ES2293057T3 - Antigenos p153 y p156 para la inmunodiagnosis de ehrliquiosis canina y humana y uso de los mismos. - Google Patents

Antigenos p153 y p156 para la inmunodiagnosis de ehrliquiosis canina y humana y uso de los mismos. Download PDF

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Abstract

ADN que codifica una proteína de superficie inmunoADN que codifica una proteína de superficie inmunoreactiva de Ehrlichia canis p153 o una proteína dereactiva de Ehrlichia canis p153 o una proteína de superficie inmunoreactiva de Ehrlichia chaffeensi superficie inmunoreactiva de Ehrlichia chaffeensis p156, en la que dicho ADN es ADN que codifica las p156, en la que dicho ADN es ADN que codifica la proteína p153 que tiene la secuencia de aminoácid proteína p153 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 y la proteína p156 que tiene os de la SEC ID NO:2 y la proteína p156 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1, resla secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1, respectivamente. pectivamente.

Description

Antígenos p153 y p156 para la inmunodiagnosis de ehrliquiosis canina y humana y uso de los mismos.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La presente invención se refiere de manera general a los campos molecular y de inmunodiagnósticos. Más específicamente, la presente invención se refiere ortólogos de proteínas inmunoreactivas específicas de las especies (\sim200 kDa) procedentes de Ehrlichia canis y Ehrlichia chaffeensis que son útiles para la diagnosis específica de las especies de ehrliquiosis canina y ehrliquiosis monocitotrópica humana.
Descripción de la técnica relacionada
La ehrliquiosis monocítica canina es una enfermedad asociada a las garrapatas potencialmente fatal de perros con distribución mundial causada fundamentalmente por el agente rickettsiano, Ehrlichia canis (Huxsoll y otros, 1970). La E. canis es una bacteria obligadamente intracelular que muestra tropismo por monocitos y macrófagos (Nyindo y otros, 1971), y establece infecciones persistentes en el huésped vertebrado (Harrus y otros, 1998). La enfermedad se caracteriza por tres fases: la fase aguda que dura de 2 a 4 semanas; la fase subclínica, en la cual los perros pueden permanecer persistentemente infectados durante años, pero no muestran signos clínicos, seguido de la fase crónica, en la que en muchos perros la enfermedad llega a ser progresivamente peor debido a la hipoplasia de la médula ósea y la prognosis menos favorable (Troy y otros, 1990).
La Ehrlichia canis infecta y causa ehrliquiosis en animales que pertenecen a la familia de los Cánidos. La ehrliquiosis canina consiste en una fase aguda y una crónica. La fase aguda se caracteriza por fiebre, descargas nasales y oculares serosas, anorexia, depresión y pérdida de peso. La fase crónica se caracteriza por pancitopenia severa, epistaxis, hematuria, sangre en heces además de signos clínicos más severos de la enfermedad aguda. Si se trata prematuramente durante el curso de la enfermedad, los perros responden bien a la doxiciclina. Sin embargo, los perros infectados crónicamente no responden bien al antibiótico. Por ello, es muy importante la diagnosis prematura para el tratamiento de la ehrliquiosis canina.
El tratamiento de la enfermedad en la fase aguda es importante para la mejor prognosis. Las anormalidades hematológicas tales como leucopenia y trombocitopenia proporcionan frecuentemente la evidencia útil de ehrliquiosis canina y son factores importantes en la diagnosis inicial (Troy y otros, 1990). Sin embargo, la diagnosis se hace difícil debido a que la presentación clínica de ehrliquiosis canina no es específica.
La diagnosis de ehrliquiosis canina mediante procedimientos serológicos tal como el ensayo de anticuerpo fluorescente indirecto (IFA) ha llegado a ser el procedimiento convencional debido a su sencillez, fiabilidad y eficacia de coste (Troy y otros, 1990). Sin embargo, los defectos del ensayo de anticuerpo fluorescente indirecto incluyen la incapacidad para realizar diagnosis específica de la especies debido a la reactividad cruzada antigénica con otras especies Ehrlichia íntimamente relacionadas que infectan a perros (E. chaffeensis, E. ewingii, Anaplasma phagocytophilum, y A. platys). Las interpretaciones subjetivas pueden dar lugar igualmente a resultados negativos falsos, o positivos falsos, ocasionados por antígenos de reactividad cruzada. Otros procedimientos de diagnóstico tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) han sido desarrollados para la detección específica de E. canis, y han sido informados que son más sensibles que el aislamiento de cultivo de células, pero este procedimiento requiere entrenamiento especializado y equipo costoso (McBride y otros, 1996). El aislamiento del organismo requiere mucho tiempo, y únicamente unos pocos laboratorios han tenido éxito constante con este procedimiento. Además, se requieren ensayos adicionales de caracterización del aislado para la definición de una etiología específica para el uso este procedimiento.
