CN107667179A - 改进的甲基化dna检测 - Google Patents

改进的甲基化dna检测 Download PDF

Info

Publication number
CN107667179A
CN107667179A CN201680030118.6A CN201680030118A CN107667179A CN 107667179 A CN107667179 A CN 107667179A CN 201680030118 A CN201680030118 A CN 201680030118A CN 107667179 A CN107667179 A CN 107667179A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
extraction
lysate
dna
extraction film
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201680030118.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107667179B (zh
Inventor
大卫·纳威拉尔斯
汉纳·肯恩斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Baiocatis Biology Co ltd
Original Assignee
Biocartis SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biocartis SA filed Critical Biocartis SA
Publication of CN107667179A publication Critical patent/CN107667179A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107667179B publication Critical patent/CN107667179B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • B01L7/525—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples with physical movement of samples between temperature zones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2523/00—Reactions characterised by treatment of reaction samples
    • C12Q2523/10—Characterised by chemical treatment
    • C12Q2523/125—Bisulfite(s)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/101—Temperature

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)

Abstract

本发明基于通过以下的敏感且特异性的甲基化检测的发现：a)在通过将DNA转化试剂(例如，亚硫酸氢盐试剂)直接与含有核酸的样品一起温育而控制转化前的过量DNA降解，而不需要从所述样品预先纯化核酸且不需要在98℃的升高的温度下预先使核酸变性，和b)通过控制亚硫酸氢盐处理的样品在自动化系统内的提取膜上的泵送流动速率而优化亚硫酸氢盐去除。

