CN107805666A - 一种利用等温核酸扩增技术检测鸟胞内分枝杆菌复合体的方法 - Google Patents

一种利用等温核酸扩增技术检测鸟胞内分枝杆菌复合体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用等温核酸扩增技术检测鸟胞内分枝杆菌复合体的方法，该检测方法包括重组酶介导等温核酸扩增体系、反应缓冲液和鸟胞内分枝杆菌复合体检测引物。该方法在等温条件下(35‑45oC)进行，10‑40分钟内，即可实现对鸟胞内分枝杆菌复合体特异基因的扩增。本发明所提供的检测方法灵敏度高、特异性好、操作简便、迅速，并且对检测材料质量要求低，该方法适用于鸟胞内分枝杆菌复合体的快速检测。

Description

一种利用等温核酸扩增技术检测鸟胞内分枝杆菌复合体的 方法
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种利用等温核酸扩增技术快速检测鸟胞内分枝杆菌复合体的方法。
背景技术
分枝杆菌属于裂殖菌纲、放线菌目、分枝杆菌科、分枝杆菌属。分枝杆菌种类繁多．达150种以上。分枝杆菌属分为结核分枝杆菌复合群[(mycobacteria tuberculosiscomplex，MTC)，包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌]、麻风分枝杆菌以及非结核分枝杆菌(nontuber culosis mycobacteria，NTM)。即，NTM是结核杆菌及麻风分枝杆菌以外的所有分枝杆菌。NTM可以是致病菌或条件致病菌，包含鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、偶发分枝杆菌、海分枝杆菌、龟分枝杆菌等10余种。
NTM广泛存在于自然界的土壤、尘埃、水、鱼类和家禽中，传播途径主要从环境中获得感染。NTM可侵犯人体肺部、淋巴结、皮肤和软组织，导致NTM病。NTM侵犯肺部则成为NTM肺病，多数由鸟胞内复合体分枝杆菌引起，其次是堪萨斯分枝杆菌。NTM肺病容易被误诊为肺结核病，且疗效较差，根治困难；另外，艾滋病的出现也加剧了NTM肺病的流行。NTM侵犯淋巴结则成为NTM淋巴结炎，主要致病菌有鸟胞内复合体分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌；以颈部淋巴结最常见，亦可累及耳部、腹股沟、腋下淋巴结；多为单侧无痛性淋巴结肿大，常有瘘管形成。NTM侵犯皮肤和软组织则成为NTM皮肤软组织病，主要致病菌有海分枝杆菌、偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、溃疡分枝杆菌。局部脓肿多由偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌引起。海分枝杆菌可引起游泳池肉芽肿和类孢子丝菌病。溃疡分枝杆菌可引起Bairnsdale溃疡。堪萨斯、苏加、嗜血分枝杆菌可引起皮肤散播性和多中心结节病灶。NTM病严重危害人类健康，且其疫情呈逐年上升趋势。
在NTM中，鸟胞内分枝杆菌复合体是一类重要的NTM，很多病例都是由鸟胞内分枝杆菌复合体引起，传统的鸟胞内分枝杆菌复合体分离鉴定法通常需要24～48 h才能报告结果，且影响因素多，不适合体检及大规模的诊断、筛查。
近年来，随着分子生物学技术的发展，常规PCR、多重PCR、Real-Time PCR、基因芯片技术以及等温核酸技术中的LAMP已经建立起来，并且在鸟胞内分枝杆菌复合体的检测中已得到较好的应用，大大缩短了检测的时间。PCR技术以其高度的特异性及灵敏性在鸟胞内分枝杆菌复合体检测方面取得了重大突破。但PCR技术对试验条件要求比较高，需要昂贵的仪器设备和专业人员，且操作相对复杂，更为重要的是检测成本高，往往只有专业检测实验室才能配备，在基层单位难以展开。LAMP技术解决了PCR技术需要昂贵的设备仪器等问题，具有操作简便、结果判断简单等优点。但LAMP技术对引物、靶基因的要求较高，且不能进行定量检测。
由于现存鸟胞内分枝杆菌复合体检测方法的不足以及鸟胞内分枝杆菌复合体快速实地检测的需求，研究一种能在基层应用、可简单快速检测鸟胞内分枝杆菌复合体的扩增方法非常有必要。
本发明中的等温核酸扩增技术不仅检测时间短、灵敏度高，并且摆脱了仪器的束缚，可以在非实验室环境下进行，达到现场检测的目的。此外，该方法操作方便，对人员要求不高。因此该方法具有很高的推广应用价值，不仅适合于科研工作，还可以作为设备条件相对较差的基层单位相关人员进行常规和应急检测的工具。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用等温核酸扩增技术检测鸟胞内分枝杆菌复合体的方法，该检测方法的主要步骤是先进行鸟胞内分枝杆菌复合体基因组的提取，然后将鸟胞内分枝杆菌复合体基因组DNA加入到含有特异引物和探针的等温核酸扩增体系中进行扩增，在等温条件(35-45oC)下，10-40分钟即可检测扩增产物。
本发明的具体技术方案如下：
1.获取鸟胞内分枝杆菌复合体基因组DNA，设计检测鸟胞内分枝杆菌复合体的引物和探针，建立鸟胞内分枝杆菌复合体等温核酸扩增体系，将鸟胞内分枝杆菌复合体基因组DNA加入到扩增体系中，再加入反应缓冲液，在等温条件(35-45oC)下，10-40分钟即可检测到扩增产物。
2.根据上述1所述的方法，建立鸟胞内分枝杆菌复合体等温核酸扩增体系，如下所示：