Se ha informado de antígenos de reactividad cruzada serológicamente compartidos entre E. canis y E. chaffeensis. Algunas de la proteínas de reactividad cruzada serológicamente importantes muestran masas moleculares de 28-30-kDa (Chen y otros, 1997; Rikihisa y otros, 1994), y es sabido ahora que estas proteínas están codificadas por familias multigenes homólogas (Ohashi y otros, 1998a, b). Existen 22 y 25 genes p28 homólogos, pero no idénticos, que han sido identificados y secuenciados en E. chaffeensis y E. canis, respectivamente. Se ha observado homología de cepa intraespecies e interespecies similares entre las proteínas P28 de E. canis y E. chaffeensis, lo que explica la reactividad cruzada serológica de estas proteínas (McBride y otros, 1999).
Un reciente informe ha demostrado que la proteína rP28 procedente de E. chaffeensis ha sido una herramienta insensible en la diagnosis de casos de ehrliquiosis monocitrópica en humanos (HME) (Yu y otros, 1999a). La razón básica parece ser la variabilidad de la proteína P28 entre cepas diferentes de E. chaffeensis (Yu y otros, 1999b). Inversamente, los genes P28 identificados en E. canis están conservados entre cepas dispersadas geográficamente, y la rP28 de E. canis ha probado ser útil para la diagnosis de la ehrliquiosis canina (McBride y otros, 1999; Ohashi y otros, 1998a). Se han clonado otras proteínas inmunoreactivas homólogas incluyendo las glucoproteínas en E. canis (gp140) y E. chaffeensis (gp120) (Yu y otros, 1997, 2000). La reactividad de la rgp120 de E. chaffeensis se corresponde bien con el anticuerpo fluorescente indirecto para la serodiagnosis de la ehrliquiosis monocitotrópica humana, y los estudios preliminares con la rgp140 de E. canis sugieren que podría ser un antígeno para inmunodiagnóstico sensible y fiable (Yu y otros, 1999a, 2000).
La técnica anterior es deficiente en antígenos específicos para diagnósticos serológicos y moleculares para E. canis y E. chaffeensis así como procedimientos para dicho uso. La presente invención colma esta necesidad y deseo largamente esperado en la técnica.
Sumario de la invención
Se ha identificado una proteína (p43) de 43 kD fuertemente inmunoreactiva de Ehrlichia canis (patente de EE.UU. No. 6.355.777). Como un antígeno para inmunodiagnóstico, la p43 tenía una exactitud del 96% comparada con el ensayo de anticuerpo fluorescente indirecto y ha proporcionado diagnosis específica de las especies de infecciones de E. canis. La investigación con más detalle ha revelado que la p43 de E. canis representa la porción N-terminal de una proteína con una masa molecular predicha de 153 kD, la proteína inmunoreactiva más larga descrita en Ehrlichia spp. El análisis de fragmentos expresados recombinantes de la p153 por electroforesis en gel de proteína ha demostrado una masa molecular mayor de la predicha (\sim10 a 30%) y la presencia de glucanos carbohidratos sobre fragmentos N- y C-terminales, lo que indica que la p153 es una glucoproteína.