Description

改进的甲基化DNA检测
技术领域
本申请涉及在自动化系统上检测核酸中的甲基化胞嘧啶的方法，以及所述系统和所述系统的卡式芯片(cartridge)用于检测和分析甲基化的核酸的用途。
背景技术
DNA甲基化是基因表达的表观遗传控制的机制之一。基因组DNA的甲基化状态的改变可以导致基因沉默。这种控制对于广泛的生物过程，包括通过例如关键生长调节剂如肿瘤抑制基因的转录沉默的细胞增殖，是重要的。DNA甲基化在调控基因表达的生物学意义及其在癌症中的作用越来越受到重视。
通过在胞嘧啶环的5'碳上共价加成甲基基团而将基因组DNA中的胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶，发生DNA甲基化。在哺乳动物DNA中，5-甲基胞嘧啶存在于大约4％的基因组DNA中，主要是富含胞嘧啶-鸟苷二核苷酸(CpG)的序列链上，所谓的“CpG岛”。基因组DNA中的一些CpG岛的超甲基化可以导致基因沉默，而低甲基化可以导致转录和基因表达。
对开发分子技术以分析CpG岛上的基因组DNA甲基化存在很大的兴趣。使用亚硫酸氢钠的DNA处理将胞嘧啶转化成尿嘧啶，同时保持5-甲基胞嘧啶完好的发现，已经对在区域和整体水平上研究基因组DNA甲基化的许多策略打开了大门(Frommer et al.)。通常，该方法涉及以下基本步骤：
1)从样品中纯化DNA，
2)DNA变性(在98℃下至少10分钟的DNA加热步骤)，
3)通过在升高的温度下用亚硫酸氢盐(转化试剂)温育DNA(至少54℃下1小时或更久)来用磺化脱氨基以产生转化的DNA，
4)通常在具有DNA结合介质(树脂或膜)的柱上，通过纯化除去亚硫酸氢盐，
5)脱磺化，即加入脱磺化缓冲液，然后在室温下温育通常20min，并通过离心除去脱磺化缓冲液，
6)一个或多个洗涤步骤，
7)洗脱DNA，通常通过加入洗脱缓冲液和离心步骤(在柱上)。
DNA甲基化检测目前主要应用于疾病诊断方法。具体地，这些方法可以应用于癌症诊断。
为了有效和高效制备用于各种下游分析的转化DNA，理想的DNA亚硫酸氢盐改性方法应该是：(1)高度精确的，以允许胞嘧啶完全转化成尿嘧啶，而不会将甲基胞嘧啶脱氨基为胸腺嘧啶；(2)足够保守的，以最小化DNA降解，和(3)尽可能快的，使得亚硫酸氢盐过程可以尽可能短。不幸的是，目前的大多数DNA转化方法由于手动处理和亚硫酸氢盐温育时间(其为成功的亚硫酸氢盐转化的关键考虑因素)的控制不足而显示出很大的变化。
许多目前可商购的试剂盒的进一步限制是它们通常在转化后和进一步下游分析样品可以发生之前通常包括亚硫酸氢盐去除步骤。这不可避免地引入额外的手动处理步骤，如添加几种缓冲液，包括洗涤缓冲液和洗脱缓冲液，进行额外的离心步骤，使样品经过低洗脱旋转柱等。另外，考虑到许多当前可用的试剂盒需要预先准备患者样品，例如，在加热步骤中纯化DNA和/或使DNA变性，现有的DNA亚硫酸氢盐改性方法涉及大量的手动处理，这使得它们难以自动化并且耗时。
所描述的因素限制了最佳的DNA亚硫酸氢盐转化，并进一步使其成为由受训练的实验室人员实施的耗时过程。因此，看上去存在对于对所提出的问题提供解决方案的甲基化DNA的检测系统的需要。
发明内容
权利要求书中阐述的本发明是基于通过以下的敏感且特异性的甲基化检测的发现：a)通过将DNA转化试剂(例如，亚硫酸氢盐试剂)直接与含有核酸的样品一起温育来控制转化前的过量DNA降解，而不需要从样品中进行纯化核酸，且不需要在98℃的升高的温度下预先核酸变性，和b)通过控制亚硫酸氢盐处理的样品在自动化系统内的提取膜上的泵送流量而优化亚硫酸氢盐去除。
因此，本发明在第一方面提供了用于在包括包含提取膜的提取室的自动化系统中检测核酸的甲基化状态的方法，所述方法包括以下步骤：
-将核酸源引入自动化系统中，将亚硫酸氢盐加入到核酸中并随后立即加热核酸源以产生包含核酸的裂解物并使存在于所述核酸中的未甲基化的胞嘧啶碱基脱氨基；
-向裂解物中加入结合缓冲液而产生结合缓冲液和裂解物溶液；
-通过将结合缓冲液和裂解物溶液在提取膜上传输而将核酸结合至提取膜并除去亚硫酸氢盐；
-向提取室中加入脱磺化缓冲液，并将在提取膜上传输脱磺化缓冲液，以使核酸中在前一步骤中脱氨基的碱基脱磺化，并将所述碱基转化成尿嘧啶碱基，
-从提取膜上洗脱转化的核酸；以及分析转化的核酸。
在更具体的方面中，提供了用于在包括包含提取膜的提取室的自动化系统中检测核酸甲基化状态的方法，所述方法包括以下步骤：
-将核酸源引入自动化系统中，将亚硫酸氢盐加入到核酸中，然后立即将核酸源加热至40至80℃的温度以产生包含核酸的裂解物并使存在于所述核酸中的未甲基化的胞嘧啶碱基脱氨基；
-向裂解物中加入结合缓冲液而产生结合缓冲液和裂解物溶液；
-通过结合缓冲液和裂解物溶液在提取膜上的受控泵送，将核酸结合至提取膜并除去亚硫酸氢盐；
-向提取室加入脱磺化缓冲液，并控制脱磺化缓冲液在提取膜上的泵送，使核酸中在前一步骤中脱氨基的碱基脱磺化并将所述碱基转化成尿嘧啶碱基，
-从提取膜中洗脱转化的核酸；和分析自动化系统中的转化的核酸。
在更具体的方面中，提供了用于在包括包含提取膜的提取室的自动化系统中检测核酸甲基化状态的方法，所述方法包括以下步骤：
-将核酸源引入自动化系统中，向核酸中加入亚硫酸氢盐，然后立即将核酸源加热至40至60℃的温度而产生包含核酸的裂解物，并使存在于所述核酸中的未甲基化的胞嘧啶碱基脱氨基；
-向裂解物中加入结合缓冲液以产生结合缓冲液和裂解物溶液；通过以慢于或等于0.1ml/s的流速在提取膜上泵送结合缓冲液和裂解物溶液，将核酸结合至提取膜并除去亚硫酸氢盐；
-向提取室中加入脱磺化缓冲液，并以慢于或等于0.1ml/s的流速将脱磺化缓冲在提取膜上液泵送，以使核酸中在第一步骤中脱氨基的碱基脱磺化并将所述碱基转化为尿嘧啶碱基；
-从提取膜上洗脱转化的核酸；和分析自动化系统中的转化的核酸。
本发明的方法可以应用于卡式芯片中，其本身可以加载到自动化系统中。因此，在进一步的方面中，提供了用于检测核酸甲基化状态的试剂盒的用途，卡式芯片包含：
-易于接受核酸源的裂解室，将亚硫酸氢盐溶液加入到核酸源中，然后立即将核酸源加热至40至80℃的温度，而产生包含核酸的裂解物，并使存在于核酸中的未甲基化胞嘧啶碱基脱氨基，并将结合缓冲液加入到转化的裂解物中以形成结合缓冲液和裂解物溶液，
-包含易于接受结合缓冲液和裂解物溶液的提取膜的提取室，允许通过结合缓冲溶液-裂解物溶液在提取膜上的受控泵送而随后除去亚硫酸氢盐，允许随后向提取室中加入脱磺化缓冲液并在提取膜上受控泵送脱磺化缓冲液而进行核酸中的在第一步骤中脱氨基的碱基的碱性脱磺化并将所述碱基转化成尿嘧啶碱基，并允许随后从提取膜上洗脱转化的核酸，
其中在裂解室和提取室之间存在用于将流体从裂解室传输到提取室的通道，以及
-允许转化的核酸的下游分析的PCR室，其中在提取室和PCR室之间存在用于将转化的核酸从提取室传输到PCR室的通道。
在更具体的方面中，提供了卡式芯片用于检测核酸甲基化状态的用途，卡式芯片包括：
-易于接受核酸源的裂解室，将亚硫酸氢盐溶液加入到核酸源中，然后立即将核酸源加热至40至60℃的温度以产生包含核酸的裂解物并使存在于所述核酸中的未甲基化胞嘧啶碱基脱氨基，并将结合缓冲液加入到转化的裂解物中以形成结合缓冲液和裂解物溶液，
-包含易于接受结合缓冲液和裂解物溶液的提取膜的提取室，允许随后通过在提取膜上以慢于或等于0.1ml/s的流速泵送结合缓冲液和裂解物溶液而除去亚硫酸氢盐，允许随后向提取室中加入脱磺化缓冲液并以慢于或等于0.1ml/s的流速在提取膜上泵送脱磺化缓冲液，以进行核酸中的在第一步骤中脱氨基的碱基的碱性脱磺化，并将所述碱基转化为尿嘧啶碱基，并允许随后从提取膜上洗脱转化的核酸，
其中在裂解室和提取室之间存在用于将流体从裂解室传输至提取室的通道，以及，
-允许转化的核酸的下游分析的PCR室，其中在提取室和PCR室之间存在用于将转化的核酸从提取室传输到PCR室的通道。
在本发明的下一个方面中，提供了自动化系统用于检测核酸源中的核酸甲基化状态的用途，自动化系统适于接收根据本发明的卡式芯片，系统控制以下的步骤：
-将亚硫酸氢盐加入到引入系统中的核酸源中，然后立即将核酸源加热至40至80℃的温度以产生包含核酸的裂解物并使存在于所述核酸中的未甲基化的胞嘧啶碱基脱氨基，
-向包含核酸的裂解物中加入结合缓冲液以产生结合缓冲液和裂解物溶液，
-将核酸结合至提取膜并通过结合缓冲液和裂解物溶液在提取膜上的受控泵送除去亚硫酸氢盐，
-向提取室中加入脱磺化缓冲液，并在提取膜上受控泵送脱磺化缓冲液以使核酸中的在先前步骤中脱氨基的碱基脱磺化，并将所述碱基转化为尿嘧啶碱基，
-从提取膜上洗脱转化的核酸，以及
-分析转化的核酸。
在本发明的更具体的方面中，提供了自动化系统用于检测核酸源中的核酸甲基化状态的用途，自动化系统适于接收整个本申请中所定义的卡式芯片，系统控制以下步骤：
-将亚硫酸氢盐加入到引入自动化系统中的核酸源中，然后立即将核酸源加热至40至60℃的温度以产生包含核酸的裂解物并使核酸中存在的未甲基化的胞嘧啶脱氨基，
-向含有核酸的裂解物加入结合缓冲液以产生结合缓冲液和裂解物溶液，
-将核酸结合至提取膜并通过以慢于或等于0.1ml/s的流速在提取膜上泵送结合缓冲液和裂解物溶液以除去亚硫酸氢盐，
-向提取室中加入脱磺化缓冲液，并以慢于或等于0.1ml/s的流速在提取膜上泵送脱磺化缓冲液，以使核酸中的在第一步骤中脱氨基的碱基脱磺化并将所述碱基转化为尿嘧啶碱基，
-从提取膜上洗脱转化的核酸，以及
-分析转化的核酸。
本发明还有的一方面是提供用于通过样品中DNA的亚硫酸氢盐转化来检测甲基化的DNA的试剂盒，试剂盒包括：
-根据本发明的用于自动化系统的卡式芯片，包含亚硫酸氢盐、结合缓冲液和脱磺化缓冲液，以及
-使用说明书。
本发明在其所有方面和实施方式中允许通过省去由受训练的实验室人员进行的不受控制的手动处理和通过使用实验室设备的过程的自动化。更具体地，本发明省略了单独的DNA纯化、DNA变性、在柱洗脱和离心机上离心，而相反的是样品中DNA的亚硫酸氢盐转化所需的所有步骤都在自动化系统内进行，其控制所有的核酸处理步骤，包括自动化的流动和定时步骤。
附图说明
图1：显示卡式芯片中的A)亚硫酸氢盐转化后的甲基化DNA和B)亚硫酸氢盐转化后的未甲基化的DNA的PCR扩增结果的图表。由于未甲基化的特异性探针具有添加的VIC荧光团的事实，转化的未甲基化的DNA产生HEX信号。由于甲基化的特异性探针具有添加的FAM荧光团的事实，转化的甲基化DNA会产生具有FAM信号的PCR。
图2：未甲基化和甲基化的转化的DNA的扩增子的测序结果的图示。测序扩增子的部分用灰色表示。第一序列是未甲基化的DNA；所有的胞嘧啶是未甲基化的，并将在亚硫酸氢盐转化过程中变成胸腺嘧啶。应注意，转化后的扩增子的互补链与扩增子的序列互补。对于甲基化的转化的DNA，已知所有胞嘧啶都被甲基化并且将不会被亚硫酸氢盐转化改变，亚硫酸氢盐反应之前的互补链与反应后是相同的。
具体实施方式
总体上，本发明的方法旨在分析样品中的一个或多个靶序列中的一个或多个靶核苷酸的甲基化状态。本发明有助于分析患者样品中的DNA的甲基化状态。本发明在第一方面中提供了用于在含有提取膜的自动化系统中亚硫酸氢盐转化DNA(在样品中)的方法，由此处理的样品以几个自动泵送步骤在提取膜上泵送。通过去除在患者样品中预先DNA纯化和DNA变性的组合，以及通过将亚硫酸氢盐处理的样品在自动化系统内的提取膜上泵送，改善了使用亚硫酸氢盐转化过程的效能和易用性。
在本发明的一个实施方式中，提供了用于在包括包含提取膜的提取室的自动化系统中检测核酸甲基化状态的方法，所述方法包括以下步骤，或其特征在于：
-将核酸源引入自动化系统中，向核酸中加入亚硫酸氢盐，然后立即将核酸源加热至40至80℃的温度以产生包含核酸的裂解物并使存在于核酸中的未甲基化的胞嘧啶碱基脱氨基；
-向裂解物中加入结合缓冲液以产生结合缓冲液和裂解物溶液；
-通过在提取膜上受控泵送结合缓冲液和裂解物溶液，将核酸结合至提取膜并除去亚硫酸氢盐；
-向提取室中加入脱磺化缓冲液，并在提取膜上受控泵送脱磺化缓冲液而使核酸中的在第一步骤中脱氨基的碱基脱磺化并将碱基转化成尿嘧啶碱基；
-从提取膜洗脱转化的核酸；以及分析自动化系统中的转化的核酸。
可替换地，可以在另一个自动化系统，而不是用于进行亚硫酸氢盐转化的自动化系统中分析转化的核酸。从自动化系统中的提取膜上洗脱转化的核酸后，转化的核酸可以在另一个系统中，例如，在(DNA)测序仪中分析。