Tris缓冲液 0-60 mM
醋酸钾 50-150 mM
醋酸镁 5-30 mM
二硫苏糖醇 1-10 mM
聚乙二醇 1.5%-7.8%(w/v)
ATP 1-5 mM
dNTPs 0.1-0.4 mM
磷酸肌酸 20-100 μg/U
单链结合蛋白 500-1000 ng/μL
重组酶 50-400 ng/μL
UvsY蛋白 50-200 ng/μL
DNA聚合酶 30-150 ng/μL
正向引物 300-600 nM
反向引物 300-600 nM
3.根据上述1、2所述的等温核酸扩增体系，其状态为冷冻干燥后的粉末状。
4.根据上述1所述的利用等温核酸扩增技术快速检测鸟胞内分枝杆菌复合体的方法，其中所述的反应缓冲液为终浓度为4%-7%(w/v)的，分子量为20000的聚乙二醇水溶液。
5.根据上述1、2所述的引物组，其引物序列为：
正向引物：5’-TGCRCAACAGCAAATGATTGCCAGACACACTAT-3’
反向引物：5’-ATGCGCCCTTAAACACTTACTTACACACA-3’
6.根据上述1、2所述的方法，其特征在于，在体系中加入核酸外切酶和探针，可实现实时检测。
7.根据上述6所述的方法，加入的核酸外切酶为核酸外切酶III。
8.根据上述6所述的探针，其探针序列为：
5’-TGAGACAACACTCGGTCVRTCCGTGTGGAGTCCCTCCATCTTGGTGGT-3’，其中，所使用的荧光探针为荧光/猝灭基团修饰的探针。
9.根据上述1、2所述的方法，扩增的最佳等温条件为37oC，最佳时间为40分钟。
10.根据上述6所述的检测鸟胞内分枝杆菌复合体的方法，扩增的最佳等温条件为39oC，最佳时间为20分钟。
11.根据上述1-10所述的方法，等温核酸扩增体系体积可以是25 μL、50 μL、100 μL中的任一个体积或其它体积，最佳体积为50 μL。
附图说明
图1为使用本发明的等温核酸扩增技术快速检测鸟胞内分枝杆菌复合体的实时荧光结果图。
具体实施方式
下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例一：
1、样品来源及鸟胞内分枝杆菌复合体DNA提取
样品系由浙江国际旅行卫生保健中心提供的鸟胞内分枝杆菌复合体标准菌株，DNA提取设备为KINGFISHER全自动核酸提取仪(Thermo)。
2、引物探针设计
设计以下鸟胞内分枝杆菌复合体引物，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成：
正向引物：5’-TGCRCAACAGCAAATGATTGCCAGACACACTAT-3’
反向引物：5’-ATGCGCCCTTAAACACTTACTTACACACA-3’
探针序列：
5’-TGAGACAACACTCGGTCVRTCCGTGTGGAGTCCCTCCATCTTGGTGGT-3’，其中，所使用的荧光探针为FAM荧光/猝灭基团修饰的探针。
3、配制扩增体系
在200 μL离心管中按以下的配比进行等温核酸扩增体系配制(体积为50 μL)：
Tris缓冲液 45 mM
醋酸钾 80 mM
醋酸镁 14mM
二硫苏糖醇 4mM
聚乙二醇 2.5%(w/v)
ATP 5 mM
dNTPs 0.24 mM
磷酸肌酸 30μg/U
单链结合蛋白 500 ng/μL
重组酶 400 ng/μL
UvsY蛋白 70 ng/μL
DNA聚合酶 90 ng/μL
核酸外切酶III 85 ng/μL
荧光探针 120 nM
正向引物 300nM
反向引物 300nM
将以上配制好的扩增体系在冷冻干燥机中负压冷冻干燥成为粉未状扩增体系。
4、鸟胞内分枝杆菌复合体DNA检测
放入到可检测FAM荧光的仪器中，在39℃反应20分钟。(注：为确保实验准确性，设置不加模板的体系作为阴性对照)。结果显示，在6分钟之后开始显示扩增的荧光信号。如附图1所示。重复以上实施例，能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。
以上实施例说明使用本发明的利用等温核酸扩增技术能够快速检测鸟胞内分枝杆菌复合体，操作简便，所用时间大大缩减，不需要大型仪器设备，适用于大规模的筛选。本发明所提供的检测方法灵敏度高、特异性好、操作简便、迅速，并且对检测材料质量要求低，便于临床上的应用，该方法适用于对鸟胞内分枝杆菌复合体的快速检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施范例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江苏奇天基因生物科技有限公司
<120> 一种利用等温核酸扩增技术检测鸟胞内分枝杆菌复合体的方法
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgcrcaacag caaatgattg ccagacacac tat 33
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgcgccctt aaacacttac ttacacaca 29
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgagacaaca ctcggtcvrt ccgtgtggag tccctccatc ttggtggt 48