Se ha realizado una investigación BLASTn sobre la secuencia del genoma de E. chaffeensis disponible (95%), y se ha identificado el gen que codifica el ortólogo p153 en E. chaffeensis. Los genes p153 de E. canis (4263-bp) y p153 de E. chaffeensis (4389-bp) tenían localizaciones cromosómicas similares, más abajo de los genes desoxiguanosino-trifosfato trifosfohidrolasa homólogos (\sim87%) y las secuencias intergénicas homólogas (\sim90%) que preceden a los marcos de lectura abiertos. Se observó homología de secuencias de ácidos nucleicos (50%) entre los genes de glucoproteínas, lo cual confirma los hallazgos previos con respecto a la divergencia genética del fragmento de gen p43, y las proteínas p153 y p156 tenían una similitud de aminoácidos del 32%. Una proteína de E. canis nativa con una masa molecular de 200 kD reaccionó con antisuero producido contra la región N-terminal (p43) de la p153, lo cual sugiere que la proteína nativa estaba modificada post-traducción. De manera similar, sobre la proteína recombinante se detectó una proteína recombinante que comprende la región N-terminal de la p156 de E. chaffeensis migrada más larga que la predicha (\sim200 kD), y el carbohidrato. En este fragmento N-terminal se detectó un epítopo inmunoreactivo principal. La localización cromosómica, la homología de aminoácidos, y las propiedades biofísicas confirman la conclusión de que las glucoproteínas p153 y p156 (designadas como gp200) son ortólogos inmunoreactivos específicos de las especies.
Se han identificado los epítopos inmunoreactivos principales en las regiones N- (P43) y C-terminales de p153 de E. canis y la región N-terminal del ortólogo de p156 de E. chaffeensis que serán útiles para diagnósticos serológicos y vacunas. Además, los genes que codifican estas proteínas son específicos de las especies y serán útiles para el desarrollo de diagnósticos de base molecular.
Otros y adicionales aspectos, características, y ventajas de la presente invención resultarán obvios a partir de la descripción siguiente de las realizaciones actualmente preferidas de la invención. Estas realizaciones se presentan con fines descriptivos.
Breve descripción de los dibujos
A fin de que la materia en la cual las características, ventajas y objetos de la invención anteriormente mencionadas, así como otros que resultarán obvios, se alcancen y puedan entenderse con detalle, podrían haberse hecho descripciones más particulares de la invención brevemente resumidas anteriormente mediante referencia a ciertas realizaciones de las mismas las cuales se ilustran en los dibujos adjuntos. Estos dibujos forman una parte de la memoria descriptiva. No obstante, ha de señalarse que, los dibujos adjuntos ilustran realizaciones preferidas, de la invención y, por ello, no deben considerarse como limitativos en su alcance.
Las Figuras 1A y 1B muestran el alineamiento Lipman-Pearson de aminoácidos de los ortólogos de la proteína p156 de la E. chaffeensis (línea superior) y de la p153 de E. canis (línea inferior). En el centro, se muestran las identidades de aminoácidos, substituciones conservadas (:) y semi-conservadas (.).
Las Figuras 2A y 2B muestran la expresión de fragmentos de proteínas recombinantes procedentes de la p153 de E. canis (A) y E. chaffeensis (B) y la detección con anticuerpo anti-V5. p153 de E. canis, banda 1, fragmento N-terminal (1107-bp, nt-1-1107), banda 2, fragmento interno (910-bp, nt-1080-1990), banda 3, fragmento interno (1000-bp, nt-1950-2950), y banda 4, fragmento C-terminal (1280-bp, nt-2940-4220). p156 de E. chaffeensis, banda 1, fragmento N-terminal (1545-bp, nt-125-1675), banda 2, fragmento interno (1365-bp, nt-1685-3050), y banda 3, fragmento C-terminal (1365-bp, nt-2950-4315).
La Figura 3A muestra la inmunotransferencia de Western de fragmentos recombinantes de p153 de E. canis. Banda 1, fragmento N-terminal (1107-bp, nt-1-1107), banda 2, fragmento interno (910-bp, nt-1080-1990), banda 3, fragmento interno (1000-bp, nt-1950-2950), y banda 4, fragmento C-terminal (1280-bp, nt-2940-4220).
La Figura 3B muestra la detección de carbohidrato sobre fragmentos recombinantes purificados correspondientes de la p153 de E. canis expresada en E. coli usando el vector de expresión pRSET. Los glucanos unidos a las proteínas recombinantes se oxidaron, marcaron con biotina y detectaron con estreptavidina-fosfatasa alcalina.
\newpage
La Figura 4A muestra la transferencia de Western de fragmentos recombinantes de p153 de E. chaffeensis (bandas 1-3) con suero humano (panel izquierdo) y de perro (panel derecho). Banda 1, fragmento N-terminal de p156 de E. chaffeensis (1545-bp, nt-125-1675), banda 2, fragmento interno (1365-bp, nt-1685-3050), banda 3, y banda 3, fragmento C-terminal (1365-bp, nt-2950-4315). Las proteínas recombinantes expresadas representan \sim95% de la p156 de E. chaffeensis.
