JP6623324B2 - 等温増幅反応産物の多項目同時検出方法 - Google Patents

等温増幅反応産物の多項目同時検出方法 Download PDF

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Description

本発明は等温増幅反応産物の多項目同時検出方法に関するものである。より詳細には、同一反応液中に存在する複数の等温増幅反応産物を同時に検出する方法に関するものである。
ＬＡＭＰ(Ｌｏｏｐ-Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ)法は、等温反応で目的遺伝子を増幅させる方法である（特許文献１、特許文献２）。昨今、遺伝子の増幅にはＰＣＲ法が利用されてきたが、ＰＣＲ法は反応に時間がかかるとともに、高価な機器等を必要としていた。これに対し、ＬＡＭＰ法は短時間に一定の温度で増幅が可能であり、高価な機器等を必要としない。また、ＰＣＲ法と比較して、ＬＡＭＰ法は非常に検出感度が高いため、微量サンプルを検出することも可能である。ＰＣＲ法は１つの検出対象につき２種類のプライマーで増幅反応をおこなう。これに対しＬＡＭＰ法は検出感度や精度を向上させるため、１つの検出対象に対し４-６種類のプライマーを使用する。ＬＡＭＰ法による増幅反応は１つの検出対象に必要とするプライマー数が多いため、同一反応液中に多数検出対象を含む結果、さらに多数のプライマーを含むこととなる多項目同時検出には向かないと考えられてきた。
従来、ＬＡＭＰ法による増幅産物の検出方法には、濁度検出法及びインターカレーター法を用いるのが一般的である。
濁度検出法は、核酸増幅反応の副産物であるピロリン酸をマグネシウムにて析出した白濁を、透過光の強弱によって濁度として検出する方法である。
インターカレーター法は、核酸増幅反応液中にＳＹＢＲ（登録商標） ＧｒｅｅｎＩ等のＤＮＡインターカレーターを共存させておくことで、ＤＮＡ増幅反応を蛍光強度の増加として検出する方法である。これらの方法は、１つの検出対象を検出するものであり、多項目を同時検出するものではない。
非特許文献１には、ＲＴ-ＬＡＭＰ法による複数の増幅産物を異なる抗原で修飾し、各抗原に対する抗体を固相に固定したクロマト紙上で展開して分離するイムノクロマト法で検出したことが記載されている。しかしながら、イムノクロマト法による検出は、別途標識物質に対する抗体を用意する必要があって、操作が煩雑であり、より簡便な方法が望まれている。
クロマトＰＡＳ（ＰＡＳ:Ｐｒｉｎｔｅｄ Ａｒｒａｙ-Ｓｔｒｉｐ）法は、１つの標的遺伝子に対して１種のタグ配列で標識したプライマーと、標識物質結合物質で標識したプライマーを用いてＰＣＲ法などで増幅反応を行い、検出対象にタグ配列を付加すると共に検出対象を増幅した後、反応産物に色素等の標識物質と展開液を添加した後に、タグ配列と相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡ（以下検出プローブという）を固定化（ＰＡＳ）したクロマト紙上で展開することで、固定化しておいた各タグ配列の相補鎖を有する検出プローブと各タグ配列において一本鎖ＤＮＡ同士のハイブリ反応（ＳＴＨ:Ｓｉｎｇｌｅ Ｔａｇ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）がおこり、検出対象を標識物質により例えば可視化されたバンドとして検出することが可能な方法である（特許文献３）。クロマトＰＡＳ法は、ＰＣＲ法において各検出対象別に異なるタグでプライマーを標識することにより、多検体同時検出に応用することが可能である。
しかしながら、上述のようにＬＡＭＰ法はＰＣＲ法と比較して１つの検出対象に必要とするプライマー数が多いため、複数の対象を検出する為に、各検出対象別に異なるタグ配列をプライマーに結合させ、さらに検出対象ごとに、タグ配列を結合させたプライマーとは別のプライマーに、検出の為の標識物質結合物質を結合させた場合に、それらのプライマーによって増幅反応が進まなくなる、または増幅反応の最適化が難しくなることが予測され、適用することは出来ないと考えられていた。
また従来、核酸増幅法において、例えばＰＣＲ法サイクル数が５０を越えると理論的には１コピーの鋳型ＤＮＡからでも検出可能なレベルのＤＮＡを増幅できることから、試薬や試料へのＤＮＡのコンタミネーション防止策をとる必要があるという基本的問題が存在する。特に、臨床検査室などでＤＮＡ診断のためにＰＣＲを繰り返し行うような場合、ＰＣＲ増幅産物によるコンタミネーション（キャリーオーバー）が大きな問題となる。ＬＡＭＰ法はＰＣＲ法と比較してさらに高感度であるため、コンタミネーションのリスクを低減させたいという要請が強い。
ＰＣＲ法についてはウラシルＮグリコシダーゼを用いたＤＮＡのキャリーオーバーの防止法が提案されている（非特許文献２）。しかしながら同様の防止法がＬＡＭＰ法とクロマトＰＡＳ法との組合せにおいても有効かどうか検討された例はない。
特許第３３１３３５８号 特開２００２-３４５４９９ 特許第５５０３０２１号
Jung JH, Oh SJ, Kim YT, Kim SY, Kim WJ, Jung J, Seo TS. Combination of multiplex reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification with an immunochromatographic strip for subtyping influenza A virus. Anal Chim Acta. 853:541-7, 2015 PMID:25467501. Longo, M. C.、Berninger, M. S. and Hartley, J. L. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene. 1990 Sep 1;93(1):125-8.
本発明は、従来難しいとされてきたＬＡＭＰ法による多項目同時検出について、クロマトＰＡＳを利用することにより、迅速・簡便にかつ多項目同時に検出する方法を提供することを課題とする。また、従来のＰＣＲとＤＮＡクロマトを組合せたＳＴＨクロマトＰＡＳ法と比較して、微量サンプルに関しても高感度に多項目を同時に検出することが出来る方法を提供することを課題とする。
本発明者等は、従来の予測に反してＬＡＭＰ法に使用する特定のプライマーに標識をすれば、プライマーの標識がＬＡＭＰ法の増幅反応に影響を与えないことを見いだした。またＬＡＭＰ法とクロマトＰＡＳ法を組み合わせてＬＡＭＰ法による多項目同時検出を行うことが出来ることを見いだし、本発明を完成するに至った。
さらに、本発明者等は、高感度な検出方法であるＬＡＭＰ法において、増幅反応を繰り返す際に、前の増幅反応の反応産物によるコンタミネーション（キャリーオーバーによるコンタミネーション）を防ぐ為にウラシルＮグリコシラーゼ（ＵＮＧ）を利用したコンタミネーション防止工程が有効であることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下の通りである。
［１］同一検体内に１又は２以上含まれる標的核酸配列の検出方法であって、
下記（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）標的核酸配列ごとに第１プライマー及び第２プライマーのセットを準備する工程であって、
前記第１プライマーにはタグ配列が結合しており、標的核酸配列が２以上含まれる場合は、前記タグ配列は、標的核酸配列ごとに異なり、
前記第２プライマーには標識物質結合物質が結合している前記工程、
（ｂ）１又は２以上の第１プライマー及び第２プライマーのセットを用いて同一反応液中でＬＡＭＰ法により核酸等温増幅を行う工程、
（ｃ）前記核酸等温増幅産物を含有する増幅反応液と前記標識物質結合物質に結合する標識物質を含む展開媒体を準備して固相担体上で核酸クロマトグラフィーを行い、
前記固相担体上に固定された１以上の検出用プローブと、前記核酸等温増幅産物とを、ハイブリダイズさせる工程と前記核酸等温増幅産物に標識物質を標識する工程を含む工程及び、
（ｄ）前記工程（ｃ）で生成したハイブリダイズ産物を前記標識物質により検出する検出工程を含み、