在本发明的上下文中，核酸是可以在CpG位点中包含甲基化的胞嘧啶碱基的基因组DNA。用亚硫酸氢盐处理DNA(亚硫酸氢盐转化或亚硫酸氢盐反应)将未甲基化的胞嘧啶化学改性为尿嘧啶，而(5-)甲基化的胞嘧啶保持不变。通过亚硫酸氢钠的(未甲基化)胞嘧啶脱氨基的化学过程涉及三个步骤：(1)磺化：将亚硫酸氢盐加成到胞嘧啶的5-6双键，(2)水解脱氨基：使获得的胞嘧啶-亚硫酸氢盐衍生物水解脱氨基而获得尿嘧啶-亚硫酸氢盐衍生物，(3)碱性脱磺化：通过碱处理除去磺酸基团，而获得尿嘧啶。一旦转化，可以使用期望的下游应用(随后用对甲基化的DNA相对于未甲基化的DNA特异性的引物扩增)测定DNA的甲基化分布。如本文中使用的术语“转化的DNA”和“转化的核酸”是指“亚硫酸氢盐处理的DNA”和“亚硫酸氢盐处理的核酸”。严格地考虑，只有DNA/核酸中的未甲基化的胞嘧啶会被亚硫酸氢盐处理化学改性或转化为尿嘧啶，而(5-)甲基化的胞嘧啶不会被亚硫酸氢盐处理改性或转化。然而，当DNA/核酸已经用亚硫酸氢盐处理时，其在整个文本中被描述为转化的DNA/转化的核酸。
在相关实施方式中，提供了用于在包括包含提取膜的提取室的自动化系统中通过亚硫酸氢盐转化样品中的DNA来检测甲基化DNA的替代方法，所述方法包括以下步骤或特征在于：
-将样品引入自动化系统中，向样品中加入亚硫酸氢盐并立即将样品加热至40至80℃的温度而产生包含DNA的裂解物并进行DNA的亚硫酸氢盐转化；
-向包含DNA的裂解物中加入结合缓冲液而产生结合缓冲液和裂解物溶液；
-通过在提取膜上受控泵送结合缓冲液和裂解物溶液，将DNA结合至提取膜并除去亚硫酸氢盐；
-向提取室中加入脱磺化缓冲液并在提取膜上受控泵送脱磺化缓冲液；
-从提取膜中洗脱转化的DNA；以及分析自动化系统中的转化的DNA。
本发明还包括用于在包括包含提取膜的提取室的自动化系统中通过样品中的DNA的亚硫酸氢盐转化而制备用于甲基化分析的样品的方法，方法包括以下步骤，或其特征在于：
-将样品引入自动化系统中，向样品中加入亚硫酸氢盐并立即将样品加热至40至80℃的温度以产生包含DNA的裂解物并进行DNA的亚硫酸氢盐转化；
-向包含DNA的裂解物中加入结合缓冲液以产生结合缓冲液和裂解物溶液；
-将DNA结合于提取膜上并通过在提取膜上受控泵送结合缓冲液和裂解物溶液而除去亚硫酸氢盐；
-向提取室中加入脱磺化缓冲液并在提取膜上受控泵送脱磺化缓冲液以进行转化的DNA的碱性脱磺化；和
-从提取膜上洗脱转化的DNA。
在本发明的优选实施方式中，核酸源的立即加热是至40至60℃的温度，和/或受控泵送优选使用慢于或等于0.1ml/s、0.001ml/s至0.1ml/s、更优选0.001至0.0017ml/s的流速。
裂解物：本发明的一个方面是释放生物样品中的核酸或DNA，使得可以直接在自动化系统中转化和分析核酸/DNA。根据本发明，将亚硫酸氢盐加入到核酸或生物样品，例如，组织样品中，并加热含有DNA的核酸或样品会产生裂解物。重要的是，裂解物应该是可以通过自动化系统传输的。裂解物包含应与亚硫酸氢盐一起温育并在自动化系统中分析(下游核酸/DNA分析)的DNA。
裂解室或样品制备室：此处将样品加入到自动化系统中，并在本发明的方法中，在升高的温度下用亚硫酸氢盐进行样品的裂解。裂解室是通过卡式芯片的流体路径中的第一步骤。在具体实施方式中，裂解室的底部位于系统中的加热元件(“珀耳帖”)的正上方。优选地，裂解室设计为最佳地将热传导至裂解室中上方的液体。在优选的实施方式中，裂解室内的所有反应温度通过裂解室的外表面的红外温度测量直接监测。也可以使用用于测量裂解室的反应温度的其它装置。
核酸源可以是包含核酸的任何来源；其可以是核酸的生物源，或包含核酸的任何溶液，例如，缓冲溶液中的DNA。
样品是来自人或动物体，优选患者样品的生物样品。生物样品包含核酸或包含待根据本发明方法分析的DNA的细胞。样品可以是组织样品、拭子样品、体液、体液沉淀物或灌洗样品。非限制性实例包括人或动物新鲜组织样品、冷冻组织样品、包埋在FFPE中的组织样品(福尔马林固定的石蜡包埋组织)、全血、血浆、血清、尿、粪便、唾液，脑脊液、腹膜流体、胸膜液、淋巴液、乳头抽吸液、痰液和射精液。样品可以使用本领域已知的任何合适的方法收集。
本发明涉及使用，用于例如结合亚硫酸氢盐转化的DNA和用于下游应用之前去除亚硫酸氢盐转化反应的提取膜。提取膜存在于卡式芯片的提取室中。核酸可以保留于提取膜上用于进一步纯化、浓缩或处理。合适的提取膜包括玻璃和二氧化硅膜。在优选的实施方式中，提取膜是二氧化硅膜。可以适当地使用一层或多层二氧化硅膜，例如2、3、4或5层二氧化硅膜，或包含2或3层二氧化硅膜层的复合膜。在具体的实施方式中，根据本发明的提取膜由(紧密地)彼此层叠的2或3层独立而不同的二氧化硅膜组成，以形成提取膜，由此在所述层叠二氧化硅膜上/通过所述层叠二氧化硅膜进行提取室中的液体的泵送。
在自动化系统中，方法在自动化过程中进行，这意味着过程的方法或步骤可以用能够以很少或没有外部控制或受人的影响而运作的装置或机器进行。在EP1896180、EP1904234和EP2419705中描述了合适的自动化系统，并因此引入描述本发明的某些实施方式中。优选使用包含一个或多个反应室和一个或多个流体室的基于卡式芯片的系统。一些流体室可以容纳用于从样品产生裂解物的流体。其他室可以容纳流体，例如反应缓冲液、洗涤液和扩增溶液。反应室用于进行检测的不同步骤，如洗涤、溶胞和扩增。
术语“卡式芯片”应理解为室和/或通道的自含式组件，其形成为可以适配于适用于接受(即，容纳或连接至)该卡式芯片的较大仪器的内部或外部的，作为整体传送或移动的单个物体。容纳于卡式芯片中的一些部件可以牢固地连接，而其它部件可以灵活地连接，并其相对于不同的卡式芯片的部件可移动。如本文所使用的术语“卡式芯片”主要是指“流体卡式芯片”，其为包括至少一个适合于处理、加工、排放或分析流体，优选液体的腔室或通道的卡式芯片。
自动化系统可以是开放或封闭的自动化系统。当样品已添加或插入基于卡式芯片的系统中时，基于卡式芯片的系统在系统运行期间关闭并保持关闭。封闭系统在其上包含所有必需的试剂，因此封闭的构造提供系统进行无污染检测的优点。可替换地，在自动化系统中可以使用开放式的可接触的卡式芯片。根据需要将必要的试剂加入开放式的卡式芯片中，然后样品可以插入开放式卡式芯片中，并且卡式芯片可以在封闭的自动化系统中运行。
在具体的设置中，自动化系统由以下元件组成：仪器、控制台和卡式芯片。仪器和控制台与可消耗卡式芯片组合使用。仪器包括用于进行测定的控制模块。控制台是在测定期间控制和监测仪器仪表的操作和卡式芯片状态的计算机。将在卡式芯片中将进行测定。在将样品插入预装载试剂的卡式芯片中后，将卡式芯片装入仪器中，而仪器控制卡式芯片中自动进行的测定。在进行测定后，控制台软件处理结果，并生成自动化系统最终用户可访问的报告。
在描述本发明的优选实施方式中，用于进行甲基化DNA检测分析所需的所有试剂预先安放于卡式芯片内，使得卡式芯片是用于进行核酸测定的内含式一次性装置。合适的装置包括基于DNA微阵列或蛋白微阵列的生物芯片和/或用于进行热循环的装置(例如，PCR、LCR等)和/或用于测序的装置。优选地，卡式芯片将并入用于进行热循环，优选聚合酶链反应(PCR)或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的装置。PCR方法是本领域熟知的，并且依赖于热循环，其由用于核酸解链和核酸的酶促复制的反应的反复加热和冷却的循环组成。这种扩增反应通常使用靶核酸和反应组分，如启动核酸合成所需的热稳定DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶)、核苷酸和寡核苷酸(例如，引物、探针、阻断剂...)。在优选的应用中，自动化系统将使用在系统中以干燥形式存在的试剂实施热循环。将如本发明所述的处理样品以形成包含核酸的裂解物，并且在样品上进行测定/在自动化系统中测试样品时重构预先放置于自动化系统中的试剂。核酸将在自动化系统中(从提取膜)洗脱。因此，洗脱液允许直接在自动化系统中进行下游PCR/核酸分析。通常，使用微气动控制器引导(“泵送”)裂解物、试剂和洗脱液，以完成测定。测定可以包括终点或实时检测；这两种方法都是本领域公知的。
泵送：在本发明的具体实施方式中，“泵送”是指流体(液体或气体)传输或移动通过提取室/通过提取膜，“受控泵送”是指在自动化系统中受控泵送或是指流动速率可以在系统中指定。因此，自动化系统控制自动化系统中泵送流体的流动速率(与使用例如重力或离心力将流体从一处移动到另一处是不同的)。受控泵送(流量控制)允许核酸与提取膜的最佳结合，并从含核酸的源中除去试剂或缓冲液。应用包括通过在提取膜上受控泵送结合缓冲溶液-裂解物溶液而最佳地去除亚硫酸盐试剂，和通过加入脱磺化缓冲液和在提取膜上受控泵送脱磺化缓冲液而使核酸中脱氨基的碱基最佳地脱磺化并将所述碱基转化成尿嘧啶碱基。受控泵送具有的优点是系统可以根据需要在所述系统中实施变速泵送。这对于控制如本文的本发明的方法步骤是特别有用的。
流速：在本发明的一个具体实施方式中，“流速”是指流体通过提取室/通过提取膜的泵送速度。在优选的实施方式中，流量以ml/s表示。
用于甲基化的DNA检测的当前可用试剂盒需要样品的预备，例如，DNA纯化(例如，从血液、组织或细胞中纯化DNA)和DNA变性步骤(通常通过将含有DNA的样品在98℃下加热10min)。在本发明的方法中已经消除了这些制备步骤。因此，与涉及核酸纯化和随后的核酸变性步骤，在用核酸转化试剂处理之前在95℃至98℃下加热10分钟的现有的核酸转化方法和系统相反，本发明保持样品在低于98℃、优选低于95℃、低于94℃、低于93℃、低于92℃、低于91℃、低于90℃、低于85℃、低于80℃、低于70℃、低于60℃的反应温度下，而不会较大程度上影响敏感和特异性的下游甲基化检测。实际上，将核酸转化试剂直接加入到核酸或样品中，并直接加热至40至60℃、45至55℃、更优选49至53℃的反应温度而产生裂解物。更优选地，用于产生裂解物的反应温度为40℃、42℃、44℃、46℃、48℃、49℃、50℃、50.5℃、51℃、51.5℃、52℃、53℃、54℃、56℃、58℃、59℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃、70℃、72℃、74℃、76℃、78℃、80℃。在一个具体实施方式中，用于生成裂解物的反应温度为51℃。
核酸/样品在裂解室中加热。自动化系统，更具体地仪器，包含加热元件，其可以将裂解室通过裂解室的壁加热至给定的反应温度。在裂解室中达到反应温度所需的时间与所要求的温度和待加热的裂解室(裂解物)内流体的体积相关/成正比。根据所需的反应温度的高度和待加热的体积，可能需要最多达5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟或30分钟以达到要求的温度。自动化系统通过裂解室外表面的温度测量控制裂解室内的反应温度。然而，裂解室内的温度可以比裂解室外表面的温度高至多达25℃。据估计，当裂解室的壁温设定于40℃，并且裂解室内具有700μL的转化试剂时，裂解室内的反应温度为51℃。
类似地，其中具有提取膜的提取室可以由位于自动化系统内，更具体地仪器内部，并位于提取室附近的加热元件加热。加热元件可以通过提取室的壁而加热提取室。在本发明的一个实施方式中，在亚硫酸氢盐去除步骤之后，通过向提取室中加入洗涤缓冲液并使用40℃的温度，使用慢于或等于0.1ml/s的流速下将洗涤缓冲液在提取膜上泵送，进行洗涤步骤。在本发明的另一个实施方式中，通过向提取室中加入脱磺化缓冲液并以20℃的温度以如本文所述的流量在提取膜上泵送脱磺化盐缓冲剂进行脱磺化。
本发明的所有方法、卡式芯片和系统直接将亚硫酸氢盐溶液加到核酸/样品中，并通过使用较低的加热温度和较长的温育时间产生包含核酸/DNA的裂解物而控制核酸降解。在优选的实施方式中，在合适的反应温度下，优选在40至60℃的反应温度下加热30分钟至1小时。为了获得最佳的灵敏度和特异性，在40至60℃的温度下加热时间为约1小时、在合适温度下加热时间优选为30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、51分钟、52分钟、53分钟、54分钟、55分钟、56分钟、57分钟、58分钟、59分钟、60分钟、61分钟、62分钟、63分钟、64分钟、65分钟、66分钟、67分钟、68分钟、69分钟、70分钟、75分钟、80分钟。温度的测量在本说明书的其他地方详细描述。