Claims (11)

1.一种利用等温核酸扩增技术检测鸟胞内分枝杆菌复合体的方法，该检测方法包括等温核酸扩增体系，引物组和反应缓冲液，扩增在等温条件35-45oC下进行，10-40分钟内即可检出鸟胞内分枝杆菌复合体。
2.根据权利要求1所述的检测鸟胞内分枝杆菌复合体的方法，其特征在于，所述等温核酸扩增体系及各组分含量为以下所示。
3.根据权利要求1、2所述的检测鸟胞内分枝杆菌复合体的方法，其特征在于，所述的体系状态为冷冻干燥后的粉末状。
4.根据权利要求1所述的检测鸟胞内分枝杆菌复合体的方法，其特征在于，所述的反应缓冲液为终浓度为4%-7%(w/v)的，分子量为20000的聚乙二醇水溶液。
5.根据权利要求1、2所述的引物组，其特征在于，所述的引物序列为：
正向引物：5’-TGCRCAACAGCAAATGATTGCCAGACACACTAT-3’
反向引物：5’-ATGCGCCCTTAAACACTTACTTACACACA-3’。
6.根据权利要求1、2所述的检测鸟胞内分枝杆菌复合体的方法，其特征在于，在体系中加入核酸外切酶和探针，可实现实时检测。
7.根据权利要求6所述的核酸外切酶，其特征在于，核酸外切酶为核酸外切酶III。
8.根据权利要求6所述的探针，其特征在于，所述的探针序列为：
5’- TGAGACAACACTCGGTCVRTCCGTGTGGAGTCCCTCCATCTTGGTGGT-3’，其中，所使用的荧光探针为荧光/猝灭基团修饰的探针。
9.根据权利要求1所述的检测鸟胞内分枝杆菌复合体的方法，其特征在于，扩增的最佳等温条件为37oC，最佳时间为40分钟。
10.根据权利要求6所述的检测鸟胞内分枝杆菌复合体的方法，其特征在于，扩增的最佳等温条件为39oC，最佳时间为20分钟。
11.根据权利要求1-10所述的检测鸟胞内分枝杆菌复合体的方法，其特征在于，可用反应缓冲液将体系重新溶解，体系体积可以是25 μL、50 μL、100 μL中的任一个体积或其它体积，最佳体积为50 μL。
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