前記標的核酸配列の３’末端から５’末端方向に配置する任意配列Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、ＬＦ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、ＬＢｃ、Ｂ２及びＢ３について
前記第１及び第２プライマーが下記（ｉ）〜（ｉｖ）：
（ｉ）Ｆ２ｃと相補的な配列Ｆ２及びＦ２の５’側にＦ１ｃと同じ配列を含むＦＩＰプライマー、
（ｉｉ）Ｂ２と同じ配列及びＢ２の５’側にＢ１と相補的な配列Ｂ１ｃを含むＢＩＰプライマー、
（ｉｉｉ）ＬＦ領域と同じ配列をもつＬＦプライマー及び
（ｉｖ）ＬＢｃ領域と相補的な配列をもつＬＢプライマー
からなる群より任意に選択される方法。
［２］第１プライマー及び第２プライマーのセットが、第１プライマーがＦＩＰプライマー且つ第２プライマーがＢＩＰプライマーまたは第１プライマーがＢＩＰプライマー且つ第２プライマーがＦＩＰプライマーである、前記［１］に記載の方法。
［３］各標的核酸配列の第１プライマー及び第２プライマーのセットが、第１プライマーがＦＩＰプライマー且つ第２プライマーがＢＩＰプライマーまたは第１プライマーがＢＩＰプライマー且つ第２プライマーがＦＩＰプライマーであって、前記核酸等温増幅工程において各標的核酸配列の第１プライマー及び第２プライマーのセット以外のプライマーを使用しない前記［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記標識物質結合物質は、抗原抗体反応における抗体並びにビオチン、ジゴキシゲニン及びＦＩＴＣを含むハプテンからなる群から選択される１種又は２種以上であり、
前記標識物質は、前記標識物質結合物質と結合可能な部位を備えて、蛍光、放射能、酵素、燐光、化学発光及び着色からなる群から選択される１種又は２種以上を利用する標識物質である、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］核酸等温増幅工程をｄＵＴＰの存在下で行い、核酸等温増幅工程の前にウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）処理を行う、前記［１］〜［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］前記［１］〜［５］のいずれか１項に記載の検出方法を実施する為に用いられ、少なくとも第１プライマー及び第２プライマーのセットを含むことを特徴とする測定試薬又は試薬キット。
［７］さらに、固相担体上に固定された１以上の検出用プローブを含むことを特徴とする前記［６］に記載の測定試薬又は試薬キット。
従来難しいとされてきたＬＡＭＰ法による多項目同時検出を簡便な方法で実現することが出来る。また、従来のＰＣＲ法とＤＮＡクロマトを組合せたＳＴＨクロマトＰＡＳ法と比較してより高感度な多項目同時検出方法を提供することが出来る。さらにＬＡＭＰ法による多項目同時検出方法において、キャリーオーバーによるコンタミネーションを防止することが出来る。
ＬＡＭＰ法において使用するプライマー設計の為の標的核酸配列上の領域設定を図示したものである。 ＬＡＭＰ法において使用するプライマーを図示したものである。 ＬＡＭＰ法による増幅産物のクロマト展開結果を示したものである。 検出プライマーの特異性について検討した結果を示したものである。 標識プライマーの組み合わせについて検討した結果を示したものである。 ＳＡＬとＳＴＡの検出感度の検討結果を示したものである。 ＳＡＬとＳＴＡのマルチプレックスによる検出感度の検討結果を示したものである。 標識の位置についての検討結果を示したものである。 ｄＵＴＰ添加によるＬＡＭＰ反応への影響を示したものである。 ＵＮＧ処理を行った際のキャリーオーバー軽減効果を示したものである。 ＵＮＧ処理によるＬＡＭＰ反応産物のクロマト展開結果を示したものである。 インナープライマーのみ、ループプライマーのみ又はアウタープライマーのみを使用した場合のＬＡＭＰ反応への影響を示したものである。
本発明の方法は
同一検体内に１又は２以上含まれる標的核酸配列の検出方法であって、
下記（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）標的核酸配列ごとに第１プライマー及び第２プライマーのセットを準備する工程であって、
前記第１プライマーにはタグ配列が結合しており、標的核酸配列が２以上含まれる場合は、前記タグ配列は、標的核酸配列ごとに異なり、
前記第２プライマーには標識物質結合物質が結合している前記工程、
（ｂ）１又は２以上の第１プライマー及び第２プライマーのセットを用いて同一反応液中でＬＡＭＰ法により核酸等温増幅を行う工程、
（ｃ）前記核酸等温増幅産物を含有する増幅反応液と前記標識物質結合物質に結合する標識物質を含む展開媒体を準備して固相担体上で核酸クロマトグラフィーを行い、
前記固相担体上に固定された１以上の検出用プローブと、前記核酸等温増幅産物とを、ハイブリダイズさせる工程と前記核酸等温増幅産物に標識物質を標識する工程を含む工程及び、
（ｄ）前記工程（ｃ）で生成したハイブリダイズ産物を前記標識物質により検出する検出工程を含み、
前記標的核酸配列の３’末端から５’末端方向に配置する任意配列Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、ＬＦ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、ＬＢｃ、Ｂ２及びＢ３について
前記第１及び第２プライマーが下記（ｉ）〜（ｉｖ）：
（ｉ）Ｆ２ｃと相補的な配列Ｆ２及びＦ２の５’側にＦ１ｃと同じ配列を含むＦＩＰプライマー、
（ｉｉ）Ｂ２と同じ配列及びＢ２の５’側にＢ１と相補的な配列Ｂ１ｃを含むＢＩＰプライマー、
（ｉｉｉ）ＬＦ領域と同じ配列をもつＬＦプライマー及び
（ｉｖ）ＬＢｃ領域と相補的な配列をもつＬＢプライマー
からなる群より任意に選択される方法である。
本明細書において「検体」とは、標的核酸を含む可能性のある検体をいう。検体の採取源は特に限定されず、例えば植物や動物など各種生体由来の検体をいう。こうした各種の検体からの核酸を含む画分は当業者であれば適宜従来技術を参照して取得することができる。
本明細書において「核酸」とは、ヌクレオチドの重合体を意味しており、その重合数は特に限定されない。
また、本明細書において「標的核酸」とは、その存在及び／又は量を検出する対象とする任意の核酸である。
（核酸等温増幅工程）
本発明の方法において核酸増幅はＬＡＭＰ法を用いた核酸等温増幅によって行う。ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ-Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法では、４から６種類のオリゴヌクレオチドプライマー、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、核酸モノマー等の試薬と標的核酸配列を含む鋳型核酸鎖を混合し、一定温度（６５℃付近）で保温することによって核酸増幅反応を行う方法である。
ＬＡＭＰ法プライマーの設計は 標的核酸配列の ３’末端から５’末端方向に任意の配列Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２及びＢ３という６つの領域を設定し、それらを利用して実施する。基本的なＬＡＭＰ法ではインナープライマー２種類とアウタープライマー２種類の計４種類のプライマーを使う。インナープライマーは、Ｆ２ｃと相補的な配列Ｆ２及びＦ２の５’側にＦ１ｃと同じ配列を含むＦＩＰプライマーとＢ２と同じ配列及びＢ２の５’側にＢ１と相補的な配列Ｂ１ｃを含むＢＩＰプライマーであり、アウタープライマー はＦ３ｃと相補的な配列を含むＦ３プライマーとＢ３と同じ配列を含むＢ３プライマーである。
さらに増幅効率を向上させる為に前記４種類のプライマーに加えて２種類のプライマー、すなわちループプライマー２種類を使用し、計６種類のプライマーを用いて増幅反応を行っても良い。この場合、標的核酸配列のＦ２ｃとＦ１ｃの間の任意の配列ＬＦおよびＢ1とＢ２の間の任意の配列ＬＢｃを設定する。ループプライマーは、ＬＦと同じ配列ＬＦを含むＬＦプライマーと、ＬＢｃに対する相補的な配列ＬＢを含むＬＢプライマーである（図１および図２参照）。
