DE4419294A1 - Ein 29 kD großes Membranprotein von Legionella pneumophila sowie dessen Nukleinsäuresequenz und die Verwendung in Diagnostik und Therapie - Google Patents
Ein 29 kD großes Membranprotein von Legionella pneumophila sowie dessen Nukleinsäuresequenz und die Verwendung in Diagnostik und TherapieInfo
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Description
Das Bakterium Legionella pneumophila (L. pneumophila) ist der Erreger der Legionelliose, einer
1977 erstmals charakterisierten Lungenentzündung hoher Mortalität. Ein weiteres klinisches
Syndrom, das Pontiac Fieber, ist eine apneumonische, selbstlimitierende respiratorische
Erkrankung.
Die mikrobiologische Diagnostik der Legionellosen umfaßt so verschiedene Verfahren wie die
kulturelle Isolierung, den Direktnachweis der Bakterien oder ihrer Abbauprodukte mittels
immunologischer Verfahren, serologische Untersuchungen und Nukleinsäure-gestützte Techniken.
Bei Krankheiten niedriger Prävalenz wie der Legionelleninfektion kommt einer hohen Testspezifität
und einem damit verbundenen hohen prädikativem Wert des Testsystems besondere Bedeutung zu.
Zudem sind nach dem Stand der Technik keine Testverfahren mit ausreichend hoher Spezifität und
Sensitivität verfügbar, mit deren Hlfe eine Legionelleninfektion sicher ausgeschlossen werden
könnte (Edelstein, P. H. (1987) The laboratory diagnosis of Legionnaires' disease. Semin. Respir.
Infect. 2: 235-241).
Unter den gegenwärtig verfügbaren Verfahren weist der kulturelle Nachweis von Legionellen in
klinischem Probenmaterial die höchste Spezifität auf (beispielsweise 99,93%; in Fukunaga, H. et
al. (1990) Asymptomatic infection of Legionella pneumophila in four cases with pulmonary
diseases. Nippon Saikingaku Zasshi 45: 833-840) die Sensitivität wird in der Literatur jedoch
widersprüchlich beurteilt (Edelstein, P. H. (1987) Laboratory diagnosis of infections caused by
legionellae. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 6: 4-10).
Zur klinischen Diagnose einer Legionelleninfektion kann neben der Bakterienanzucht auch die
Technik der direkten Immunfluoreszenz eingesetzt werden (Cherry, W. B. et al (1978) Detection in
clinical specimens by direct immunofluorescence. In: Legionnaires', the disease, the bacterium and
methodology. Jones, J. L., H´bert, G. A. (eds). Centers for Disease Control, Atlanta, pp 130-145).
Dieses Verfahren setzt jedoch die Verfügbarkeit von geeignetem Gewebematerial sowie eines
entsprechenden Antiserums bzw. eines monoklonalen Antikörpers voraus. Da die gegenwärtig
verfügbaren monoklonalen Antikörper zwar gegen speziesspezifische Epitope (meist
Polysaccharide) von L. pneumophila gerichtet sind, aber keineswegs alle Isolate von L.
pneumophila erfassen, ist ihr Nutzen für die Diagnostik beschränkt (Gosting, L. H., et al. (1984)
Identification of a species specific antigen in Legionella pneumophila by a monoclonal antibody. J.
Clin. Microbiol. 20: 1031-1035; Cercenado, E. et al. (1987) Legionella micdadei and Legionella
dumoffii monoclonal antibodies for laboratory diagnosis of Legionella infections. J. Clin.
Microbiol. 25: 2163-2167; Steinmetz, I. (1991) Genius-specific epitope on the 60-kilodalton
legionella heat shock protein recognized by a monoclonal antibody. J. Clin. Microbiol. 29: 346-354).
Serologische Verfahren stützen sich auf den Nachweis von spezifischen Antikörpern, die das
kompetente Immunsystem des Infizierten gegen bakterielle Bestandteile ausbildet. Der Nachweis
von anti-Legionellen Antikörpern erfolgt über einen indirekten Immunfluoreszenztest (IFT) oder
mittels ELISA. Als Antigene werden hier inaktivierte Bakterienstämme, durch Ultraschallaufbruch
gewonnene oder lösliche Antigene der einzelnen Spezies und Serogruppen verwendet (Barka, N. et
al. (1986) ELISA using whole Legionella pneumophila cell als antigen. Comparison between
monovalant and polyvalent antigens for the serodiagnosis of human legionellosis. J. Immunol.
