KR101080087B1 - 세포 증폭반응용 칩 및 이를 이용한 등온증폭반응기 - Google Patents

Abstract

종래의 PCR 방법 등에 비하여 간편하고, 오염 위험성이 없이 신속·정확하게 표적세포를 증폭할 수 있는 세포 증폭반응용 칩 및 이를 이용한 등온증폭반응기가 개시되어 있다. 이를 위하여, 본 발명은 생물학적 시료용액을 수용하는 제 1 유로 와, 시약을 수용하는 제 2 유로, 및 상기 제 1 유로와 제 2 유로에 연결되어 상기 시료용액과 시약을 수용하는 반응챔버를 포함하는 세포 증폭반응용 칩 및 이를 이용한 등온증폭반응기를 제공한다. 본 발명에 의하면, 종래의 PCR 방법 등에 비하여 간편하고, 오염 위험성이 없이 신속·정확하게 세포를 증폭할 수 있으며, 유전자 변경의 검출, 유전 질환 또는 질환에 대한 감수성의 진단, 유전자 발현의 평가 및 다양한 게놈 프로젝트에 응용되어 분자생물학적 연구 및 질병진단에 유용한 효과가 있다.

Description

세포 증폭반응용 칩 및 이를 이용한 등온증폭반응기{CHIP FOR CELL AMPLIFICATION REACTION AND ISOTHERMAL AMPLIFICATION DEVICE USING THE SAME}

본 발명은 세포 증폭반응용 칩 및 이를 이용한 등온증폭반응기에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 유전자 변형에 대한 신속한 진단이 가능하고 진단비용이 저렴하며, 오염위험이 없이 생물체의 세포조직을 용이하게 증폭할 수 있는 세포 증폭반응용 칩 및 이를 이용한 등온증폭반응기에 관한 것이다.

핵산 증폭기술은 소량의 핵산을 검출하고 분석하는 데 있어서, 매우 유용한 기술이다. 표적핵산에 대한 핵산증폭기술의 높은 민감성은 감염성 질환 및 유전성 질환의 진단과 분석을 위한 유전자의 분리 기술 및 법의학적 측면에서 특정 핵산의 검출하는 기술에 발전을 가져왔으며, 이러한 핵산 검출 방법을 기초로 매우 민감한 진단분석을 수행할 수 있는 방법들이 개발되어 왔다(Belkum, Current Opinion in Pharmacology, 3:497, 2003). 핵산의 검출은 DNA 가닥의 상보성과 in vitro에서 단일 가닥 핵산이 이중 가닥의 하이브리드 분자를 형성하는 능력에 기인한 것으로, 상기 능력에 의하여, 시료에서 특정 핵산을 검출할 수 있다(Barry et al., Current Opinion in Biotechnology, 12:21, 2001).

핵산 검출에 사용되는 프로브는 핵산 시료에 존재하는 표적서열과 혼성화될 수 있는 특정서열로 구성된다. 상기 프로브는 화학물질, 면역-화학물질, 형광 또는 방사선 동위원소에 의해 판독된다. 대체적으로, 프로브는 표적핵산에 대한 상보적 서열을 가지는 짧은 단편의 핵산과 DNA 하이브리다이제이션을 판독할 수 있는 형광물질이나, 비오틴 및 딕옥시제닌과 같은 표지 또는 리포터 분자를 포함하도록 구성된다.

그러나 상기와 같은 핵산 검출방법에 의해서는 특히, 염색체 DNA 상의 짧은 서열을 검출할 수 없으며, 카피 수가 낮고, 야생형 유전자에 대한 변형된 대립유전자의 제한된 카피수를 해결하는데 한계가 있었다. 핵산 검출방법의 다른 문제점으로는 표적서열, 화학물질, 또는 프로브와 다른 분자 또는 구조와의 물리적 상호작용을 제한하는 in vitro 또는 in situ의 환경조건과 관련이 있다.

표적핵산을 검출하기 위한 방법은 세 가지 카테고리로 그룹 지을 수 있으며, 표적핵산을 증폭시키는 방법인 목표서열의 증폭, 프로브 분자 자체를 증폭시키는 프로브 증폭, 각 프로브가 나타내는 신호를 복합 프로브 또는 연결 프로브 기술에 의해 증가시키는 신호 증폭이 있다.

In vitro 핵산 증폭기술은 소량의 핵산을 검출 및 분석하는데 강력한 방법으로 사용되어 왔다. 그 중에서도 PCR(polymerase chain reaction)은 가장 광범위하게 사용되고 있는 핵산의 증폭방법으로, 상보적 서열의 각 나선(strand)을 주형으 로 사용하여, 프라이머에 의하여 핵산의 합성이 반복적으로 진행됨으로써, 상보적 서열의 각 나선의 복제본이 합성되는 것이다. PCR 과정을 수행하기 위해서는 미리 프로그램된 열 순환 장비(thermal cycling instrument)가 필요하다. 그러나 이 방법은 비용이 많이 들고, 특이성이 비교적 낮을 뿐 아니라, 결과를 재현하기 위해서는 수행단계를 극도로 표준화시켜야 하는 단점이 있다.

또 다른 핵산증폭방법인 LCR(ligase chain reaction)은 두 개의 인접한 올리고뉴클레오티드가 표적핵산과 혼성화되고, 리가아제(ligase)에 의해 라이게이션된다. 이를 통하여 형성된 프로브(probe)는 상보적인 뉴클레오티드와 함께 온도-사이클링(temperature cycling)에 의해 증폭된다.

상기 LCR은 프라이머를 이용한 핵산의 신장(primer extension)보다 높은 식별력(discriminatory power)을 가지고 있기 때문에, 유전자의 점돌연변이(genotyping point mutation)에 있어서는 PCR 보다 높은 대립유전자 특이성(allele specificity)을 나타낸다. 상기 LCR은 지금까지 개발된 핵산 증폭 기술 중에서 가장 높은 특이성을 가지며, 모든 식별 기작이 최적화되어 있기 때문에 가장 손쉽게 수행할 수 있는 방법이지만, 반응속도가 가장 느리고, 많은 수의 변형 프로브를 필요로 하는 단점이 있다.

