan la misma secuencia
que es idéntica a la secuencia aminoterminal de la HBHA purificada
a partir de paredes de BCG. Esta observación muestra por tanto que
la degradación de la HBHA recombinante se efectúa por escisiones
carboxiterminales sucesivas. Estas escisiones que van a la par de un
descenso de afinidad para la heparina muestran que los aminoácidos
carboxiterminales de la HBHA están directamente implicados en el
reconocimiento de los polisacaridos sulfatados. El gran contenido de
lisinas en las zonas repetidas carboxiterminales de la HBHA aboga
por otra parte por una interacción electrostática entre las cargas
positivas de las lisinas y las cargas negativas soportadas por los
residuos sulfatados de la heparina.
Por otra parte, la función de las lisinas en las
interacciones proteínas-azúcares sulfatados está
documentada (18).
La forma de 19 kDa observada después de
proteolisis de la HBHA recombinante podría por lo tanto corresponder
a una HBHA y que ha perdido su secuencias repetidas
carboxiterminales y que corresponden a una pérdida de 39
aminoácidos. En esta hipótesis, la cadena polipeptídica de la HBHA
perdería una masa de aproximadamente 3,8 kDa y pasaría así de 21,3
a 17,5 kDa. El peso molecular aparente de la HBHA recombinante
después de proteolisis en un lisado de E. coli
XL1-Blue es totalmente compatible con esta
hipótesis, también es interesante destacar que la migración
electroforética aberrante de la HBHA y atribuida a sus secuencias
repetidas carboxiterminales, ya no es observada con la forma
degrada de 19 kDa que ya no fija la heparina. Esta última
observación refuerza por tanto la hipótesis según la cual la HBHA
recombinante de 19 kDa correspondería a una HBHA que ha perdido sus
secuencias repetidas carboxiterminales. Como el anticuerpo
monoclonal 3921E4 no reconoce ya la HBHA recombinante de 19 kDa,
esto sugiere que su epítopo estaría localizado en las secuencias
repetidas carboxiterminales.
Para saber si HBHA es capaz de inducir una
respuesta inmunitaria en el hombre, unos análisis de inmunomarcados
han sido realizados utilizando HBHA purificada y unos antisueros
humanos que provienen de tuberculosos. Cinco microgramos de la
proteína han sido sometidos a la electroforesis utilizando un gel de
poliacrilamida-SDS al 15%, y después transferidos
sobre unas membranas de nitrocelulosas sondeadas ulteriormente con
los sueros diluidos 100 veces que provienen de 7 pacientes
diferentes afectados de tuberculosis evolutiva (ver figura 6,
pistas 3A a 493) (pista 1, HBHA purificada, pista 2, proteína no
pertinente), así como el suero de un sujeto sano (pista testigo).
Las pistas de la izquierda contienen las proteínas purificadas
(pistas 1 y 2) y los marcadores de peso molecular (ver PM) ha sido
coloreados con azul de Coomassie después de
SDS-PAGE.
Los resultados presentados en la figura 6
muestran que todos los sueros de los tuberculosos contienen unos
anticuerpos anti-HBHA, mientras que el suero del
individuo sano no contenía dichos anticuerpos. Estos resultados
indican que la HBHA expuesta a la superficie es inmunógena durante
la evolución de la tuberculosis humana y que la presencia de
anticuerpos anti-HBHA permite determinar la
presencia de infecciones micobacterianas.
La modificación postraduccional soportada por la
HBHA nativa es un determinante antigénico importante en los
pacientes de tuberculosis.
La HBHA recombinante producida por E.
coli fue analizada por inmunoblot utilizando los sueros de
pacientes tuberculosos. Comparativamente con las señales de
detección obtenidas con la HBHA nativa, estos reactivos
inmunológicos han reconocido muy débilmente la proteína
recombinante, indicando por tanto que la modificación
postraduccional de la HBHA lleva uno o unos epítopos mayores. Estos
sueros han resultado incapaces de detectar la HBHA recombinante de
19 kDa.
