CH676606A5

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Info

Publication number: CH676606A5
Application number: CH2160/88A
Authority: CH
Inventors: Michael V Norgard
Original assignee: Univ Texas
Priority date: 1986-09-30
Filing date: 1987-09-21
Publication date: 1991-02-15
Also published as: US4868118A; DE3751870D1; IL84006A0; CA1336692C; JPH02500403A; IL84006A; DK293988A; DK293988D0; EP0324774A1; WO1988002403A1; EP0324774B1; DE3751870T2; AU8021487A; ATE141325T1

Description

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Beschreibung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von mikrobiellen Klonen, welche das 47 kDa-Oberflächenimmunogen von Treponema pallidum exprimieren. Die genetisch modifizierten Mikroorganismen ermöglichen die Produktion des immuno-dominanten 47- bis 48-KiIodaIton-Qberflächenantigens von Treponema pallidum, welches allgemein als das 47-KiIodaIton-Oberflächenanti-gen bezeichnet wird.

Die Infektion durch Treponema pallidum ist die wohlbegründete Ursache von Syphilis, Trotz der Erhältlichkeit von wirksamen Antibiotika bewirkt die Syphilis weltweit weiterhin Elend und Krankheit. Die Unfähigkeit, in vitro-Kulturen von Treponema pallidum zu erzeugen, hat die Forschungsarbeiten an diesem Organismus eingeschränkt. Dieser Mikroorganismus wird normalerweise durch eine in vivo-Kultur in Hamster-Lymphknoten oder Kaninchen-Proben fortgepflanzt, was nützlich ist, jedoch sind diese Verfahren nicht für die Durchführung der grosstechnischen Herstellung von Treponema pallidum oder Antigenen davon, insbesondere reinen Antigenen, geeignet. Es hat sich als schwierig erwiesen, Treponema pallidum-Antiaene zu erhalten, die frei von Hamster- oder Kaninchen-Antigenen sind, aus in vivo kultivierten Treponema pallidum. Demzufolge waren gereinigte treponemale Antigene nicht durch traditionelle Techniken der Mikroorganismus-Herstellung zugänglich.

Modernere Techniken der Molekularbiologie sind im Zusammenhang der Charakterisierung und dem Nachweis von Treponema pallidum. Treponema pallidum-Antiaenen und die Treponema pallidum-lnfektion angewandt worden. Verschiedene polyklonale und monoklonale Antikörper gegen Treponema pallidum-Antigene sind ebenfalls hergestellt worden.

Das US-Patent Nr. 4 514 498, erteilt am 30. April 1985 an Kettman und Norgard, beschreibt zahlreiche monoklonale Antikörper, welche gegen Antigene von T. pallidum gerichtet sind. Zwei Hybridom-Klo-ne 8G2 (ATCC HB 8134) und 11E3 produzierten für das 47 kDa-Oberflächenantigen von T. pallidum spezifische Antikörper. Diese zwei besonderen Antikörper wurden in der vorliegenden Erfindung für die Auswahl von E. coli-Klonen. die das 47 kDa-Antigen produzieren, verwendet.

Norgard et al. (1983) (Infect, und Immun., V 42, Seiten 435 bis 445) beschrieben die Konstruktion von hybriden pBR322-PIasmidklonbanken in E. coli K-12, die das gesamte Treponema pallidum-Genom darstellen. Es wurde Anti-T. pallidum-Serum von Kaninchen in einem Radioimmuno-Kolonieblot-Test zum Nachweis von E. coli-Klonen. die T. pallidum-Antiaene produzieren, verwendet. Es wurde ein Klon gefunden, das ein Genprodukt von 44 kDa produziert. Es wurde entweder das Kaninchen-Immunserum oder das humane, syphilitische Serum verwendet, um E. coli-Klone. die das T. pallidum-Antiaen produzieren, nachzuweisen. Der methodologische Unterschied zwischen dieser Referenz und der vorliegenden Offenbarung beginnt die vorliegende Erfindung zu unterscheiden. Zusätzlich ist gefunden worden, dass monoklonale Antikörper, die auf das T. pallidum-47 kDa-Oberflächenantigen spezifisch waren, unfähig waren, eine Reaktion mit dem 44 kDa-Antigen einzugehen.

Stamm et al., (1982) (Infect, und Immuno., V 36, Seiten 1238 bis 1241) beschrieben das Einrichten einer T. paliidum-DNA-Klonbank. Die T. pallidum-DNA wurde mit Bam Hl-Endonukleus gespalten und die Spaltfragmente wurden am Bam HI-gespaltenen Plasmid pBR322 gebunden. Es wurde festgestellt, dass vier transformierte E. coli-Klone in der Regel T. pallidum-Antiaene produzieren.

Stamm et al., (1983) (Infect, und Immuno., V 41, Seiten 709 bis 721) beschrieben die Expression von Treponema pallidum-Antiaenen in Escherichia coli K-12. Stamm et al., (1983) beschrieben die Verwendung einer pBR322-Bank von rekombinanten Plasmiden, die Treponema pallidum-DNA-lnsertionen in Escherichia coli beherbergen und die Identifikation von Klonen, die Treponema pallidum-Antiaene exprimieren. Die Molekulargewichte der durch die PIasmid-pLV32-transformierten E coli-produzierten Antigene hatten die Grösse 25 kDa, 35 kDa und 39 kDa. Ein E. coli-Klon. das das Plasmid pLV55 enthielt, codierte ein 35 kDa-T. oallidum-Protein-Antiaen. Viel der Stamm et al., (1983)-Referenz war die Herstellung von T. pallidum-Oberflächenantiaenen. In der Stamm et al., (1983)-Referenz wurde komplettes Human- oder Kaninchenserum, das gegen Syphilis gerichtet war, verwendet, um die transformierten E. coli-Klone auszuwählen.

Van de Donk et al., (1984) (in Innovations in Biotechnology, ed. by Houwink, et al., Elsevier Science, Amsterdam) beschrieb die Entwicklung von Hybridom-Zellinien, die Antikörper produzieren, die gegen T. pallidum-Antiaene gerichtet waren. Es wird ebenfalls offenbart, dass gewisse monoklonale Antikörper, die von Hybridomzellinien erhalten wurden, mit einem 46 kDa- und einem 44 kDa-Polypeptid-Anti-gen von Treponema pallidum reagierten. Weiter ist in der Referenz angegeben, dass diese monoklonalen Antikörper für die Reinigung von Treponema pallidum-Antiaenen. die durch E. coli-traaender Treponema pallidum-rekombinanter DNA produziert wurden, verwendet werden können, wie vorher durch Norgard et al,, (1983) vorgeschlagen wurde (Infect, and Immun., V 42, Seiten 435 bis 445).

Van Embden et al., (1983), (Infect, and Immun., V 42, Seiten 187 bis 196) beschrieben die Herstellung von E, coli K-12-Klonen, die mit Plasmiden transformiert wurden, die T. pallidum-DNA enthielten. Es wurden E. coli-Transformanden festgestellt, die diverse T. pallidum-Polvpeptid-Antiaene produzierten, einschliesslich Polypeptiden mit scheinbaren Grössen von 25 kDa, 41 kDa, 44 kDa und 58 kDa, unter anderem.

Çoates et al, (1985), (Abstracts of the 85th Annual Meeting of the Amer, Soc, for Microbîol., Ab-

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stract C29, Seite 304) beschrieben einen E. coli-Transformanden. der ein 18 kDa-T. pallidum-Polvpeptid-Antigen produziert.

Fehninger et al., (1985), (Abstracts of the 85th Annual Meeting of the Amer. Soc. for Mîcrobiol., Abstract B156, Seite 44) beschrieben ein 38 kDa-hydrophobes T. pallidum-Antiaen. wie es durch rekombi-nantes Plasmid-transformierte E. coli produziert wurde.

Rodgers et al., (1985), (Abstracts of the 85th Annual Meeting of Amer. Soc. for Mîcrobiol., Abstract C30, Seite 305) beschrieben die Auswertung der Radioaktivität eines 37 kDa-Polypeptid T. pallidum-An-tigens, das durch einen E. coli-Transformanden produziert wurde.

Die PCT-Patentanmeldung (1984) Nr. PCT/US 83/01 718 (Internationale Publikationsnummer WO 84/01 961 mit dem Titel «Rekombinante DNA-derivierte Antigene von Treponema pallidum» von Lovett) beschreibt E. coli-Transformationsklone. die plasmîd-gebundene T. pallidum-DNA enthält und T. palli-dum-Peptid-Antiaene exprimiert. Verschiedene Klone produzierten Antigene mit Molekulargewichten oder Gewichtsbereichen von 16 bis 30 kDa; 43 kDa; 37 bis 46 kDa; 18 bis 23 kDa; 150 kDa; oder 180 kDa.