Methods 93: 77-81; Elder, E. M. et al. (1983) Microenzyme-linked immunosorbent assay for
detection of immunoglobin G and immunoglobin M antibodies to Legionella pneumophila. J. Clin.
Microbiol. 17: 112-121; Naot. Y. et al. (1982) IgM and IgG antibody response in two
immunosuppressed patients with Legionnaires' disease. Evidence of reactivation of latent
infections. Am. J. Med. 73: 791-794; Sampson, J. S. et al. (1983) Kinetic-dependent enzyme linked
immunosorbent assay for detection of antibodies to Legionella pneumophila. J. Clin. Microbiol.
18: 1340-1344).
Da aber mittels der gegenwärtig verfügbaren Verfahren selbst 3 Wochen nach Erkrankungsbeginn
nur bei 2 von 3 Patienten eine Serokonversion nachweisbar ist (Harrison, T. G. et al. (1988) Timing
of seroconversion in Legionnaires' disease. Lancet 1:795), liefern Antikörpernachweise weitgehend
retrospektive Diagnosen. Zudem sind entsprechende Antikörperbestimmungen bisher nur für die
Serogruppe 1 von L. pneumophila evaluiert und innerhalb der Subgruppen werden erhebliche
Unterschiede der Reaktivität beobachtet (Benson, R. F. et al. (1983) Factors influencing the
reactivity of Legionella antigens in immunofluorescence tests. J. Clin. Microbiol. 17: 909-917)
Als Bestätigungstest hat sich in diesem Umfeld ein Immunoblot mit definierten Zellwandantigenen
(im wesentlichen Protein- und mit Proteinen kovalent verknüpfte Lipopolysaccharid-Antigene) als
unabdingbar erwiesen (Ehret et al. (1983) Species specific membrane proteins of Legionellaceae,
Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. 255: 33-38).
Der immunologische Nachweis von Legionellenantigenen im Urin stellt eine weitere Möglichkeit
zur Diagnose von Legionelleninfektionen dar. Verfügbare Testsysteme basieren vorwiegend auf
Antikörpern gegen die stark abgebauten Kohlenhydratbestandteile der bakteriellen Zellwand und
zeigen eine hohe Rate an falsch-positiven Ergebnissen (Sathapatayavongs, B. et al. (1982) Rapid
diagnosis of Legionnaires' disease by urinary detection. Comparison of ELISA and
radioimmunoassay. Am. J. Med. 72: 576-582).
Als die sensitivste Methode zum Nachweis von Legionellen hat sich in letzter Zeit der Nachweis
von spezifischen Nukleinsäuresequenzen innerhalb des Bakteriengenoms mit Hilfe von DNA-
Sonden oder in vitro Amplifikationsreaktionen (z. B. PCR) erwiesen. Da auf Nukleinsäureebene
zunehmend charakteristische Unterschiede zwischen einzelnen Legionella-Stämmen bzw.
-Serogruppen identifiziert werden können, wird mit Hilfe dieses Verfahrens eine speziesspezifische
Detektion möglich (beispielsweis Starnbach, M. N. et al. (1989) Species-specific detection of
Legionella pneumophila in water by DNA amplification and hybridization. J. Clin. Microbiol.
27: 1257-1261).
Die Erfindung betrifft eine Nukleinsäuresequenz aus dem Genom von L. pneumophila (Serogruppe
1, Stamm Philadelphia 1), die für das 29 kD große Hauptmembranprotein ("major outer membrane
protein"; im folgenden als MOMP bezeichnet) von L. pneumophila codiert. Die Erfindung nutzt
diese Sequenz zum direkten Nachweis von L. pneumophila mittels Verfahren zum
Nukleinsäurenachweis, beispielsweise Hybridisierung, in vitro Amplifikation oder anderen
empfindlichen Verfahren, sowie zur Herstellung von Antigen. Dabei kann dieses Antigen zur
Identifizierung der Erreger dienen oder aber die Immunantwort des Körpers gegen dieses Antigens
bestimmt werden. Weiterhin ist dieses Protein, Teile davon, sowie Antikörper oder immunreaktive
Zellen dagegen, auch als therapeutisch oder präventiv wirksame Substanz Gegenstand dieser
Erfindung.