本発明の方法においては、以下に述べる第１プライマーおよび第２プライマーを用いる以外は通常のＬＡＭＰ法と同様に核酸増幅反応を行うことが出来る。プライマーの設計やＬＡＭＰ法による増幅の増幅機構などについては、例えば、特許第３３１３３５８号や特開２００２-３４５４９９号公報に記載されている。
本発明の方法において、タグ配列を結合させた第１プライマーを用いる。標的核酸配列が２以上含まれる場合は、前記タグ配列は、標的核酸配列ごとに異なる。
タグ配列は、増幅産物が、後述する検出用プローブとハイブリダイゼーションを可能とするための一本鎖核酸配列であり、標的核酸配列を検出するものであるため、標的核酸ごとに異なる検出用プローブの検出用配列にハイブリダイズ可能に設定される。典型的には、検出用プローブの検出用配列に相補的な塩基配列を有する。タグ配列の塩基長は、好ましくは検出用プローブの検出用配列の塩基長に一致し、好ましくは、２０塩基以上５０塩基以下であり、より好ましくは、２０塩基以上２５塩基以下である。
また本発明において、標識物質結合物質が結合された第２プライマーを用いる。ここで標識物質結合物質とは標識物質と結合可能な物質であり、詳しくは後述する。
本明細書において「標識物質」とは、検出しようとする物質あるいは分子を他と識別することを可能とする物質である。標識物質は、特に限定しないが、典型的には、蛍光、放射能、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、燐光、化学発光、着色などを利用した標識物質が挙げられる。
標識物質は、検出を迅速かつ簡易に行う観点から、目視で検出可能な発光又は発色を提示する発光物質又は発色物質であることが好ましい。こうした物質としては、典型的には、各種の顔料や染料などの各種の着色剤が挙げられる。また、これに準ずる、金、銀などの貴金属ほか、銅などの各種金属又は合金、あるいは当該金属を含む有機化合物（錯体化合物であってもよい）が挙げられる。また、着色剤に準ずる、マイカ等の無機化合物が挙げられる。
この種の標識物質としては、典型的には、各種染料、各種顔料、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム化合物、オレフィン、エノールエーテル、エナミン、アリールビニルエーテル、ジオキセン、アリールイミダゾール、ルシゲニン、ルシフェリン及びエクリオンを包含する化学発光物質が挙げられる。また、こうした標識物質でラベルされているラテックス粒子などの粒子も挙げられる。さらに、金コロイド若しくはゾル又は銀コロイド若しくはゾルを包含するコロイド若しくはゾル等が挙げられる。さらにまた、金属粒子、無機粒子等が挙げられる。
標識物質結合物質としては、例えばタンパク質−タンパク質相互作用、低分子化合物−タンパク質相互作用等を利用して標識物質と結合できるものを選択することが出来る。例えば、抗原抗体反応における抗体や、アビジン（ストレプトアビジン）−ビオチンシステムにおけるビオチン、抗ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）システムにおけるジゴキシゲニン、又は抗ＦＩＴＣ−ＦＩＴＣシステムにおけるＦＩＴＣ等に代表されるハプテン類などが挙げられる。この場合、最終的に検出のために用いられる標識物質は、標識物質結合物質と相互作用する他方の分子又は物質（例えば、抗原、すなわち、ストレプトアビジン、抗ＦＩＴＣなど）を、標識物質結合物質との結合のための部位として備えるように修飾される。増幅産物が標識物質結合物質を備える場合には、ハイブリダイゼーション工程において、あるいはこの工程に先立って、あるいはこの工程後に、増幅産物の標識物質結合物質と、標識物質結合物質と結合する部位を備える標識物質との複合体を形成させて、標識物質により増幅産物を検出する。
第１プライマー及び第２プライマーは、標的核酸配列の３’末端から５’末端方向に配置する任意配列Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、ＬＦ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、ＬＢｃ、Ｂ２及びＢ３について、（ｉ）Ｆ２ｃと相補的な配列Ｆ２及びＦ２の５’側にＦ１ｃと同じ配列を含むＦＩＰプライマー、（ｉｉ）Ｂ２と同じ配列及びＢ２の５’側にＢ１と相補的な配列Ｂ１ｃを含むＢＩＰプライマー、（ｉｉｉ）ＬＦ領域と同じ配列をもつＬＦプライマー及び（ｉｖ）ＬＢｃ領域と相補的な配列をもつＬＢプライマーからなる群から任意に選択される。
すなわち第１プライマー及び第２プライマーはインナープライマー ２種類（ＦＩＰ、ＢＩＰ）とループプライマー ２種類（ＬＦ、ＬＢ）から任意に選択される。第１プライマー及び第２プライマーの種類の組み合わせは特に限定されない。
なお、本発明の方法は各標的核酸配列の第１プライマー及び第２プライマーのセットが、第１プライマーがＦＩＰプライマー且つ第２プライマーがＢＩＰプライマーまたは第１プライマーがＢＩＰプライマー且つ第２プライマーがＦＩＰプライマーの場合、核酸等温増幅工程において各標的核酸配列の第１プライマー及び第２プライマーのセット以外のプライマーを使用せずに行うことができる。
第１プライマーにおけるタグ配列の結合位置、第２プライマーにおける標識物質結合物質の結合位置はいずれもプライマーの５’末端、プライマーの３’末端、プライマーの配列内部のいずれであっても良い。
（核酸クロマトグラフィー）
本明細書において、核酸クロマトグラフィーとは、キャピラリー現象により液体（展開媒体）を拡散・移動可能な多孔質状の固相担体を用いて、前記液体により核酸を固相担体内を移動させて固相担体に固定化されている検出用プローブとの特異的な塩基対合によってハイブリダイズ産物を形成させて前記核酸を固相担体に補足するクロマトグラフィーをいう。
検出用プローブは、一本鎖の核酸配列であり、検出用配列の長さは、特に限定しないが、２０塩基以上５０塩基以下であることが好ましい。この範囲であれば、各検出用配列の特異性を確保しつつハイブリダイゼーション効率も確保できる。例えば、こうした検出用配列の設計方法や例は、特許５５０３０２１号公報に開示されている。
なお、第１プライマーに結合しているタグ配列は、検出用プローブ配列と対合する塩基配列であるため、タグ配列の塩基長は、検出用配列と同様、２０塩基以上５０塩基以下であることが好ましく、より好ましくは、２０塩基以上２５塩基以下である。
検出用プローブは、固相担体に固定化されている。例えば、固相担体はプラスチックであってもよいし、ガラスであってもよく、材質は特に限定されない。また、セルロース、ニトロセルロース、ナイロン等の多孔質体であってもよい。この種の多孔質担体は、特に、アフィニティークロマトグラフィーにより、固相担体に固定化した検出用プローブと増幅断片とをハイブリダイゼーションさせるのに好適である。
検出用プローブを固定化した固相担体は商業的に入手することも可能であり、例えばクロマトＰＡＳ(Ｆ４)（株式会社ＴＢＡ社製）、クロマトＰＡＳ(Ｆ８)（株式会社ＴＢＡ社製）等が挙げられる。
（ハイブリダイゼーション工程）
ハイブリダイゼーション工程は、核酸等温増幅産物を含有する増幅反応液と前記標識物質結合物質に結合する標識物質を含む展開媒体を準備して核酸クロマトグラフィーを行い、固相担体上に固定された１以上の検出用プローブと、前記核酸等温増幅産物とを、ハイブリダイズさせる工程である。さらに展開媒体に標識物質が含まれることで、核酸クロマトグラフィーの工程中に核酸等温増幅産物には標識物質が標識される。
展開媒体は、クロマトグラフィー本体の固相担体をキャピラリー現象により拡散移動する液体であり、固相担体上で増副産物を移動させるための媒体である。展開媒体は、水性媒体である。水性媒体は、特に限定しないが、例えば、水、水と相溶する有機溶媒、又は水と１種又は２種以上の前記有機溶媒の混液が挙げられる。水と相溶する有機溶媒は、当業者において周知であるが、例えば、炭素数１〜４程度の低級アルコール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類、アセトン等が挙げられる。展開媒体は、好ましくは水を主体とする。