Potentiell wichtige Antigene oder Immunogene von T. pallidum wurden in verschiedenen Laboratorien identifiziert (Alderete et äl. (1980) Infect. Immun.. V 30, pp 814-823; Baker-Zander et al. (1985) (J. Infect. Dis.. V 151, pp 264-272; Baker-Zander et al., (1983) Infect. Immun.. V 42, pp 634-638; Baker-Zander et al. (1984 ) Infect. Immun.. V 46. pp 116-121; Hanff et al., (1982) J. Immunol.. V 129, pp 1287-1291; Jones et al., (1984) J Exo. Med.. V160, pp 1404-1420; Lukehart et al., (1982) J. Immunol.. V129, pp 833-838; Lukehart et al. (1986) Sex. Trans. Dis.. V 13, pp 9-15; Lukehart et al. (1985) J. Immunol.. V 134, pp 585-592; Marchitto et al. (1984) Infect. Immun.. V 45, pp 660-666,; Marchitto et al. (1986) Infect. lm-mun.. V 51 , pp 168-176 ; Moskophidis et al. (1984) Infect. Immun.. V 43, pp 127-132; Norris et al. (1984) J. Immunol.. V 133, pp 2686-2692; Penn et al. (1985) J. Gen. Microbio!.. V131', pp 2349-2357; Strugnell et al. (1986) Infect. Immun.. V 51, pp 957-960; Thornburg et al. (1983) Infect. Immun.. V 42, pp 623-627; Thornburg et al. (1985) Genitourin. Med.. V 61, pp 1-6; und van Eijk et al. (1982) J. Microbiol.. V 48, pp 486-497)

Die potentielle biologische Bedeutsamkeit wurde vorher einem immunogenen Oberflächen-Hauptantigen von T. pallidum zugeschrieben, welches eine Molekularmasse von 47 Kilodaltons (kDa) aufweist (Jones et al., (1984), J. Exp. Med., V 160, Seiten 1404 bis 1420; und Marchitto et al., (1984), Infect. Immun., V 45, Seiten 660 bis 666). Biologisch aktive, monoklonale Antikörper (mAbs), in Kombination mit verschiedenen in vitro- und in vivo-Tests wurden zur Charakterisierung des Immunogens verwendet (Jones et al., (1984), J. Exp. Med., V 160, Seiten 1404 bis 1420; Marchitto et al., (1984), Infect. Immun.,

V 45, Seiten 660 bis 666; Marchitto et al., (1986), Infect. Immun., V 51, Seiten 168 bis 176; und Norgard et al., (1984), J. Clin. Microbiol., V 20, Seiten 711 bis 717). Das 47 kDa-Antigen wurde gezeigt als: (i) Ober-flächen-assoziiert; (ii) reichlich (Jones et al., (1984), J. Exp. Med., V 160, Seiten 1404 bis 1420; Marchitto et al., (1984), Infect. Immun., V 45, Seiten 660 bis 666; und Marchitto et al., (1986), Infect, immun.,

V 51, Seiten 168 bis 176); (iii) hohe Immunität sowohl bei Kaninchen als auch bei Menschen (Baker-Zander et al., (1985) J. Infect. Dis., V151, Seiten 164 bis 272; Hanff et al., (1982) J. Immunol., V 129, Seiten 1287 bis 1291 ; Jones et ai., (1984) J. Exp. Med., V160, Seiten 1404 bis 1420; Lukehart et a!.r (1986) Sex. Trans. Dis., V 13, Seiten 9 bis 15; Strugnell et al., (1986), Infect. Immun., V 51, Seiten 957 bis 960; und van Eijk et al., (1982), J. Microbiol., V 48, Seiten 486 bis 497); (iv) als Protein vorliegend; (v) wurde in mindestens drei Unterarten von pathogenem T. pallidum gefunden, den etiologischen Wirkstoffen der veneralen Syphilis, der endemischen Symphilisch und Frambösie; und (vi) Abwesenheit in nicht-pathogenen, sapro-phytischen Treponemen (Jones et al., (1984), J. Exp. Med., V 160, Seiten 1404 bis 1420; Marchitto et al., (1984) Infect. Immun., V 45, Seiten 660 bis 666; Marchitto et ai., (1986) Infect. Immun., V 51, Seiten 168 bis 176; und Norgard et al., (1984) J. Clin. Microbiol., V 20, Seiten 711 bis 717). Die Anti-47 kDa-mAbs besitzen einen diagnostischen Wert; sie binden sich stark bei Immunofluoreszenz-Tests mit T. pallidum, die aus humanen, syphilitischen Läsionen isoliert wurden. Die Anti-47 kDa-mAbs blockieren ebenfalls partiell das Binden von T. pallidum an Wirtszellen in vitro (Jones et al., (1984), J. Exp. Med., V 160, Seiten 1404-1420). Anti-47-kDa-mAbs binden sich an T. pallidum im T. pallidurn-lmmobilisierunastest (TPI), wobei eine Komplement-abhängige Immobilisierung der beweglichen Organismen erhalten wird und diese mAbs in Gegenwart von Komplement T. pallidum neutralisieren (abtöten) im in vitro-in vivo-Neutralisati-onstest von Bishop and Miller (Bishop et al., (1986) J. Immunol., V 117 Seiten 197 bis 207; Jones et al., (1984), J. Exp. Med., V160, Seiten 1404 bis 1420; und Marchitto et al., (1986), Infect. Immun., V 51, Seiten 168 bis 176).

Die potentielle biologische Signifikanz des 47 kDa-lmmunogens wird durch Arbeiten an ähnlichen oder identischen Immunogenen gestützt. Lukehart et al., (Lukehart et al., (1982) J. immunol., V 129, Seiten 833 bis 838 ) und Baker-Zander und Lukehart (Baker-Zander et al., (1983), Infect. Immun., V 42, Seiten 634 bis 638 und Baker-Zander et al., (1984), Infect. Immun., V 46, Seiten 116 bis 121) schilderten, dass ein 48 kDa-lmmunogen von T. pallidum. T. pallidum-spezifische Epitope enthielt, welche in den treponemalen, pathogenen T. pallidum. T. pertenue (Frambösie-Organismen), T. paraluis-cuniculi (Wirkstoff der veneralen Spirochätosis von Kaninchen) und T. hvodvsenteriae (Wirkstoff der Schweinedysenterie). Lukehart beobachtete ebenfalls eine frühe und signifikante, humorale Antwort auf das 47 kDa-lmmunogen von T. pallidum bei Patienten, die mit T. carateum (Pintaorganismus) infisziert waren (S.A. Lukehart, persönliche Mitteilung). Hanff et al. (Hanff et al., (1982), J. Immunol., V129, Seiten 1287 bis 1291) zeigten eine frühe humorale Immunantwort während der humanen Syphilis durch T. pallidum-Antiaene mit Moleku3

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larmassen von 45 bis 47 kDa. Baker-Zander et al. (Baker-Zander et al., (1985) (J. Infect. Dis., V 151,

Mi m He ili) Min n frinii Yoriaui ir unni intoitiioo me ine fiMi* von p politischen Seren mit einem 48 kDa-Antigen von T. pallidum. Diese frühe und signifikante, humorale Im-munantwort wurde ebenfalls in Versuchskaninchen beobachtet (Lukehart et al., (1986), Sex. Trans. Dis., V13, Seiten 9 bis 15). Van Eijk und van Embden (van Eijk et al., (1982), J. Microbiol., V 48, Seiten 486 bis 497) schilderten eine frühe, humorale Immunantwort auf ein 46 kDa T. pallidum-lmmunoaen bei Menschen mit primärer Syphilis und in späten Stadien der Krankheit. Strugnell et al., (Strugnell et al., (1986) Infect, immun., V 51, Seiten 957 bis 960) schilderten, dass die meisten heftigen Immunantworten, die im frühen Stadium bei Versuchskaninchen nachweisbar waren, gegen ein Polypeptid von 47 kDa gerichtet waren. Thornburg und Baseman (Thornburg et al., (1983) Infect. Immun., V 42, Seiten 623 bis 627); und Thornburg et al. (Thornburg et al., (1985) Genitourin. Med., V 61, Seiten 1 bis 6) beschrieben ebenfalls ein 45 kDa-Hauptimmunogen von T. pallidum, welches in T. pallidum und T. peiienue gefunden wurde. Penn et al., (Penn et al., (1985) J. Gen. Microbiol., V131, Seiten 2349 bis 2357) schlössen kürzlich, dass T. pallidum ein Immuno-dominantes, grösseres 47 kDa-Membranprotein enthielt. Zusätzlich zeigten unsere früheren Erkenntnisse (Marchitto et al., (1986) Infect. Immun., V 51, Seiten 168 bis 176; und Norgard et al., (1984) J. Clin. Microbiol., V 20, Seiten 711 bis 717) das Anti-47-kDa-mAbs diagnostisch zum Nachweis von verhältnismässig wenigen T. pallidum verwendet werden konnten, was durch Lukehart et al., bestätigt wurde (Lukehart et al., (1985) J. Immunol., V134, Seiten 585 bis 592) und Hook et al. (Hook et al., (1985) J. Clin. Microbiol., V 22, Seiten 241 bis 244). Hook et al. (Lukehart et al. (1986) Sex. Trans. Dis., V 13, Seiten 9 bis 15) schilderten ebenfalls eine Korrelation zwischen der frühen Immunclearance von infiszierenden T. pallidum und der Heilung von primären Läsionen bei Versuchskaninchen; es wurde postuliert, dass die Heilung der primären Läsionen durch Antikörper beeinflusst sein könnte, die gegen Immuno-dominante Moleküle, wie das 47 kDa-lmmunogen gerichtet sind (Lukehart et al., (1986) Sex. Trans. Dis., V13, Seiten 9 bis 15).

Unter Verwendung von T. pallidum-infiszierten Kaninchen oder Mäuse-mAbs, die gegen das 47 kDa-lmmunogen von T. pallidum gerichtet sind, wurde früher geschildert, dass das 47 kDa-lmmunogen patho-gen-spezifisch war (Jones et al., (1984) J. Ex. Med., V 160, Seiten 1404 bis 1420; Marchitto et ai, (1984) Infect. Immun., V 45, Seiten 660 bis 666; Marchitto et al., (1986) Infect. Immun., V 51, Seiten 168 bis 176; und Norgard et al., (1984) J. Clin. Microbiol., V 20, Seiten 711 bis 717). Die Gegenwart von analogen 47 kDa-Antigenen wurde in den nicht-pathogenen Trephonemen T. ohaaedenis. Biotyp Reiter, T. denticola. T. scoliodontum. T. Vincent» oder T. refrinaens unter Verwendung eines immunen Kaninchenserums oder gegen das 47 kDa-lmmunogen gerichtete mAbs, nicht nachgewiesen. Lukehart et al., (Lukehart et al., (1982) J. Immunol., V 129, Seiten 833 bis 838; Lukehart et al., (1985) J. Immunol., V 134, Seiten 585 bis 592) postulierten, dass ein 48 kDa-T. pallidum-lmmunoaen «pathogen-spezifische» Determinanten enthalten könnte, die auf getrennten Polypeptiden vorhanden sein könnten, die In Polyacrylamidgelen mitwandern. Wenn entweder ein 3,85 kb Hindi II DNA-Fragment der 5,4 kb-codierenden Sequenz oder eine intakte Hybridplasmid-DNA (welche die gesamte 5,4 kb-codierende Sequenz enthält) als DNA-Hybridi-sterungsproben verwendet werden unter gemässigter oder niederer DNA-Hybridisierungsstärke konnte keine Hybridisierung mit homologen DNA der nicht-pathogenen Trephonemen beobachtet werden. Weiter reagierte der mAb C2-1 von Lukehart, der gegen ein «gewöhnliches» treponemales Epitop eines 47 kDa-lmmunogens gerichtet war (Hook et al., (1985) J. Clin. Microbiol., V 22, Seiten 241 bis 244; und Lukehart et a!„ (1985) J. Immunol., V134, Seiten 585 bis 592) nicht mit den 47 kDa-lmmunogen-exprimie-renden Klonen der vorliegenden Erfindung, während der pathogenspezifische mAb H9*1 (Hook et al„ (1985) J. Clin. Microbiol., V 22, Seiten 241 bis 244, Lukehart et al., (1985) J. Immunol., V 134, Seiten 585 bis 592) mit diesen Klonen reagierte. Demzufolge stützen die genetischen und immunologischen Daten die Existenz eines pathogen-spezifischen 47 kDa-lmmunogens.