La invención se refiere por tanto a la
utilización de una secuencia peptídica o de la proteína de la
invención, y particularmente a una o varias regiones inmunógenas de
esta secuencia o proteína, en el diagnóstico de infecciones
micobacterianas, en particular para la posterior evidencia de la
presencia de anticuerpos anti-HBHA en los fluidos
biológicos. De manera general, una secuencia peptídica o la proteína
o un polipéptido recombinante preferentemente modificado según la
invención está ligada a un soporte e incubada con unos fluidos
biológicos susceptibles de contener unos anticuerpos
anti-HBHA. Los anticuerpos anti-HBHA
ligados al polipéptido de la invención son a continuación puestos
en evidencia o bien con unos anticuerpos marcados dirigidos contra
los anticuerpos anti-HBHA, o bien con unos
anticuerpos no marcados dirigidos contra los anticuerpos
anti-HBHA y unos anticuerpos marcados por ejemplo
por una enzima de tipo fosfatasa alcalina o peroxidasa, o de biotina
dirigidos contra los anticuerpos no marcados.
De forma detallada, se puede utilizar la
proteína completa o un polipéptido recombinante de la invención pero
también se puede utilizar una o varias regiones inmunógenas de esta
proteína que pueden ser determinadas por unas técnicas llamadas de
"epitope mapping" bien conocidas por el experto en la materia.
Por ejemplo, con vistas a cartografiar los epítopos B y T presentes
en la molécula de HBHA completa, se recurre al procediendo de los
perfiles de hidrofobicidad (19). También se utiliza la predicción
informatizada de determinantes antigénicos para células B (B).
El polipéptido elegido es adsorbido sobre un
soporte de placa de microtitulación, cánula, microbola u otro. La
fijación del polipéptido se efectúa utilizando unas técnicas
conocidas por el experto en la materia. De manera preferida, el
soporte utilizado es una placa de microtitulación. El polipéptido
está por tanto diluido en un tampón carbonato básico y distribuido
en los pocillos. Después de una incubación de algunas horas a
temperatura ambiente, se efectúan varios lavados utilizando un
tampón fisiológico.
El polipéptido fijado al soporte es a
continuación incubado con una muestra de fluido biológico. Varios
tipos de fluidos biológicos pueden ser utilizados y obtenidos a
partir de animales o de humanos. Más particularmente, el fluido
biológico puede ser obtenido a partir de suero, de linfa, de saliva
o de orina o también aislado a partir de tejidos tales como las
células de pulmones. La incubación se realiza según los
procedimientos habituales. En este caso, los sueros de paciente son
diluidos y puestos en contacto con la secuencia peptídica fijada
sobre la placa. La incubación de aproximadamente una hora es seguida
por varios lavados con un tampón fisiológico. Los anticuerpos
anti-HBHA ligados al polipéptido de la invención son
a continuación puestos en evidencia o bien con unos anticuerpos
marcados dirigidos contra los anticuerpos anti-HBHA,
o bien con unos anticuerpos no marcados dirigidos contra los
anticuerpos anti-HBHA y después con unos anticuerpos
marcados dirigidos contra los anticuerpos no marcados.
El marcado de los anticuerpos puede ser
radioactivo pero se preferirá de forma general otro tipo de marcado
habitual. Las sustancias fluorescentes tales como la
esitiocianatofluoriscina o las enzimas tales como la fosfatasa
alcalina, la peroxidasa o la biotina/estreptavidina son unos
marcadores comúnmente utilizados. La elección de los anticuerpos
marcados o no marcados depende del animal del cual provienen los
líquidos biológicos. Si se trata de líquido biológico humano, los
anticuerpos utilizados son dirigidos contra unas inmunoglobulinas
humanas.
El enlace entre el anticuerpo
anti-HBHA y los anticuerpos marcados o no marcados
se efectúa según las técnicas habituales. Por ejemplo, la reacción
tiene lugar durante una hora a temperatura ambiente y después de
varios lavados, se añade un substrato del marcador.