本发明要求在提取膜上泵送溶液，并且通常泵送步骤涉及在自动化系统中的受控泵送，更优选缓慢泵送，例如，以慢于或等于0.1ml/s的流速，优选0.001至0.1ml/s的流速，更优选以0.001至0.0017ml/s的流速泵送。在具体的实施方式中，在根据本发明的方法中，存在至少一个0.001至0.0017ml/s的流速。
用于甲基化的DNA检测的几种目前可用的试剂盒会使用首先用结合缓冲液洗涤的低洗脱旋转柱进行亚硫酸氢盐去除，然后将转化的DNA溶液加入到柱中以除去亚硫酸氢盐转化试剂。根据本发明，在将亚硫酸氢盐转化结合缓冲液加入到裂解物中后，将结合缓冲液和裂解物溶液以小于或等于0.1ml/s的流速，优选0.001至0.1ml/s流速，更优选0.001至0.0017ml/s在提取膜上泵送，以除去亚硫酸氢盐转化试剂，而不需要洗脱柱步骤。
用于甲基化DNA检测的几种目前可用的试剂盒需要多个离心步骤。在这些试剂盒中，脱磺化步骤通过以下进行：在室温下将转化的DNA溶液与脱磺化缓冲液一起温育20分钟，然后离心步骤；然后加入洗涤缓冲液，随后下一个离心步骤；然后加入洗脱缓冲液，随后再次离心步骤以洗脱转化的DNA。根据本发明，脱磺化步骤通过以下进行：向自动化系统中的转化的DNA溶液中加入脱磺化缓冲液，并以慢于或等于0.1ml/s的流速，优选0.001至0.1ml/s的流速，更优选0.001至0.0017ml/s的流速在提取膜上泵送脱磺化缓冲液，而无需离心步骤。类似地，通过在提取膜上以慢于或等于0.1ml/s的流速泵送洗涤缓冲液来进行洗涤步骤和从提取膜上洗脱转化的DNA，而不需要任何离心步骤。
核酸从结合缓冲液和裂解物溶液中至提取膜的最佳结合将涉及慢于或等于0.1ml/s、或0.001至0.1ml/s、或0.001至0.0017ml/s的流速，优选不高于0.1ml/s、0.090ml/s、0.080ml/s、0.075ml/s、0.070ml/s、0.0625ml/s、0.060ml/s、0.050ml/s、0.040ml/s、0.030ml/s、0.020ml/s、0.01ml/s、0.0090ml/s、0.0080ml/s、0.0070ml/s、0.0060ml/s、0.0050ml/s、0.0040ml/s、0.0030ml/s、0.0020ml/s、0.0019ml/s、0.0018ml/s、0.0017ml/s、0.0016ml/s、0.0015ml/s、0.0014ml/s、0.0013ml/s、0.0011ml/s或0.0010ml/s的流速。最优选地，核酸从结合缓冲液和裂解物溶液至提取膜的最佳结合将涉及0.1ml/s的流速。
通过在提取膜上泵送结合缓冲液和裂解物溶液来从结合缓冲液和裂解物溶液中除去亚硫酸氢盐，将涉及慢于或等于0.1ml/s、或0.001至0.1ml/s、或0.001至0.0017ml/s的流速，优选不高于0.1ml/s、0.090ml/s、0.080ml/s、0.075ml/s、0.070ml/s、0.0625ml/s、0.060ml/s、0.050ml/s、0.040ml/s、0.030ml/s、0.020ml/s、0.01ml/s、0.0090ml/s、0.0080ml/s、0.0075ml/s、0.0070ml/s、0.0060ml/s、0.0050ml/s、0.0040ml/s、0.0030ml/s、0.0020ml/s、0.0019ml/s、0.0018ml/s、0.0017ml/s、0.0016ml/s、0.0015ml/s、0.0014ml/s、0.0013ml/s、0.0012ml/s、0.0011ml/s或0.0010ml/s的流速。最优选地，在提取膜上从结合缓冲液和裂解物溶液中最佳的亚硫酸氢盐去除将涉及0.1ml/s的流速。
通过在提取膜上泵送脱磺化缓冲液的核酸的最佳脱磺化将涉及慢于或等于0.1ml/s、或0.001至0.1ml/s、或0.001至0.0017ml/s的流速，优选不高于0.1ml/s、0.090ml/s、0.080ml/s、0.075ml/s、0.070ml/s、0.0625ml/s、0.060ml/s、0.050ml/s、0.040ml/s、0.030ml/s、0.020ml/s、0.01ml/s、0.0090ml/s、0.0080ml/s、0.0075ml/s、0.0070ml/s、0.0060ml/s、0.0050ml/s、0.0040ml/s、0.0030ml/s、0.0020ml/s、0.0019ml/s、0.0018ml/s、0.0017ml/s、0.0016ml/s、0.0015ml/s、0.0014ml/s、0.0013ml/s、0.0012ml/s、0.0011ml/s或0.0010ml/s的流速。最优地，选通过在提取膜上泵送脱磺化缓冲液对核酸的最佳脱磺化将涉及0.0017ml/s的流速。
(碱性)脱磺化是通过以慢于或等于0.1ml/s的流速在提取膜上泵送脱磺化缓冲液进行的。对于转化的DNA的泵送步骤的碱性脱磺化，流速应该优选保持非常慢，优选不高于0.01ml/s、0.075ml/s、0.0625ml/s、0.0090ml/s、0.0080ml/s、0.0075ml/s、0.0070ml/s、0.0060ml/s、0.0050ml/s、0.0040ml/s、0.0030ml/s、0.0020ml/s、更优选不高于0.0017ml/s、甚至更优选为0.001至0.0017ml/s。通过保持较低的提取膜上的泵送流速，当在膜上泵送时，例如在亚硫酸氢盐转化期间可能在样品中形成的杂质和有害的元素从处理的样品中适当地去除。从裂解物泵送步骤中去除亚硫酸氢盐可以比转化的DNA泵送步骤的(碱性)脱磺化稍微更快地进行。
在本发明的一个优选实施方式中，提供了用于在包括包含提取膜的提取室的自动化系统中检测核酸甲基化状态的方法，所述方法包括以下步骤，或其特征在于：
-将核酸源引入自动化系统中，向核酸中加入亚硫酸氢盐，然后立即将核酸源加热至40至60℃的温度以产生包含核酸的裂解物，并使存在于裂解物中的核酸中的未甲基化胞嘧啶碱基脱氨基；
-向裂解物中加入结合缓冲液而产生结合缓冲液和裂解物溶液；
-通过以0.001至0.0017ml/s的流速在提取膜上泵送结合缓冲液和裂解物溶液，将核酸结合于提取膜并除去亚硫酸氢盐，
-向提取室中加入脱磺化缓冲液，并以0.001至0.0017ml/s的流速在提取膜上泵送脱磺化缓冲液以使核酸中的在第一步骤中脱氨基的碱基脱磺化并将碱基转化为尿嘧啶碱基；
-从提取膜洗脱转化的核酸；以及分析自动化系统中的转化的核酸。
在进一步优选的实施方式中，提供了用于在包括包含提取膜的提取室的自动化系统中通过样品中DNA的亚硫酸氢盐转化检测甲基化DNA的方法，所述方法包括以下步骤，或其特征在于：
-将样品引入自动化系统中，向样品中加入亚硫酸氢盐并立即将样品加热至40至60℃的温度以产生包含DNA的裂解物并进行所述DNA的亚硫酸氢盐转化；
-向包含DNA的裂解物中加入结合缓冲液以产生结合缓冲液和裂解物溶液；
-通过以0.001至0.0017ml/s的流速在提取膜上泵送结合缓冲液和裂解物溶液，将DNA结合于提取膜并除去亚硫酸氢盐；
-向提取室中加入脱磺化缓冲液，并以0.001至0.0017ml/s的流速在提取膜上泵送脱磺化缓冲液，以进行转化的DNA的碱脱磺化；
-从提取膜中洗脱转化的DNA；和分析自动化系统中的转化的DNA。
根据本发明，亚硫酸氢盐去除步骤和(碱性)脱磺化步骤通过在依次两个独立且不同的泵送步骤中在所述(同一个)提取膜上分别泵送结合缓冲液和裂解物溶液以及脱磺化缓冲液来进行。在更优选的实施方式中，亚硫酸氢盐去除步骤和(碱性)脱磺化步骤通过依次在提取膜上泵送而进行，由此脱磺化泵送步骤比亚硫酸氢盐去除泵送步骤进行更慢。此外，洗涤缓冲液可以在一个或多个洗涤步骤中在提取膜上泵送，其优选处于亚硫酸氢盐去除-泵送步骤和(碱性)脱磺化-泵送步骤之间，并在(碱性)脱磺化-泵送步骤之后再次泵送。在优选的实施方式中，洗涤缓冲液以0.0625ml/s的流速在提取膜上泵送。
在本发明的一个实施方式中，提供了用于在包括包含提取膜的提取室的自动化系统中检测核酸甲基化状态的方法，所述方法包括以下步骤，或其特征在于：
-将核酸源引入自动化系统中，向核酸中加入亚硫酸氢盐，然后立即将核酸源加热至40至60℃的温度以产生包含核酸的裂解物，并使存在于核酸中的未甲基化的胞嘧啶碱基脱氨基；
-向裂解物中加入结合缓冲液以产生结合缓冲液和裂解物溶液；
-通过在2至15min的时段内以慢于或等于0.1ml/s的流速在提取膜上泵送结合缓冲液和裂解物溶液，将核酸结合于提取膜并去除亚硫酸氢盐；
-向提取室中加入脱磺化缓冲液，并在6至20分钟的时段内以慢于或等于0.1ml/s的流速在提取膜上泵送脱磺化缓冲液，以使核酸中的在第一步骤中脱氨基的碱基脱磺化并将所述碱基转化成尿嘧啶碱基；
-从提取膜洗脱转化的核酸；以及分析自动化系统中的转化的核酸。
以与本文已经描述的相似的方式，提供了在包括包含提取膜的提取室的自动化系统中通过样品中的DNA的亚硫酸氢盐转化而检测甲基化DNA的方法，所述方法包括以下步骤：
-将样品引入自动化系统中，向样品中加入亚硫酸氢盐，然后立即将样品加热至40至60℃的温度以产生包含DNA的裂解物并进行DNA的亚硫酸氢盐转化，
-向包含DNA的裂解物中加入结合缓冲液以产生结合缓冲液和裂解物溶液；
-通过在2至15分钟的时段内以小于或等于0.1ml/s的流速在提取膜上泵送结合缓冲液和裂解物溶液，将核酸结合于提取膜并去除亚硫酸氢盐；
-向提取室中加入脱磺化缓冲液，并在6至20分钟的时段内以小于0.1ml/s的流速在提取膜上泵送脱磺化缓冲液，以进行转化的DNA的碱性脱磺化；
-从提取膜中洗脱转化的DNA；以及分析自动化系统中的转化的DNA。
如上所述，改进了亚硫酸氢盐转化过程的效能并允许最小的DNA降解。因此，本发明的方法尤其适用于具有相对少量的基因组DNA的样品的甲基化分析。例如，一些样品可以包含10、9、8、7、6、5、4、3、2或1纳克的DNA。其它样品可以包含少于500、400、300、200或100皮克的DNA。这些样品以尿液和血浆为例，其中包含相对少量的循环DNA。在这方面，本发明的方法适用于包含耗尽或者稀少的基因组DNA的样品的分析。
本发明的方法在自动化系统中找到它们的应用。在某些实施方式中，自动化系统将容纳用于检测样品中甲基化的DNA的卡式芯片。在本发明的一个实施方式中，卡式芯片用于根据本发明的方法检测样品中，例如，在人体组织样品中的甲基化DNA。优选地，卡式芯片包括提取室，提取室包含提取膜。甚至更优选地，卡式芯片包括裂解室和提取室，提取室包含提取膜，并且其中在裂解室和提取室之间存在用于将流体从裂解室传输到提取室的通道。通道是卡式芯片中将裂解室连接到提取室的流体路径。通道可以是简单的通道或其自身在裂解室和提取室之间含有另外的腔室的通道。甚至更优选地，卡式芯片包括裂解室，提取室，提取室包含提取膜，并且其中在裂解室和提取室之间存在用于将流体从裂解室传输到提取室的通道，以及用于卡式芯片中的PCR过程步骤的PCR模块。
因此，合适的卡式芯片包括多个室，优选至少三个室：裂解室、提取室，提取室含有提取膜，以及允许下游DNA分析的PCR室。可能需要其他腔室存储适合用于核酸甲基化检测的过程的试剂。流体通道提供不同腔室之间的连接，并允许按照本发明所述的方法所需将流体(液体和气体)从一个腔室传送到另一个腔室。
通常，卡式芯片中的裂解室易于：
-接收样品，
-向样品中加入亚硫酸氢盐溶液，
-将样品直接加热至40至60℃以产生包含DNA的裂解物并进行裂解物中DNA的亚硫酸氢盐转化，
-向溶胞液中加入结合缓冲液。
亚硫酸氢盐溶液和结合缓冲液将储存于卡式芯片中的其它腔室或容器中，并且其它腔室或容器通过流体通道与裂解室连接。
正说明书的其它地方详细描述的，卡式芯片中的提取室含有提取膜。卡式芯片中的提取室易于：
-接收裂解物，
-通过以慢于或等于0.1ml/s、0.001至0.1ml/s、更优选0.001至0.0017ml/s的流速在提取膜上泵送结合缓冲液和裂解物溶液，允许随后除去亚硫酸氢盐，
-允许随后向提取室中加入脱磺化缓冲液，并在提取膜上以慢于或等于0.1ml/s、0.001至0.1ml/s、更优选0.001至0.0017ml/s的流速泵送脱磺化缓冲液，以进行转化的DNA的碱脱磺化，以及
-允许随后从提取膜中洗脱转化的DNA。
为了允许进行不同的步骤，在裂解室和提取室之间存在用于将流体从裂解室传输到提取室的通道。卡式芯片还包含允许转化的DNA的下游分析的PCR室。在提取室和PCR室之间存在用于将转化的DNA从提取室传输到PCR室的流体通道。