展開媒体は、そのｐＨを一定範囲にするための成分を含むことができる。緩衝塩は、意図するｐＨにもよるが通常は、６．０以上８．０以下の範囲である。より好ましくは、７．０以上８．０以下である。こうしたｐＨを得るための成分は、例えば、酢酸と酢酸ナトリウム（酢酸緩衝液）、クエン酸とクエン酸ナトリウム（クエン酸緩衝液）、リン酸とリン酸ナトリウム（リン酸緩衝液）等である。さらに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等が挙げられる。なお、展開媒体として、増幅反応液をそのまま採用してもよい。また、増幅反応液に対して、界面活性剤や適当な塩等の追加の成分や溶媒を加えたりすることで、組成や濃度の調整をして展開媒体として使用してもよい。
検出工程は、最終的なハイブリダイズ産物を、標識物質に基づいて検出する工程である。より具体的には、検出用プローブが固定化された領域の着色及び位置を確認する工程である。標識物質によるシグナルを検出するには、標識物質の種類に応じて適宜選択される。特異的結合反応や酵素による発色反応が必要な場合には、適宜そうした操作が行われる。
（コンタミネーション防止）
本発明の方法は、核酸等温増幅工程（ＬＡＭＰ反応）をｄＵＴＰの存在下で行い、核酸等温増幅工程（ＬＡＭＰ反応）の前にウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）処理を行うことで、先行する核酸等温増幅工程からの「キャリーオーバー」コンタミネーションを防ぐことができる。
本方法は、増幅された核酸を容易に分解させるように修飾することによってコンタミネーションを防ぐ方法である。
まず、潜在的なキャリーオーバー汚染源である、先行するＬＡＭＰ反応の増幅産物である単位複製配列がウラシルを含有するように、先行するＬＡＭＰ反応工程においてヌクレオチドとしてｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを用いて増幅反応を行う。先行するＬＡＭＰ反応はｄＵＴＰの存在下で行い、反応においてｄＴＴＰの一部分または全てをｄＵＴＰに置換させる。
後続するＬＡＭＰ反応においてもｄＵＴＰを用いて増幅反応を行い、反応液にウラシル−Ｎ−ＤＮＡグリコシラーゼを添加する。増幅反応（例えば６５℃、３０分）の前にＵＮＧが活性である温度範囲内でインキュベートされる（例えば室温、５分）。先行する反応からのウラシル含有汚染物質が存在する場合、ＵＮＧはウラシルを開裂させ脱塩基部位を残す。脱塩基部位をもつＤＮＡは、高いｐＨ条件下では高温で不安定であることが知られており、増幅反応が開始した時点で、このようなＤＮＡは分解される。ＵＮＧ酵素は増幅反応を行う温度で不活性化され、ウラシルを含有する新しいＤＮＡ単位複製配列を生成させる。これ以降のＬＡＭＰ反応においても同様にウラシル−Ｎ−ＤＮＡグリコシラーゼ処理を行うことで「キャリーオーバー」コンタミネーションを防ぐことができる。
以下本発明を具体的に説明する為に実施例を示すが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
（実施例１）
１．目的
ＬＡＭＰ反応産物がC-ＰＡＳで検出可能かどうか検討した。
２．材料
<ＬＡＭＰ反応で使用する試薬類>
・１００μM フォワード インナープライマー (ＦＩＰ)
・１００μM バックワード インナープライマー (ＢＩＰ)
・１００μM フォワード ループプライマー (ＬＦ)_タグ配列結合(５’末端)
・１００μM バックワード ループプライマー (ＬＢ)_ビオチン結合(５’末端)
・１００μM フォワード アウタープライマー (Ｆ３)
・１００μM バックワード アウタープライマー (Ｂ３)
・Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ (ＯｐｔｉＧｅｎｅ社)
・Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ(ＳＡＬ) ゲノムＤＮＡ
・Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ(ＳＴＡ) ゲノムＤＮＡ
< ＳＴＨクロマトＰＡＳ法で使用する試薬類>（株式会社ＴＢＡ社製）
・クロマトＰＡＳ(Ｆ４)
・クロマト展開バッファー
・クロマト展開用色素
３．方法
はじめに、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ（ＳＡＬ）ゲノムＤＮＡ（配列番号１）とＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＴＡ）ゲノムＤＮＡ（配列番号２）のそれぞれを特異的に検出可能なプライマーセット（ＦＩＰ、ＢＩＰ、ＬＦ、ＬＢ、Ｆ３及びＢ３）の設計を行った。各プライマーセットの設計は、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ(栄研化学)を使用した。
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａゲノムＤＮＡを検出可能なプライマーセット（ＳＡＬ検出用プライマーセット）の配列は以下の表の通りである。

表１ ＳＡＬ検出用プライマーセット
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓゲノムＤＮＡを検出可能なプライマーセット（ＳＴＡ検出用プライマーセット）の配列は以下の表の通りである。

表２ ＳＴＡ検出用プライマーセット
設計後のプライマーは、ダイマー形成の可能性の有無を確認した上で、ＳＴＨクロマトＰＡＳ法にて検出できるように、常法によりタグ配列をＬＦプライマーの５’末端に、ビオチンをＬＢプライマーの５’末端にそれぞれ結合させた。なおタグ配列はＳＡＬ検出用とＳＴＡ検出用で異なるものを用いた。
次にＰｒｏｂｅ Ｍｉｘｔｕｒｅの調製を行った。Ｐｒｏｂｅ Ｍｉｘｔｕｒｅは１反応あたり、ＦＩＰを０.４μＬ、ＢＩＰを０.４μＬ、ＬＦを０.４μＬ、ＬＢを０.４μＬ、Ｆ３を０.０５μＬ、Ｂ３を０.０５μＬ及び滅菌水を０.８μＬ添加した。次にＬＡＭＰ反応液の調製を行った。ＬＡＭＰ反応用Ｔｕｂｅ Ｓｔｒｉｐに、調製済みＰｒｏｂｅ Ｍｉｘｔｕｒｅを２μＬ、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを８μＬ、Ｔｅｍｐ． ＤＮＡを２μＬ添加して混合した。マルチプレックス（同一検体中に複数の検出対象核酸を含む場合）で反応を行う場合は、ＳＡＬ検出用とＳＴＡ検出用のＰｒｏｂｅ Ｍｉｘｔｕｒｅをそれぞれ１:１で混合させた。ＬＡＭＰ等温反応にはＧｅｎｉｅＩＩ(ＯｐｔｉＧｅｎｅ社)を使用した。反応温度を６５℃とし、３０分間反応させた。
反応後のＬＡＭＰ産物を滅菌水で１/１０希釈を行った。希釈産物を１μＬ、滅菌水を９μＬ、クロマト展開用色素１μＬ及びクロマト展開バッファーを１０μＬ添加した後に混合した。混合した反応液にクロマト紙を浸して、室温で２０分間クロマト展開を行った。
４．結果
ＬＡＭＰ用プライマーのＬＦとＬＢにそれぞれタグ配列とビオチンを結合させたものを用いてＬＡＭＰ反応を行った。ＬＡＭＰ反応産物のクロマト展開結果を図３に示す。図３において、レーン１は検体内にＳＡＬ ゲノムＤＮＡのみが含まれるもの、レーン２は検体内にＳＴＡ ゲノムＤＮＡのみが含まれるもの、レーン３は検体内にＳＡＬ ゲノムＤＮＡとＳＴＡ ゲノムＤＮＡが含まれるもの、レーン４はネガティブコントロール１(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ)、レーン５はネガティブコントロール２(Ｄ．Ｗ．)である。
ＳＡＬゲノムＤＮＡとＳＴＡゲノムＤＮＡについてそれぞれ特異的なバンドを検出することができた(図３、レーン１及びレーン２)。また、マルチプレックスにてＬＡＭＰ反応を行った場合、ＳＡＬゲノムＤＮＡとＳＴＡゲノムＤＮＡをともに検出することができた(図３、レーン３)。なお、ネガティブコントロールはＳＡＬゲノムＤＮＡとＳＴＡゲノムＤＮＡともに検出されなかった(図３、レーン４及びレーン５)。