또한, LCR과 같이 라이게이션을 이용하는 방법은 LCR 또는 RCA(rolling circle replication) 과정에서 수반되는 DNA 접합에 의해 첫 번째로 원형화되는 패드록 프로브(padlock probe)를 이용하여 RCA방법으로 증폭시킴으로써, 표적 증폭 PCR을 수행하지 않고도 유전자형을 분석(genotyping)할 수 있다(Qi et al., Nucleic Acids Research, 29:e116, 2001).

또한, SDA(strand displacement amplification)는 엔도뉴클레아제를 통해 나선을 치환(strand displacement)시킴으로써 샘플 내의 표적핵산 서열 및 이의 상보적 나선을 증폭시키는 방법이다. 이 방법은 핵산 중합효소(nucleic acid polymerase), 적어도 하나의 치환된 dNTP(deoxynucleoside triphosphate)를 포함하는 dNTPs 및 표적 단편(target fragment)의 3' 말단에 대해 상보적인 프라이머를 적어도 하나 이상 함유하는 혼합물을 사용한다. 각 프라이머는 5' 말단에 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease)가 인지할 수 있는 서열을 가지고 있다(Walker et al., Nucleic Acids Res., 20:1691, 1992).

또한, SDA 방법과 유사한 방법으로 RNA/DNA 혼성 프라이머 또는 RNA 프라이머를 사용하여 프라이머를 신장시킨 다음, 주형 DNA와 혼성화를 이루고 있는 RNA 프라이머를 절단하는 RNaseH 효소를 사용하여 프라이머와 주형 DNA를 절단한 후, 사슬치환에 의해 새로운 프라이머를 신장시키는 방법으로, 5'-RNA/DNA-3' 프라이머를 사용하는 SPIA(single primer isothermal amplification) 방법(미국특허 6,251,639), 5'-DNA/RNA-3' 프라이머를 사용하는 ICAN(isothermal chimeric primer-initiated amplification of nucleic acid) 방법(미국 특허출원 제 2005-0123950호), RNA 프라이머를 사용하는 Riboprimer 방법(미국 특허출원 제 2004-0180361호) 등이 있다.

또한, TMA(transcription Mediated amplification) 방법은 일정한 온도, 일정한 이온 세기(ionic strength) 및 일정한 pH에서 하나의 프로모터-프라이머만을 사용하여 표적핵산을 증폭하는 방법이다(Kwoh et al., Proc. Nat. Aca. Sci. USA, 86:1173, 1989). 상기 TMA 방법은 실질적으로 표적핵산으로 구성된 혼합물과 표적핵산의 3' 말단부위 혹은 그와 인접한 부위와 혼성화시키기 위한 표적서열의 3' 말단부위와 상보적인 올리고뉴클레오티드인 프로모터-프라이머(promoter-primer)를 결합시키는 것을 특징으로 한다. 상기 프로모터-프라이머는 컴플렉싱 서열(complexing sequence)의 5' 말단부위에 위치한 RNA 중합효소에 대한 프로모터부위 서열도 포함한다. 상기 프로모터-프라이머 및 표적서열은 프로모터-프라이머/표적서열 하이브리드를 형성하여 DNA가 신장되게 된다.

상기 TMA 방법의 DNA 신장(extension) 과정에서, 표적서열의 3' 말단은 컴플렉싱 서열과 표적서열 사이에서 프로모터 프라이머가 혼성화된 복합체(complex)에 근접한 위치로부터 신장하는 것으로 추측된다. 프로모터 서열은, 첫 번째 DNA 신장생성물을 생성하여 이중나선 프로모터 서열을 형성하는 상기 신장과정에 대한 주형으로 작용하게 된다. 프로모터-프라이머의 3' 말단은 두 번째 DNA 신장과정에 대한 프라이머로도 사용될 수 있다. 상기 신장과정에서는 주형으로 표적서열을 사용하여 이중나선 핵산 복합체가 형성된다. 상기 복합체는 RNA 표적서열이 사용되었을 경우에는 DNA/RNA 복합체이고, DNA 표적서열이 사용되었을 경우에는 DNA/DNA 복합체가 된다. 그 다음, 표적서열의 다양한 RNA 복제본을 생산하기 위하여 프로모터-프라이머의 프로모터를 인지하는 RNA 중합효소가 상기 첫 번째 DNA 신장생성물을 사용하여 RNA를 합성한다.

또한, NASBA(nucleic acid sequence-based amplification) 방법에는 단일나 선 RNA의 합성, 단일나선 DNA의 합성 및 이중나선 DNA의 합성이 포함한다(Compton, Nature, 350:91, 1991). 상기 단일나선 RNA는 첫 번째 프라이머에 대한 첫 번째 주형이 되고, 상기 단일나선 DNA는 두 번째 프라이머에 대한 두 번째 주형이 되며, 상기 이중나선 DNA는 상기 첫 번째 주형에 대한 복제본을 합성하는데 있어 세 번째 주형이 된다.

전술한 PCR 등의 열순환 과정을 사용하는 증폭방법은 각 사이클의 "표적" 온도에 도달하기 위해 열순환 블록을 필요로 하고, 열블럭이 표적온도에 도달하기 까지 지연 시간이 필요하므로 증폭반응이 완료될 때까지 장시간이 필요하다는 단점이 있다.