本发明提供用于在自动化系统中根据本发明的方法检测核酸甲基化状态的卡式芯片，所述卡式芯片包括包含提取膜、亚硫酸氢盐、结合缓冲液和脱磺化缓冲液的提取室。当结合缓冲液和裂解物溶液在提取膜上传输时，卡式芯片的提取室中的提取膜易于结合核酸并除去亚硫酸氢盐。
本发明还提供了用于检测核酸甲基化状态的卡式芯片，卡式芯片包括：
-裂解室，其易于接受核酸源，将亚硫酸氢盐溶液加入到核酸源中，然后立即将核酸源加热至40至60℃的温度，以产生包含核酸的裂解物并使存在于所述核酸中的未甲基化的胞嘧啶碱基脱氨基，并将结合缓冲液加入裂解物中以形成结合缓冲液和裂解物溶液；
-提取室，包含提取膜，其易于接受结合缓冲液和裂解物溶液，允许随后通过以慢于或等于0.1ml/s、0.001至0.1ml/s、更优选0.001至0.0017ml/s的流速在提取膜上泵送结合缓冲液和裂解物溶液而除去亚硫酸氢盐，允许随后向提取室中加入脱磺化缓冲液，并在提取膜上以小于或等于0.1ml/s，0.001至0.1ml/s，更优选0.001至0.0017ml/s的流速泵送脱磺化缓冲液，以使核酸中在第一步骤中脱氨基的碱基进行碱脱磺化并将碱基转化为尿嘧啶碱基，并允许随后从提取膜中洗脱转化的核酸，
其中在裂解室和提取室之间存在用于将流体从裂解室传输到提取室的通道，和，
-PCR室，允许转化的核酸的下游分析，其中在提取室和PCR室之间存在用于将转化的核酸从提取室传输到PCR室的通道。
本发明还提供了用于检测样品中甲基化DNA的卡式芯片，卡式芯片包括：
-裂解室，其易于接受样品，向样品中加入亚硫酸氢盐溶液，加热样品以产生包含DNA的裂解物，并进行裂解物中的DNA的亚硫酸氢盐转化，并向转化的裂解物中加入结合缓冲液以形成结合缓冲液和裂解物溶液，
-提取室，其中具有易于接收结合缓冲液和裂解物溶液的提取膜，允许随后通过以慢于或等于0.1ml/s、0.001至0.1ml/s、更优选0.001至0.0017ml/s的流速在提取膜上泵送结合缓冲液和裂解物溶液而除去亚硫酸氢盐，允许随后向提取室中加入脱磺化缓冲液，并以小慢于或等于0.1ml/s、0.001至0.1ml/s、更优选0.001至0.0017ml/s的流速在提取膜上泵送脱磺化缓冲液，以进行转化的DNA的碱性脱磺化，并允许随后将转化的DNA从提取膜洗脱，
其中在裂解室和提取室之间存在用于将流体从裂解室传输到提取室的通道，以及
-PCR室，允许转化的DNA的下游分析，其中在提取室和PCR室之间存在用于将转化的DNA从提取室传输到PCR室的通道。
在最优选的实施方式中，卡式芯片包含裂解室、8个试剂容器、过滤区域、其中具有提取膜的提取室、PCR室和废料室以及所有的连接通道。试剂容器储存检测甲基化核酸或DNA所需的必需试剂(脱磺化缓冲液，洗涤缓冲液等)。
本发明还提供了用于自动检测甲基化DNA的系统，系统适用于实施本发明的方法。应用如上所述的方法可以需要自动化系统接收如上所述的卡式芯片。
在本发明的具体实施方式中，在自动化系统中，插入/装载入卡式芯片，卡式芯片包括裂解室和其中具有提取膜的提取室，并且其中在裂解室和提取物之间存在流体通道，其中流体通道包含过滤器。自动化系统的元件之一的仪器控制在卡式芯片内要进行的测定步骤(样品中DNA的亚硫酸氢盐转化)。卡式芯片预装有必要的试剂和缓冲液。将样品引入到卡式芯片的裂解室中后，将卡式芯片装载到仪器中，而仪器控制卡式芯片中自动进行的测定。将亚硫酸氢盐加入到卡式芯片的裂解室中的样品中，并将裂解室中的反应温度升高到至少40至60℃，以进行样品中DNA的亚硫酸氢盐转化。在裂解室中的亚硫酸氢盐转化后，将结合缓冲液加入到裂解室中以产生结合缓冲液和裂解物溶液。从裂解室，将结合缓冲液和裂解物溶液通过通道引导至卡式芯片中的提取室中。通道可以预见具有一个或多个过滤器。这些过滤器的主要功能是净化裂解物，以去除裂解室中形成的碎屑，以除去任何可能足够大而堵塞自动化系统或卡式芯片中的下游窄通道的颗粒。在提取室中，通过以如上所述的流速在提取膜上泵送结合缓冲液和裂解物溶液而将来自裂解物的DNA与提取膜结合并除去亚硫酸氢盐。然后以0.001至0.1ml/s的流速在提取膜上泵送包含乙醇的洗涤缓冲液，以除去任何可能的剩余的结合缓冲液和裂解物溶液。将脱磺化缓冲液加入提取室中，并以如上所述的流速在提取膜上泵送以进行转化的DNA的碱性脱磺化。由该具体实施方式，本领域技术人员应该理解的是，本发明的自动化系统或卡式芯片还可以包括过滤器。在具体的实施方式中，卡式芯片因此包含裂解室和提取室之间的通道中的过滤器，以及提取室中的提取膜。显而易见的是，当流体通过所述过滤器时，这种过滤器实施过滤功能。过滤器可以具有单过滤器构造结构或用于更困难的样品三叠过滤器构造。
因此，在另一方面中，本发明涉及用于检测核酸源中的核酸甲基化状态的自动化系统，自动化系统适于接收包括包含提取膜的提取室的卡式芯片，所述系统控制以下步骤：
-将亚硫酸氢盐加入到引入自动化系统中的核酸源中，然后立即将核酸源加热至40至60℃的温度以产生包含核酸的裂解物并使存在于所述核酸中的未甲基化的胞嘧啶碱基脱氨基，
-向包含核酸的裂解物中加入结合缓冲液以产生结合缓冲液和裂解物溶液，
-通过以慢于或等于0.1ml/s、或0.001至0.1ml/s、更优选0.001至0.0017ml/s的流速在提取膜上泵送结合缓冲液和裂解物溶液，将核酸结合至提取膜并除去亚硫酸氢盐，
-向提取室中加入脱磺化缓冲液，并以慢于或等于0.1ml/s、0.001至0.1ml/s、更优选0.001至0.0017ml/s的流速在提取膜上泵送脱磺化缓冲液，以使核酸中的在第一步骤中脱氨基的碱基脱磺化并将碱基转化成尿嘧啶碱基，
-从提取膜洗脱转化的核酸，以及
-分析转化的核酸。
本发明还设想用于通过样品中DNA的亚硫酸氢盐转化而自动检测甲基化DNA的系统，系统适于接收具有至少一个其中具有提取膜的提取室的卡式芯片，系统控制以下步骤：
-将亚硫酸氢盐加入到自动化系统中引入的样品中，并直接加热样品至40至60℃以产生包含DNA的裂解物并进行DNA的亚硫酸氢盐转化；
-向包含DNA的裂解物中加入结合缓冲液以产生结合缓冲液和裂解物溶液；
-通过以慢于或等于0.1ml/s、或0.001至0.1ml/s、优选0.001至0.0017ml/s的流速在提取膜上泵送结合缓冲液和裂解物溶液，将DNA结合至提取膜并除去亚硫酸氢盐；
-向提取室中加入脱磺化缓冲液，并通过以慢于或等于0.1ml/s、或0.001至0.1ml/s、优选0.001至0.0017ml/s的流速在提取膜上泵送脱磺化缓冲溶液，进行转化的DNA的碱性脱磺化；
-从提取膜中洗脱转化的DNA；以及
-分析转化的DNA。
自动化系统包含将流体从一处泵送到另一处的元件。系统的泵送系统可以调节为以所需的具体增长速率在卡式芯片内的提取膜上泵送液体。提取膜上的泵送步骤按照自动化系统中的编程机械进行，并取代了通过在低洗脱自旋柱上处理样品和/或通过离心的样品的手动净化(例如，亚硫酸氢盐去除，脱磺化和洗涤步骤)。这样的自动化允许在短时间内的样品高通量，而在本发明的方法步骤期间没有任何人的交互。
在本发明的一个实施方式中，提取膜上的泵送步骤可以在提取膜上以两个或多个泵送步骤进行，例如，通过将一定体积的脱磺化缓冲液以脱磺化缓冲液的原始体积的一半分两次在提取膜上泵送。类似地，在洗涤步骤期间的泵送，例如，将样品与洗涤缓冲液一起在提取膜上泵送，可以在多于一个泵送步骤中进行。在一个实施方式中，第一洗涤步骤在1个泵送步骤中进行，而最后的洗涤步骤在3个泵送步骤中进行。在另一个实施例中，第一洗涤步骤在3个泵中进行，而最后的洗涤步骤在7个泵中进行。
在优选的实施方式中，用于本发明的方法、卡式芯片和系统中的样品是人组织样品。
在本发明的优选实施方式中，自动化系统中的DNA分析/核酸分析包括DNA扩增/核酸扩增。根据本发明特别优选的扩增方法是本领域已知的甲基化特异性PCR方法(MSP)，例如，使用亚硫酸氢盐转化的特异性测定的实时PCR(RT-PCR)反应。在优选的实施方式中，方法可以进一步包括检测扩增的核酸的步骤。存在利用寡核苷酸与特异性序列的杂交和随后的杂交体检测的基于探针的测定。还可以在本领域技术人员已知的进一步步骤之后对靶核酸测序。在本发明的特别优选的实施方式中，通过在扩增期间测定荧光强度，例如采用用于检测未甲基化转化的DNA的特异性信号和用于检测甲基化DNA的特异性信号检测核酸。这种方法需要监控实时荧光。
通常，评估包含至少一个基因连同一个、两个、三个或四个或五个另外的基因的一组基因的甲基化状态，其中组中的至少一个基因中的甲基化状态的变化指示疾病如癌症的倾向或发生。术语“甲基化状态”是指感兴趣的核酸或基因中一个或多个CpG二核苷酸内甲基化胞嘧啶残基的存在或不存在。在许多基因中，CpG岛发现于启动子区域，并可以开始(恰好)于启动子的上游，并向下游延伸进入转录区域。当启动子区域中的CpG分布相当稀少时，就可以在内含子和/或外显子区域内评估甲基化水平。用于评估的区域可以是包含内含子序列和外显子序列两者并因此重叠两个区域的区域。
优选地，根据本发明的方法用于诊断，用于对某些甲基化模式的存在筛选来自人或甚至动物体的组织或流体。核酸或DNA中甲基化胞嘧啶碱基的存在或不存在指示细胞增殖性病症。根据本发明的方法用于增强核酸中甲基化位点检测的速度和用户友好性(无需手动处理)。
可替换地，根据本发明的方法用于检测样品中癌症的倾向或发生率，其中甲基化DNA状态的变化的检测指示癌症的倾向或发生率。所述方法可以用于预测对使用癌抑制剂的癌症治疗的抵抗的可能性，或者选择合适的癌症治疗方案的可能性。或者，方法可以用于预测癌症抑制剂治疗癌症的抗性/成功治疗的可能性，其中甲基化变化的检测指示对治疗的抗性的可能性低于/高于如果甲基化改性未检测到的情况。进一步的用途可以包括选择合适的癌症治疗方案，其中甲基化状态变化的检测会导致癌症抑制剂的选择，并且其中如果未检测到甲基化变化，则不选择癌症抑制剂用于治疗，或相反。
继已经广泛描述的本发明的自动化系统，在最优选的实施方式中，自动化系统应用在包含含有裂解室、其中具有提取膜的提取室的卡式芯片的自动化系统中应用检测患者样品中的甲基化DNA的方法，包括以下步骤：
-将患者样品引入自动化系统的裂解室中，
-将亚硫酸氢盐加入裂解室中的样品中，然后立即在裂解室内在40至60℃的温度下加热1小时，以产生包含DNA的裂解物并进行DNA的亚硫酸氢盐转化，
-向包含DNA的裂解物中加入结合缓冲液以产生结合缓冲液和裂解物溶液，
-将结合缓冲液和裂解物溶液从裂解室传输到提取室，提取室含有提取膜，
-将DNA从裂解物结合至提取膜，并通过在提取膜上以0.001至0.1ml/s，更优选0.001至0.0017ml/s的流速泵送结合缓冲液和裂解物溶液而去除亚硫酸氢盐，以除去亚硫酸氢盐，结合缓冲液和裂解物，而来自裂解物的DNA仍保留于提取膜上，
-以0.001至0.1ml/s的流速在提取膜上泵送包含乙醇的洗涤缓冲液，以除去任何可能的剩余的结合缓冲液和裂解物溶液，
-向提取室中加入脱磺化缓冲液，并在提取膜上以0.001至0.1ml/s，更优选0.001至0.0017ml/s的流速泵送脱磺化缓冲液，以进行转化的DNA的碱性脱磺化，
-向提取室中加入包含乙醇的洗涤缓冲液，并在至少3个泵送步骤，更优选7个泵送步骤中，在提取膜上以0.001至0.1ml/s的流速泵送洗涤缓冲液，以除去任何可能的剩余的脱磺化缓冲液，
-通过在提取膜上以0.1ml/s的流速泵送空气进行乙醇蒸发，
-通过在提取膜上以0.001至0.1ml/s的流速泵送洗脱缓冲液或水，从提取膜上洗脱转化的DNA，
以及在自动化系统中分析转化的DNA。
通过将裂解室的壁温调节到选择的具体温度可以调节自动化系统中的卡式芯片中的裂解室的温度。在具体实施方式中，通过将自动化系统的珀耳帖加热至40℃而将裂解室的壁温升高到至少40℃。珀尔帖是用于加热裂解室(内的液体)的元件，其位于裂解室的外表面上。壁温设置于40℃是指卡式芯片的裂解室内的真实反应温度在裂解室内至少为40℃，甚至约50至60℃。因此，在本发明的方法中，温度直接从室温达到至少或等于40℃的反应温度：当在裂解室中向患者样品中加入转化试剂(亚硫酸氢盐)时，反应温度在裂解室中立即升至至少40℃或甚至约50至60℃达1小时以产生裂解物并使所述患者样品中的核酸中的胞嘧啶碱基脱氨基(以进行所述患者样品中的DNA的亚硫酸氢盐转化)。在Zymo ResearchEZ DNA Methylation-LightningTM试剂盒方案中，指出亚硫酸氢盐转化试剂加入到DNA样品中，并随后将温度升至98℃8分钟，并在下一步骤中升至54℃60分钟。因此在自动化系统中，该第一步骤，即在98℃下的加热已被消除。可替换地，当样品插入时，转化试剂(亚硫酸氢盐)已经存在于裂解室中。因此，当将患者样品加入含有预先填充的转化试剂(亚硫酸氢盐)的裂解室中时，反应温度在裂解室中立即升高至至少40℃，或甚至至约50至60℃达1小时以产生裂解物并使所述患者样品中的核酸中的胞嘧啶碱基脱氨基(以进行所述患者样品中的DNA的亚硫酸氢盐转化)。本领域技术人员应当理解的是，本发明的几个步骤可以以另一顺序进行，例如，可以在将亚硫酸氢盐试剂加入到核酸中之后，同时或在之前将结合缓冲液加入到核酸中。