Der Inhalt der obenbeschriebenen Zitate ist hier als Referenz enthalten für die Beschreibungen von Mikroorganismen, Materialien und Methoden, welche im Gebiet anerkannt sind.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das im Anspruch 1 definierte Verfahren zur Herstellung von mikrobiellen Klonen, welche das 47 kDa-Oberflächenimmunogen exprimieren. Es wurden monoklonale Antikörper verwendet, die gegen das 47 kDa-Oberflächenimmunogen der äusseren Hautmembrane der virulenten Treponema pallidum gerichtet sind, um die rekombinanten E. coli-Klone. die das 47 kDa-lmmunogen exprimieren, auszuwählen. Der Phänotyp der Klone war abhängig von der Gegenwart des rekombinanten Plasmides in der Wirtszelle. Die Southern-Hybridisierung zeigte, dass die kïonîerte T. palli-dum-DNA-Seauenz eine genaue Repräsentation der genomischen DNA-Anordnung von T. pallidum darstellt. Das gereinigte IgG aus Kaninchen, die experimentell mit T. pallidum infisziert wurden oder humane, sekundäre, syphilitische Seren, reagierten spezifisch mit den Klonen, während normales, humanes Serum oder IgG von normalen Kaninchen nicht reagierte. Die Resultate der Southern-Hybridisierung zeigten, dass ein homologes, 47 kDa-lmmunogen-Gen in mindestens vier Arten von nicht-pathogenen, getesteten Treponemen abwesend war, ebenso wie in der gesamten genomischen DNA von Kaninchen. Anti-T. phaaedenis-Antiserum des Biotyps Reiter (treponema), nicht-pathogen) und ein monoklonaler Antikörper, der gegen eine «gewöhnliche» treponemale Determinante gerichtet war, waren unreakb'v mit den Klonen, Western-BIotting- und Radioimmunopräzipitations-Versuche mit spezifischen, monoklonalen Antikörpern zeigten, dass die rekombinanten (E. colh und nativen CT*, pallidum) Formen des Antigens identische elektrophoretische Beweglichkeiten aufwiesen. Die Zugänglichkeit des rekombinanten 47 kDa-Im-

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munogens zeigt neue Möglichkeiten für biochemische Analysen von Protein, Struktur-Funktions-Studi-en, die Prüfung der Rolle bei der mikrobiellen Pathogenese und die direkte Abschätzung ihrer diagnostischen und vaccinogenen Potentiale.

Fig. 1. Radioimmuno-Kolonie-BIottest von rekombinanten DNA-Klonkolonien aus E. coli, welche das 47 kDa-Oberflächenimmunogen von T. pallidum exprimieren. T. pallidum-Zellen (Bande 1 ) wurden auf jedes Filter als Positivkontrolie aufgetragen. Die negativen Kontrollklone umfassten pMN7 (Bande 2) und pBR322 in E. coli RR! (Bande 3). Die Filter wurden mit den mAbs 11E3 (Reihe A), 8G2 (Reihe B) und 3B5 (Reihe C) (Negativkontrolle) umgesetzt, bevor mit i25[-markiertem Kaninchen-Antimaus-IgG getestet wurde.

Fig. 2 zeigt eine partielle Restriktionsenzym-Karte der 5,4 kb-lnsertion von pMN23, welche das 47 kDa-lmmunogen von T. pallidum codiert. Die EcoRI-Stelle von pBR322 befindet sich auf der rechten Seite der Figur. Die Richtung der Transkription für das 47 kDa-Antigen führt von links nach rechts, gegenläufig zu derjenigen des Beta-Lactamase-Gens. Die Insertion ist durch die Pstl-Stellen flankiert, gerade ausserhalb der GC-Enden und besitzt ein internes Hindlll-Fraament mit 3,85 kb.

Fig. 3. Southern-Hybridisierung von Hindlll-aesoaltenen. genomischen DNAs und rekombinantem Plasmid pMN23, das das 47 kDa-lmmunogen von T. pallidum codiert. Platte A: 1% Agarose-Gel, das Hindlll-aesbaltene. genomische Kaninchen-DNA enthält (Strecke 2), T. pallidum (Strecke 3), T. dentico-ja (Strecke 4), T. phaaadenis (Strecke 5), T. scoliodontum (Strecke 6), T. vincentii (Strecke 7), rekombi-nantes Plasmid pMN 23 (Strecke 8) und Plasmid pBR322. Die Strecken 1 und 2 enthalten in Kombination pBR322-Alul und Bakteriophaa-Lambda-Hindlll-Molekularqewichts-Marker. B: Southern Blot von Platte A; Fragment der Plasmid-DNA des Klons pMN23 wurde als markierte Hybridisierungsprobe verwendet. Zu beachten ist die Gegenwart des homologen 3,85 kb DNA-IjindIII-Fragmentes, das nur in genomischer T. pallidum-DNA (Strecke 3) und im rekombinanten pMN23 (Strecke 8) vorhanden ist.

Fig. 4. Radioimmunopräzipitation des 47 kDa-lmmunogens von T. pallidum von i25|-markiertem T. pallidum und 35S-markiertem rekombinanten Klon pMN23 von E. coli. Die Strecken 1 bis 3, 3 bis 6 und 7 bis 9 wurden mit mAbs 11 Es, 8G2 bzw. 3B5 (Kontrolle) immunoräzipitiert. Die Strecken 1,4 und 7 enthielten 125l-markierte T. pallidum-Antiaene. Die Strecken 2, 5 und 8 enthielten 35S-markierte Produkte des 47 kDa-lmmunogen-exprimierenden Klons pMN23. Die Strecken 3, 6 und 9 enthielten 35S-markierte Produkte der Klone pMN20, welche ein 34 kDa-lmmunogen von T. pallidum exprimieren, das durch mAb 3B5 erkannt wird. Die Molekulargewichte der Proteine sind auf der linken Seite (in kDa) angegeben, abgeleitet von MC-Molekulargewicht-Marker, welcher auf dem Gel einer Elektrophorese unterworfen wurde. Die Pfeile zeigen die Lage der 47 kDa und 34 kDa-lmmunogene an.

Fig. 5. Der Western-Blot des 47 kDa-lmmunogens, welches durch die rekombinanten Klone pMN23 und pMN24 exprimiert wird. Die solubilisierten Antigene wurden nach der Gel-Elektrophorese und dem Proteintransfer durch Inkubation mit Anti47 kDa-mAb 8G2 nachgewiesen, wobei das charakteristische Reaktivitätsprofil mit 47 kDa-T. pallidum-lmmunoaen erhalten wurde (Strecke 1). Die Strecken 2 und 3 enthielten die 47 kDa-lmmunogen-exprimierenden Klone pMN23 bzw. pMN24. Die Strecken 4, 5 und 6 enthielten die 34 kDa-lmmunogen-exprimierenden Klone pMN20, pBR322 in E. coli RRI bzw. das 44 kDa-Immunogen-exprimierende Klon pMN7 als Negativkontrollen.

Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung einer Klonbank, welche durch konventionelle re-kombinante DNA-Techniken hergestellt wurde, zu welchen die Insertion von Treponema pallidum-DNA-Fragmenten in einen zweckmässigen Vektor und die Transferierung der DNA-Fragmente in einem Empfangsmikroorganismus gehörten. Obschon jede Klonbank, die Treponema pallidum-DNA enthält, verwendet werden kann, ist die vorher erstellte (9. Juni 1982) pBR322 Hybridklonbank, welche früher beschrieben wurde, eine bevorzugte Quelle für rekombinante E. coli-Klone (Norgard et al., (1983) Infection and Immunity, 42, 435-445). Diese Klonbank von Mikroorganismen wurde einem Screening auf Klone, die ein besonderes Treponema pallidum-Antiaen produzieren, unterworfen. Das Screening wurde durchgeführt, indem Wechselwirkungen der Klon-Kolonien mit Antikörpern, welche das interessierende Treponema pallidum-Antiaen spezifisch binden, beobachtet wurden. Die Klone, welche das interessierende Antigen produzieren, wurden ausgewählt, abgetrennt und fortgepflanzt, um Treponema pallidum-Antiaen für eine weitere Identifikation, Charakterisierung oder Verwendung herzustellen. Diese Verwendung kann beispielsweise der Nachweis von Antikörpern gegen Treponema pallidum oder die Produktion eines Impfstoffes sein, der nützlich für die Induktion von Immunität gegen Syphilis ist.

Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren für die Herstellung von mikrobiellen Klonen, die das 47 kDa-Oberflächenimmunogen von Treponema pallidum exprimieren. Zuerst wird in der Regel die DNA eines mikrobiellen Vektors gespalten, vorzugsweise durch eine Restriktions-Endonuklease, um ein erstes DNA-Fragment herzustellen. Das genannte erste DNA-Fragment wird mit einem zweiten, das 47 kDa-Oberflächenimmunogen codierenden DNA-Fragment kombiniert, wobei das zweite DNA-Fragment aus Treponema pallidum stammt. Das genannte erste und das genannte zweite DNA-Fragment sind dadurch gekennzeichnet, dass sie fähig für die Rekombination sind, wobei ein rekombinanter Vektor, welcher die Treponema pallidum DNA enthält, durch Verbinden geformt wird. In der nächsten Stufe wird ein zweckmässiger, mikrobieller Wirt mit dem genannten rekombinanten Vektor einer Transfektion unterworfen, um mikrobielle Klone zu produzieren, welche Treponema pallidum-Antiaene exprimieren. Diese mikro-

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biellen Klone werden dann kultiviert, vorzugsweise auf der Oberfläche eines Nähragars, wobei sie sichtbare Kolonien bilden. Diese Kolonien werden dann mit einem Antikörper in Kontakt gebracht, welcher eine spezifische Affinität für das 47 kDa-Oberflächenimmunogen von Treponema pallidum besitzt. Die mikrobiellen Klon-Kolonien, welche eine Affinität für den Antikörper besitzen, werden dann identifiziert und ausgewählt. Die genannten ausgewählten Kolonien sind durch ihre Expression des 47 kDa-Oberflächenimmunogens von Treponema pallidum gekennzeichnet.

Das 47 kDa-Oberflächenimmunogen, das oben beschrieben ist, kann durch eine spezifische Affinität für monoklonale Antikörper definiert werden, welche durch die Mäusehybridomzellinie 8G2 produziert werden (am 19. Mal 1982 hinterlegt bei American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rock-ville, MD, 20852-US, Hinterlegungsnummer HB 8134).

Obschon die meisten Fachleute bezüglich der 47 kDa-Grösse dieses immuno-dominanten Oberflächenimmunogens von Treponema pallidum übereinstimmen, können solche Gewichtsbestimmungen in einem kleinen Ausmass variieren. Der mikrobielle Vektor ist am bevorzugtesten ein Plasmid, obschon andere brauchbare Vektoren, wie viele Phagen auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind. Der am meisten bevorzugte mikrobielle Vektor ist das Plasmid pBR322. Im obenbeschriebenen Verfahren wird der mikrobielle Vektor vorzugsweise mit Pstl gespalten, wobei DG-Enden gebildet werden und das erste DNA-Fragment erhalten wird. In der Praxis umfasst das obenbeschriebene Verfahren die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers als Antikörper für die Identifikation und Selektion von Klon-Kolonien, die das 47 kDa-Oberflächenimmunogen produzieren. Ein meistbevorzugter, monoklonaler Antikörper ist derjenige, welcher durch die Mäusehybridomzellinie 8G2 produziert wird (American Type Culture Collection, Hinterlegungsnummer HB8134).

Ein besonders bevorzugter mikrobieller Wirt ist in der Praxis der Erfindung der Art Escherichia coli. Das zweite DNA-Fragment, welches für die Bildung eines rekombinanten Vektors für die Kreation von rekombinanten Mikroorganismen dient, stammt vorzugsweise von einer partiellen Restriktionsenzymverdauung von Treponema pallidum oder einer anderen pathogenen Unterart von Treponema. Das zweite DNA-Fragment wird vorzugsweise von dieser partiellen Restriktionsenzymverdauung erhalten und weist dc-Reste als Schwänze auf.

Das für die Transformation und für die Bildung eines Treponema pallidum-lmmunogen am meisten bevorzugte rekombinante Plasmid umfasst vorzugsweise einen Plasmidvektor, welcher als Insertion Desoxyribonukleinsäure-Segment (DNA-Segment), welches das 47 kDa-Oberflächenimmunogen von Treponema pallidum codiert, enthält Die erfindungsgemässen Transformanten-Mikroorganismen sind diejenigen, welche ein rekombinantes Plasmid einschliessen, welches einen Plasmidvektor enthält, worin ein DNA-Segment insertiert ist, welches das 47 kDa-Oberfiächenimmunogen von Treponema pallidum codiert. Das insertierte Treponema pallidum-DNA-Seament. das das 47 kDa-Oberflächenimmunogen codiert, ist als das partielle Restriktionsenzymkardierte Fragment mit 5,4 kb in Fig. 2 dargestellt.

Die Gegenwart von Antikörpern gegen Treponema pallidum in biologischen Flüssigkeiten kann durch erfindungsgemässe Verfahren nachgewiesen werden. Eine Probe einer biologischen Flüssigkeit wird zuerst erhalten und dann wird ein 47 kDa-Oberflächenimmunogen von Treponema pallidum, welches durch die rekombinanten DNA-Techniken der vorliegenden Erfindung hergestellt ist, zur Probe der biologischen Flüssigkeit zugegeben. Ob dann das genannte lmmiinogen mit in der genannten Probe vorhandenen Antikörpern gegen Treponema pallidum reagiert, kann durch jede der zahlreichen auf dem Fachgebiet bekannten immunologischen Methoden nachgewiesen werden. Ein Impfstoff für die Immunisierung von Individuen gegen Treponema pallidum-Infektionen ist in der vorliegenden Erfindung ebenfalls enthalten. Er enthält das 47 kDa-Oberflächenimmunogen von Treponema pallidum aus einem rekombinanten Mikroorganismus, welcher dieses Immunogen produziert. Der Impfstoff dient zur Verabreichung in einer Menge und auf eine Weise, welche die Bildung von Antikörpern oder die Induktion von zellvermittelter Immunität durch das Individuum hervorruft.

Ein Mikroorganismus des Stammes Escherichia coli, welcher fähig ist, das 47 kDa-lmmunogen von Treponema pallidum zu produzieren, ist gemäss den erfindungsgemässen Verfahren hergestellt und bei der American Type Culture Collection, Parklawn Drive, Rockviile, MD, 20 852-US, als ATCC Hinterlegungsnummer 67 204 am 18. September 1986 hinterlegt worden. Dieser Mikroorganismus besitzt insofern ein Identifikationsmerkmal, als dass er reaktiv mit Antikörpern gegen Treponema pallidum, insbesondere gegen Antikörper gegen das 47 kDa-Oberflächenimmunogen von Treponema pallidum ist. Das 47 kDa-Antigen, welches mit den Antikörpern gegen Treponema pallidum reaktiv ist, und durch einen rekombinanten Mikroorganismus, wie durch den Stamm von Escherichia coli mit der ATCC Hinterlegungsnummer 67 204 produziert wird, wird ebenfalls spezifisch durch die vorliegende Erfindung umfasst.

Solche rekombinant synthetisierten 47 kDa-Antigene, die durch die Molekularmasse (Grösse) und immunologische Kennzeichen (Bindung von monoklonalen Antikörpern 8G2 (ATCC-Nr. HB8134) und 11E3 (Patent Nummer 4 514 498 und Patentanmeldung Serial Number 702 327)) als das 47 kDa-Oberflächenimmunogen von Treponema pallidum identifiziert werden, können für die Herstellung von einmaligen Zusammensetzungen verwendet werden, von Materialien, welche nützlich sind für die Diagnose von oder Impfung gegen pathogene, treponemale Infektionen, wie durch Treponema pallidum oder andere pa-thogene Unterarten von Treponema.

Ein Verfahren für den Nachweis der Gegenwart von Treponema pallidum in einer klinischen Probe kann unter Verwendung der nukleotiden Fragmente der vorliegenden Erfindung einschliesslich diejeni6

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gen, welche das 47 kDa-Oberflächenimmunogen von Treponema pallidum codieren, durchgeführt werden, Solche nukleotiden Fragmente werden von der 5,4 kb-lnsertion des Plasmides pNN23, wie in Fig. 2 gezeigt, umfasst. Dieses Plasmid wurde in E. coli bei der American Type Culture Collection als ATCC Hinterlegungsnummer 67 204 hinterlegt. Markierte Nukleotid-Fragmente können direkt aus der 5,4 kb-lnsertion hergestellt werden oder aus komplementären Nukleotid-Fragmenten aus den Nukieotid-Se-quenzen dieser Insertion synthetisiert werden. In 1,28 kb-Fragment zwischen etwa der Clal-Spaltstelle und einer zweiten internen Pstl-Soaltstelle scheint das kleinste Fragment zu sein (kleiner als alle Leadersequenzen), was tatsächlich das strukturelle 47 kDa-Oberflächenimmunogen codiert. In der Praxis können die Verfahren und Reagenzien, die in U.S. Patent Nr. 4 358 535 beschrieben ist, welche durch Referenz hier eingeschlossen sind, verwendet werden, jedoch mit den obenbeschriebenen Treponema palli-dum-Nukleotid-Fraamenten oder Nukleotid-Sequenzen, die darin enthalten sind.

Zuerst werden die klinischen Proben eines Patienten auf einem inerten Träger aufgetragen. Die aufgetragene Probe wird dann behandelt, um das genetische Material von allen pathogenen Treponema pallidum. die in der genannten Probe vorhanden sind, in im wesentlichen einsträngiger Form, vorwiegend an der gleichen Stelle des Trägers, wo die genannte Probe aufgetragen ist, zu fixieren. Das fixierte, ein-strängige, genetische Material wird dann mit einer markierten Probe, welche mindestens 25 Basen enthält, die im wesentlichen komplementär zu einer Nukleotid-Sequenz von Treponema pallidum ist und das 47 kDa-Oberflächenimmunogen codiert, in Kontakt gebracht. Dieses In-Kontakt-Bringen findet unter hybridisierenden Bedingungen und mit einer vorbestimmten Stärke statt. Die Duplexbildung auf dem genannten Träger zwischen der fixierten Treponema pallidum-DNA und der markierten Probe kann nachgewiesen werden, indem der Anteil des auf den festen Träger gebundenen Markers bestimmt wird. Das Treponema pallidum-Antiaen. welches in der vorliegenden Erfindung von besonderem Interesse ist, ist das 47 kDa-Oberflächenimmunogen, welches vorher beschrieben war (Jones et al., (1984) J. Exp. Med., V160, Seiten 1404 bis 1420) und Marchitto et al., (1984) Infect. Immun., V 45, Seiten 660 bis 666). Zum Screenen auf rekombinante Klone, die das 47 kDa-Antigen produzieren, wurden monoklonale Antikörper verwendet, die spezifisch dieses Antigen binden. Diese Antikörper und die Hybridome, welche diese produzieren (8G2 (ATCC HB3184) und 11E3) sind im U.S. Patent 4 514 498 und in der hängigen US-Patentanmeldung Serial Number 702 327 beschrieben.