さらに検出プライマーの特異性を検討した結果を図４に示す。図４において、レーン１〜３はＳＡＬ検出用プライマーを使用し、検体内にＳＡＬ ゲノムＤＮＡのみが含まれるもの（レーン１）、検体内にＳＴＡ ゲノムＤＮＡのみが含まれるもの（レーン２）、ネガティブコントロール（レーン３）である。またレーン１〜３はＳＴＡ検出用プライマーを使用し、検体内にＳＡＬ ゲノムＤＮＡのみがふくまれるもの（レーン４）、検体内にＳＴＡ ゲノムＤＮＡのみが含まれるもの（レーン５）、ネガティブコントロール（レーン６）である。
ＳＡＬ及びＳＴＡ検出用プライマーについてＬＦとＬＢにそれぞれタグ配列とビオチンを結合させたものを使用してＬＡＭＰ反応を行った場合、それぞれＳＡＬゲノムＤＮＡとＳＴＡゲノムＤＮＡが存在している時にのみバンドとして検出された（図４、レーン１及びレーン５）。
これにより、ＬＡＭＰ用プライマーにタグ配列やビオチン等の標識物質結合物質を結合させた場合でもＬＡＭＰの反応は阻害されないことが明らかとなった。また、ＬＡＭＰの反応産物はＳＴＨクロマトＰＡＳ法で検出することが可能であった。さらに、プライマーを複数混合させることにより、マルチプレックスで検出を行うことが可能であることが明らかとなった。また、ＳＡＬ及びＳＴＡ検出用プライマーによる反応は特異的なものであることが示された。
（実施例２）
１．目的
ＬＡＭＰプライマーのうち、どのプライマーにタグ配列又はビオチンを結合させればよいか検討を行った。
２．材料
<ＬＡＭＰ反応で使用する試薬類>
・１００μM フォワード インナープライマー (ＦＩＰ)
・１００μM バックワード インナープライマー (ＢＩＰ)
・１００μM フォワード インナープライマー (ＦＩＰ)_タグ配列結合(５’末端)
・１００μM バックワード インナープライマー (ＢＩＰ) _ビオチン結合(５’末端)
・１００μM フォワード ループプライマー (ＬＦ)
・１００μM バックワード ループプライマー (ＬＢ)
・１００μM フォワード ループプライマー (ＬＦ) _タグ配列結合(５’末端)
・１００μM バックワード ループプライマー (ＬＢ) _ビオチン結合(５’末端)
・１００μM フォワード アウタープライマー (Ｆ３)
・１００μM バックワード アウタープライマー (Ｂ３)
・Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ (ＯｐｔｉＧｅｎｅ社)
・Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ(ＳＴＡ) ゲノムＤＮＡ
<ＳＴＨクロマトＰＡＳ法で使用する試薬類>（株式会社ＴＢＡ社製）
・クロマトＰＡＳ(Ｆ４) １本
・クロマト展開バッファー
・クロマト展開用色素
３．方法
使用したＳＴＡ検出用プライマーセットのプライマー配列は実施例１と同じである。以下の表に従って、常法により各プライマーの５’末端にタグ配列又はビオチンを結合させたプライマーを準備した。
表３ タグ配列又はビオチンを結合させたプライマーの組み合わせ及び検出結果
検出可：＋ 検出不可：− Ｐｒｏｂｅ Ｍｉｘｔｕｒｅの調製は”表３上段に示すプライマーの組み合わせ”の通りに行った。（i）はインナープライマーであるＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーの５’末端部位にそれぞれタグ配列又はビオチンが結合している。（ii）はインナープライマーのＦＩＰとループプライマーのＬＢにそれぞれタグ配列又はビオチンが結合している。（iii）はインナープライマーのＢＩＰとループプライマーのＬＦにそれぞれタグ配列又はビオチンが結合している。Ｐｒｏｂｅ Ｍｉｘｔｕｒｅは１反応あたり、ＦＩＰを０.４μＬ、ＢＩＰを０.４μＬ、ＬＦを０.４μＬ、ＬＢを０.４μＬ、Ｆ３を０.０５μＬ、Ｂ３を０.０５μＬ及び滅菌水を０.８μＬ添加した。次にＬＡＭＰ反応液の調製を行った。ＬＡＭＰ反応用Ｔｕｂｅ Ｓｔｒｉｐに、調製済みＰｒｏｂｅ Ｍｉｘｔｕｒｅを２μＬ、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを８μＬ、Ｔｅｍｐ. ＤＮＡを２μＬ添加して混合した。ＬＡＭＰ等温反応にはＧｅｎｉｅＩＩ(ＯｐｔｉＧｅｎｅ社)を使用した。反応温度を６５℃とし、３０分間反応させた。
反応後のＬＡＭＰ産物を滅菌水で１/１０希釈を行った。希釈産物を１μＬ、滅菌水を９ μＬ、クロマト展開用色素 １μＬ及びクロマト展開バッファーを１０μＬ添加した後に混合した。混合した反応液にクロマト紙を浸して、室温で２０分間クロマト展開を行った。
４．結果
結果を図５に示す。ＬＡＭＰプライマーのうち、（i）第１プライマー及び第２プライマーのセットがフォワードとバックワード 共にインナープライマーの場合(図５、レーン１)、ＳＴＡゲノムＤＮＡの特異的なバンドが検出された。同様に、（ii）第１プライマー及び第２プライマーのセットがフォワード インナープライマーとバックワード ループプライマーの組み合わせの場合(図５、レーン３)や（iii）第１プライマー及び第２プライマーのセットがフォワード インナープライマーとバックワード ループプライマーの組み合わせの場合(図５、レーン５)でもＳＴＡゲノムＤＮＡの特異的なバンドが検出された。なお、図５のレーン２、４及び６はそれぞれ(i)、(ii)及び(iii)のプライマーの組み合わせを使用したときのネガティブコントロール（Ｄ．Ｗ．）である。さらに実施例１で使用した第１プライマー及び第２プライマーのセットはフォワードとバックワード 共にループプライマーの場合であることから、インナープライマー及びループプライマーのいずれにおいてタグ配列又はビオチンを結合させても検出可能であることがわかった。なお、結果を示さないが、同様に５’末端にタグ配列又はビオチンを結合させたアウタープライマーを使用した場合は検出できなかった。
（実施例３）
１．目的
ＬＡＭＰ_Ｃ-ＰＡＳの検出感度の確認を行った。
２．材料
<ＬＡＭＰ反応で使用する試薬類>
・１００μM フォワード インナープライマー (ＦＩＰ)
・１００μM バックワード インナープライマー (ＢＩＰ)
・１００μM フォワード ループプライマー (ＬＦ) _タグ配列結合（５’末端）
・１００μM バックワード ループプライマー (ＬＢ) _ビオチン結合（５’末端）
・１００μM フォワード アウタープライマー (Ｆ３)
・１００μM バックワード アウタープライマー (Ｂ３)
・Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ (ＯｐｔｉＧｅｎｅ社)
・Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ(ＳＡＬ) ゲノムＤＮＡ (１０ｎｇ、１ｎｇ、１００ｐｇ、１０ｐｇ、１ｐｇ、１００ｆｇ、１０ｆｇ及び１ｆｇ)
・Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ(ＳＴＡ) ゲノムＤＮＡ (１０ｎｇ、１ｎｇ、１００ｐｇ、１０ｐｇ、１ｐｇ、１００ｆｇ、１０ｆｇ、１ｆｇ)

<ＳＴＨクロマトＰＡＳ法で使用する試薬類>（株式会社ＴＢＡ社製）
・クロマトＰＡＳ(Ｆ４) １本
・クロマト展開バッファー
・クロマト展開用色素
３．方法
使用したＳＡＬ検出用およびＳＴＡ検出用プライマーセットのプライマー配列は実施例１と同じである。常法によりタグ配列をＬＦプライマーの５’末端に、ビオチンをＬＢプライマーの５’末端にそれぞれ結合させた。なおタグ配列は実施例１と同様、ＳＡＬ検出用とＳＴＡ検出用で異なるものを用いた。
ＳＡＬ ゲノムＤＮＡ及びＳＴＡ ゲノムＤＮＡをそれぞれ１０ｎｇ、１ｎｇ、１００ｐｇ、１０ｐｇ、１ｐｇ、１００ｆｇ、１０ｆｇ及び１ｆｇとなるように希釈系列を作製した。ＳＡＬゲノムＤＮＡとＳＴＡゲノムＤＮＡを混合状態で検出を行う場合は、両者を同じ濃度ずつ混合させた。
次にＰｒｏｂｅ Ｍｉｘｔｕｒｅの調製を行った。Ｐｒｏｂｅ Ｍｉｘｔｕｒｅは１反応あたり、ＦＩＰを０.４μＬ、ＢＩＰを０.４μＬ、ＬＦを０.４μＬ、ＬＢを０.４μＬ、Ｆ３を０.０５μＬ、Ｂ３を０.０５μＬ及び滅菌水を０.８μＬ添加した。次にＬＡＭＰ反応液の調製を行った。ＬＡＭＰ反応用Ｔｕｂｅ Ｓｔｒｉｐに、調製済みＰｒｏｂｅ Ｍｉｘｔｕｒｅを２μＬ、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを８μＬ、Ｔｅｍｐ． ＤＮＡを２μＬ添加して混合した。マルチプレックスで反応を行う場合は、ＳＡＬとＳＴＡ検出用のＰｒｏｂｅ Ｍｉｘｔｕｒｅをそれぞれ１:１で混合させた。ＬＡＭＰ等温反応にはＧｅｎｉｅＩＩ(ＯｐｔｉＧｅｎｅ社)を使用した。反応温度を６５℃とし、３０分間反応させた。