전술한 SDA, NASBA 및 TMA 등의 등온 표적핵산 증폭방법은 일정한 온도에서 핵산 증폭이 이루어지기 때문에 별도의 열순환 장치가 필요하지 않아 조작이 쉬운 장점이 있다. 그러나 지금까지 개시된 등온 표적핵산 증폭방법은 몇 가지 단점을 가지고 있다. SDA 방법에 따른 핵산증폭은 규정된 제한효소를 위한 부위가 존재해야 하므로 응용성이 제한되고, NASBA 및 TMA와 같은 전사-기초 증폭방법은 프라이머에 의한 중합효소 프로모터 서열과 증폭 생성물의 결합이 필요하며, 이 과정은 비-특이적 증폭을 가져오는 경향이 있다. 이러한 단점 때문에, 이들 전사-기초증폭 방법에 의한 DNA 표적의 증폭 메카니즘은 잘 수립되어 있지 않다.

또한, 현재 사용되고 있는 증폭방법은 또 다른 단점으로는 선행 증폭반응의 증폭 생성물에 의해 시험 샘플이 오염될 가능성이 있고, 이에 의해 샘플의 비-표적 특이적 증폭을 가져오는 단점이 있다. 이를 방지하기 위하여, 증폭 반응의 마지막 에, 또는 표적핵산의 증폭 개시 전에 시험 샘플을 탈오염하는 다양한 수단과 물리적 수단을 채용하는 시험 용액의 오염 검출 방법이 개발되고 있으나, 이들은 대부분 핵산 증폭 조작을 복잡하게 만든다.

핵산검출을 위한 다른 방법인 프로브를 증폭시키는 방법으로는 상기 핵산증폭 방법에서 사용되는 LCR 방법이 있다.

핵산검출을 위한 또 다른 방법으로는 목적핵산이나 프로브를 증폭시키는 것이 아니라 신호를 증폭시키는 방법이 있다. 이들 방법 중에는 표적핵산을 캡처하기 위하여 네 가지 세트의 프로브를 사용하는 bDNA(branched DNA) 증폭법이 있다(Ross et al., J. Virol. Method., 101:159, 2002). 신호 증폭을 이용한 하이브리드 캡처 방법은 표적핵산을 직접적으로 검출하고 표적핵산을 증폭하는 방법과 비교할만한 민감성을 가지고 있으며, 신호 검출을 위하여 항체나 화학발광물질을 사용한다(Van Der Pol et al., J. ClinicalMicrobiol., 40:3564, 2002; Nelson et al., Nucleic Acids Research, 24:4998, 1996).

또한, 신호 프로브를 증폭하는 방법으로 CPT(cycling probe technology) 증폭방법이 있다(Duck et al., BioTechniques 9:142, 1990). 상기 방법은 표적핵산과 상보적인 염기서열을 갖는 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브를 사용하며 표적핵산과 상기 프로브가 혼성화될 경우 혼성 프로브의 RNA 부분이 RNaseH 효소에 의해 절단되고 절단된 혼성 프로브는 표적핵산과 분리되고 또 다른 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브가 표적핵산과 혼성화되어 다시 절단된 프로브가 생성되어 결과적으로 순환적으로 신 호 프로브를 증폭하는 방법이다. 그러나 상기 CPT 방법은 증폭 효율이 10³ 내지 10⁶으로 비교적 낮아 독립적으로 진단에 사용하기는 어렵고 PCR 방법 등 종래의 핵산증폭에 의해 일차적으로 표적핵산의 특정 부위의 양을 증가시킨 후 별도로 신호 프로브를 증폭 하게 되어 사용이 복잡하고 고비용과 장시간이 소요되는 단점이 있다.

이에, 표적핵산을 신속하고 정확하게 증폭시키고, 표적핵산의 증폭과 동시에 상기 증폭산물을 검출하는 방법 및 장치에 대한 개발의 필요성이 요구되고 있다.

따라서 본 발명의 제 1 목적은 시약의 활성을 장시간 유지할 수 있고, 고농도의 시약으로 인한 반응저해를 방지하며, 유전자 변경의 검출, 유전 질환 또는 질환에 대한 감수성의 진단, 유전자 발현의 평가 및 다양한 게놈 프로젝트에 사용할 수 있는 세포 증폭반응용 칩을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 제 2 목적은 기존의 PCR보다 핵산의 증폭시간을 단축할 수 있고, 증폭반응을 통해 증폭산물의 확인하는데 소요되는 비용이 감소되며, 증폭산물의 오염을 방지하는 세포 증폭반응용 칩을 이용한 등온증폭반응기를 제공하는데 있다.

상술한 본 발명의 제 1 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 외부로부터 생물학적 시료용액이 유입되는 시료 유입구와, 상기 시료 유입구와 연결되어 유입된 상기 생물학적 시료용액을 수용하는 제 1 유로와, 외부로부터 시약이 유입되는 시약 유입구와, 상기 시약 유입구와 연결되어 유입된 상기 시약을 수용하는 제 2 유로, 및 상기 제 1 유로 및 제 2 유로와 연결되어 외력에 의해 유동되는 상기 생물학적 시료용액 및 시약을 수용하는 반응챔버를 포함하는 세포 증폭반응용 칩을 제공한다.

그리고 본 발명의 제 2 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 외부로부터 생물학적 시료용액이 유입되는 시료 유입구, 상기 시료 유입구와 연결되어 유입된 상기 생물학적 시료용액을 수용하는 제 1 유로, 외부로부터 시약이 유입되는 시약 유입구, 상기 시약 유입구와 연결되어 유입된 상기 시약을 수용하는 제 2 유로, 및 상기 제 1 유로 및 제 2 유로와 연결되어 외력에 의해 유동하는 상기 생물학적 시료용액 및 시약을 수용하는 반응챔버를 포함하는 세포 증폭반응용 칩; 상기 칩이 안착되는 공간을 제공하는 칩 안착부가 구비된 하우징; 상기 하우징 내부의 온도를 제어하여 상기 칩에 수용된 생물학적 시료용액을 증폭반응시키는 온도조절수단; 상기 시료 유입구 및 시약 유입구에 접촉되도록 상기 하우징 내부에 구비되어 공기를 분사하는 분사노즐; 및 상기 분사노즐 및 온도조절수단의 동작을 제어하는 제어부를 포함하는 칩을 이용한 등온증폭반응기를 제공한다.