Material und Methoden

Bakterienstämme, Plasmide und DNAs

Der bösartige Nichols-Stamm der Treponema pallidum-Unterart (T. pallidum) wurde als repräsentative Pathogen in dieser Studie verwendet. Er wurde in den Testikeln von weissen Neuseeland-Kaninchen aufrechterhalten und kultiviert, wie vorher beschrieben (Norgard et al., (1983) Infect. Immun., V 42, Seiten 435 bis 445 und Robertson et al., (1982) Infect, Immun., V 36, Seiten 1076 bis 1085). Nicht-pathogene Stämme von Treponemes T. phaaedenis Biotyp Reiter, T. denticola. T. scoliodontum und T. vincentii wurden in vitro kultiviert (Swancutt et al., (1986) Infect. Immun., V 52, Seiten 110 bis 119). Escherichia coli RR1 wurde als empfangender Wirtsstamm für die Klonierung in den Transformationsexperimenten verwendet (Swancutt et al., (1986) Infect. Immun., V 52, Seiten 110 bis 119). Eine Zusammenfassung der relevanten, in dieser Studie verwendeten, rekombinanten Plasmide ist in Tabelle 1 angegeben.

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Tabelle 1

Merkmale der rekombinanten Plasmide

Plasmidstamm T. pallidum exprimiertes Relevante mAb-oder Referenz

DNA-Insertion Immunogen polyklonaleAnti- (kb) (kDa) körper-Reaktivität

pBR322

keine keines keine c

pMN7/RlCB2-1

3,7

44a

ORSb c

pMN20

1,75

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3B5,9B12,10G2

d pMN23

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dieser pMN24

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Bericht a Es besteht keine Beziehung zum 47 kDa-Antigen der Klone pMN23 und pMN24, wie durch mAb und genetische Studien gezeigtwurde b Immunes Kaninchenserum, erhalten von T. pallidum-infiszierten Kaninchen c (Norgard et al., (1983) Infect. Immun., V 42, Seiten 435 bis 444)

d (Swancutt et al., (1986) Infect. Immun., V 52, Selten 110 bis 119).

E. coli RRI, die das Plasmid pMN7 beherbergen (alte Bezeichnung: RICB2-1) sind beschrieben worden

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(Norgard et al., (1983) Infect. Immun., V 42, Seiten 435 bis 445); pMN7 stammte von der nachstehend zitierten Klonbank und enthält eine 3,7-Kilobasen (kb)-DNA-lnsertion von T. pallidum-DNA.- die durch GC-tailing an der Pstl-Stelle von pBR322 geklont wurde. Sie codiert ein 44 kDa-Rekombinationsantigen, das in keiner Beziehung zum 47 kDa-Antigen steht. Das 44 kDa-Antigen des Klons pMN7 ist durch immunes Kaninchenserum immunpräzipierbar (Norgard et al., (1983) Infect. Immun., V 42, Seiten 435 bis 445), jedoch nicht durch einen unseren geläufigen mAbs. Das Klon pMN20, das ein 34 kDa-Oberflächenantigen von T. pallidum codiert und exprimiert, wurde beschrieben (Swancutt et al., (1986) Infect. Immun., V 52, Seiten 110 bis 119). Alle Plasmidderivate wurden in E. coli RR1 fortgepflanzt und nach Norgard isoliert und gereinigt (Norgard (1981) Anal. Biochem., V 113, Seiten 34 bis 42). Leber-DNA von weissen, normalen, männlichen Neuseeland-Kaninchen und treponemale DNAs wurden, wie vorher beschrieben, isoliert (Norgard et al., (1981) Science, V 213, Seiten 553 bis 555).

Klonierungsverfahren und Restriktionsenzym-Analysen

Eine vorerstellte pBR322-Hybridplasmid-Klonbank (9. Juli 1982) wurde als mögliche Quelle von Anti-gen-Expressionsklonen verwendet (Norgard et al., (1983) Infect. Immun, V 42, Seiten 435 bis 445). Die Bank wurde konstruiert, indem kombinierte Akjl und Haelll-partielle Restriktionsenzym-Verdauungen von T. pallidum-DNA verwendet wurden, welche DNA anschliessend mit dC-Restschwänzen versehen wurde und in pBR322 geklont wurde (versehen mit dG-Schwänzen an der Stelle JPsil, um die Pstl-Stellen. welche die klonierten Insertionen flankieren, zu regenieren) (Norgard et al., (1983) Infect. Immun., V 42, Seiten 435 bis 445). Die Restriktionsenzyme für die Analyse der Plasmide und die Verdauung der genomischen DNA wurden von New England Biolabs (Beverly, MA) erworben.

Radiomarkierung von Bakterien, DNA und Proteinen

T. pallidum wurde aus testikulärem Kaninchengewebe mittels der Percoll-Dichte-Gradientenmethode gereinigt (Hanff et al., (1984) Sex. Trans. Dis., VII, Seiten 275 bis 286); die Bakterien wurden mit Na-125l radiomarkiert, wobei eine Lactoperoxidase-Methode verwendet wurde (Alderete et al., (1980) Infect. Immun., V30, Seiten 814 bis 823, Jones et al., (1984) J. Exp. Med., V160, Seiten 1404 bis 1420V. E. coli RR1-Stämme, die verschiedene pBR322-Plasmidderivate beherbergen, wurden metabolisch mit L-35S-Methio-nin, wie früher beschrieben, markiert (Norgard et al., (1982) Infect. Immun., V 42, Seiten 435 bis 445). Alle DNA-Sonden wurden mit Alpha-32P-dCTP-radiomarkiert, indem das «nick translation kit» von New England Nuclear (Boston, MA) verwendet wurde. Die Antikörperproben wurden mit Na-125l radiomarkiert, wobei die Chloramin-T-Methode verwendet wurde (Hunter et al., (1962) Nature, V 194, Seiten 495 bis 496).

Southern-Gel-Hybridisierungen

Southern-BIots wurden gemäss dem publizierten Verfahren durchgeführt (Norgard et a!„ (1981) Science, V 213, Seiten 553 bis 555, Southern (1975) J. Mol. Bio!., V 98, Seiten 503 bis 517, Swancutt et al., (1986) Infect. Immun., V 52, Seiten 110 bis 119). Für eine Probe wurde ein DNA-Restriktionsenzym-Fragment aus niederschmelzender Agarose durch Elutip ™-Affinitätschromatographie isoliert (Schmitt et al., (1983) Anal. Biochem., V 13, Seiten 462 bis 464) (Elutip ist eine Warenmarke von Schleicher & Schuell, Keene, NH). Die Hybridisierung von DNA-Proben wurden in 2X Denhardt-Lösung durchgeführt (Southern (1975) J. Mol. Biol, V 98, Seiten 503 bis 517) plus 6X SSC-Puffer (IX SSC « 0,15 M NaCI+ = 0,015 M Natriumeitrat, pH 7,0), 1 mM EDTA und 100 jig/ml Scherkräften unterworfene, denaturierte Lachssperma-DNA (Southern (1975) J. Mol. Biol., V 98, Seiten 503 bis 517). Nach der Hybridisierung während 16 Std. bei 68"C wurden die Filter dreimal (30 Min. pro Waschung) bei Zimmertemperatur mit 500 ml Teilen von 2X SSC + 0,1% Natriumdodecylsulphat gewaschen, gefolgt durch drei Waschungen bei Zimmertemperatur (30 Min. pro Waschung) unter Verwendung von 500 ml Teilen von 0,1X SSC + 0,1% Natriumdodecylsulphat. Die Filter wurden getrocknet und einer Autoradiographie unterworfen (Laskey (1977) FEBS Lett., V 82, Seiten 314 bis 316).

Monoklonale Antikörper, Antiseren und Antikörperproben

Mäuse-mAbs-8G2 (IgG1), li E3 (lgG2a) und 3B5 (lgG1), die spezifisch gegen T. pallidum gerichtet waren, wurden gebildet, aufrechterhalten und wie vorher beschrieben, charakterisiert (Jones et al-, (1984) J. Exp. Med., V 160, Seiten 1404 bis 1420, Marchitto et al., (1984) Infect. Immun., V 45, Seiten 660 bis 666, Marchitto (1986) Infect. Immun., V 51, Seiten 168 bis 176, Norgard et al,, (1984) J. Clin. Microbio!., V 20, Seiten 711 bis 717, Robertson et al. (1982) Infect. Immun., V 36, Seiten 1076 bis 1085, und Swancutt et al., (1986) Infect. Immun., V 52, Seiten 110 bis 119). Die mAb 11E3 wurden im einzelnen beschrieben (Jones et all, )1984) J. Exp. Med., V 160, Seiten 1404 bis 1420; Marchitto et al., (1984) Infect. Immun., V 45, Seiten 660 bis 666; Marchitto et al., (1986) Infect. Immun., V 51, Seiten 168 bis 176; und Norgard et al., (1984) J. Clin. Microbiol., V 20, Seiten 711 bis 717). Die mAbs 8G2 und 11E3 waren gegen das 47 kDa-Hauptim-munogen gerichtet (Jones et al., (1984) J. Exp. Med., V 160, Seiten 1404 bis 1420; Marchitto et al., (1984)

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Infect. Immun., V 45, Seiten 660 bis 666). Der mAb 3B5 reagiert mit einem 34 kDa-Oberflächenimmunogen von T. pallidum (Swancutt et al., (1986) Infect. Immun., V 52, Seiten 110 bis 119).