反応後のＬＡＭＰ産物を滅菌水で１/１０希釈を行った。希釈産物を１μＬ、滅菌水を９ μＬ、クロマト展開用色素 １μＬ及びクロマト展開バッファーを１０μＬ添加した後に混合した。混合した反応液にクロマト紙を浸して、室温で２０分間クロマト展開を行った。
４．結果
ＳＡＬゲノムＤＮＡ及びＳＴＡゲノムＤＮＡを希釈してＬＡＭＰ反応を行い、ＬＡＭＰ反応産物をクロマト展開した結果を図６に示す。図６において、レーン１〜４はＳＡＬゲノムＤＮＡを順に１ｎｇ、１ｐｇ、１０ｆｇ、１ｆｇ含むもので、レーン６〜９はＳＴＡゲノムＤＮＡを順に１ｎｇ、１ｐｇ、１０ｆｇ、１ｆｇ含むものでレーン５及びレーン１０はそれぞれネガティブコントロールである。
ＳＡＬゲノムＤＮＡ及びＳＴＡゲノムＤＮＡ共に１０ｆｇまで検出することができた。
なおＳＡＬゲノムＤＮＡまたはＳＴＡゲノムＤＮＡを希釈してＬＡＭＰ反応を行い、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎを利用した従来法により増幅産物の検出を行ったところ、共に１０ｆｇまで検出することができた。
またＳＡＬ ゲノムＤＮＡ及びＳＴＡ ゲノムＤＮＡを混合し同一検体に含むものを希釈して、ＬＡＭＰ反応を行い、ＬＡＭＰ反応産物をクロマト展開した結果を図７に示す。図７においてレーン１〜５はＳＡＬゲノムＤＮＡ＋ＳＴＡゲノムＤＮＡを順に１ｎｇ、１ｐｇ、１００ｆｇ、１０ｆｇ、１ｆｇ含むもので、レーン６はネガティブコントロールである。検体に含まれるＳＡＬゲノムＤＮＡとＳＴＡゲノムＤＮＡのいずれも１ｐｇまでは検出可能であった。１００ｆｇ以下の場合は、いずれか一方のみが検出された。
（実施例４）
１．目的
プライマー配列内の結合の位置による影響を検討した。
２．材料
・１００μM フォワード インナープライマー (ＦＩＰ) _タグ配列結合(３’末端)
・１００μM バックワード インナープライマー (ＢＩＰ) _ビオチン結合(３’末端)
・１００μM フォワード インナープライマー (ＦＩＰ) _タグ配列結合(５’末端及び３’末端)
・１００μM バックワード インナープライマー (ＢＩＰ) _ビオチン結合(５’末端及び３’末端)
・１００μM フォワード インナープライマー (ＦＩＰ) _タグ配列結合(５’末端)
・１００μM バックワード インナープライマー (ＢＩＰ) _ビオチン結合(３４位Ｔ、B２内部)
・１００μM フォワード インナープライマー (ＦＩＰ) _タグ配列結合(５’末端)
・１００μM バックワード インナープライマー (ＢＩＰ) _ビオチン結合(１０位Ｔ、Ｂ１ｃ内部)
・１００μM フォワード ループプライマー (ＬＦ) _タグ配列結合(３’末端)
・１００μM バックワード ループプライマー (ＬＢ) _ビオチン結合(３’末端)
・１００μM フォワード ループプライマー (ＬＦ) _タグ配列結合(５’末端及び３’末端)
・１００μM バックワード ループプライマー (ＬＢ) _ビオチン結合(５’末端及び３’末端)
・１００μM フォワード ループプライマー (ＬＦ) _タグ配列結合(５’末端)
・１００μM バックワード ループプライマー (ＬＢ) _ビオチン結合(１０位Ｔ、ＬＢ内部)
・１００μM フォワード アウタープライマー (Ｆ３) _タグ配列結合(５’末端)
・１００μM バックワード アウタープライマー (Ｂ３) _ビオチン結合(５’末端)
・１００μM フォワード アウタープライマー (Ｆ３) _タグ配列結合(３’末端)
・１００μM バックワード アウタープライマー (Ｂ３) _ビオチン結合(３’末端)
・１００μM フォワード アウタープライマー (Ｆ３) _タグ配列結合(５’末端及び３’末端)
・１００μM バックワード アウタープライマー (Ｂ３) _ビオチン結合(５’末端及び３’末端)
・１００μM フォワード アウタープライマー (Ｆ３) _タグ配列結合(５’末端)
・１００μM バックワード アウタープライマー (Ｂ３) _ビオチン結合(１１位Ｔ、Ｂ３内部)
・１００μM フォワード インナープライマー (ＦＩＰ)
・１００μM バックワード インナープライマー (ＢＩＰ)
・１００μM フォワード ループプライマー (ＬＦ)
・１００μM バックワード ループプライマー (ＬＢ)
・１００μM フォワード アウタープライマー (Ｆ３)
・１００μM バックワード アウタープライマー (Ｂ３)
・Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ(ＯｐｔｉＧｅｎｅ社)
・Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ(ＳＴＡ) ゲノムＤＮＡ
< ＳＴＨクロマトＰＡＳ法で使用する試薬類>（株式会社ＴＢＡ社製）
・クロマトＰＡＳ(Ｆ４) １本
・クロマト展開バッファー
・クロマト展開用色素
３．方法
ＬＡＭＰ反応に必要なプライマーのうち、プライマー配列にビオチン又はタグ配列を結合する位置の検討を行った。
使用したＳＴＡ検出用プライマーセットのプライマー配列は実施例１と同じである。常法によりプライマーの５’末端、３’末端、５’末端及び３’末端の両方及びプライマーの配列内部に結合させたものを調製した。なおタグ配列は実施例１と同様、ＳＡＬ検出用とＳＴＡ検出用で異なるものを用いた。

次にＰｒｏｂｅ Ｍｉｘｔｕｒｅの調製を行った。Ｐｒｏｂｅ Ｍｉｘｔｕｒｅは１反応あたり、ＦＩＰを０.４μＬ、ＢＩＰを０.４μＬ、ＬＦを０.４μＬ、ＬＢを０.４μＬ、Ｆ３を０.０５μＬ、Ｂ３を０.０５μＬ及び滅菌水を０.８μＬ添加した。次にＬＡＭＰ反応液の調製を行った。ＬＡＭＰ反応用Ｔｕｂｅ Ｓｔｒｉｐに、調製済みＰｒｏｂｅ Ｍｉｘｔｕｒｅを２μＬ、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを８μＬ、Ｔｅｍｐ． ＤＮＡを２μＬ添加して混合した。マルチプレックスで反応を行う場合は、ＳＡＬとＳＴＡ検出用のＰｒｏｂｅ Ｍｉｘｔｕｒｅをそれぞれ１:１で混合させた。ＬＡＭＰ等温反応にはＧｅｎｉｅＩＩ(ＯｐｔｉＧｅｎｅ社)を使用した。反応温度を６５℃とし、３０分間反応させた。
反応後のＬＡＭＰ産物を滅菌水で１/１０希釈を行った。希釈産物を１μＬ、滅菌水を９ μＬ、クロマト展開用色素 １μＬ及びクロマト展開バッファーを１０μＬ添加した後に混合した。混合した反応液にクロマト紙を浸して、室温で２０分間クロマト展開を行った。
４．結果
結果を図８に示す。図８におけるタグ配列又はビオチンを結合させたプライマーの組み合わせ及び検出結果は以下の表４にまとめる通りである。レーン１はアウタープライマーの５’末端にタグ配列又はビオチンを結合させたもの、レーン２はアウタープライマーの３’末端にタグ配列又はビオチンを結合させたもの、レーン３はアウタープライマーの５’末端と３’末端の両方にタグ配列又はビオチンを結合させたもの、レーン４はインナープライマーの３’末端にタグ配列又はビオチンを結合させたもの、レーン５はインナープライマーの５’末端と３’末端の両方にタグ配列又はビオチンを結合させたもの、レーン６はループプライマーの３’末端にタグ配列又はビオチンを結合させたものもの、レーン７はループプライマーの５’末端と３’末端の両方にタグ配列又はビオチンを結合させたもの、レーン８はインナープライマーの５’末端にタグ配列、インナープライマーのＢ１ｃ内にビオチンを結合させたもの、レーン９はインナープライマーの５’末端にタグ配列、インナープライマーのＢ２内にビオチンを結合させたもの、レーン１０はループプライマーの５’末端にタグ配列、ループプライマーのＬＢ内にビオチンを結合させたもの、レーン１１はアウタープライマーの５’末端にタグ配列、アウタープライマーのＢ３内にビオチンを結合させたものを使用したものである。