Die Erfindung betrifft daher auch Verfahren zur Herstellung von rekombinantem L. pneumophila
MOMP-Protein, vorzugsweise in Form von unterschiedlichen, definierten MOMP-Fragmenten und
vorzugsweise mittels prokaryonter Expressionssysteme. Ferner betrifft die Erfindung die
Verwendung entsprechender rekombinanter Proteine als Komponente in diagnostischen
Testsystemen.
In diesem Zusammenhang bedeutet therapeutisch wirksam, daß entsprechende Polypeptide oder
davon abgeleitete Substanzen zur Behandlung von Legionellen-Infektionen geeignet sind. Präventiv
wirksam bedeutet, daß entsprechende Polypeptide oder davon abgeleitete Substanzen zum Schutz
vor Legionellen-Infektionen geeignet sind. Diagnostisch spezifisch bedeutet in diesem
Zusammenhang, daß entsprechende Nukleinsäuresequenzen, Polypeptide oder Antikörper dagegen
zum spezifischen Nachweis von Legionellen oder Legionellen-Infektionen geeignet sind.
Relevante biologische Aktivitäten des L. pneumophila MOMP-Proteins sind seine Rolle als
potentieller Pathogenitätsfaktor bei Legionellen-Infektionen (durch Bindung der
Komplementkomponente C3 besitzt das Protein eine Schlüsselrolle bei der Phagozytose und somit
für die intrazelluläre Lebensweise), seine Speziesspezifität (Proteine mit einem Molekulargewicht
von 29 kD konnten zwar in Membranpreparationen aller klinisch relevanten Legionella Spezies
nachgewiesen werden, aber ein Sequenzvergleich der entsprechenden Gene bestätigt eine
speziesspezifische Konservierung großer Proteinbereiche) und seine Eigenschaft als
meistsynthetisiertes Protein in L. pneumophila.
Erfindungsgemäß stellen in vitro Amplifikationsverfahren Verfahren dar, mit deren Hilfe
Nukleinsäure- oder damit assoziierte Moleküle in vitro vermehrt werden, vorzugsweise unter
spezifischen Bedingungen.
Die relevanten Nukleinsäuresequenzen sind zur Diagnose geeignet, wenn sie Basenabfolgen
repräsentieren, die spezifisch für L. pneumophila sind.
Erfindungsgemäß bezeichnet der Begriff Primer kurze Oligonukleotide, die aufgrund ihrer
Basenabfolge mit einer bestimmten Nukleinsäuresequenz hybridisieren, vorzugsweise spezifisch.
Erfindungsgemäß bedeutet der Begriff Hybridisieren die Hybridisierung von Nukleinsäuren unter
üblichen Bedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen.
Erfindungsgemäß werden mit dem Begriff molekularbiologische Reinigungshilfe Proteine
bezeichnet, die, mit dem gewünschten Protein als Fusionsprotein exprimiert, aufgrund ihrer
biologischen Aktivität dessen anschließende Reinigung erleichtern. Reporterenzyme stellen in
diesem Zusammenhang Proteine dar, die, mit dem gewünschten Protein als Fusionsprotein
exprimiert, aufgrund ihrer enzymatischen Aktivität dessen anschließenden Nachweis ermöglichen.
Nach dem Stand der Technik ist eine Nukleinsäuresequenz aus dem Genom von L. pneumophila
(Serogruppe 1, Stamm Philadelphia 1) bekannt, die für ein Protein aus dem Hauptmembranprotein-
Komplex kodiert; vergleiche Hoffmann P.S. et al. (1992) Cloning and nucleotide sequence of a
gene (omp S) encoding the major outer membrane protein of Legionella pneumophila. J. Bacteriol.
2: 914-920.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wurde überraschenderweise eine
Nukleinsäuresequenz aus dem Genom von L. pneumophila ermittelt, die den vollständigen offenen
Leserahmen des 29 kD großen Hauptmembranproteins (MOMP) von L. pneumophila darstellt, und
dadurch erhältlich, daß man
- - das native MOMP-Protein aus einer L. pneumophila Bakterienkultur mittels molekularbiologischer Techniken in angereicherter Form isoliert,
- - einer Bromcyan-Spaltung unterwirft und die Amino-terminale Aminosäuresequenz der spezifischen Proteinfragmente ermittelt,
- - anhand der Aminosäuresequenz mit Hilfe des genetischen Codes sogenannte degenerierte Oligonukleotidprimer synthetisiert, diese zur in vitro Amplifikation genomischer Nukleotidsequenzen verwendet, anschließend die Nukleotidsequenz der Amplifikationsprodukte bestimmt und diese als Grundlage für eine Sequenzierung des vollständigen offenen Leserahmens verwendet.