본 발명에 의한 칩을 사용하면, 증폭산물을 공기 중에 노출시키지 아니하여 상기 증폭산물의 오염을 방지할 수 있다. 이와 같이, 증폭과정이 종료된 후 시약을 자동적으로 증폭산물과 혼합할 수 있으므로, 증폭반응의 종료를 기다렸다가 시약을 피펫을 통해 직접 주입해야 하는 불편함을 방지할 수 있다.

그리고 본 발명의 의한 칩은 증폭과정의 초기가 아닌 증폭과정이 종료된 후에 증폭산물과 시약이 혼합되므로, 상기 시약의 활성을 장시간 유지할 수 있고, 증폭산물에 미량의 시약을 혼합할 수 있으므로 고농도의 시약으로 인한 반응저해를 방지할 수 있으며, 제조비용이 저가이어서 대량생산이 가능하여 일회용으로 사용하기에 적합하다.

아울러 본 발명에 의한 등온증폭반응기를 이용하면, 기존의 PCR 장치보다 증폭반응시간을 단축할 수 있고, 증폭반응을 통해 증폭산물의 확인하는데 소요되는 비용이 감소되며, 사용법이 간단하고 가벼워 장소에 구애받지 않고 임상진단 실험실 및 기타 어느 장소에서도 검사가 가능하다.

이하, 첨부도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예들에 의한 세포 증폭반응용 칩(이하, "세포 칩"이라고 한다.) 및 이를 이용한 등온증폭반응기(이하, "등온증폭반응기"라고 한다.)를 상세하게 설명한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 의한 세포 칩을 나타내는 사시도이며, 도 2는 본 발명의 다른 실시예에 의한 세포 칩을 나타내는 사시도이다.

도 1 및 도 2를 참조하면, 본 발명에 따른 세포 칩(10)은 생물학적 시료용액이 유입되는 시료 유입구(11)와, 상기 생물학적 시료용액을 수용하는 제 1 유로(12)와, 시약이 유입되는 시약 유입구(13)와, 상기 시약이 수용되는 제 2 유로(14) 및, 상기 생물학적 시료용액 및 시약이 혼합되는 반응챔버(15)를 포함하며, 유입된 공기를 배출하는 공기 배출구(16) 및 착색층(19)을 더 포함할 수 있다.

상기 세포 칩(10)은 생물학적 시료용액이 유입되는 통로와 시약이 유입되는 통로가 별도로 구비되어 시약의 활성이 장시간 유지될 수 있으며, 증폭과정이 종료된 후에 시약을 별도로 주입해야 하는 불편함이 방지된다.

상기 세포 칩(10)은 주입된 생물학적 시료용액 및 시약을 눈으로 확인할 수 있도록 투명한 소재로 형성될 수 있다. 여기서, 투명한 소재는 빛이 투과되는 소재라면 어떠한 소재를 사용하여도 무방하지만, 바람직하게는 투명한 합성수지를 사용하는 것이 좋고, 보다 바람직하게는 투명 실리콘, 투명 우레탄, 투명 PVC 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다. 다만, 필요에 따라 세포 칩(10)의 후면, 예컨대 하부층(17)은 난반사를 방지할 수 있도록 불투명한 색상으로 처리되거나 불투명한 소재로 형성될 수 있다. 또한, 투명한 소재로만 형성된 세포 칩(10) 또는 상기 하부층(17)의 상부에 구비된 투명한 상부층(18)의 전면에는 시료에 의해 검출된 변형된 유전자의 존재여부를 용이하게 확인할 수 있도록 녹색 또는 주황색의 착색층(19)이 구비될 수 있다.

상기 세포 칩(10)은 후술하는 등온증폭반응기(20)에 삽입되어 상기 등온증폭반응기(20)로부터 제공한 열에 의해 내부에 수용된 DNA 또는 RNA 용액을 증폭반응시킬 수 있도록 100℃ 이상의 내열성을 가지는 소재로 이루어지고, 3㎜ 두께를 갖는 직육면체로 형성될 수 있다.

이하, 도면을 참조하여 각 구성요소별로 보다 구체적으로 설명한다.

먼저 본 발명의 일 실시예에 의한 세포 칩(10)은 시료 유입구(11)를 포함한다.

상기 시료 유입구(11)는 세포 칩(10)의 상부에 형성되어 외부로부터 생물학적 시료용액이 유입되는 통로를 제공한다. 즉, 사용자가 피펫 등을 통해 상기 시료 유입구(11)로 분석하고자 하는 생물학적 시료용액을 주입하여 칩 내부로 상기 생물학적 시료용액을 안착시킨다. 이와 같이, 상기 시료 유입구(11)는 피펫의 일단부가 삽입될 수 있는 크기로 형성되는 것이 바람직하다.

여기서, 생물학적 시료용액에는 DNA 중합효소, 특정적으로는 Bst DNA 중합효소(polymerase)가 포함되는 것이 바람직하다. 상기 Bst DNA 중합효소는 생물학적 시료용액에 포함된 핵산이 변성, 접합, 신장되도록 온도변화를 주지 않고 일정한 온도에서 이 변화가 모두 진행될 수 있도록 한다. 또한, 생물학적 시료용액에는 생물체의 세포조직으로부터 추출한 게놈의(genomic) DNA, 게놈의 RNA 또는 이들의 혼합물이 포함될 수 있다.

그리고 본 발명의 일 실시예에 의한 세포 칩(10)은 제 1 유로(12)를 포함한다.

상기 제 1 유로(12)는 상기 시료 유입구(11)와 연결되고, 세포 칩(10)의 내부에 구비되어 유입된 상기 생물학적 시료용액을 수용하는 공간을 제공한다. 이때, 상기 제 1 유로(12)는 20 내지 30㎕의 생물학적 시료용액을 수용할 수 있는 용량을 가진다. 또한, 제 1 유로(12)로 유입된 생물학적 시료용액이 자체적으로 유동하지 않도록 제 1 유로(12)의 저면은 칩의 하측면과 수평하게 형성되는 것이 바람직하다.