所需的转化试剂的体积取决于裂解室的体积。在具体实施方式中，在裂解室中使用的体积为700μL的转化试剂(例如亚硫酸氢盐试剂)以确保在自动化系统中的流体泵送正常工作。在目前市场上可获得的Zymo Research EZ DNA Methylation-LightningTM试剂盒中，对于20μL的DNA样品使用了体积130μL的转化试剂。因此，根据本发明的具体实施方式，与试剂盒相比，转化试剂的体积增加至700μL，以充分充满自动化系统中的裂解室而使卡式芯片中的泵送系统可以正常工作。可替换地，根据需要可以将其它(更高)的量的转化试剂加入到裂解室中的样品中(取决于所使用的样品)，例如，700μL、800μL、900μL、1ml、1100μL、1200μL、1300μL、1400μL、1500μL、1600μL、1700μL、1800μL、1900μL、2ml、2100μL、2200μL、2300μL、2400μL、2500μL、2600μL、2700μL、2800μL、2900μL或3ml亚硫酸氢盐试剂可以加入引入自动化系统的样品中，以根据本发明的方法进行核酸/DNA的亚硫酸氢盐转化。
在另一个实施方式中，本发明涉及用于在自动化系统中进行亚硫酸氢盐反应的试剂盒，自动化系统包括：
-根据本发明的用于自动化系统的卡式芯片，包含亚硫酸氢盐，结合缓冲液和脱磺化缓冲液，以及
-使用说明书。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于在自动化系统中进行亚硫酸氢盐反应的试剂盒，包括：
-根据本发明的用于自动化系统的卡式芯片，包括包含提取膜、亚硫酸氢盐、结合缓冲液和脱磺化缓冲液的提取室，以及
-使用说明书。
优选地，根据本发明的方法、卡式芯片和试剂盒用于诊断，例如用于筛选来自人或甚至动物体的组织或液体的某些甲基化模式的存在，例如，预测细胞增殖性疾病发展的风险。本发明的方法、检测系统、卡式芯片和试剂盒及它们的用途可以实施用于筛选、早期检测、疾病进展和预测癌症疗法响应的结果。
条款
条款1.一种用于在包括包含提取膜的提取室的自动化系统中检测核酸甲基化状态的方法，所述方法包括以下步骤：
-将核酸源引入自动化系统中，将亚硫酸氢盐加入到核酸中，然后立即将核酸源加热至40至80℃的温度以产生包含核酸的裂解物，并使存在于所述核酸中的未甲基化的胞嘧啶碱基脱氨基；
-向裂解物加入结合缓冲液以产生结合缓冲液和裂解物溶液；
-通过在提取膜上受控泵送结合缓冲液和裂解物溶液将核酸结合于提取膜上并除去亚硫酸氢盐；
-向提取室中加入脱磺化缓冲液，并在提取膜上受控泵送脱磺化缓冲液，以使核酸中的在前一步骤中脱氨基的碱基脱磺化并将所述碱基转化成尿嘧啶碱基，
-从提取膜洗脱转化的核酸；和分析自动化系统中的转化的核酸。
条款2.根据条款1的用于在包括包含提取膜的提取室非自动化系统中检测核酸甲基化状态的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将核酸源引入自动化系统中，向核酸中加入亚硫酸氢盐，然后立即将核酸源加热至40℃至80℃的温度以产生包含核酸的裂解物并使存在于所述核酸中的未甲基化的胞嘧啶碱基脱氨基；
b)向裂解物中加入结合缓冲液以产生结合缓冲液和裂解物溶液；
c)通过在提取膜上受控泵送结合缓冲液和裂解物溶液将核酸结合至提取膜并除去亚硫酸氢盐；
d)向提取室中加入脱磺化缓冲液，并在提取膜上受控泵送脱磺化缓冲液，以使核酸中的在步骤a)中脱氨基的碱基脱磺化并将所述碱基转化成尿嘧啶碱基，
e)从提取膜上洗脱转化的核酸；以及在自动化系统中分析转化的核酸。
条款3.根据条款1或2的方法，其中核酸源的立即加热处于40℃至60℃的温度下，和/或受控泵送以慢于或等于0.1ml/s的流速进行。
条款4.根据条款1至3中任一项的方法，其中步骤c)中的流速和步骤d)中的流速包含0.001ml/s至0.1ml/s。
条款5.根据条款1至4中任一项的方法，其中步骤c)中的流速和步骤d)中的流速中的至少一种为0.001至0.0017ml/s。
条款6.根据条款1至5中任一项的方法，其中步骤d)中的流速比步骤c)中的流速慢。
条款7.根据条款1至6中任一项的方法，其特征在于核酸分析包括核酸扩增。
条款8.根据条款1至7中任一项的方法，其中核酸中甲基化胞嘧啶碱基的存在或不存在的检测是细胞增殖性病症的指示。
条款9.根据条款1至8中任一项的方法，其中核酸源是人组织样品。
条款10.根据条款1至9中任一项的方法，其中提取膜是二氧化硅膜或包含2或3层二氧化硅膜层的复合膜。
条款11.卡式芯片用于根据条款1至10中任一项的方法检测核酸甲基化状态的用途。
条款12.根据条款11的卡式芯片的用途，所述卡式芯片包括包含提取膜的提取室。
条款13.根据条款11或12的卡式芯片的用途，其特征在于卡式芯片包括其中进行根据条款1至10中任一项的方法的步骤a)至b)的裂解室，和其中进行根据条款1至10的方法的步骤c)至e)的提取室，其中在裂解室和提取室之间存在用于将流体从裂解室传输到提取室的通道。
条款14.自动化系统用于检测核酸源中的核酸甲基化状态的用途，自动化系统适于接收如条款11至13中任一项所定义的卡式芯片，系统控制以下步骤：
a)将亚硫酸氢盐加入到引入系统中的核酸源中，然后立即将核酸源加热至40℃至80℃的温度以产生包含核酸的裂解物并使存在于所述核酸中的未甲基化的胞嘧啶碱基脱氨基，
b)向包含核酸的裂解物中加入结合缓冲液以产生结合缓冲液和裂解物溶液，
c)通过在提取膜上受控泵送结合缓冲液和裂解物溶液，将核酸结合于提取膜上并除去亚硫酸氢盐，
d)向提取室中加入脱磺化缓冲液，并在提取膜上受控泵送脱磺化缓冲液以使核酸中的在步骤a)中脱氨基的碱基脱磺化并将所述碱基转化为尿嘧啶碱基，
e)从提取膜上洗脱转化的核酸，以及
f)分析转化的核酸。
条款15.根据条款14的系统的用途，其中核酸源的即时加热处于40℃至60℃的温度，和/或其中以小慢于或等于0.1ml/s的流速进行受控泵送。
条款16.根据条款14或15的系统的用途，其中核酸源是人组织样品。
条款17.一种用于在自动化系统中进行亚硫酸氢盐反应的试剂盒，包括：
g)如条款11至13中任一项所定义的卡式芯片，用于自动化系统，包含亚硫酸氢盐、结合缓冲液和脱磺化缓冲液，以及
h)使用说明书。
以下实施例提供用于辅助理解本发明，其真实范围在所附权利要求书中阐述。
实施例
实施例1.使用IdyllaTM系统在IdyllaTM卡式芯片中进行添加的DNA样品的亚硫酸氢盐转化
使用ZymoResearch的EZ DNA Methylation Lightning试剂盒(目录号D5031)的缓冲液填充开放式IdyllaTM卡式芯片(包含提取膜)的不同容器。卡式芯片的容器1含有2ml的lightning转换试剂。容器2含有2.5ml的M-结合缓冲液。在容器3和4中，加入2ml的M-洗涤缓冲液。在使用ZymoResearch的洗涤缓冲液之前，我们确保在6ml洗涤缓冲液浓缩物中加入24ml的100％乙醇。卡式芯片的容器5含有1.5ml的L-脱磺化缓冲液，容器6含有1.5ml洗脱缓冲液，其在这种情况下是超纯水。将5μL未甲基化的DNA(由ZymoResearch目录号D5014-1提供)和甲基化的DNA(由Millipore目录号S7821提供)添加于IdyllaTM卡式芯片的裂解室中。当在IdyllaTM系统上进行亚硫酸氢盐转化程序时，将700μL转化试剂泵入裂解室中。在裂解室中，通过加热珀耳帖将温度升至至少40℃。将壁温设置为40℃是指卡式芯片的裂解室内的实际温度将为50℃左右。将DNA和转化试剂在裂解室中在40℃(壁温)下温育1小时。温育后，将2ml的M-结合缓冲液(容器2)泵入裂解室。将裂解室的所有内容物以0.1ml/s的流速在提取膜上泵送。然后，通过以40℃的温度在提取膜上从容器3中3次泵送0.2ml的M-洗涤缓冲液而进行第一次洗涤步骤。在洗涤步骤之后，通过以20℃的温度在提取膜上以流速0.0017ml/s泵送0.9ml(2×0.45ml)的L-脱磺化缓冲液，进行L-脱磺化步骤。该L-脱磺化步骤花费约9分钟。通过以0.1ml/s的流速在提取膜上7次泵送0.3ml容器4的洗涤缓冲液(共2.1ml)进行最后洗涤步骤。在该最后洗涤步骤之后，通过在膜上(膜温度为110℃)以0.1ml/s的流速泵送20ml空气(使用空气入口)进行乙醇蒸发。通过以0.1ml/s的流速在膜上添加0.25ml洗脱缓冲液(容器6)进行向混合室的DNA洗脱。
实施例2.通过实时PCR(RT-PCR)和测序检查亚硫酸氢盐转化
使用Qiagen提供的亚硫酸氢盐转化的特异性测定(EpitectMethyLight Assay：Hs_ONECUT2.)并根据其制造商的说明在25μl RT-PCR反应中分析5μl所获得的洗脱液。图1表示未甲基化和甲基化转化的DNA的实时PCR的结果。未甲基化转化的DNA在Biorad(Qiagen试剂盒中检测未甲基化的亚硫酸氢盐转化的DNA的VIC-探针)上显示了具有HEX信号的PCR扩增。甲基化的转化DNA在Biorad(Qiagen试剂盒中检测甲基化的亚硫酸氢盐转化的DNA的FAM-探针)上显示出具有FAM信号的良好PCR扩增。如果IdyllaTM卡式芯片中不存在转化，因为Qiagen分析测试是亚硫酸氢盐转化的DNA特异性分析测试法的事实，不会产生PCR结果。引物和探针不会结合于未转化的DNA。
还对RT-PCR后提供的扩增子测序以研究未甲基化的胞嘧啶与甲基化胞嘧啶相比的转化。如图2所示，来自未甲基化DNA的所有未甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶，并在扩增子的序列中检测为腺嘌呤。
实施例3.使用IdyllaTM系统在IdyllaTM卡式芯片中进行FFPE组织样品的亚硫酸氢盐转化
用ZymoResearch的EZ DNA Methylation Lightning试剂盒(目录号D5031)的缓冲液填充IdyllaTM卡式芯片(包括提取膜)的不同容器。卡式芯片的容器1含有3ml的lightning转化试剂。容器2含有2.5ml M-结合缓冲液。容器3和4每个含有2ml M-洗涤缓冲液。在使用ZymoResearch的洗涤缓冲液之前，我们确保在6ml洗涤缓冲液浓缩物中加入24ml的100％乙醇。卡式芯片的容器5含有1.5ml的L-脱磺化缓冲液，容器6含有1.5ml洗脱缓冲液，其在这种情况下是超纯水。将患有结肠直肠癌的患者的福尔马林固定的石蜡包埋组织癌样品(其包含人癌细胞)通过引入孔插入IdyllaTM卡式芯片的裂解室中。用裂解室中的Biocartis专有缓冲液进行FFPE样品的第一次液化(样品制备)。为了在IdyllaTM系统上进行亚硫酸氢盐转化程序，将3ml转化试剂泵入裂解室中。通过加热珀尔帖将裂解室内的反应温度升高至50℃至55℃，并将DNA(来自FFPE样品)和转化试剂一起在裂解室中温育1小时。温育后，将2ml的M-结合缓冲液(容器2)泵入裂解室。将裂解室的所有内容物以0.0017ml/s的流速在提取膜上泵送。然后，通过以40℃的温度在提取膜上从容器3中3次泵出0.2ml的M-洗涤缓冲液而进行第一次洗涤步骤。在洗涤步骤之后，通过以20℃的温度在提取膜上以流速0.0017ml/s泵送0.9ml(2×0.45ml)L-脱磺化缓冲液，进行L-脱磺化步骤。该L-脱磺化步骤花费约9分钟。通过以0.1ml/s的流速在提取膜上7次泵送0.3ml的容器4的洗涤缓冲液(总共2.1ml)进行最后洗涤步骤。在最后洗涤步骤之后，通过在膜上以流速0.1ml/s泵送20ml空气(使用空气入口)，进行乙醇蒸发(膜温度为110℃)。通过以0.1ml/s的流速在膜上添加0.25ml洗脱缓冲液(容器6)而进行向混合室的DNA洗脱。
通过考虑本文公开的本发明的说明书和实践，本发明的其它实施方式对于本领域技术人员将是显而易见的。预想的是说明书和实施例仅被当作示例性的，而本发明的真实范围和精神由所附权利要求书表示。