Die erfindungsgemäß ermittelte Nukleinsäuresequenz unterscheidet sich dabei in wesentlichen
Teilen von der von Hoffmann et al. (1992) veröffentlichten Nukleinsäuresequenz. Die von diesen
Nukleinsäuresequenzen codierten Proteine unterscheiden sich deutlich in ihrer
Aminosäurezusammensetzung als auch in der Abfolge der einzelnen Aminosäuren. Ein Vergleich
der beiden Nukleinsäuresequenzen, aus dem diese Unterschiede ersichtlich werden, ist in Fig. 1
dargestellt.
Des weiteren konnte, ausgehend von der erfindungsgemäß ermittelten Nukleinsäuresequenz, die
dem MOMP-Gen zugehörige Promotersequenz auf dem Genom von L. pneumophila identifiziert
werden. Hierbei handelt es sich um eine Promotersequenz, die nach derzeitigem Wissenstand eine
sehr starke Transkription der unter Kontrolle stehenden Gene bewirkt. Im Gegensatz dazu
wurde für das von Hoffmann et al. (1992) beschriebene Gen eine deutlich schwächere
Promotorsequenz beschrieben. Da das MOMP-Protein das meistsynthetisierte Protein von L.
pneumophila darstellt, ist zu erwarten, daß die Initiation entsprechender Transkripte von einem sehr
starken Promotor aus erfolgt.
Ferner ist die Herstellung von prokaryonten Expressionsplasmiden bekannt, die eine kodierende
Sequenz des L. pneumophila MOMP-Proteins enthalten (vergleiche beispielsweise Hoffmann et al.,
1992). Da eine Expression und anschließende Charakterisierung des entsprechenden Proteins
vermutlich aufgrund der Toxizität des Proteins für Bakterienzellen nicht gelang (vergleiche
Hoffmann et al., 1992), konnte bisher nicht zweifelsfrei gezeigt werden, daß diese beschriebene
Nukleinsäuresequenz ein Protein mit den biologischen Eigenschaften des genannten MOMP-
Proteins auf der Ebene des Bakteriengenoms repräsentiert.
Des weiteren ist die Herstellung eines prokaryonten Vektorkonstrukts bekannt, das ein 25 kD
großes Protein exprimiert. Dieses Protein, das von den Autoren dem Hauptmembranprotein-
Komplex von L. pneumophila zugeordnet wurde, ist jedoch aufgrund der ermittelten
Nukleinsäuresequenz und seiner Größe nicht identisch mit dem genannten 29 kD großen MOMP-
Protein (vergleiche Highs, A. S.. et al. (1993) Cloning, nucleotide sequence and expression in
Escherichia coli of a gene (ompM) encoding a 25 kDa major outer-membrane protein (MOMP) of
legionella pneumophila. J. Gen Microbiol. 1389: 1715-1721).
Deshalb war die Aufgabe, auf Grundlage der erfindungsgemäß ermittelten Nukleinsäuresequenz
Vektorkonstrukte anzufertigen, mit deren Hilfe sich das 29 kD große L. pneumophila MOMP-
Protein, beziehungsweise Fragmente davon, bereitstellen lassen.