상기 제 1 유로(12)는 상기 생물학적 시료를 일정시간 보관하다가 외부로부터 제공된 공기압에 의해 생물학적 시료를 반응챔버(15)로 이동시킨다.

이어서 본 발명의 일 실시예에 의한 세포 칩(10)은 시약 유입구(13)를 포함한다.

상기 시약 유입구(13)는 상기 시료 유입구(11)로부터 일정거리 이격된 칩의 상부에 형성되어 외부로부터 시약이 유입되는 통로를 제공한다. 즉, 사용자가 피펫 등을 통해 상기 시약 유입구(13)로 시약을 주입하여 칩 내부로 상기 시약을 안착시킨다. 이와 같이, 상기 시료 유입구(11)는 피펫의 일단부가 삽입될 수 있는 크기로 형성되는 것이 바람직하다. 여기서, 상기 시약은 각종 PCR(polymerase chain reaction), LCR(ligase chain reaction), 올리고뉴클레오티드라이게이션 분석반응(oligonucleotide ligation assay), 혼성화 분석반응(hybridization assay), 각종 프로브 분석반응(probe assay)에 통상적으로 사용되는 분석시약을 의미할 수 있다. 구체적으로 상기 시약은 핵산 증폭반응이 완료된 생물학적 시료용액에 표적 DNA가 존재하는지를 관찰할 수 있는 시약으로서, 통상 광학적으로 검출할 수 있는 광을 생성하는 시약으로서 형광시약이 사용되고 있다. 상기 형광시약을 사용할 경우 생물학적 시료용액과 혼합과정 후 발생되는 형광을 통하여 상기 생물학적 시료용액에 표적 DNA가 존재하는지를 관찰할 수 있게 된다. 이러한 핵산 분석시약으로서는 예를 들면 이중나선 DNA에 끼워들어 가는 Sybr Green I(Molecular probe, USA)를 들 수 있다. 여기서, Sybr Green I는 핵산증폭 중에 증폭되는 이중나선 DNA에 끼워 들어가 특정 파장의 형광을 나타내는 시약이다. 이들 핵산 분석시약용액을 시약 유입구(13)로 주입한 다음 반응까지 제 2 유로(14)에서 보관한다.

본 발명의 일 실시예에 의한 세포 칩(10)은 제 2 유로(14)를 포함한다.

상기 제 2 유로(14)는 상기 시약 유입구(13)와 연결되고, 유입된 상기 시약을 세포 칩(10)의 내부에 수용하는 공간을 제공한다. 이때, 상기 제 2 유로(14)는 1 내지 10㎕의 시약을 수용할 수 있는 용량을 가진다. 또한, 제 2 유로(14)로 유입된 시약이 자체적으로 유동하지 않도록 제 2 유로(14)의 저면은 칩의 하측면과 수평하게 형성되는 것이 바람직하다.

상기 제 2 유로(14)는 상기 시약을 일정시간 보관하다가 외부로부터 제공된 공기압에 의해 시약을 반응챔버(15)로 이동시킨다.

마지막으로, 본 발명의 일 실시예에 의한 세포 칩(10)은 반응챔버(15)를 포함한다.

상기 반응챔버(15)는 제 1 유로(12) 및 제 2 유로(14)와 연결되어 외력, 즉 등온증폭반응기(20)에 의해 유동되는 상기 생물학적 시료용액 및 시약을 상기 세포 칩(10)의 내부에 수용하는 공간을 제공한다.

상기 반응챔버(15)의 크기는 가로가 약 3 내지 15mm, 세로가 약 1 내지 10mm로 형성되는 것이 바람직하며, 반응챔버(15)의 저면부터 천장까지의 높이는 1 내지 5mm, 바람직하게는 2 내지 4mm가 되도록 형성되는 것이 좋다.

상기 반응챔버(15)는 상기 생물학적 시료용액 및 시약의 역류를 방지할 수 있도록 상기 제 1 유로(12) 및 제 2 유로(14)보다 저면이 낮게 형성될 수 있다.

본 발명에 따른 세포 칩(10)의 크기와 두께 및 형상과, 제 1 유로(12), 제 2 유로(14), 반응챔버(15)의 형상 및 용량은 사용자의 의도에 따라 조절이 가능하므로 특별히 한정되지는 않는다.

한편, 본 발명의 일 실시예에 의한 세포 칩(10)은 공기 배출구(16)를 포함한다.

상기 공기 배출구(16)는 상기 제 1 유로(12) 및 제 2 유로(14)로부터 유입된 공기를 칩의 외부로 배출하기 위해 형성된 것으로서, 상기 반응챔버(15)의 일측으로부터 세포 칩(10)의 표면을 연결하는 통로로 형성된다. 이때, 공기 배출구(16) 는 1개 이상 형성될 수 있으며, 바람직하게는 1개 또는 2개가 형성되는 것이 좋다.

도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 의한 세포 칩(10)의 전면에는 증폭과정을 통과한 생물학적 시료용액에 시약을 혼합시켜 자체적으로 발생하는 형광을 통해 표적 DNA(돌연변이 유전자)의 존재여부를 용이하게 확인할 수 있도록 녹색 또는 주황색의 착색층(19)이 구비될 수 있다. 즉, 생물학적 시료용액에 표적 DNA가 존재하면 착생층은 형광시약에 의해 생물학적 시료용액이 변색되어, 외부에서 관찰하면 녹색 또는 주황색과는 다른 색상이 나타난다. 즉, 생물학적 시료용액에 표적 DNA가 존재하지 않으면 착색층(19)의 색상은 그대로 유지된다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 의한 덮개부가 닫힌 등온증폭반응기를 나타내는 사시도이며, 도 4는 본 발명의 일 실시예에 의한 덮개부가 열린 등온증폭반응기를 나타내는 사시도이다.