Claims (24)

1.一种用于在包括包含提取膜的提取室的自动化系统中检测核酸甲基化状态的方法，所述方法包括以下步骤：
-将所述核酸的源引入所述自动化系统中，将亚硫酸氢盐加入所述核酸并随后立即加热所述核酸的源以产生包含所述核酸的裂解物，并使存在于所述核酸中的未甲基化的胞嘧啶碱基脱氨基；
-向所述裂解物中加入结合缓冲液以产生结合缓冲液和裂解物溶液；
-通过将所述结合缓冲液和裂解物溶液在所述提取膜上传输而将所述核酸结合至所述提取膜并除去所述亚硫酸氢盐；
-向所述提取室中加入脱磺化缓冲液，并将所述脱磺化缓冲液在所述提取膜上传输，以使所述核酸中在之前的步骤中脱氨基的碱基脱磺化，并将所述碱基转化成尿嘧啶碱基，
-从所述提取膜上洗脱转化的核酸；以及分析所述转化的核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述加热在40℃至80℃的温度下进行。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述传输通过泵送、优选地受控泵送进行。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述转化的核酸的分析在所述自动化系统中进行。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的用于在包括包含提取膜的提取室的自动化系统中检测核酸甲基化状态的方法，所述方法包括以下后续步骤：
f)将所述核酸的源引入所述自动化系统中，将亚硫酸氢盐加入所述核酸，然后将所述核酸的源立即加热至40℃至80℃的温度以产生包含所述核酸的裂解物，并使存在于所述核酸中的未甲基化的胞嘧啶碱基脱氨基；
g)向所述裂解物中加入结合缓冲液以产生结合缓冲液和裂解物溶液；
h)通过在所述提取膜上受控泵送所述结合缓冲液和裂解物溶液以将所述核酸结合至所述提取膜并除去所述亚硫酸氢盐；
i)向所述提取室中加入脱磺化缓冲液，并在所述提取膜上受控泵送所述脱磺化缓冲液以使所述核酸中在步骤a)中脱氨基的碱基脱磺化，并将所述碱基转化为尿嘧啶碱基，
j)从所述提取膜洗脱转化的核酸；并在所述自动化系统中分析所述转化的核酸。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述核酸的源的所述立即加热处于40℃至60℃的温度下，和/或所述受控泵送使用慢于或等于0.1ml/s的流速进行。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，步骤c)中的流速和步骤d)中的流速为0.001ml/s至0.1ml/s。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，步骤c)中的流速和步骤d)中的流速中至少一种为0.001至0.0017ml/s。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，步骤d)中的流速比步骤c)中的流速慢。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，核酸分析包括核酸扩增。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，所述核酸中的甲基化胞嘧啶碱基的存在或不存在的检测是细胞增殖性病症的指示。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，所述核酸的源是人组织样品。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，所述提取膜是二氧化硅膜，或包含2或3层二氧化硅膜层的复合膜。
14.卡式芯片用于根据权利要求1至13中任一项所述的方法检测核酸甲基化状态的用途。
15.根据权利要求14所述的卡式芯片的用途，所述卡式芯片包括包含提取膜的提取室。
16.根据权利要求14或15所述的卡式芯片的用途，其特征在于，所述卡式芯片包括其中进行根据权利要求5至13中任一项所述的方法的步骤a)至b)的裂解室，和其中进行根据权利要求5至13中任一项所述的方法的步骤c)至e)的提取室，其中在所述裂解室和所述提取室之间存在用于将流体从所述裂解室传输到所述提取室的通道。
17.自动化系统用于检测核酸的源中的核酸甲基化状态的用途，所述自动化系统适于接收权利要求14至16中任一项所限定的卡式芯片，所述系统控制以下步骤：
a)将亚硫酸氢盐加入到引入至所述系统中的核酸的源中并随后将所述核酸的源立即加热至40℃至80℃的温度以产生包含所述核酸的裂解物并使存在于所述核酸中的未甲基化的胞嘧啶碱基脱氨基，
b)向包含所述核酸的裂解物中加入结合缓冲液以产生结合缓冲液和裂解物溶液，
c)通过在所述提取膜上受控泵送所述结合缓冲液和裂解物溶液，将所述核酸结合至所述提取膜并除去所述亚硫酸氢盐，
d)向所述提取室中加入脱磺化缓冲液，并在所述提取膜上受控泵送所述脱磺化缓冲液以使所述核酸中在步骤a)中脱氨基的碱基脱磺化并将所述碱基转化为尿嘧啶碱基，
e)从所述提取膜上洗脱转化的核酸，以及
f)分析所述转化的核酸。
18.根据权利要求17所述的系统的用途，其中，所述核酸的源的所述立即加热处于40℃至60℃的温度下，和/或其中所述受控泵送以慢于或等于0.1ml/s的流速进行。
19.根据权利要求17或18所述的系统的用途，其中，核酸的源是人组织样品。
20.一种用于在自动化系统中进行亚硫酸氢盐反应的试剂盒，包括：
a)用于自动化系统的权利要求14至16中任一项所限定的卡式芯片，包含亚硫酸氢盐、结合缓冲液和脱磺化缓冲液，以及
b)使用说明书。
21.一种用于在自动化系统中进行亚硫酸氢盐反应的试剂盒，包括：
a.用于自动化系统的权利要求14至16中任一项所限定的卡式芯片，包括提取室、提取膜、亚硫酸氢盐、结合缓冲液和脱磺化缓冲液，以及
b.使用说明书。
22.一种用于根据权利要求1至13中任一项所述的方法检测核酸甲基化状态的卡式芯片，所述卡式芯片包括包含提取膜、亚硫酸氢盐、结合缓冲液和脱磺化缓冲液的提取室。
23.一种用于根据权利要求1至13中任一项所述的方法检测核酸甲基化状态的卡式芯片，所述卡式芯片包括提取室，所述提取室包括提取膜，所述提取膜用于当所述结合缓冲液和裂解物溶液在所述提取膜上传输时结合所述核酸并除去所述亚硫酸氢盐。
24.一种用于在自动化系统中进行亚硫酸氢盐反应的试剂盒，包括：
a.用于自动化系统的权利要求22或23中限定的卡式芯片，以及
b.使用说明书。
CN201680030118.6A 2015-06-10 2016-06-10 改进的甲基化dna检测 Active CN107667179B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15171523.2 2015-06-10
EP15171523 2015-06-10
PCT/EP2016/063269 WO2016198582A1 (en) 2015-06-10 2016-06-10 Improved detection of methylated dna