Wenn sich erfindungsgemäß Vektoren herstellen lassen, die die kodierende Sequenz des 29 kD
großen L. pneumophila MOMP-Proteins oder Fragmente davon enthalten und die Herstellung von
rekombinantem Protein ermöglichen, so ist diese Leistung insofern als erfinderisch zu bewerten,
daß es bisher noch nicht gelungen ist, Vektoren anzufertigen, mit deren Hilfe sich das genannte
Protein oder einzelne Fragmente davon exprimieren lassen.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wurde nun überraschenderweise ein prokaryontes
rekombinantes Expressionsplasmid zur Verfügung gestellt, das stabil und in großer Ausbeute einen
Teil des genannten Membranproteins in Bakterienzellen exprimiert und dadurch erhältlich ist, daß
man
- - mit Hilfe der erfindungsgemäß ermittelten Nukleinsäuresequenz kurze Oligonukleotide synthetisisiert, die im Rahmen einer anschließenden in vitro Amplifikationsreaktion als Primer dienen,
- - wobei diese Oligonukleotide an ihrem 5′-Ende zusätzliche, nicht Template-komplementäre Sequenzen aufweisen, die vorzugsweise Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme darstellen,
- - anschließend Teile der erfindungsgemäß ermittelten Nukleinsäuresequenz mittels einer in vitro Amplifikationsreaktion vermehrt und unter Beibehaltung des vorgegebenen Leserahmens, vorzugsweise mit Hilfe der zusätzlich eingeführten Restriktionsschnittstellen, in einen prokaryonten induzierbaren Expressionsvektor kloniert,
- - geeignete Bakterienzellen mit dem rekombinanten Expressionskonstrukt transformiert,
- - die Bakterienzellen kultiviert und die Expression der genannten MOMP- Proteinfragmente induziert, vorzugsweise in einer Art, daß ein Großteil des neusynthetisierten rekombinanten Proteins innerhalb der Bakterienzellen in Form von Einschlußkörpern vorliegt.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich Fragmente des L. pneumophila MOMP-
Proteins gewinnen, die zwar in ihrer Aminosäuresequenz identisch zu den entsprechenden nativen
Proteinfragmenten sind, die im Gegensatz zu diesen jedoch nicht kovalent mit Peptidoglycanen und/oder
Lipopolysacchariden assoziiert sind.
Da ein Großteil der humoralen Immunantwort gegen serogruppenspezifische Zuckerreste der
Legionellenzellwand gerichtet ist, werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erstmals
speziesspezifische rekombinante Antigene und Antikörper verfügbar.
Solche rekombinanten Antigene verfügen über ein enormes diagnostisches Potential, da mit ihrer
Hilfe im Rahmen von immunologischen Testsystemen, wie beispielsweise Immunoblot, Multispot-
Test oder ELISA, erstmals eine Erfassung aller bisher beschriebenen 14 Serogruppen von L.
pneumophila in einem einzigen Testansatz ermöglicht wird. Gegenwärtig werden zur Erfassung der
14 unterschiedlichen Serogruppen 14 unterschiedliche Testansätze benötigt. Die unterschiedlichen
Serogruppen unterscheiden sich zwar in definierten Sequenzbereichen innerhalb des genannten
MOMP-Proteins, diese sind jedoch anhand der erfindungsgemäß ermittelten Nukleinsäuresequenz
genau definiert.
Ferner erweist sich das erfindungsgemäße Verfahren als geeignet, um rekombinante Proteine zu
gewinnen, die als therapeutisch oder präventiv wirksame Polypeptide sowie zur Herstellung von L.
pneumophila-spezifischen Antikörpern dienen können.
Ausgehend von einer L. pneumophila Kultur (Serogruppe 1, Stamm Philadelphia) wurde das 29 kD
große MOMP-Protein mit Hilfe von molekularbiologischen Standardmethoden zur Proteinreinigung
isoliert und aufgereinigt. Um genauere Informationen über die Aminosäuresequenz zu erhalten,
wurde das gereinigte Protein mit Bromcyan in kürzere Peptide gespalten und diese ansequenziert.
Die Spaltung des reduzierten, carboxymethylierten 29 kD Hauptmembranproteins erfolgte für 24 h mit einer 0,1 M BrCN-Lösung in 70%iger Ameisensäure. Der Spaltansatz wurde nach
entsprechender Aufarbeitung in 10%iger Essigsäure gelöst und das Peptidgemisch mittels
Gelfiltration an Sephadex G-100 Superfine (Pharmacia) fraktioniert. Die Bestimmung der
Aminosäuresequenz der einzelnen Fragmente erfolgte in einem automatisierten
Proteinsequenzierungsgerät nach dem Prinzip des Edman-Abbaus.