도 3 및 도 4를 참조하면, 상기 등온증폭반응기(20)는 세포조직으로부터 추출한 핵산, 바람직하게는 DNA를 포함하는 생물학적 시료용액을 증폭반응시키기 위한 장치로서, 전술한 구성을 갖는 세포 칩(10), 하우징(21), 온도조절수단(미도시), 분사노즐(23', 23"), 및 제어부(미도시)를 포함하며, 입력수단(25), 디스플레이부(26), 개폐버튼(28), 전원버튼(미도시)을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의한 등온증폭반응기(20)는 하우징(21)을 포함한다.

상기 하우징(21)은 상기 세포 칩(10)이 안착되는 공간을 제공하며, 각 구성 요소의 외형을 제공하는 것이다.

상기 하우징(21)은 사용자의 조작에 따라 개폐되는 덮개부(27)가 상부에 구비되며, 상기 덮개부(27)의 내측면에 마주보는 하우징(21)의 내측면에는 1개 이상의 안착부(29)가 구비된다. 즉, 상기 세포 칩(10)은 하우징(21)의 덮개부(27)를 개방시킨 상태로 하우징(21) 내부에 구비된 안착부(29)에 안착시킬 수 있다. 여기서, 안착부(29)는 세포 칩(10)이 삽입되어 안착될 수 있도록 상기 세포 칩(10)에 대응되는 크기의 안착홈이 형성된다.

특정 양태로서, 본 발명에 따른 안착부(29)는 온도조절수단으로부터 열을 제공받아 안착홈에 안착된 세포 칩(10)에 열을 제공하는 역할을 수행한다. 즉, 상기 안착부(29)는 세포 칩(10)의 생물학적 시료용액을 원활하게 증폭반응시킬 수 있도록 열전도율이 높은, 바람직하게는 200 ㎉/℃ 이상의 열전도율을 가지는 재질, 예컨대 스테인리스, 은, 구리, 금 등으로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의한 등온증폭반응기(20)는 온도조절수단을 포함한다.

상기 온도조절수단은 상기 하우징(21) 내부에 구비되어 하우징(21) 내부의 온도를 제어하여 상기 세포 칩(10)의 생물학적 시료용액이 등온 증폭과정을 수행할 수 있도록 작용하는 것이다.

상기 온도조절수단은 상기 하우징(21) 내부의 온도를 조절할 수 있다면 어떠한 온도조절장치를 사용하여도 무방하지만, 바람직하게는 상기 안착부(29)에 열을 제공하여 안착부(29)에 안착된 세포 칩(10)을 일정한 온도로 가열하는 가열장치를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 온도조절수단은 제어부에 의해 온도가 제어됨으로써, 하우징(21) 내부를 일정한 온도로 균일하게 가열하거나, 사이클적으로 가열·냉각하여 세포 칩(10) 내의 생물학적 시료용액에 포함된 핵산을 증폭(배양)반응시킨다.

구체적으로, 상기 온도조절수단은 생물학적 시료용액의 프라이머와 주형 DNA가 어닐링될 수 있고, 사용되는 효소의 활성을 실질적으로 억제하지 않는 온도를 제공한다. 즉, 온도조절수단은 핵산 증폭반응이 진행될 수 있도록 30 내지 75℃, 바람직하게는 50 내지 65℃ 범위의 온도를 제공한다.

이와 같이, 상기 온도조절수단은 제어부의 제어에 의해 하우징(21) 내부의 온도를 변화시켜 생물학적 시료용액에 포함된 표적 DNA를 증폭시킨다.

본 발명의 일 실시예에 의한 등온증폭반응기(20)는 분사노즐(23', 23")을 포함한다.

상기 분사노즐(23', 23")은 상기 시료 유입구(11) 및 시약 유입구(13)에 접촉되도록 상기 하우징(21) 내부에 구비되어 공기를 분사하는 것이다.

특정 양태로서, 안착부(29)가 덮개부(27)의 내측면에 마주보는 하우징(21)의 내부 일측에 형성되면, 상기 분사노즐(23', 23")은 안착부(29)에 형성된 세포 칩(10)에 직접 접촉될 수 있도록 상기 덮개부(27)의 내측면에 구비된다.

상기 분사노즐(23', 23")은 제어부와 전기적으로 연결되어 제어부의 제어에 의해 상기 시료 유입구(11) 및 시약 유입구(13)로 공기를 분사한다.

즉, 상기 온도조절수단에 의한 발열이 종료되면 제어부에 의해 상기 분사노즐(23', 23")로 공기가 주입되어 상기 제 1 유로(12)에 수용된 생물학적 시료용액과 제 2 유로(14)에 수용된 시약이 상기 반응챔버(15)로 유입되어 혼합된다.

본 발명의 일 실시예에 의한 등온증폭반응기(20)는 제어부를 포함한다.

상기 제어부는 분사노즐(23', 23"), 온도조절수단, 온도센서, 디스플레이부, 전원버튼과 전기적으로 연결되어 상기 분사노즐(23', 23"), 온도조절수단 및 디스플레이부의 동작을 제어하는 것으로서, 전원버튼을 통해 전원이 인가되면 내부에 프로그래밍된 가열온도와 가열시간으로 하우징(21) 내부를 가열한 후 분사노즐(23', 23")을 작동시키거나 가열온도 및 가열시간을 외부로부터 입력받아 상기 분사노즐(23', 23") 및 온도조절수단을 제어한다.

본 발명의 일 실시예에 의한 등온증폭반응기(20)는 입력수단(25)을 더 포함할 수 있다.

상기 입력수단(25)은 상기 하우징(21)의 외부에 구비되고 상기 제어부와 연결되어 사용자에게 발연온도 및 발열시간을 입력받는 것으로서, 이러한 목적으로 사용되는 입력수단이라면 어떠한 형태의 입력수단을 사용하여도 무방하지만, 바람직하게는 당업계에서 통상적으로 사용되는 입력수단을 사용하는 것이 좋다.

본 발명의 일 실시예에 의한 등온증폭반응기(20)는 온도센서, 디스플레이부(26), 개폐버튼(28), 및 전원버튼을 더 포함할 수 있다.