Die mAbs wurden in den in vitro-Hvbridom-Klon-Überständen verwendet oder wurden aus Hybridom-Klon-Überständen einer Affinitätschromatographie unterworfen unter Verwendung von einzelnen Pro-tein-A-Sepharose-Säulen (Ey et al, (1978) Immunochemistry, V 15, Seiten 429 bis 436). Die mAbs C2-1 (IgM) und H9-1 (lgG1) waren gegen «gewöhnliche» bzw. «pathogen-spezifische» Epitope von T. pallidum gerichtet (Hook et al., (1985) J. Clin. Microbiol., V 22, Seiten 241 bis 244, Lukehart et al. (1985) J. Immunol., V 134, Seiten 585 bis 592). Das normale Kaninchenserum wurde von nicht-reaktiven weissen, männlichen Neuseeland-Kaninchen des Versuchslaboratoriums für verenische Erkrankungen gewonnen. Das Kaninchen-Anti-T. pallidum-Serum (immunes Kaninchenserum) wurde von vier Tieren 3 bis 12 Monate im Anschluss an eine starke Orchitis in beiden Testikeln nach einer T. pallidum-intratestikularen Infektion gewonnen und gepoolt. Die immunen Kaninchen erwiesen sich als «Schanker-immun», wenn sie intradermal mit 1 x 105-beweglichen T. pallidum pro Stelle herausgefordert wurden (Jones et al., (1984) J. Exp. Med., V 160, Seiten 1404 bis 1420). Das Kaninchen-Anti-T. phaaedenis-Biotvp Reiter-Antiserum wurde durch S.A. Lukehart zur Verfügung gestellt. Sieben sekundäre syphilitische, humane Serumproben wurden durch Dr. George Wendel zur Verfügung gestellt; diese Seren wurden für routinemässige sereologische, diagnostische Tests gesammelt (innerhalb des vergangenen Jahres) von Frauen, bei welchen eine sekundäre Syphilis nachgewiesen wurde. Von jedem Patienten wurde überschüssiges Serum bei —70°C gelagert und in diesen Forschungsarbeiten verwendet, es wurde vom klinischen Laboratorium erhalten anstelle der regelmässigen Vernichtung durch das Laboratorium. Das IgG wurde aus Seren isoliert, indem Natriumsulphat-Fällung und DEAE-Cellulose-Säulenchromatographie verwendet wurde.

Radloimmuno-Säulenblot-Test

Der Radioimmuno-Kolonienblot-Test (RICB) für den Nachweis von E. coli-Klonkolonien. die T. pallidum-Antigene synthetisieren, wurde gemäss Norgard und Miller durchgeführt (Norgard et al., (1983) Infect. Immun., V 42, Seiten 435 bis 445) mit kleinen Änderungen (Swancutt et al., (1986) Infect. Immun., V 52, Seiten 110 bis 119).

Radioimmuno-Präzipitatlon

Die Radioimmuno-Präzipitation (RIP) wurde, wie vorher beschrieben, durchgeführt (Swancutt et al., (1986) Infect. Immun., V 52, Seiten 110 bis 119) mit kleineren Änderungen. Für die Radioimmuno-Präzipitation vonT. pallidum wurden ungefähr 5x106 Impulse pro Minute voni25|-markiertenTreponemen (1 bis 3 Impulse pro Minute pro Treponem) in 1,0 ml Solubilisationspuffer inkubiert (10 mM Tris-HCI (pH 7,8), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA und 0,2% Zwittergent 3-12 (Calbiochem-Behring Corp. La Jolla, CA)). Für 35S-Methionin-markierte E. coli wurden etwa 7 x 107 Impulse verwendet. 10 ng Geissen-Anti-Maus-IgG wurden nach den primären mAb zugegeben (30 Min. bei 4°C unter Rührung) als Brücke für lgG1 mAbs 8G2 und 3B5. Die solubilisierten Immunopräzipitate wurden schliesslich einer Natriumdodecylsulphat-po-lyacryl-Gel-Elektrophorese (10%) unterworfen, nachdem sie bei 100°C in 5% 2-Mercaptoethanol reduziertwurden (Swancutt et al„ (1986) Infect. Immun., V 52, Selten 110 bis 119). Verschiedene radiomarkierte Verbindungen ( 35S, "MC und 125|) wurden auf dem gleichen Gel nach Behandlung mit EnHance (New England Nuclear Corp.) für 35S und 14C und anschliessend durch Autoradiographie (Laskey (1977) FEBS Lett., V 82, Seiten 314 bis 316) nachgewiesen.

Western-Blots

Es wurden Western-Blots, wie vorher beschrieben, durchgeführt (Marchitto et al., (1984) Infect. Immun., V 45, Seiten 660 bis 666). Für die Analyse von T. pallidum-Antiaenen wurden ungefähr 1 x 107 solu-bilisierte Treponemen pro Polyacrylamid-Gelweg einem Blot unterzogen. Für die rekombinanten E. coli Derivate wurden ungefähr 1 x 108 solubilisierte E. coli pro Gelweg verwendet.

Resultate

Identifikation von Antigen-exprimierenden Klonen

Fig. 1 zeigt die Resultate von RICB-Tests unter Verwendung von mAbs. Zwei rekombinante DNA-Klo-ne, pMN23 und pMN24, wurden isoliert, welche mit Anti-47 kDa-mAbs 11E3 und 8G2 reagierten, jedoch nicht mit der negativen Kontrolle mAb 3B5. Alle drei mAbs reagierten nicht mit den negativen Kontrollklo-nen pMN7 und pBR322. Die mAb 3B5, welche gegen ein 34 kDa-Oberflächenimmunogen von T, pallidum gerichtet waren (Swancutt et al., (1986) Infect. Immun., V 52, Seiten 110 bis 119) reagierten nur mitT. pallidum.

Das immune IgG reagierte im RICB-Test mit den Klonen pMN23, pMN24 und pMN7, wie erwartet, während IgG aus normalem Kaninchenserum nicht reagierte (nicht gezeigt). Kaninchen-Anti-T. phaaedenis-

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Biotyp Reiter-Antiserum, welches Antikörper gegen gewöhnliche treponemale Determinanten enthält, reagierte ebenfalls nicht mit den Klonen pMN23 und pMN24 (nicht dargestellt). Der mAb H9-1, der spezifisch gegen das 47 kDa-lmmunogen gerichtet ist (Hook et al., (1985) J. Clin. Microbio!., V 22, Seiten 241 bis 244; Lukehart et al,, (1985) J. Immunol., V134, Seiten 585 bis 592) reagierte stark mit den Klonen pMN23 und pMN24, jedoch mit pMN7 oder pBR322 (nicht gezeigt). In zusätzlichen RIGB-Versuchen reagierte der mAb C2-1, der gegen ein gewöhnliches treponemales Epitop gerichtet ist (Hook et al., (1985) J, Clin. Mîcrobiol,, V 22, Seiten 241 bis 244; Lukehart et al., (1985) J. immunol., V134, Seiten 585 bis 592) reagierte mit T. pallidum und T. phaaedenis. Biotyp Reiter, jedoch nicht mit irgendwelchen E. coli-Klonen (nicht gezeigt).

Weitere Unterstützung für den Plasmid-codierten, Antigen-exprimierten Phänotyp wurde durch die Tatsache demonstriert, dass die gereinigte Plasmid-DNA aus RICB-positiven, rekombinanten Klonen fähig war, den 47 kDa-Antigen-exprimierenden Phänotyp gegen normale E. coli-Wirtszellen in einer Frequenz von 100% zu transformieren (200 von 200 getesteten zufälligen Transformanden).

Restriktionsenzym-Karte des 47 kDa-lmmunogenexprimierenden Klons pMN23

Fig. 2 zeigt eine vorläufige Restriktionsenzym-Karte der 5,4 kb-lnsertion des Plasmides pMN23, Die pMN23-lnsertlon wird durch die kurzen dGC-Schwänze innerhalb der Pstl-Stellen flankiert, wobei fünf interne Pstl-Stellen in der Insertion lokalisiert sind. Ein strategisches Fragment für die Strukturanalyse des 47 kDa-lmmunogen-codierenden Bereichs umfasst ein 3,85 kb Hindlll-Fraament: die Subklonierung dieses Fragmentes in die Hindlll-Stelle von pBR322 führte jedoch nicht zum Resultat der Expression des relevanten Epitopes bzw. Epitope als 54 Ampicillin-resistente, Tetracyclin-empfindliche 3,85 kb Hindlll-Fragmente enthaltende Subklone im RICB-Test unter Verwendung der mAbs 11E3 oder 8G2 getestet wurden. Eine analoge Restriktionsenzym-Kardierung des Ktones pMN24 zeigte die Gegenwart von ähnlichen Restriktionsenzym-Fragmenten, wie diejenigen von pMN23. Demzufolge könnten pMN23 und pMN24 identisch sein.

Spezifität der klonierten 47 kDa-lmmunogen-Gensequenz innerhalb der T. pallidum-DNA

Wegen der potentiellen Gegenwart von kontaminierender Kaninchenwirts-DNA in T. pallidum-DNA-Präparaten, die für die Klonierung als Quelle verwendet wurden, war es wesentlich, den T, pallidum-Ur-sprung der klonierten DNA-Sequenz festzulegen. Es war ebenfalls wichtig zu bestimmen, ob homologe Gensequenzen in den immunologisch verwandten, nicht-pathogenen Treponemen existierten. Zur Feststellung dieser Möglichkeiten, wurde das 3,85 kb Hindlll-Fraament von pMN23 isoliert, markiert und als Hybridisierungsprobe in Southern Blot-Analysen verwendet (Fig. 3B). Das Agarosegel (1%) (Fig. 3A) enthielt Hindlll-geschnittene Zubereitungen von genomischen DNAs aus T. pallidum. Kaninchenleber und vier nicht-pathogene Treponemen. Die Gelstrecken 2 und 4 bis 7 von Fig. 3A, die andere als T. pallidum-DNA enthielten, waren zu überladen, um ein zuverlässiges Resultat sicherzustellen. In den Strecken 3 und 8 von Fig. 3B hybridisierte die 3,85 kb Hindlll-Probe mit einem 3,85 kb Hindlll-Fraament von T. pallidum-DNA und mit sich selbst. Es wurde keine Hybridisierung mit Kaninchen-DNA, der DNAs von vier nicht-pathogenen Treponemen oder Kontroll-DNA (Lambda oder pBR322) beobachtet. Mehrfache, hybridisierende Strecken, die im Hindlll-gespaltenen pMN23 (Fig. 3B, Strecke 8) beobachtet wurden, zeigen den kleinen Anteil von pMN23, der nicht komplett durch die Hindill aufgespalten wurde.