La invención se refiere asimismo a un kit que
permite detectar la presencia de anticuerpos
anti-HBHA en una muestra de fluido biológico. El
kit comprende un polipéptido, o una o varias regiones inmunógenas de
la HBHA adsorbida sobre un soporte y de forma opcional, un
anticuerpo marcado (y si es necesario un anticuerpo no marcado) así
como los tampones habituales y un substrato del marcador.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> IDENTIFICACIÓN Y CLONACIÓN DE UN
ANTÍGENO MICROBACTERIANO QUE CORRESPONDE A UNA HEMAGLUTININA DE
UNIÓN A LA HEPARINA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> B3168AAA-I. P.
L./INSERM
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 97925109.7
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1997-05-20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<151>
1996-05-17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia peptídica que comprende una región involucrada
en interacciones con glicoconjugados sulfatados y en el enlace
heparina.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Lys Ala Ala Pro Ala Lys Lys Ala Ala Pro
Ala Lys Lys Ala Ala}
\sac{Pro Ala Lys Lys Ala Ala Ala Lys Lys Ala
Pro Ala Lys Lys Ala Ala}
\sac{Ala Lys Lys Val Thr Gln Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido S 1441
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Ala Glu Gly Tyr Leu Glu Ala Ala
Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido S 1443
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Gly Tyr Val Asp Gln Ala Val Glu Leu
Thr Gln Glu Ala Leu}
\sac{Gly Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido S 1446
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Gln Glu Xaa Leu Pro Glu Xaa Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<231> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido S 1447
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Thr Ala Glu Glu Leu Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido originado a partir del péptido S 1441
(oligo S 1441)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaggcsgagg gstacct
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido originado a partir del péptido S 1441
(oligo S 1441 inverso)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggtasccct csgcctt
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido originados a partir del péptido S 1443
(oligo S 1443)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaccaggcsg tsgagct
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido originado a partir del péptido S 1443
(oligo S 1443 inverso)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagctcsacsg cctggtc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido denominado HBHASeq1 y utilizado para
secuenciar el gen que codifica para HBHA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagccggtaca acgagctggt c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido denominado HBHA Seqlinv y utilizado para
secuenciar el gen que codifica para HBHA
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaccagctcg ttgtaccggc t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido denominado HBHASeq2 y utilizado para
secuenciar el gen que codifica para HBHA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatccaacac gtcgactcc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido denominado HBHA Seq3 y utilizado para
secuenciar el gen que codifica para HBHA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgatgtcat caatgttcg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido denominado HBHA Seq4 y utilizado para
secuenciar el gen que codifica para HBHA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtggaccag gcggtggag
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido denominado HBHA Seq5 y utilizado para
secuenciar el gen que codifica para HBHA
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacgatcagg aggtttcccc g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido denominado iniciador inverso y
utilizado para secuenciar el gen que codifica para HBHA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcggataac aatttcacac agga
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 149
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia nucleotídica y secuencia amino de un fragmento
de HBHA deducido a partir de un fragmento PRC de ADN BCG
cromosómico.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(147)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia nucleotídica y secuencia amino de un fragmento
de HBHA deducido a partir de un fragmento PRC de ADN BCG
cromosómico.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1097
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia ADN del gen BCG que codifica para HBHA.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (331)..(924)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDS desde 811 a 828, desde 829 a
846, desde 847 a 864, desde 865 a 885 y desde 895 a 915: péptido que
puede estar particularmente involucrado en la interacción con
glicoconjugados sulfatados.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 198
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia ADN del gen BCG que codifica para HBHA.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
Claims (21)
1. Antígeno proteínico micobacteriano
seleccionado de entre el grupo constituido:
- a)
- por la parte C-terminal de polipéptido HBHA de la figura 10,
- b)
- por la secuencia peptídica de los 50 últimos aminoácidos del polipéptido HBHA de la figura 10, y
- c)
- por una secuencia peptídica de los 30 a 50 últimos aminoácidos del polipéptido HBHA de la figura 10,
permitiendo dicho antígeno la adherencia de las
micobacterias a los glúcidos sulfatados de las células
epiteliales.
2. Antígeno según la reivindicación 1,
caracterizado porque el polipéptido que permite la adherencia
está comprendido en la secuencia siguiente:
KKAAPAKKAAPAKKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKKVTQK
o cualquier porción de esta
secuencia que permita la adherencia de micobacterias a unas células
huéspedes.