La Figura 4B muestra la detección de carbohidrato de las tres proteínas de p156 de E. chaffeensis recombinantes correspondientes. (Bandas 1-3).
La Figura 5 muestra la transferencia de Western que demuestra las proteínas en lisato de células enteras de E. canis con antisueros policlonales procedentes de un perro infectado con E. canis (banda 1) y suero de conejo policlonal de p43 (gp200) anti-recombinante (banda 2) y de gp140 anti-recombinante (banda 3).
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Descripción detallada de la invención
La secuencia del gen p43 de E. canis ha sido previamente informada como 1173-bp (patente de EE.UU. No. 6.355.777), pero análisis más detallados han revelado un error en la secuenciación del ADN, dando como resultado un codón de terminación artificial y una secuencia de gen truncada. Usando el procedimiento de caminar por el gen cebador-adaptador, se ha determinado una secuencia de 4,5-kbp adicional más debajo de la de 2,4-kbp en el clon de p43 original. Se completó la secuencia del gen p43 incompleta, lo cual reveló un marco de lectura abierto de 4263-bp, que codificaba una proteína con una masa molecular predicha de 153 kD (designada como p153). Más arriba del gen p153 existe un marco de lectura abierto que codifica una desoxiguanosino-trifosfato trifosfohidrolasa y una región de no codificación intergénica que precede al gen p153 que tiene alta homología de ácidos nucleicos (87% y 90%, respectivamente) entre E. canis y E. chaffeensis.
Una investigación BLASTn de la secuencia del genoma de E. chaffeensis con el clon p43 de 2,4-kbp identificó unas secuencias de ácidos nucleicos altamente homólogos. Se encontró un marco de lectura abierto grande (4389-bp) equivalente aproximadamente en tamaño al de p153 de E. canis en la misma localización cromosómica con respecto a la codificación del homólogo más arriba y secuencias de ácidos nucleicos intergénicas y que codifican una proteína con una masa molecular predicha de 156 kD (p156). Se observó homología de secuencias de ácidos nucleicos (\sim50%) entre los genes p153 de E. canis y p156 de E. chaffeensis; sin embargo, las proteínas mostraron una similitud de secuencias de aminoácidos total del 32% (Figura 1).
Se expresaron constructos de genes en E. coli que representan la proteína p156 de E. chaffeensis (nt-125-1670; nt-1685-3050; nt-2950-4315) y cuatro fragmentos recombinantes de p153 de E. canis (nt-1-1107 (p43); nt-1080-1990; nt-1950-2950; nt-2940-4220) en E. coli (Figura 2). Las proteínas expresadas recombinantes N-terminal (nt-1-1107) y C-terminal (nt-2940-4220) de E. canis mostraron fuerte inmunoreactividad (Figura 3A). Sin embargo, únicamente el fragmento N-terminal (nt-125-1670) de p156 de E. chaffeensis fue inmunoreactivo (Figura 4A).
Los fragmentos de proteínas recombinantes de p156 de E. canis (nt-1-1107 y nt-2940-4420) y de E. chaffeensis (nt-125-1607) migraron más largamente que lo predicho por la SDS-PAGE, lo que indica que se había producido la modificación post-traducción de estos fragmentos. Posteriormente, se detectó carbohidrato sobre los fragmentos de péptidos p153 de E. canis y p156 de E. chaffeensis (Figuras 3B y 4B).
El anticuerpo anti-p43 reaccionó con una proteína nativa de aproximadamente 200 kD en lisatos de células enteras de E. canis. Además, esta proteína de 200 kD fue igualmente reconocida por sueros procedentes de un perro infectado con E. canis (Figura 5). Una secuencia del gen parcial previamente identificada como p43 (porción N-terminal de la p153) se la asignó en el GenBank el número de registro AF252298. La p153 que codifica la secuenciación adjunta se la asignó en el GenBank el número de registro AY156950.