Wenn Southern-BIots, die identisch zu Fig. 3B sind, einer Probe unterworfen und weniger extensiv bis zum Punkt gewaschen werden, wo nicht-homologe DNA-DNA-Hybridisierung beobachtet werden konnte, die mit Lambda-DNA oder pBR322-DNA stattfand, konnte keine Hybridisierung der 3,85 kb Hjndlll-Fragmentprobe mit jedem Hindlll-DNA-Fraament von nicht-pathogenen Treponemen beobachtet werden (nicht gezeigt). Das intakte Plasmid pMN23 (das die gesamte 5,4 kb-Sequenz enthält), das als markierte Probe verwendet wurde, hybridisierte unter reduziert starken Bedingungen mit keinem Hindlll-DNA-Fragment von Nichtpathogenen (nicht gezeigt). Die Unmöglichkeit, eine homologe 47 kDa-lmmuno-gen-Gensequenz in den nicht-pathogenen Treponemen nachzuweisen, scheint somit nicht das Resultat von übermässig starken Hybridisierungsverbindungen, wie sie im Southem-Blot verwendet werden, zu sein.

Wenn Southern-Blots identisch zu Fig. 3B mit markierter pBR322 getestet werden (Vektor-DNA), wurde keine Hybridisierung des 3,85 kb Hjndl Il-Fragmentes mit T, pallidum-DNA oder mit dem 3,85 kb Hindlli-Fraament des Klons pMN23 beobachtet (nicht gezeigt), im Gegensatz dazu hybridisierte intakte markierte pMN23-Plasmid-DNA, die als Hybridisierungsprobe verwendet wurde mit der entsprechenden T. pallidum-DNA-Seauenz sowohl in der T. pallidum-Genom-DNA und Klon pMN23, ebenso wie mit der pBR322-DNA-Sequenz, jedoch nicht mit Kaninchen-DNA oder genomischen DNAs von nicht-patho-genen Treponemen, wie vorausgesagt (nicht gezeigt).

Expression des 47 kDa-lmmunogen in T. pallidum und E. coli

Fig. 4 zeigt die Resultate von RIP-Assays, welche unter Verwendung von i25l-markiertem T. pallidum und 35S-markierten, rekombinanten Klonen pMN23 und pMN20 als Antigene durchgeführt wurden. Solu-

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bilisierte Antigene wurden einer lmmunopräzipitation unterworfen, wobei die mAbs 11E3, 8G2 und 3B5 verwendet wurden. Der mAb 3B5, weicher gegen ein 34 kDa-lmmunogen von T. pallidum (Strecke 7 ) gerichtet ist, wurde als Kontrolle verwendet. Die mAbs 11E3 und 8G2 immunopräzipitierten das 47 kDa-lmmunogen von 125l-markierten T. pallidum (Fig. 4, Strecken 1 und 4 ). Ein Antigen mit einem scheinbar identischen Mr zum 47 kDa-lmmunogen von T. pallidum wurde durch die mAbs 11E3 und 8G2 aus Klon pMN23 (Strecken 2, 5) immunopräzipitiert, jedoch nicht aus E. coli, welches das Kontrollhybrid-PIasmid pMN20 (Strecken 3, 6) enthielt, welches ein 34 kDa-T. pallidum-Antiaen (Strecke 9) codiert. In den Strecken 1, 4 und 7 repräsentierte das fremde Band mit der Molekularmasse von 50 kDa das schwerkettige Kanin-chenwirt-lmmunoglobuiin, das mit T. pallidum mitgereinigt wird und welches durch Lactoperoxidase-kataly-sierte Jodierung markiert ist (Marchitto et al., (1986) Infect. Immun., V 51, Seiten 168 bis 176); weitere irrelevante Bänder in den Strecken 1 bis 9 beruhen auf nicht-spezifischer Absorption von markierten Produkten auf S. aureus-Zellen.

Ein analoges Resultat wie dasjenige von RIP wurde unter Verwendung von Western-Blotting (Fig. 5) erhalten. Anti-47 kDa-mAb 8G2 reagierte mit 47 kDa-Antigenen aus T. pallidum, den Klonen pMN23 und pMN24, jedoch mit keinen der negativen Kontrollklone pMN20, pBR322 oder pMN7 (Fig. 5). Ein ähnlicher Westernblot wurde mit Anti-47 kDa-mAb 11E3 als Probe durchgeführt und ergab identische Resultate (nicht dargestellt). Die Durchführung eines weiteren Blots mit mAb 3B5 als Probe wies die Gegenwart des 34 kDa-Antigens in T. pallidum und im Klon pMN20 nach, jedoch nicht in den Klonen pMN23, pMN24, pMN7 oder pBR322, wie erwartet (nicht dargestellt).

Weitere Westernblotting-Experimente zeigten, dass mindestens 6 von 7 humanen, sekundären, syphilitischen Seren mit der rekombinanten Form des 47 kDa-lmmunogens reagierten (ein Resultat war zweideutig), während normales humanes Serum nicht reagierte (nicht dargestellt). Die gleichen humanen, syphilitischen Seren waren nicht-reaktiv mit E. coli, welches den Klonierungsvektor allein enthielt. Die Experimente bestätigten die Reaktivität von humanen Antikörpern, welche in Antwort auf die natürlich erworbene Infektion durch T. pallidum hervorgerufen wurde, mit dem rekombinanten DNA-abgeleiteten 47 kDa-lmmunogen, das in E. coli exprimiert wurde.

Es wird der Beweis für die Klonierung und Expression des 47 kDa-Hauptoberflächenimmunogens von T. pallidum in E. coli erbracht. Die 5,4 kb-DNA-lnsertion, welche das 47 kDa-lmmunogen codiert, be-sass eine breite Codierungskapazität für das Immunogen; ungefähr 1,3 kb der DNA wäre für die Codierung eines reifen 47 kDa-Antigens erforderlich. Ein 3,85 kb Hindlll-DNa-Fraament-Subklon von 5,4 kb totaler DNA-Insertion war unfähig, das relevante, epitope bzw. die relevanten Epitope zu exprimieren, wenn die Subkione unter Verwendung der mAbs 11E3 oder 8G2 analysiert wurden. Zusätzliche frühe vorläufige Subklonierungsexperimente führten zum Schluss, dass die rechtsseitigen drei Pstl-Fraamen-te des Klons pMN23 (Fig. 2) für die Expression des 47 kDa-lmmunogens nicht nötig waren. Anteile aller drei der linksseitigen Pstl-Fragmente von pMN23 schienen für die Expression des 47 kDa-Genproduk-tes erforderlich, jedoch ist offensichtlich ein kleiner rechtsseitiger Teil für das linke 1150 bp Pstl-Fraa-ment für die Expression erforderlich. Das 510 bp Pstl-Fraament ist für die Expression nötig. Die Dele-tion des 510 bp Pstl-Fraamentes führt zu einem verstümmelten Genprodukt mit einer Molekularmasse von etwa 44,5 kDa (reaktiv mit mAb 11E3), Diese vorläufigen Resultate lassen den Schluss zu, dass die Richtung der Transkription bezüglich Fig. 2 von links nach rechts verläuft, dass die Transkription für das strukturelle 47 kDa-Gen unmittelbar links der Çtal-Stelle beginnt und ungefähr 70 Basenpaare auf die rechte Seite der zweiten internen Pstl-Stelle in der geklonten Insertion verläuft. Weitere Versuche sind nötig für präzisere Bestimmungen.

Auf Basis von früheren Studien (Fehninger et al., (1984) Infect. Immun., V 46, Seiten 598 bis 607; Hansen et al., (1985) J. Bacteriol, V162, Seiten 1127 bis 1237; Norgard et al., (1983) Infect. Immun,, V 42, Seiten 435 bis 445; Stamm et al., (1983) Infect. Immun,, V 41, Seiten 709 bis 721; und Swancutt et al., (1986) Infect. Immun., V 52, Seiten 110 bis 119) ist es wahrscheinlich, dass E. coli den T. oallidum-Promoter für die Transkription des 47 kDa-Gens verwendet. Vorläufige Versuche lassen jedoch schliessen, dass das Ausmass der Expression des 47 kDA-Genproduktes in E. coli mit ungefähr 103 bis 104 weniger effizient (auf Basis von Zellen) im Vergleich mit T. pallidum ist. Die ursprüngliche Verwendung des Expressionsvektorsystems, das durch Tabor und Richardson beschrieben wurde (Tabor et al., (1985) Proc, Nati. Acad. Sei. USA, V 82, Seiten 1074 bis 1078) verbesserte die Expression des 47 kDa-Gen-produktes mehr als 100fach (unpubliziert).

Die Zugänglichkeit des gereinigten, rekombinanten 47 kDa-lmmunogen, das wie hier beschrieben hergestellt wird, ergibt eine neue Möglichkeit für die direkte Diagnostik, Pathogenese und Impfstoffabschätzung. Dass sowohl native als auch rekombinante, DNA-abgeleitete Formen des 47 kDa-lmmunogens identische, elektrophoretische Beweglichkeiten auf Polyacrylamid-Gel besitzen und dass die in humanen, syphilitischen Seren vorhandenen Antikörper an die rekombinante Form des Antigens gebunden werden, lässt den Schluss zu, dass das rekombinante Molekül anstelle des nativen, für diese Studien verwendet werden kann.