Für die Ermittlung der entsprechenden codierenden DNA-Sequenz des MOMP-
Proteins wurden
anhand der partiellen N-terminalen Aminosäuresequenzen mit Hilfe des genetischen Codes eine
Reihe von Oligonukleotiden synthetisiert und anschließend als PCR-Primer zur Amplifikation und
direkten Sequenzierung von Teilbereichen des MOMP-Gens eingesetzt. Dabei diente die Codon-
Präferenz einiger gut charakterisierter und sequenzierter Gene von L. pneumophila als Grundlage
bei der Auswahl geeigneter Oligonukleotidsequenzen. Da die Lage der einzelnen Peptidfragmente
innerhalb des Gesamtproteins nicht bekannt war, wurden jeweils zwei Primer mit umgekehrter
Orientierung synthetisiert, um eine Elongation in beide Richtungen zu ermöglichen.
Da die eingesetzten PCR-Primer zusätzlich auf unspezifische Weise im upstream- und downstream
Bereich des MOMP-Gens hybridisierten, konnte über die Sequenzierung von "unspezifischen"
Amplifikationsprodukten auch die den offenen Leserahmen des MOMP-Gens flankierende Sequenz
ermittelt und darin erhaltene regulatorische Elemente charakterisiert werden. In Fig. 1 ist die
vollständige Nukleotid- und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz des 29 kD großen MOMP-
Proteins dargestellt.
Anhand der erfindungsgemäß ermittelten Nukleinsäuresequenz wurden spezifische
Oligonukleotidprimer synthetisiert, die innnerhalb des MOMP-Leserahmens mit dem L. pneumophila
Genom hybridisieren und über 5′-terminale Basenfehlpaarungen BamHI- und EcoRI-
Restriktionsschnittstellen in davon abgeleitete PCR-Produkte einführen. Nach in vitro
Amplifikation der entsprechenden MOMP-Fragmente (vergleiche Fig. 3A) mittels PCR wurden
die Amplifikationsprodukte isoliert, mit den genannten Restriktionsenzymen inkubiert und
anschließend in analog gespaltene pGEX 3X-Expressionsvektoren (Pharmacia) liegiert. E.coli K12
XL1-blue Zellen wurden mit den rekombinanten Expressionsvektoren transformiert, erfolgreich
transformierte Zellen wurden selektioniert, kultiviert und die Proteinexpression mit IPTG induziert.
Mittels SDS-Gelelektrophorese konnte die Expression von Proteinfragmenten entsprechender
Größe bestätigt werden.
Die MOMP-Fragmente exprimierenden Bakterienzellen wurden durch 15minütige Zentrifugation
bei 5000 × g vom LB-Kulturmedium abgetrennt, in Lysis-Puffer (25 mM Tris-HCl, 0,15 mM NaCl,
1 mM EDTA) resuspendiert und die Zellwände anschließend mittels Ultraschallbehandlung
aufgebrochen. Durch einen erneuten Zentrifugationsschritt (5000 × g) wurde das, innerhalb der
Bakterienzellen in denaturierter Form als cytosomale Einschlußkörper vorliegende, rekombinante
Protein von löslichen Zellbestandteilen abgetrennt. Der den Großteil des rekombinanten Proteins
enthaltende Niederschlag wurde in Harnstoff-Puffer (4-8 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH 8,4) für
45 min unter Schütteln bei 4°C inkubiert. Es wurde festgestellt, daß sich durch fraktionierte
Inkubation mit Puffern, die eine steigende Konzentration an Harnstoff enthalten, eine gute
Abreinigung von bakteriellen Verunreinigungen erreichen ließ. Nach Inkubation in Harnstoff-Puffer
befand sich ein Großteil des rekombinanten Proteins in Lösung. Nach Zugabe von 1 Volumen
Probenpuffer (10% Glycerin, 2% SDS, 10% β-Mercaptoethanol, 1 mM EDTA, 0,005%
Bromphenolblau) wurde die Mischung 3 min im Kochwasserbad erhitzt. Anschließend wurden je 2ml
dieser Proteinpräparation auf ein 12% zylindrisches SDS-Gel aufgetragen und mit Hilfe einer
Apparatur zur kontinuierlichen Elektroelution gemäß den Herstellerangaben elektrophoretisch nach
Molekulargewicht aufgetrennt (PrepCell Model 491, BioRad GmbH). Das Eluat wurde fraktioniert
gesammelt und Fraktionen, die das gewünschte rekombinante Protein enthielten, mittels SDS-
Gelelektrophorese identifiziert. Reines rekombinantes Protein ist, in Elektrophoresepuffer
eingefroren, bei -20°C stabil lagerbar. Insgesamt wurde durch den Aufreinigungsprozeß etwa 20%
des rekombinanten Proteins in reiner Form gewonnen.