La localización cromosómica, la homología de aminoácidos, y las propiedades biofísicas confirman la conclusión de que las glucoproteínas p153 y p156 (designadas como gp200) son ortólogos inmunoreactivos específicos de las especies. Estas proteínas tienen usos potenciales en el desarrollo de vacunas y pueden usarse como antígenos para serodiagnósticos sensibles y fiables para la diagnosis de infecciones de Ehrlichia. Esto está confirmado por los hallazgos previos que han mostrado la inmunoreactividad y uso potencial de la p43 de E. canis como antígeno para serodignóstico (patente de EE.UU. No. 6.355.777). La reacción con anticuerpos contra p43 tenía una correlación del 100% con muestras que tienen un título de anticuerpo fluorescente indirecto (IFA) >40 y reaccionaron con varias muestras con títulos de anticuerpo fluorescente indirecto de <40. La débil reactividad de varias muestras negativas al anticuerpo fluorescente indirecto con los anticuerpos de p43 sugiere que la proteína p43 puede ser un antígeno para serodiagnóstico más sensible. Los resultados presentados en la presente invención indican que p43 es parte de una proteína p153 mayor en E. canis.
La presente invención está dirigida a polinucleótidos aislados que codifican la proteína p153 de superficie inmunoreactiva de Ehrlichia canis y la proteína p156 de E. chaffeensis. Preferiblemente, los polinucleótidos aislados codifican las proteínas con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID No:1 y 2. Como alternativa, el ADN puede diferir en la secuencia nucleótida debido a la degeneración del código genético.
La presente invención abarca igualmente vectores que comprenden estos polinucleótidos aislados y elementos reguladores necesarios para la expresión del ADN en una célula; proteínas p153 y p156 aisladas y purificadas; y anticuerpos dirigidos contra estas proteínas.
La presente invención está dirigida además al uso de las proteínas p153 y p156 en la preparación de vacunas contra la ehrliquiosis canina y humana. Además, se proporcionan procedimientos para la determinación de si un humano o un perro están infectados con una de las especies Ehrlichia mediante la determinación de si un suero procedente del perro reacciona con la proteína p153 o p156. Las proteínas usadas pueden provenir de fuentes recombinantes, y para detectar la reacción del suero a las proteínas puede usarse un análisis de transferencia de Western. Puesto que la reacción con la proteína p28 de E. canis previamente aislada es igualmente un marcador fiable de la infección por E. canis, la diagnosis puede consistir en la detección de inmunoreactividad a la proteína p153, a la gp140, y a los antígenos p28 de Ehrlichia canis.
La presente invención está dirigida igualmente a un kit de serodignóstico para la determinación de si un perro o humano está infectado con una de las especies de Ehrlichia. El kit comprende proteínas inmovilizadas (p153 o p156) que tienen la secuencia de aminoácidos de la SEC ID No:2 o que tienen la secuencia de aminoácidos de la SEC ID No:1,respectivamente, aquí descrita, tampones de dilución apropiada para suero de perro, segundo suero anti-perro de anticuerpo ligado a una molécula informadora, y reactivos apropiados para la detección de la molécula informadora. Los procedimientos posibles para la inmovilización de antígenos incluyen el enlace a membranas o placas de microvaloración. La molécula informadora puede ser luciferasa, peroxidasa de rábano picante, \beta-galactosidasa, o un marcador fluorescente.
De acuerdo con la presente invención, pueden usarse técnicas de biología molecular, microbiología, y de ADN recombinante convencionales dentro de los conocimientos de la técnica. Dichas técnicas están completamente descritas en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Maniatis, Fritsch & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, volúmenes I y II (D.N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis, (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; Transcription and Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, (1984).
Tal como se usa aquí, el término "huésped" se entiende que incluye no solamente procariotes sino igualmente eucariotes tal como levaduras, células de plantas y animales. Un gen o molécula de ADN recombinante que codifica una proteína de la presente invención puede usarse para transformar un huésped usando cualquiera de las técnicas comúnmente conocidas para los expertos normales en la técnica. Los huéspedes procarióticos pueden incluir E. coli, S. thymphimurium, Serratia marcescens y Bacillus subtilis. Los huéspedes eucarióticos incluyen levaduras tales como Pichia pastoris, células de mamíferos y células de insectos.