インナープライマーの３’末端にタグ配列又はビオチンを結合させたもの（レーン４）、インナープライマーの５’末端と３’末端の両方にタグ配列又はビオチンを結合させたもの（レーン５）、インナープライマーの５’末端にタグ配列、インナープライマーの内部にビオチンを結合させたもの（レーン９）を使用した場合はバンドが検出された。同様に、ループプライマーの３’末端にタグ配列又はビオチンを結合させたもの（レーン６）、ループプライマーの５’末端と３’末端の両方にタグ配列又はビオチンを結合させたもの（レーン７）、ループプライマーの５’末端にタグ配列、ループプライマーの内部にビオチンを結合させたものを使用した場合（レーン８）もバンドが検出された。一方、アウタープライマーの５’末端にタグ配列又はビオチンを結合させたもの（レーン１）、アウタープライマーの３’末端にタグ配列又はビオチンを結合させたもの（レーン２）、アウタープライマーの５’末端と３’末端の両方にタグ配列又はビオチンを結合させたもの（レーン３）、アウタープライマーの５’末端にタグ配列、アウタープライマーの内部にビオチンを結合させたもの（レーン１１）を使用した場合のいずれについてもバンドが検出されなかった。
た。
表４ 図８におけるタグ配列又はビオチンを結合させたプライマーの組み合わせ及び検出結果


検出可：＋ 検出不可：−
実施例２においてインナープライマーの５’末端にタグ配列又はビオチンを結合させたもの、ループプライマーの５’末端にタグ配列又はビオチンを結合させたものを使用した場合に検出可能であったことと合わせて、プライマー配列内の標識の位置による検出可能性への影響をまとめると以下の表２の通りとなる。
表５
検出可：＋ 検出不可：−
（実施例５）
コンタミネーション防止策について
１．目的
Ｕｒａｃｉｌ-ＤＮＡ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＮＧ）を利用したＬＡＭＰ_Ｃ-ＰＡＳ反応系の検討
２．材料
・Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ(ＯｐｔｉＧｅｎｅ社)
・２×ＬＡＭＰ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ (株式会社ニッポンジーン)
・Ｕｒａｃｉｌ-ＤＮＡ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＮＧ）１Ｕｎｉｔｓ／μＬ（株式会社ニッポンジーン）
・１００μM フォワード インナープライマー (ＦＩＰ)
・１００μM バックワード インナープライマー (ＢＩＰ)
・１００μM フォワード ループプライマー (ＬＦ) _タグ配列結合（５’末端）
・１００μM バックワード ループプライマー (ＬＢ) _ビオチン結合（５’末端）
・１００μM フォワード アウタープライマー (Ｆ３)
・１００μM バックワード アウタープライマー (Ｂ３)
・Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ゲノムＤＮＡ
< ＳＴＨクロマトＰＡＳ法で使用する試薬類>（株式会社ＴＢＡ社製）
・クロマトＰＡＳ(Ｆ８)
・クロマト展開バッファー １０μＬ
・クロマト展開用色素 １μＬ
３．方法
（１）ＬＡＭＰ反応系においてｄＴＴＰのかわりにｄＵＴＰを添加した場合でもＬＡＭＰ用ポリメラーゼが反応するかどうかを確認するためにヌクレオチドとして、ｄＮＴＰsを使用したもの、ｄＴＴＰ:ｄＵＴＰ=１:１となるようにｄＮＴＰsに含まれるｄＴＴＰをｄＵＴＰで置換したもの、ｄＮＴＰsに含まれるｄＴＴＰをすべてｄＵＴＰに置換したものを比較した。
使用したＳＴＡ検出用プライマーセットのプライマー配列は実施例１と同じである。常法によりタグ配列をＬＦプライマーの５’末端に、ビオチンをＬＢプライマーの５’末端にそれぞれ結合させた。
Ｐｒｏｂｅ Ｍｉｘｔｕｒｅは１反応あたり、ＦＩＰを０.２μＬ、ＢＩＰを０.２μＬ、ＬＦを０.１μＬ、ＬＢを０.１μＬ、Ｆ３を０.０２５μＬ、Ｂ３を０.０２５μＬ及び滅菌水を１.８５μＬ添加した。次にＬＡＭＰ反応液の調製を行った。ＬＡＭＰ反応用Ｔｕｂｅ Ｓｔｒｉｐに、調製済みＰｒｏｂｅ Ｍｉｘｔｕｒｅを２.５μＬ、２×ＬＡＭＰ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む）を１２.５μＬ、Ｔｅｍｐ． ＤＮＡを２.５μＬ、滅菌水を６.５μＬ添加して混合した。
ＬＡＭＰ等温反応にはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を使用した。反応温度を６５℃とし、６０分間反応させた。
（２）キャリーオーバーによるコンタミネーションを防ぐために、ＬＡＭＰ反応系にＵｒａｃｉｌ-ＤＮＡ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＮＧ）（株式会社ニッポンジーン）を添加してＬＡＭＰ反応への影響を確認した。Ｐｒｏｂｅ Ｍｉｘｔｕｒｅは１反応あたり、ＦＩＰを０.４μＬ、ＢＩＰを０.４μＬ、ＬＦを０.２μＬ、ＬＢを０.２μＬ、Ｆ３を０.０５μ、Ｂ３を０.０５μＬ及び滅菌水を１.２μＬ添加した。次にＬＡＭＰ反応液の調製を行った。ＬＡＭＰ反応用Ｔｕｂｅ Ｓｔｒｉｐに、調製済みＰｒｏｂｅ Ｍｉｘｔｕｒｅを２.５μＬ、２×ＬＡＭＰ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｂｓｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅまたはＣｓａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む）を１２.５μＬ、ＵＮＧを１.０μＬ、Ｔｅｍｐ． ＤＮＡを２.５μＬ添加して混合した。ＬＡＭＰ等温反応にはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を使用した。反応温度を６５℃とし、６０分間反応させた。ＬＡＭＰ等温反応の前に室温で１０分間インキュベートすることによってＵＮＧ処理をおこなった。
反応後のＬＡＭＰ産物を滅菌水で１/１０希釈を行った。希釈産物を１μＬ、滅菌水を９μＬ、クロマト展開用色素１μＬ及びクロマト展開バッファーを１０μＬ添加した後に混合した。混合した反応液にクロマト紙を浸して、室温で２０分間クロマト展開を行った。
４．結果
ヌクレオチドとしてｄＮＴＰｓに含まれるｄＴＴＰをｄＵＴＰで置換した場合のＬＡＭＰ反応への影響を図９に示す。
ヌクレオチドとしてｄＮＴＰｓを使用した通常のＬＡＭＰ反応(図９の（１）)と同様に、ｄＴＴＰ:ｄＵＴＰ=１:１となるようにｄＮＴＰｓに含まれるｄＴＴＰをｄＵＴＰで置換したもの（図９の（２））、ｄＮＴＰｓに含まれるｄＴＴＰをすべてｄＵＴＰに置換したもの（図９の（３））でもＬＡＭＰ反応が問題なく進むことが確認された。
また、ＵＮＧ処理の有無によるキャリーオーバーへの影響を検討した結果を図１０及び図１１に示す。図１０はＢｓｔ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅまたはＣｓａ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの２種類の酵素を使用したＬＡＭＰ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて、ＵＮＧを添加しないものと添加したものでＬＡＭＰ反応産物を鋳型としたＬＡＭＰ反応が起こるかどうかを検討したものである。いずれの酵素を使用したＬＡＭＰ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用した場合でもＵＮＧを添加して反応を行った場合はＬＡＭＰ反応は進まなかった。
図１１において、レーン１はＳＴＡゲノムＤＮＡを鋳型としてＵＮＧを添加して反応したもの、レーン２はＳＴＡゲノムＤＮＡと、ＳＴＡ ＬＡＭＰ増幅産物を鋳型としてＵＮＧを添加して反応したもの、レーン３はＳＴＡ ＬＡＭＰ増幅産物を鋳型としてＵＮＧを添加して反応したもの、レーン４はＳＴＡゲノムＤＮＡを鋳型としてＵＮＧを添加せずに反応したもの、レーン５はＳＴＡゲノムＤＮＡと、ＳＴＡ ＬＡＭＰ増幅産物を鋳型としてＵＮＧを添加せずに反応したもの、レーン６はＳＴＡ ＬＡＭＰ増幅産物を鋳型としてＵＮＧを添加せずに反応したものである。いずれもＵＮＧを添加した系、すなわちＵＮＧ処理を行った系では、ＬＡＭＰ反応が見られず（図１０、図１１のレーン３）、キャリーオーバーが起こっていないことが確認された。