Proben der genannten Proteinpräparation, die etwa 500 ng des rekombinanten Proteins enthielten,
wurden mit Hilfe der Western-Blot Technik auf eine Nitrocellulosemembran aufgebracht und
jeweils unter gleichen Versuchsbedingungen mit unterschiedlichen Seren inkubiert. Zum einen
wurde für diese Experimente ein anti-MOMP Kaninchenhyperimmunserum verwendet. Zum
anderen wurden Seren von gesunden Personen und Seren von Personen verwendet, die eine
eindeutig diagnostizierte L. pneumophila-Infektion durchgemacht hatten. Im Rahmen dieser
Untersuchungen konnte für die rekombinanten MOMP-Fragmente eine ausgeprägte
immunologische Reaktivität mit dem anti-MOMP-Kaninchenhyperimmunserum (vergleiche Fig. 3
B) sowie mit L. pneumophila-positiven Humanseren gezeigt werden. Mit L. pneumophila-negativen
Humanseren war keine MOMP-spezifische immunologische Reaktivität zu beobachten.
Claims (15)
1. Nukleinsäuresequenz gemäß Fig. 1 aus dem Genom von Legionella pneumophila, die den
vollständigen offenen Leserahmen des 29 kD großen Hauptmembranproteins (MOMP) von
Legionella pneumophila enthält, Fragmente davon, die therapeutisch oder präventiv wirksame
oder diagnostisch spezifische Fragmente des MOMP-Proteins oder Fragmente mit der
biologischen Aktivität des MOMP-Proteins codieren oder selbst als Primer oder zur Diagnose
oder zum Nachweis geeignet sind, Nukleinsäuresequenzen, die mit den vorgenannten
Nukleinsäuresequenzen durch die Degeneration des genetischen Codes verwandt sind, und
Nukleinsäuresequenzen, die mit einer der vorstehenden Nukleinsäuresequenzen hybridisieren und
ein Protein mit der biologischen Aktivität des MOMP-Proteins oder ein therapeutisch oder
präventiv wirksames Fragment oder ein diagnostisch spezifisches Fragment des MOMP-Proteins
codieren.
2. Vektoren, die eine Expression des MOMP-Proteins oder von Fragmenten des MOMP-Proteins
ermöglichen und dadurch erhältlich sind, daß man
- - entsprechende Teile der Legionella pneumophila Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 unter Beibehaltung des Leserahmens in geeignete Vektoren einfügt,
- - geeignete Bakterienzellen mit dem rekombinanten Vektorkonstrukt transformiert,
- - die transformierten Bakterienzellen kultiviert und die Expression der entsprechenden MOMP- Proteinfragmente induziert.
3. Vektoren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Vektor ein Expressionsplasmid
mit molekularbiologischer Reinigungshilfe, beispielsweise murine Dihydrofolat-Reduktase
(DHFR) oder Glutathion-S-Transferase (GST) verwendet.
4. Vektoren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie neben den entsprechenden
Teilen des MOMP-Proteins zusätzlich ein Gen für ein Reporterenzym enthalten, beispielsweise β-
Galaktosidase (β-Gal) oder Glutathion-S-Transferase (GST), und dieses als Fusionsprotein
zusammen mit einem Teil des MOMP-Proteins exprimiert wird.
5. Verfahren zur Gewinnung des MOMP-Proteins oder von Fragmenten des MOMP-Proteins,
dadurch gekennzeichnet, daß man
- - rekombinante Vektoren gemäß den Ansprüchen 2 bis 4 in geeignete Zellen einbringt, diese kultiviert und die gewünschten rekombinanten Proteine exprimieren läßt,
- - die Zellen vom Kulturmedium abtrennt, vorzugsweise durch Zentrifugation,
- - die Zellwände zerstört, vorzugsweise durch Ultraschall-Behandlung,
- - danach die die gewünschten rekombinanten Proteine in unlöslicher Form enthaltenden Einschlußkörper durch Zentrifugation von löslichen Zellbestandteilen abtrennt,
- - danach die rekombinanten Proteine in Lösung bringt, vorzugsweise mittels Zugabe von Harnstoff,
- - das Proteingemisch fraktioniert, vorzugsweise mit Hilfe einer Apparatur zur präparativen kontinuierlichen Elektroeluation über ein Polyacrylamid-Gel nach Molekulargewicht, und
- - Fraktionen identifiziert, die das gewünschte Protein erhalten.