En general, se usan vectores de expresión que contienen secuencias promotoras que facilitan la eficaz transcripción del fragmento de ADN insertado conjuntamente con el huésped. Típicamente, el vector de expresión contiene un origen de replicación, promotor(es), terminador(es), así como genes específicos que son capaces de proporcionar la selección fenotípica en las células transformadas. Los huéspedes transformados pueden fermentarse y cultivarse de acuerdo con medios conocidos en la técnica para lograr el óptimo desarrollo de la célula. Pueden usarse los procedimientos que son bien conocidos para los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contengan las señales de control de transcripción y traducción apropiadas. Véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2nd ed.), (1989), Cold Spring Harbor Press, N.Y.
El término "cebador" tal como se usa aquí, se refiere a un oligonucleótido, tanto producido de manera natural como en un digesto de restricción purificado o producido sintéticamente, el cual es capaz de actuar como un punto de iniciación de síntesis cuando se coloca bajo condiciones en las cuales se induce la síntesis de un producto de extensión del cebador complementario a una hebra de ácido nucleico. Las condiciones incluyen la presencia de nucleótidos y un agente de inducción tal como un ADN polimerasa y una temperatura y pH adecuados. El cebador puede ser o bien monohebra o bien de doble hebra y debe ser lo suficientemente largo como para cebar la síntesis del producto de extensión deseado en la presencia del agente de inducción. La longitud exacta del cebador dependerá de muchos factores, incluyendo la temperatura, la fuente del cebador y el procedimiento usado. Por ejemplo, para aplicaciones de diagnósticos, el cebador oligonucleótido contiene, típicamente, 15-25 o más nucleótidos dependiendo de la complejidad de la secuencia diana. Igualmente, pueden usarse cebadores con menos nucleótidos.
Los presentes cebadores se seleccionan de manera que sean "substancialmente" complementarios a las diferentes hebras de una secuencia de ADN diana particular. Esto significa que los cebadores deben ser suficientemente complementarios como para hibridarse con sus hebras respectivas. De acuerdo con ello, la secuencia del cebador no necesita reflejar la secuencia exacta del molde. Por ejemplo, un fragmento de nucleótido no complementario puede unirse al extremo 5' del cebador, siendo el resto de la secuencia del cebador complementaria de la hebra. Como alternativa, pueden entremezclarse secuencias más largas o bases no complementarias dentro del cebador, siempre y cuando que la secuencia del cebador tenga suficiente complementariedad con la secuencia o se hibride con ella y, de esta manera, forme el molde para la síntesis del producto de extensión.
Los ejemplos siguientes se muestran con el fin de ilustrar las diversas realizaciones de la invención, no estando destinado de ninguna manera a limitar la presente invención.
Ejemplo 1
Caracterización de las proteínas p153 de E canis y p156 de E. chaffeensis
El gen de la proteína p43 de E. canis se identificó a partir de una biblioteca de expresión de Lambda Zap II tal como ha sido previamente descrito (MacBride y otros, 2001; patente de EE.UU. No. 6.355.777). El clon de 2,4-kb original estaba formado por un marco de lectura abierto (ORF) que codifica un gen desoxiguanosino-trifosfato trifosfohidrolasa y un espacio intergénico de 229-bp más abajo que precede al fragmento de gen p43 truncado. Se usó un procedimiento de PCR de cebador-adaptador para determinar la secuencia completa del marco de lectura abierto de p43 usando ADN genómico de E. canis (Jake, cepa North Carolina) como un molde. Los amplicones se secuenciaron directamente con cebadores usados para la amplificación o clonados dentro de TOPO/TA para análisis de secuencias. El ortólogo de E. chaffeensis (gen p156) se identificó mediante la realización de una investigación BLASTn de la secuencia del genoma de E. chaffeensis con el clon p43 de E. canis completo (2,4-kb).
Los genes p153 de E. canis y p156 de E. chaffeensis se dividieron en fragmentos grandes (1 a 1,5-kbp), se clonaron dentro del vector donante pUni/V5-His-TOPO Echo, y se recombinaron con los vectores de expresión de aceptores pBAD Thio-E o pREST Echo. Las proteínas recombinantes se expresaron durante 4 horas después de la inducción con arabinosa o IPTG. La detección de glucano sobre proteínas recombinantes expresadas se llevó a cabo usando un kit de inmunotransferencia para la detección de glucoproteína (Bio-Rad) siguiendo el protocolo de marcado de membrana. La proteína Dsb recombinante de E. chaffeensis descrita previamente (MacBride y otros, 2002) se expresó en E. coli y se usó como una proteína de control negativo ehrliquiano para estudios de detección de glucoproteínas. Los lisatos de células enteras de E. canis se separaron mediante electroforesis en gel usando geles de gradientes (Bis-Tris al 4-12%, Novagen).y se transfirieron sobre nitrocelulosa pura usando una unidad de transferencia semi-seca (Bio-Rad). La inmunotransferencia se llevó a cabo tal como se ha descrito previamente (McBride y otros, 2001).