Die Expression des 47 kDa-lmmunogens in E. coli erlaubt eine präzisere biochemische Analyse des 47 kDa-Proteins. Lukehart et al. schlugen vor, dass das 48 kDa-lmmunogen von T. pallidum ein Glyko-protein sein könnte (Lukehart et al., (1982) J. Immunol. V, 129, Seiten 833 bis 838). Obschon F-Pilin von E. coli als Glykoprotein betrachtet werden kann (enthält eine Glykose und möglicherweise entweder Ga-

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lactose oder Didesoxyhexose) (Willets et al., (1980) Ann. Rev. Gent. V 14, Seiten 41 bis 76), ist das vorhergehende für Glykoproteine in Prokaryonten selten. Die Tatsache, dass E. coli ein 47 kDa-Antigen exprimiert, das eine identische, elektrophoretische Mobilität, wie das native 47 kDa-lmmunogen von T. pallidum besitzt, lässt den Schluss zu, dass das 47 kDa-lmmunogen kein Glykoprotein ist.

Das native 47 kDa-lmmunogen erscheint häufig als «47 bis 48 kDA-Doublett» auf Westemblot des Immunogens (Marchitto et al., (1984) Infect. Immun., V 45, Seiten 660 bis 666; und Norgard etat., (1984) J, Clin. Microbio!., V20, Seiten 711 bis 717). Die Erscheinung des «Doubletts» wird in der RIP-Analyse undeutlich (Jones et al., (1984) J. Exp. Med., V 160, Seiten 1404 bis 1420), vermutlich wegen der Intensität des breiten radioaktiven Bandes, welches auf dem Polyacrylamidgel erscheint. Die zweidimensionale Genanalyse des 47 kDA-Antigens führte zur Auflösung in einem Schwärm von 2-3 Flecken, mit ähnlichen isoelektrischen Punkten von etwa pH 5,5 bis 5,7, wobei die 47 bis 48 kDa-Doubletterscheinung in der zweiten Dimension vorlag (unpublizierte Daten). Dies stimmt mit den anderen, nicht-publizierten zweidimensionalen Geldaten überein, die unabhängig im Laboratorium S.J. Norris erhalten wurden (S.J. Nor-ris, persönliche Mitteilung), Die Natur des Schwarms der Polypeptid-Flecken mit ähnlichen isoelektrischen Punkten ist unklar, jedoch bleibt das «Doublett»-Phänomen konsistent mit der eindimensionalen Genanalyse. Die 48 kDa-Komponente des 47 bis 48 kDa-Doublett hat immer eine kleinere Bande« Die 48 kDa-Komponente kann den nicht entwickelten, äusseren Membranproteinvorläufer darstellen, welcher anschliessend während der transmembranen Sekretion in die niedriger-molekulargewichtige 47 kDa-Form (reif) gespalten wird. Alternativ kann die 48 kDa-Komponente einige post-translationale Modifikationen des 47 kDa-Produktes darstellen. Beim rekombinanten DNA-abgeleiteten 47 kDa-lmmunogen konnte das 47 bis 48 kDa-Doublettphänomen bis jetzt noch nicht beobachtet werden, dies mag auf der Nicht-Nachweisbarkeit des niedrigen Anteils des 48 kDa-Produktes, das in E. coli exprimiert wird, beruhen. Das Subkloning des 47 kDa-Gens in einem Expressionsvektor (Tabor et al., (1985) Proc. Nati. Acad. Sei, USA, V 82, Seiten 1074 bis 1078) sollte für die Klärung und Beobachtung hilfreich sein. Die DNA-Sequenierungstudien werden ebenfalls nützlich sein bei der Erstellung der primären Aminosäuresequenz eines reifen 47 kDa-lmmunogen und irgendeiner möglichen Vorläuferform,

Die Klonierung und Expression des 47 kDa-lmmunogens von T. pallidum in E. coli stellt ein Werkzeug dar, um die chemische Zusammensetzung des Proteins zu ermitteln, und die Struktur/Funktionsbeziehung des nativen 47 kDa-lmmunogens in T. pallidum kann möglicherweise zu einer Verbesserung des Verständnisses der Biologie dieses schwer fassbaren Pathogens führen. Die DNA, die das 47 kDa-Antigen codiert, kann nützlich als diagnostische DNA-Sonde sein (Moseley et at„ (1980) J. Infect. Dis., V 142, Seiten 892 bis 898), um die treponemalen Pathogene in genitalen UIcer, Hautläsionen und anderen Körperflüssigkeiten zu identifizieren. Das gereinigte 47 kDa-lmmunogen kann verwendet werden, um unter Verwendung von in vitro- und in vivo-Methoden sowohl humorale als auch zellvermittelte Immunantworten auf gereinigte Antigene nachzuprüfen; dies kann helfen, die entsprechenden Rollen von beiden Zweigen der Immunantwort der T. oallidum-lnfektion in einem Wirt zu klären. Das rekombinante DNA-abgeleitete Immunogen kann ebenfalls eine Basis für einen verbesserten serologischen Test auf Syphilis dienen, zu möglichen verbesserten Spezifitäten und Vereinfachungen bei gegenwärtig verwendeten Methoden führen. Zusätzlich sollte das rekombinante Immunogen eine direkte Abschätzung des immunogenen Potentials des 47 kDa-lmmunogens ermöglichen. Weil schliesslich das 47 kDa-lmmunogen pathogen spezifische Epitope aufweist, kann die Demonstration eines vaccinogenen Potentials zu einem treponemalen Breitbandimpfstoff führen.

Es können Änderungen in den Komponenten durchgeführt werden, wie in den Vektoren, Plasmiden, den T. pallidum-DNA-lnsertionen oder den Wirtsmikroorganismen, die hier beschrieben sind, oder in den Stufen oder Sequenzen der Stufen der hier beschriebenen Verfahren ohne vom Konzept und Bereich der vorliegenden Erfindung, wie sie in den beiliegenden Ansprüchen definiert sind, abzuweichen.

Claims

Patentansprüche

1, Verfahren zur Herstellung von mikrobiellen Klonen, welche das 47 kDa-Oberflächenimmunogen von Treponema pallidum exprimieren. gekennzeichnet durch folgende Schritte:

a) Aufspalten der DNA eines mikrobiellen Vektors, um ein erstes DNA-Fragment herzustellen;

b) Kombinieren des ersten DNA-Fragmentes mit einem zweiten, das 47 kDa-Oberflächenimmunogen codierenden DNA-Fragment aus einer pathogenen Unterart von Treponema pallidum, wobei das erste und zweite DNA-Fragment zur Rekombination fähig sind, um einen rekombinanten Vektor zu bilden, welcher Treponema pallidum-DN A aufweist;

c) Transformation eines zweckmässigen mikrobiellen Wirts mit dem genannten rekombinanten Vektor, um mikrobielle Klone zu bilden, welche Treponema pallidum-Antiaene exprimieren;

d) Kultivierung von Kolonien der mikrobiellen Klone;

e) Kontaktierung der Kolonien mit einem Antikörper, welcher eine spezifische Affinität für das 47 kDa-Oberflächenimmunogen von Treponema pallidum besitzt; und f) Auswahl von mikrobiellen Klon-Kolonien, die eine Affinität für den Antikörper besitzen, wobei die ausgewählten Kolonien durch ihre Expression des 47 kDa-Oberflächenimmunogens von Treponema pallidum gekennzeichnet sind.

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Klon-Kolonien mit monoklonalen

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Antikörpern kontaktiert werden, welche durch die Mäusehybridomzellinie 8G2 ATCG Nr. HB8134 produziert werden.

3. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der mikrobielle Vektor ein Plasmid ist.

4. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der mikrobielle Vektor das Plasmid pBR322 ist.

5. Verfahren gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der mikrobielle Vektor mit Pstl gespalten ist und ein dG-Ende aufweist.

6. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

7. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der mikrobielle Wirt eine Art von Escherichia coli ist.

8. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite DNA-Fragment durch eine partielle Restriktionsenzym-Verdauung von DNA aus pathogenen Unterarten von Treponema pallidum stammt.

9. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite DNA-Fragment Enden mit dC-Resten besitzt.

10. Rekombinantes Plasmid, das einer Transformation eines mikrobiellen Wirts angepasst ist als Zwischenprodukt im Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasmid einen Plasmidvektor enthält, worin ein DNA-Segment insertîert ist, welche das 47 kDa-Oberflächenimmunogen von Treponema pallidum codiert.

11. Rekombinantes Plasmid gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es das Plasmid pMN23 ist, hinterlegt in E. coli unter der ATCC Nr. 67204.

12. Transformationsmikroorganismus, hergestellt nach dem Verfahren nach Anspruch 1, welcher ein rekombinantes Plasmid gemäss Anspruch 10 enthält.

13. Mikroorganismus nach Anspruch 12 des Stammes Escherichia coli, welcher die Identifikationsmerkmale von ATCC Nr. 67204 besitzt, welcher Mikroorganismus fähig ist, das 47 kDa-Oberflächenimmunogen von Treponema pallidum zu produzieren, welches mit den Antikörpern gegen Treponema pallidum reaktiv ist.

14. Antigen, welches mit Antikörpern gegen Treponema pallidum reaktiv ist, hergestellt durch einen Mikroorganismus gemäss Anspruch 13.

15. Zusammensetzung für die Diagnose von Treponema pallidum-lnfektionen. dadurch gekennzeichnet, dass sie das 47 kDa-Oberflächenimmunogen von Treponema pallidum enthält, welches von einem rekombinanten Organismus gemäss Anspruch 12 oder 13 erhalten wurde.

16. Impfstoff für die Immunisierung von Individuen gegen Infektionen durch Treponema pallidum, dadurch gekennzeichnet, dass er das 47 kDa-Oberflächenimmunogen von Treponema pallidum enthält, welches aus dem rekombinanten Organismus gemäss Anspruch 12 oder 13 erhalten wurde.

17. Verfahren zum Nachweis der Gegenwart von Antikörpern gegen Treponema pallidum in biologischen Flüssigkeiten, gekennzeichneet durch:

a) Zugabe von 47 kDa-Oberflächenimmunogen von Treponema pallidum, das durch rekombinante

DNA-Techniken mittels eines Mikroorganismus gemäss Anspruch 12 oder 13 hergestellt worden ist,

auf eine Probe einer biologischen Flüssigkeit; und b) Nachweis, ob das genannte Immunogen mit Antikörpern gegen Treponema pallidum, die in der genannten Probe vorhanden sind, reagiert.

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