6. MOMP-Protein oder therapeutisch oder präventiv wirksame oder diagnostisch spezifische
Fragmente davon, die von einer Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 codiert werden oder nach
einem der Ansprüche 2 bis 5 erhältlich sind.
7. Arzneimittel, enthaltend mindestens ein MOMP-Protein oder Fragmente davon gemäß Anspruch
6 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
8. Arzneimittel nach Anspruch 7 zur Therapie oder Prävention einer Legionella pneumophila-
Infektion.
9. Verfahren zum spezifischen Nachweis von Legionella pneumophila mittels Nukleinsäure
gestützter Techniken, die dadurch gekennzeichnet sind, daß spezifische Teile der
Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 hergestellt und
- - als Sondenmoleküle bei Hybridisierungsexperimenten oder
- - als Primer im Rahmen von in vitro Amplifikationsreaktionen verwendet werden.
10. Verfahren zum spezifischen Nachweis einer Infektion mit Legionella pneumophila, dadurch
gekennzeichnet, daß man ein MOMP-Protein oder ein Fragment davon gemäß Anspruch 6 als
rekombinantes Antigen in immunologischen Testsystemen zum Nachweis von anti-MOMP-
Antikörpern einsetzt.
11. Monospezifische oder monoklonale Antikörper oder immunreaktive Zellen gegen ein MOMP-
Protein oder Fragment davon gemäß Anspruch 8 oder antigenspezifische Derivate des
Antikörpers.
12. Verwendung dieser Antikörper und verwandter Proteine gemäß den Ansprüchen 8 und 11 für
den spezifischen Nachweis einer Legionella pneumophila-Infektion oder für den spezifischen
Nachweis von Legionella pneumophila.
13. Arzneimittel zur spezifischen Therapie einer Legionella pneumophila-Infektion, das einen
Antikörper oder ein antigenspezifisches Derivat davon gemäß Anspruch 11 enthält und
gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
14. Testkit zum Nachweis von Legionella pneumophila oder von Legionella pneumophila-
Infektionen, enthaltend eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder ein Fragment davon, ein
MOMP-Protein oder ein Fragment davon gemäß Anspruch 6 und/oder einen Antikörper oder ein
Derivat davon gemäß Anspruch 11.
15. Testkit zum Nachweis von Legionella pneumophila-Infektionen, vorzugsweise Immunoblot-
Test oder Mehrkomponenten-Test, enthaltend ein MOMP-Protein oder ein Fragment davon gemäß
Anspruch 6 und zusätzliche Antigene, vorzugsweise Legionella-Antigene, die zur Absicherung
der Diagnose wichtig sind.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4419294A DE4419294A1 (de) | 1994-06-05 | 1994-06-05 | Ein 29 kD großes Membranprotein von Legionella pneumophila sowie dessen Nukleinsäuresequenz und die Verwendung in Diagnostik und Therapie |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4419294A DE4419294A1 (de) | 1994-06-05 | 1994-06-05 | Ein 29 kD großes Membranprotein von Legionella pneumophila sowie dessen Nukleinsäuresequenz und die Verwendung in Diagnostik und Therapie |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE4419294A1 true DE4419294A1 (de) | 1995-12-07 |
Family
ID=6519616
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE4419294A Withdrawn DE4419294A1 (de) | 1994-06-05 | 1994-06-05 | Ein 29 kD großes Membranprotein von Legionella pneumophila sowie dessen Nukleinsäuresequenz und die Verwendung in Diagnostik und Therapie |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE4419294A1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016028384A1 (en) | 2014-06-30 | 2016-02-25 | Dow Global Technologies Llc | Method and reagents for detecting water contamination |
-
1994
- 1994-06-05 DE DE4419294A patent/DE4419294A1/de not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016028384A1 (en) | 2014-06-30 | 2016-02-25 | Dow Global Technologies Llc | Method and reagents for detecting water contamination |
| US10392671B2 (en) | 2014-06-30 | 2019-08-27 | Dow Global Technologies Llc | Method and reagents for detecting water contamination |
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