Exposición
La fuerte inmunoreactividad del clon que contiene la porción N-terminal (p43) de la p153 de E. canis conduce a su identificación y caracterización inicial (MacBride y otros, 2001). Cuando se compararon con los resultados del ensayo de anticuerpo fluorescente indirecto para la detección de anticuerpos contra E. canis en perros, la p43 mostró excelente sensibilidad y especificidad. Además, la p43 pareció proporcionar detección específica de las especies, puesto que el anticuerpo monoclonal p43 anti-recombinante no reaccionó con células DH82 infectadas con E. chaffeensis. La identificación del ortólogo de p153 en E. chaffeensis (p156), el cual es genéticamente divergente y tiene un bajo grado de homología de aminoácidos, confirma los hallazgos previos de que la proteína p43 es un antígeno específico de las especies, y, por ello, sería un excelente antígeno de inmunodiagnóstico específico de las especies. Los epítopos de la célula B lineal principal están presentes en las regiones N- (p43) y C-terminal de la proteína p153.
La proteína recombinante p43 mostró una masa molecular mayor de la predicha (\sim30% o \sim10 kD) de la que inicialmente estaba sin reconocer. Las glucoproteínas ehrliquianas previamente informadas gp120 y gp140 fueron 60 a 100% mayores que lo esperado. Aunque el grado de desviación de masa molecular fue mucho más pequeño, la proteína p43 es una glucoproteína que fue confirmada mediante detección del carbohidrato de los glucanos unidos. De acuerdo con los hallazgos de p43, los fragmentos de gen recombinante p156 de E. chaffeensis expresado mostraron una masa molecular mayor de la esperada, y el carbohidrato se detectó sobre estos fragmentos. Adicionalmente, el fragmento C-terminal de la p153 de E. canis mostró igualmente una masa molecular mayor de la predicha (\sim10% o 6 kD).
Cuando se identificó el gen p43, una proteína de E. canis nativa correspondiente procedente de lisatos de células enteras no reaccionó con antisueros anti-p43. En base a los hallazgos aquí presentados, esta discrepancia puede ser atribuida al hecho que el gen p43 representa una marco de lectura abierto incompleto, y que no codifica una proteína de 43 kD. Además, la gran masa molecular de esta proteína (>150 kD) requiere especial atención a las condiciones de la electroforesis en gel con el fin de obtener la identificación compatible de esta proteína mediante inmunotransferencia. La proteína de 200 kD en lisatos de células enteras de E. canis fue fuertemente inmunoreactiva con el anticuerpo policlonal anti-p43. La masa molecular de esta proteína está de acuerdo con la masa predicha de la p153 acoplada con algunos glucanos que contribuyen al incremento de masa molecular. Este hallazgo está de acuerdo igualmente con la masa molecular de los fragmentos recombinantes de p156 de E. chaffeensis que representan casi el marco de lectura abierto entero.
Las glucoproteínas de la Ehrlichia spp son algunas de las primeras de dichas proteínas en ser caracterizadas en bacterias patógenas. Las glucoproteínas ehrliquianas descubiertas hasta la fecha son reconocidas de manera constante y firme por anticuerpos en pacientes y animales infectados. Estas proteínas inmunoreactivas de superficie expuesta únicas tienen valor potencial en el desarrollo de vacunas, y estas proteínas pueden ser componentes importantes de vacunas subunidad.
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Todas las patentes o publicaciones mencionadas en esta memoria descriptiva son indicativas de los niveles de los expertos en la técnica a la cual pertenece la invención. Estas patentes y publicaciones se incorporan aquí como referencia con la misma extensión que si cada publicación individual estuviera específica e individualmente indicada para ser incorporada como referencia.