3. Antígeno según la reivindicación 1,
susceptible de ser obtenido a partir de una micobacteria, y en
particular de M. bovis BCG.
4. Antígeno según una de las reivindicaciones
anteriores, caracterizado porque es reconocido por los
anticuerpos monoclonales 3921E4 y 4057D2.
5. Polipéptido recombinante, susceptible de ser
obtenido por expresión en un huésped celular, de un polinucleótido
que codifica para la parte C-terminal del
polipéptido HBHA de la figura 10, o los 50 últimos aminoácidos del
polipéptido HBHA de la figura 10 o los 30 a 50 últimos aminoácidos
del polipéptido HBHA de la figura 10, y constitutivo de un antígeno
micobacteriano HBHA que permite la adherencia de las micobacterias a
los glúcidos sulfatados de las células epiteliales.
6. Polipéptido recombinante según la
reivindicación 5, caracterizado porque la secuencia
polinucleotídica se obtiene a partir de M. bovis BCG o M.
tuberculosis.
7. Polipéptido recombinante según cualquiera de
las reivindicaciones 5 a 6, caracterizado porque es
reconocido por el anticuerpo monoclonal 3921E4 y no reconocido por
el anticuerpo monoclonal 4057D2.
8. Polipéptido recombinante según cualquiera de
las reivindicaciones 5 a 7, comprendido en los 50 últimos
aminoácidos del extremo C-terminal del polipéptido
HBHA de la figura 10.
9. Polipéptido recombinante según la
reivindicación 7, caracterizado porque el huésped celular es
E. coli.
10. Composición inmunógena contra las
infecciones micobacterianas que contienen a título de principio
activo un antígeno proteico según una de las reivindicaciones 1 a 4
o un polipéptido según una de las reivindicaciones 5 a 8.
11. Reactivo, para la detección de anticuerpos
anti-HBHA en un fluido biológico, seleccionado en un
grupo constituido:
- a)
- por la parte C-terminal del polipéptido HBHA de la figura 10,
- b)
- por la secuencia peptídica de los 50 últimos aminoácidos del polipéptido HBHA de la figura 10, y
- c)
- por una secuencia peptídica de los 30 a 50 últimos aminoácidos del polipéptido HBHA de la figura 10,
- d)
- por un antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, y
- e)
- por un polipéptido recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9.
12. Kit para el diagnóstico serológico de las
infecciones por micobacterias, que comprende por lo menos:
- a)
- un reactivo según la reivindicación 11, estando dicho reactivo acoplado o adsorbido sobre un soporte;
- b)
- un anticuerpo anti-anticuerpo, modificado de tal manera que se le pueda acoplar una señal de detección.
13. Kit según la reivindicación 12,
caracterizado porque el anticuerpo
anti-anticuerpo es específico de las
inmunoglobulinas humanas.
14. Kit según la reivindicación 12 ó 13, en el
que el anticuerpo anti-anticuerpo está marcado
directamente o indirectamente, o bien por una sustancia marcadora,
o bien por una enzima que por transformación de su substrato
emitirá una señal de marcado.
15. Polinucleótido, caracterizado porque
su secuencia codifica para un antígeno según la reivindicación
1.
16. Polinucleótido según la reivindicación 15,
caracterizado porque su secuencia está comprendida en una
secuencia que codifica para el polipéptido siguiente.
KKAAPAKKAAPAKKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKKVTQK
o cualquier porción de esta
secuencia peptídica que permite la adherencia de micobacterias a
unas células
huéspedes.
17. Vector recombinante, caracterizado
porque comprende una secuencia nucleotídica según cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 16.
18. Huésped celular recombinante,
caracterizado porque contiene el vector recombinante de la
reivindicación 17.
19. Huésped celular recombinante según la
reivindicación 18, caracterizado porque dicho huésped es una
micobacteria.
20. Huésped celular recombinante según
cualquiera de las reivindicaciones 18 a 19, caracterizado
porque dicho huésped celular es M. bovis BCG.
21. Huésped según cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 20, caracterizado porque dicha
secuencia nucleotídica está sobreexpresada por dicho huésped.
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