（実施例６）
１．目的
ＬＡＭＰ反応にインナープライマー、ループプライマーまたはアウタープライマーのいずれかのみを使用した場合の検討
２．材料
<ＬＡＭＰ反応で使用する試薬類>
・Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ (ＯｐｔｉＧｅｎｅ社製)
・１００μM フォワード インナープライマー (ＦＩＰ) _タグ配列結合（５’末端）
・１００μM バックワード インナープライマー (ＢＩＰ) _ビオチン結合（５’末端）
・１００μM フォワード ループプライマー (ＬＦ) _タグ配列結合（５’末端）
・１００μM バックワード ループプライマー (ＬＢ) _ビオチン結合（５’末端）
・１００μM フォワード アウタープライマー (Ｆ３) _タグ配列結合（５’末端）
・１００μM バックワード アウタープライマー (Ｂ３) _ビオチン結合（５’末端）
・Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ゲノムＤＮＡ (ＳＴＡ)
< ＳＴＨクロマトＰＡＳ法で使用する試薬類>（株式会社ＴＢＡ社製）
・クロマトＰＡＳ(Ｆ８)
・クロマト展開バッファー １０μＬ
・クロマト展開用色素 １μＬ
３．方法
インナープライマー、ループプライマーまたはアウタープライマーのいずれかのみを使用した場合に、ＬＡＭＰ反応が進むかどうかを確認した。
使用したＳＴＡ検出用プライマーセットのプライマー配列は実施例１と同じである。タグ配列又はビオチンを結合させる位置はすべてプライマーの５’末端であった。Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘｔｕｒｅの調製では、１反応あたり、ＦＩＰを０.４μＬとＢＩＰを０.４μＬまたはＬＦを０.４μＬとＬＢを０.４μＬまたはＦ３を０.４μＬとＢ３を０.４μＬ添加し、滅菌水を添加して計２.５μＬとした。次にＬＡＭＰ反応液の調製を行った。ＬＡＭＰ反応用Ｔｕｂｅ Ｓｔｒｉｐに、調製済みＰｒｉｍｅｒ Ｍｉｘｔｕｒｅを２.５μＬ、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを８μＬ、Ｔｅｍｐ． ＤＮＡを２μＬ添加して混合した。マルチプレックスで反応を行う場合は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａとＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ用のＰｒｉｍｅｒ Ｍｉｘｔｕｒｅをそれぞれ１:１で混合させた。ＬＡＭＰ等温反応にはＧｅｎｉｅＩＩ(ＯｐｔｉＧｅｎｅ社)を使用した。反応温度を６５℃とし、３０分間反応させた。
反応後のＬＡＭＰ産物を滅菌水で１/１０希釈を行った。希釈産物を１μＬ、滅菌水を９ μＬ、クロマト展開用色素 １μＬ及びクロマト展開バッファーを１０μＬ添加した後に混合した。混合した反応液にクロマト紙を浸して、室温で２０分間クロマト展開を行った。
４．結果
結果を図１２に示す。図１２はインナープライマーのみを使用した場合のＳＴＡ ゲノムＤＮＡ（レーン１）、ネガティブコントロール（レーン２）、ループプライマーのみを使用した場合のＳＴＡ ゲノムＤＮＡ（レーン３）、ネガティブコントロール（レーン４）、アウタープライマープライマーのみを使用した場合のＳＴＡ ゲノムＤＮＡ（レーン５）、ネガティブコントロール（レーン６）を示す。
インナープライマー(ＦＩＰ及びＢＩＰ)、ループプライマー(ＬＦ及びＬＢ)そしてアウタープライマー(Ｆ３及びＢ３)のいずれかの組合せをＬＡＭＰ反応に使用した結果、インナープライマー(ＦＩＰ及びＢＩＰ)のみを使用した場合（レーン１）にのみバンドとして検出することができた。

Claims (8)

  1. 同一検体内に２以上含まれる標的核酸配列の検出方法であって、
    下記（ａ）〜（ｄ）：
    （ａ）標的核酸配列ごとに第１プライマー及び第２プライマーのセットを準備する工程であって、
    前記第１プライマーにはタグ配列が結合しており、前記タグ配列は、標的核酸配列ごとに異なり、
    前記第２プライマーには標識物質結合物質が結合している前記工程、
    （ｂ）２以上の第１プライマー及び第２プライマーのセットを用いて同一反応液中でＬＡＭＰ法により核酸等温増幅を行う工程、
    （ｃ）前記核酸等温増幅産物を含有する増幅反応液と前記標識物質結合物質に結合する標識物質を含む展開媒体を準備して固相担体上で核酸クロマトグラフィーを行い、
    前記固相担体上に固定された、２以上の検出用プローブ（前記タグ配列に相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡ）と、前記核酸等温増幅産物とを、ハイブリダイズさせる工程と前記核酸等温増幅産物に標識物質を標識する工程を含む工程及び、
    （ｄ）前記工程（ｃ）で生成したハイブリダイズ産物を前記標識物質により検出する検出工程を含み、

    前記標的核酸配列の３’末端から５’末端方向に配置する任意配列Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、ＬＦ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、ＬＢc、Ｂ２及びＢ３について
    前記第１及び第２プライマーが下記（ｉ）〜（ｉｖ）：
    （ｉ）Ｆ２ｃと相補的な配列Ｆ２及びＦ２の５’側にＦ１ｃと同じ配列を含むＦＩＰプライマー、
    （ｉｉ）Ｂ２と同じ配列及びＢ２の５’側にＢ１と相補的な配列Ｂ１ｃを含むＢＩＰプライマー、
    （ｉｉｉ）ＬＦ領域と同じ配列をもつＬＦプライマー及び
    （ｉｖ）ＬＢc領域と相補的な配列をもつＬＢプライマー、
    からなる群より任意に選択される方法。
  2. 第１プライマー及び第２プライマーのセットが、第１プライマーがＦＩＰプライマー且つ第２プライマーがＢＩＰプライマーまたは第１プライマーがＢＩＰプライマー且つ第２プライマーがＦＩＰプライマーである、請求項１に記載の方法。
  3. 各標的核酸配列の第１プライマー及び第２プライマーのセットが、第１プライマーがＦＩＰプライマー且つ第２プライマーがＢＩＰプライマーまたは第１プライマーがＢＩＰプライマー且つ第２プライマーがＦＩＰプライマーであって、前記核酸等温増幅工程において各標的核酸配列の第１プライマー及び第２プライマーのセット以外のプライマーを使用しない請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記タグ配列の塩基長が２０塩基以上５０塩基以下である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記標識物質結合物質は、抗原抗体反応における抗体並びにビオチン、ジゴキシゲニン及びＦＩＴＣを含むハプテンからなる群から選択される１種又は２種以上であり、
    前記標識物質は、前記標識物質結合物質と結合可能な部位を備えて、蛍光、放射能、酵素、燐光、化学発光及び着色からなる群から選択される１種又は２種以上を利用する標識物質である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 核酸等温増幅工程をｄＵＴＰの存在下で行い、核酸等温増幅工程の前にウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）処理を行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の検出方法を実施する為に用いられ、少なくとも第１プライマー及び第２プライマーのセットを含むことを特徴とする測定試薬又は試薬キット。
  8. さらに、固相担体上に固定された２以上の検出用プローブを含むことを特徴とする請求項７に記載の測定試薬又は試薬キット。
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