상기 온도센서는 하우징(21)의 내부에 구비되어 온도조절수단으로부터 제공받은 열에 의해 가열된 하우징(21) 내부의 온도를 측정하는 것으로서, 제어부에 전기적으로 연결된다. 즉, 제어부는 온도센서로부터 하우징 내부의 온도를 전달받고, 상기 온도가 목표 온도에 미달되면 온도조절수단의 가열온도를 상승시킨다.

상기 디스플레이부(26)는 하우징(21)의 외부에 구비되고, 제어부와 전기적으로 연결되어 상기 제어부로부터 온도조절수단의 온도와 하우징(21) 내부의 온도를 제공받아 이를 출력한다.

상기 개폐버튼(28)은 하우징(21)의 외부에 구비되고 덮개부(27)와 연결되어 외력에 의해 가압되면 상기 덮개부(27)를 자동으로 개폐시키는 역할을 수행한다.

상기 전원버튼은 하우징(21)의 외부에 구비되어 등온증폭반응기(20)를 온/오프 시키는 역할을 수행하며, 이러한 목적으로 사용되는 전원버튼은 어떠한 형태로 형성되어도 무방하지만, 바람직하게는 당업계에서 통상적으로 사용되는 전원버튼을 사용하는 것이 좋다.

이하의 실시예 및 비교예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이지 이들만으로 한정하는 것은 아니다.

genomic DNA 추출

먼저, 생물학적 시료는 비소세포폐암으로 진단 받은 환자의 FFPET (formalin-fixed paraffin-embedded tissue) 슬라이드를 받아 사용하였다.

그 다음, 상기 FFPET 슬라이드를 칼로 긁어서 2 ㎖ 원심분리 튜브(tube)로 옮기고, 1 ㎖의 자일렌(xylene)[SIGMA^®, USA]을 넣고 혼합한 후, 5분 동안 상온에서 13,000 rpm으로 원심분리 하였다.

그 다음, 펠릿(pellet)이 딸려오지 않게 튜브의 상층액을 제거한 후, 한 번 더 1 ㎖의 자일렌[SIGMA^®, USA]으로 처리하고, 원심분리 후 상층액을 제거하였다.

그 다음, 튜브에 1 ㎖의 에탄올[SIGMA^®, USA]을 넣고 혼합시킨 후, 5분 동안 상온에서 13,000 rpm으로 원심분리 하였다.

그 다음, 펠릿이 딸려오지 않게 상층액을 제거하고, 한 번 더 1 mL의 에탄올[SIGMA^®, USA]을 넣고, 원심분리 후 상층액을 제거하였다.

그 다음, 튜브를 열고 65℃에서 에탄올[SIGMA^®, USA]이 완전히 증발할 때까지 건조시켰다.

그 다음, 튜브에 400 ㎕의 조직분해 완충용액(tissue lysis buffer)[GeNet Bio, Korea]과 20 ㎕의 Proteinase K[Bioneer, Korea]를 넣고 70℃에서 1시간 동안 반응시켰다.

그 다음, 튜브에 동량의 PCI-9(phenol chlorofrom isoamylalchol 25:24:1)[bioWORLD, USA]을 넣고 13,000 rpm에서 5분간 원심분리한 후, 상층액을 새로운 1.5 ㎖ 원심분리 튜브로 옮겼다.

그 다음, 상층액을 옮긴 튜브에 2M 아세트산 나트륨 30 ㎕와 100% 에탄올 900 ㎕를 넣은 후 가볍게 섞어준다.

그 다음, DNA의 수율을 최대화하기 위해 -20℃에서 30분 동안 방치한 다음, 13,000 rpm에서 5분간 원심분리 한 후 상층액을 제거하였다.

그 다음, 70% 에탄올 500 ㎕을 넣고 섞어 준 다음, 13,000 rpm에서 5분간 원심분리 시킨 후 상층액을 제거하였다.

그 다음, 에탄올을 완전히 제거하기 위해 오븐에서 1시간 30분 동안 건조 시킨 후, 50㎕의 용리 완충용액(elution buffer)[GeNet Bio, Korea]을 넣었다.

이렇게 분리한 DNA는 곧바로 실험에 사용하거나 4℃에 보관하고, 장기간 보존하기 위해서는 -20℃에 저장하였다.

아가로우스 겔 제조

먼저, 삼각플라스크(250 ㎖)에 아가로우스[QA-Agarose™, Q-bio gene, USA] 2 g을 넣고, 0.5X TBE(tris boric acid EDTA) 완충용액[Tris-Base, Q-biogene, USA] 100 ㎖을 넣는다.

그 다음, 상기 삼각플라스크의 혼합물을 전자레인지에서 2분 동안 녹인 후 상기 혼합물을 겔 용기에 넣는다.

그 다음, 상기 혼합물을 30분 동안 굳혀 2% agarose gel을 제조하였다.

전기영동장치를 이용한 증폭산물의 확인

전기영동장치[Mupid-α, Advance, Japan]에 0.5X TBE 완충용액을 채운 후 증폭산물 4 ㎕와 6X Loading dye(0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, 30% glycerol)[Bio Basic, CANADA] 0.8 ㎕를 섞어서 4.8 ㎕씩 로딩(loading)하였다.

그 다음, 100V에서 25분 동안 전기영동 시켰다.

그 다음, 겔을 떼어내어 EtBr(ethidium bromide)[SIGMA^®, USA]로 10 분간 염색한 후, 10 분간 증류수로 DNA와 결합하지 못한 EtBr을 씻어냈다.

그 다음, UV transilluminator[CTOC KOREA, Korea] 위에 아가로우스 겔을 올려놓고 반응여부를 확인했으며, 마지막으로 염기서열분석법으로 확인하였다.