Un experto en la técnica apreciará fácilmente que la presente invención está bien adaptada para llevar a cabo los objetos y obtener los fines y ventajas mencionadas, así como los inherentes a ellos. Los presentes ejemplos conjuntamente con los procedimientos, tratamientos, moléculas, y compuestos específicos aquí descritos son representativos actualmente de realizaciones preferidas, son ejemplos, y no están destinados a ser limitaciones del alcance de la invención. A los expertos en la técnica se les ocurrirán cambios en ellos y otros usos que estén abarcados dentro del espíritu de la invención tal como se define por el alcance de las reivindicaciones.
<110> Research Development Foundation
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<120> Antígenos P153 y P156 para la inmunodiagnosis de la ehrliquiosis canina y humana y usos de los mismos
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> D6481PCT
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\vskip0.400000\baselineskip
<141> 2003-11-04
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/423.573
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<151> 2002-11-04
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<160> 2
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<210> 1
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<211> 831
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<212> PRT
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<213> Ehrlichia chaffeensis 
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<220>
<223 < proteína de superficie inmunoreactiva p156
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<400> 1
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1
2
3 
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<210> 2
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<211> 831
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<212> PRT
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<213> Ehrlichia canis 
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<220>
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<223> proteína de superficie inmunoreactiva p153
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<400> 2
4
5
6

Claims (14)

1. ADN que codifica una proteína de superficie inmunoreactiva de Ehrlichia canis p153 o una proteína de superficie inmunoreactiva de Ehrlichia chaffeensis p156, en la que dicho ADN es ADN que codifica la proteína p153 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 y la proteína p156 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1, respectivamente.
2. Un vector que comprende el ADN de la reivindicación 1 y los elementos reguladores necesarios para la expresión del ADN en una célula.
3. Una célula huésped transfectada con el vector de la reivindicación 2.
4. La célula huésped de la reivindicación 3, en la que dicha célula es una célula bacteriana, una célula de mamífero, una célula de planta, o una célula de insecto.
5. Proteína de superficie inmunoreactiva de Ehrlichia canis p153 o proteína de superficie inmunoreactiva de Ehrlichia chaffeensis p156 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:2 y en la SEC ID NO:1, respectivamente.
6. Un anticuerpo dirigido contra la proteína p153 o la p156 de la reivindicación 5.
7. Una vacuna contra la ehrliquiosis canina, comprendiendo la vacuna la proteína p153 o la p156 de la reivindicación 5.
8. Uso de la proteína 153 de Ehrlichia canis que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 o la proteína 156 de Ehrlichia chaffeensis que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1, en la fabricación de un agente de diagnóstico para ensayar suero procedente de un perro para su reacción a las proteínas para la determinación de si dicho perro está infectado con una especie Ehrlichia.
9. Uso de la reivindicación 8, en el que dicha proteína es una proteína recombinante y/o en el que el ensayo de diagnóstico se lleva a cabo por medio de análisis de transferencia de Western.
10. Uso de la reivindicación 8, en el que el agente de diagnóstico se combina con un agente de diagnóstico adicional que comprende proteína p28 de Ehrlichia canis.
11. Kit que comprende:
a) al menos uno de los antígenos de Ehrlichia p153, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 y p156, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1, inmovilizados sobre un soporte;
b) un tampón para diluir el suero de perro;
c) un segundo suero anti-perro de anticuerpo ligado a una molécula informadora; y,
d) un reactivo para detectar dicha molécula informadora.
12. El kit de la reivindicación 11, en el que dicho soporte es una membrana o una placa de microvaloración y/o en el que dicha molécula informadora es luciferasa, peroxidasa de rábano picante, \beta-galactosidasa, o un marcador fluorescente.
13. Un procedimiento de determinación de si un perro ha sido infectado con una especie Ehrlichia, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
extracción del ADN procedente de la sangre previamente obtenida a partir de dicho perro;
realización de la amplificación mediante PCR sobre dicho ADN con cebadores de oligonucleótidos específicos para el gen p153 de Ehrlichia canis, que codifica una proteína p153 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2, o el gen p156 de Ehrlichia chaffeensis, que codifica una proteína p156 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1;
separación del producto de PCR resultante por tamaños; y
detección de un producto de amplificación por PCR de tamaño apropiado,
en el que la detección positiva de un producto de amplificación de tamaño apropiado indica infección con Ehrlichia canis o Ehrlichia chaffeensis.
14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicho producto de amplificación por PCR se detecta mediante electroforesis en gel.
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