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107667179A true CN107667179A (zh) 2018-02-06
CN107667179B CN107667179B (zh) 2021-04-13

Family

ID=53373346

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680030118.6A Active CN107667179B (zh) 2015-06-10 2016-06-10 改进的甲基化dna检测

Country Status (7)

Country Link
US (2) US10533210B2 (zh)
EP (2) EP3307438B1 (zh)
JP (1) JP6681414B2 (zh)
CN (1) CN107667179B (zh)
CA (1) CA2981940A1 (zh)
ES (1) ES2815684T3 (zh)
WO (1) WO2016198582A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3957742A1 (en) * 2014-10-10 2022-02-23 Cold Spring Harbor Laboratory Random nucleotide mutation for nucleotide template counting and assembly
EP3307885B1 (en) 2015-06-15 2020-10-21 Cepheid Integrated purification and measurement of dna methylation and co-measurement of mutations and/or mrna expression levels in an automated reaction cartridge
KR102479432B1 (ko) 2016-12-12 2022-12-20 세페이드 자동화 반응 카트리지에서 DNA 메틸화의 통합 정제 및 측정 및 돌연변이 및/또는 mRNA 발현도의 동시 측정
US11332777B1 (en) 2021-10-28 2022-05-17 URIT Medical Electronic Co., Ltd. Methods and reagent kits for bisulfite conversion of DNA

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005058217A (ja) * 2003-07-31 2005-03-10 Japan Science & Technology Agency メチル化ｄｎａ検出方法およびその利用法
JP2005151977A (ja) * 2003-10-31 2005-06-16 Fuji Photo Film Co Ltd 核酸の分離精製方法
CN101090764A (zh) * 2004-09-16 2007-12-19 富士胶片株式会社 稳定地制造微孔膜的方法、以及该微孔膜在核酸分离纯化方法中的用途
CN101331148A (zh) * 2005-12-14 2008-12-24 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于亚硫酸氢盐处理的新方法
CN102220412A (zh) * 2004-11-29 2011-10-19 塞昆纳姆股份有限公司 用于检测甲基化dna的试剂盒和方法
CN102549168A (zh) * 2009-09-23 2012-07-04 皇家飞利浦电子股份有限公司 监视亚硫酸氢盐介导的dna转化的方法
JP2014526905A (ja) * 2011-09-07 2014-10-09 ヒューマン ジェネティック シグネチャーズ ピーティーワイ リミテッド 分子検出アッセイ

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2771000A1 (en) * 1998-10-23 2000-05-04 Qiagen Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Processes and means for the isolation and purification of nucleic acids at surfaces
US9394332B2 (en) * 2002-08-29 2016-07-19 Epigenomics Ag Method for bisulfite treatment
US7338637B2 (en) * 2003-01-31 2008-03-04 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Microfluidic device with thin-film electronic devices
WO2006039563A2 (en) * 2004-09-30 2006-04-13 Epigenomics Ag Method for providing dna fragments derived from an archived sample
US20070042384A1 (en) * 2004-12-01 2007-02-22 Weiwei Li Method for isolating and modifying DNA from blood and body fluids
US20060246575A1 (en) * 2005-01-13 2006-11-02 Micronics, Inc. Microfluidic rare cell detection device
CN102268367A (zh) 2005-06-23 2011-12-07 拜欧卡蒂斯股份公司 用于自动医疗诊断的盒体、系统和方法
EP1904234B1 (en) 2005-06-30 2011-10-19 Biocartis SA Cartridge for automated medical diagnostics
KR20120018153A (ko) 2009-04-14 2012-02-29 비오까르띠 에스아 집속된 음향 에너지에 의한 샘플의 처리
CN105164259B (zh) 2013-02-25 2018-02-27 拜奥卡蒂斯股份有限公司 核酸的分离

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005058217A (ja) * 2003-07-31 2005-03-10 Japan Science & Technology Agency メチル化ｄｎａ検出方法およびその利用法
JP2005151977A (ja) * 2003-10-31 2005-06-16 Fuji Photo Film Co Ltd 核酸の分離精製方法
CN101090764A (zh) * 2004-09-16 2007-12-19 富士胶片株式会社 稳定地制造微孔膜的方法、以及该微孔膜在核酸分离纯化方法中的用途
CN102220412A (zh) * 2004-11-29 2011-10-19 塞昆纳姆股份有限公司 用于检测甲基化dna的试剂盒和方法
CN101331148A (zh) * 2005-12-14 2008-12-24 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于亚硫酸氢盐处理的新方法
CN102549168A (zh) * 2009-09-23 2012-07-04 皇家飞利浦电子股份有限公司 监视亚硫酸氢盐介导的dna转化的方法
JP2014526905A (ja) * 2011-09-07 2014-10-09 ヒューマン ジェネティック シグネチャーズ ピーティーワイ リミテッド 分子検出アッセイ

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
D. J. SHIN等: "DROPLET BISULFITE CONVERSION PLATFORM FOR EPIGENETIC CANCER", 《TRANSDUCERS》 *
EMILY EVA HOLMES等: "Performance evaluation of kits for bisulfite-conversion of DNA from tissues, cell lines, FFPE tissues, aspirates, lavages, effusions, plasma, serum, and urine", 《PLOS ONE》 *
VASUDEV J BAILEY等: "Single-tube analysis of DNA methylation with silica superparamagnetic beads", 《CLIN CHEM》 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20180201973A1 (en) 2018-07-19
EP3307438B1 (en) 2020-08-05
EP3782731A1 (en) 2021-02-24
CA2981940A1 (en) 2016-12-15
US20200199653A1 (en) 2020-06-25
EP3307438A1 (en) 2018-04-18
JP6681414B2 (ja) 2020-04-15
JP2018524976A (ja) 2018-09-06
CN107667179B (zh) 2021-04-13
ES2815684T3 (es) 2021-03-30
US11634749B2 (en) 2023-04-25
US10533210B2 (en) 2020-01-14
WO2016198582A1 (en) 2016-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6528632B1 (en) Nucleic acid assays
CN107667179A (zh) 改进的甲基化dna检测
JP5399993B2 (ja) 組織試料およびパラフィン包埋組織から核酸を抽出するための改良方法
JPWO2005012518A1 (ja) 核酸検出用キット
AU2009201529A1 (en) Apparatus For Polynucleotide Detection and Quantitation
JP2013545475A (ja) マイクロ流体多重温度可撓性反応デバイスの設計、製造及び使用
CN113234856A (zh) 一种基于CRISPR/Cas12a和恒温扩增的DENV一步法核酸检测方法
CN107488721A (zh) 消除pcr产物污染的甲基化扩增方法及其应用
EP3902929A1 (en) Fast and portable microfluidic detection system as an alternative to salmonella's classical culture method
US20100196884A1 (en) Nucleic Acid Preparation
CN111808937A (zh) 一种类孟买血型FUT1 508dupT等位基因及其检测方法和应用
CN110760586A (zh) 一种人血浆fhit基因甲基化的检测试剂盒和检测方法
US20200216870A1 (en) Non-purified nucleic acid amplification method and device
US20070202522A1 (en) Isothermal screening of tumor cell related nucleic acids
KR101080087B1 (ko) 세포 증폭반응용 칩 및 이를 이용한 등온증폭반응기
WO2009149115A1 (en) Cartridge for conducting biochemical assays
CN111088396A (zh) 一种同时检测副猪嗜血杆菌、猪细小病毒、猪圆环病毒2型的三重实时荧光pcr方法
CN116334184A (zh) 用于高危近视筛查的基因芯片及其使用方法
TW202229563A (zh) 使用細胞溶解組成物用於核酸萃取之分子診斷方法
CN114045354A (zh) 一种直扩ERA偶联CRISPR/cas12a的核酸一步实时检测方法
CN106987632A (zh) 一种能特异性检测Swia抗原基因的试剂及检测方法
WO2017070339A1 (en) Microfluidic device for enrichment of nucleic acid sequence alterations
Stamna et al. Fetal RHD genotyping by maternal plasma analysis

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20180206

Assignee: Guangzhou Wanfu catis Biotechnology Co., Ltd

Assignor: Wanfu Cadiz Co., Ltd

Contract record no.: X2020990000658

Denomination of invention: Improved detection of methylated DNA

License type: Common License

Record date: 20201203

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP01 Change in the name or title of a patent holder
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: Mechelen

Patentee after: Baiocatis biology Co.,Ltd.

Address before: Mechelen

Patentee before: BIOCARTIS N.V.