[실시예 1]

먼저, 20 ㎕의 생물학적 시료용액(표 1)을 세포 칩의 시료 주입구에 주입하고, 형광시약[SYBR Green Ⅰ 100X, invitrogen, 미국] 6㎕를 세포 칩의 시약 주입구에 주입하였다.

그 다음, 세포 칩을 등온증폭반응기의 안착부에 안착시키고, 덮개부를 닫은 다음, 온도조절수단을 60분 동안 63℃로 가열하여 생물학적 시료용액을 증폭시켰다.

그 다음, 온도조절수단의 가열이 종료되면, 분사노즐은 공기를 주입하여 생 물학적 시료용액과 형광시약을 혼합시켰다.

그 다음, 세포 칩을 등온증폭반응기로부터 분리한 다음 눈으로 관찰하고, 2% 아가로오스 겔(agarose gel)을 이용하여 전기영동장치로 증폭산물을 분석하였다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 의한 세포 칩의 색변화를 나타내는 사진이다.

도 5를 참조하면, 상기 세포 칩은 그 내부에 수용된 증폭산물에 EGFR 돌연변이가 검출되지 않으면 색변화가 발생되지 않는다는 것을 확인할 수 있다.

[실시예 2]

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하되, 생물학적 시료용액에 포함된 주형 DNA를 사용하지 않고, 별도로 획득한 주형 DNA를 사용하였다.

도 6은 본 발명의 다른 실시예에 의한 세포 칩의 색변화를 나타내는 사진이다.

도 6을 참조하면, 상기 세포 칩은 그 내부에 수용된 증폭산물에 EGFR 돌연변이가 검출되면 색변화가 발생되는 것을 확인할 수 있다.

[비교예]

먼저, 0.2 ㎖ PCR 반응 튜브[PCR-02-C, Axygen, USA]에 20 ㎕의 반응용액(표 1)을 동량 분주하였다.

그 다음, 2% 아가로오스 겔(agarose gel)을 이용하여 전기영동장치로 PCR 산 물을 분석하였다.

그 결과를 표 2로 나타내었다.

표 1. 생물학적 시료용액의 조성

표 2. 등온증폭반응기와 PCR 장비의 소요시간 및 가열온도

이와 같이, 비소세포폐암으로 진단 받은 환자를 대상으로 FFPET에서 추출한 genomic DNA를 본 발명의 등온증폭반응기와 종래의 PCR 장비를 사용하여 각각 증폭시켰다.

그 결과, 상기 등온증폭반응기에 구비된 세포 칩의 색 변화를 통해 비소세포폐암을 진단 받은 환자로부터 추출한 genomic DNA는 등온증폭방법을 수행하면 세포 칩의 색변화가 발생될 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 개개인의 genomic DNA를 추출하여 본 발명의 등온증폭반응기를 통해 등온증폭방법을 수행하면 신속하게 비소세포폐암의 유무를 판단할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

또한, 종래의 PCR 장치를 사용하여 돌연변이를 검출 시 2 내지 3 시간이 소요된 반면, 본 발명의 등온증폭반응기는 Taq. DNA 중합효소 대신 Bst. DNA　중합효소를 사용하여 변성, 접합, 신장에 온도변화를 주지 않고 일정 온도에서 이 변화를 모두 시행함에 따라 실험시간을 60 분으로 단축할 수가 있었다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 의한 세포 증폭반응용 칩을 나타내는 사시도이다.

도 2는 본 발명의 다른 실시예에 의한 세포 증폭반응용 칩을 나타내는 사시도이다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 의한 덮개부가 닫힌 등온증폭반응기를 나타내는 사시도이다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 의한 덮개부가 열린 등온증폭반응기를 나타내는 사시도이다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 의한 세포 칩의 색변화를 나타내는 사진이다.

도 6은 본 발명의 다른 실시예에 의한 세포 칩의 색변화를 나타내는 사진이다.

* 도면의 주요 부분에 대한 간단한 설명 *

10 : 칩 11 : 시료 유입구

12 : 제 1 유로 13 : 시약 유입구

14 : 제 2 유로 15 : 반응챔버

16 : 공기 배출구 17 : 하부층

18 : 상부층 19 : 착색층

20 : 등온증폭반응기 21 : 하우징

23', 23" : 분사노즐 25 : 입력수단

26 : 디스플레이부 27 : 덮개부

28 : 개폐버튼 29 : 안착부

Claims (11)

1. 외부로부터 생물학적 시료용액이 유입되는 시료 유입구;

   상기 시료 유입구와 연결되어 유입된 상기 생물학적 시료용액을 수용하는 제 1 유로;

   외부로부터 시약이 유입되는 시약 유입구;

   상기 시약 유입구와 연결되어 유입된 상기 시약을 수용하는 제 2 유로; 및

   상기 제 1 유로 및 제 2 유로와 연결되어 외력에 의해 유동되는 상기 생물학적 시료용액 및 시약을 수용하는 반응챔버를 포함하며,

   상기 반응챔버는 상기 생물학적 시료용액 및 시약의 역류를 방지할 수 있도록 상기 제 1 유로 및 제 2 유로보다 저면이 낮게 형성되는 것을 특징으로 하는 세포 증폭반응용 칩.
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서,

   상기 제 1 유로 및 제 2 유로부터 유입된 공기를 외부로 배출하기 위해 상기 반응챔버에 연결된 공기 배출구가 더 포함된 것을 특징으로 하는 세포 증폭반응용 칩.
4. 제 1 항에 있어서,

   상기 칩은 투명한 소재로 형성되는 것을 특징으로 하는 세포 증폭반응용 칩.
5. 제 4 항에 있어서,

   상기 투명한 소재는 투명 실리콘, 투명 우레탄, 투명 PVC 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 세포 증폭반응용 칩.
6. 제 4 항에 있어서,

   상기 칩의 전면에 녹색 또는 주황색의 착색층이 구비되는 것을 특징으로 하는 세포 증폭반응용 칩.
7. 제 1 항에 있어서,

   상기 칩은 100℃ 이상의 내열온도를 가지는 소재로 이루어진 것을 특징으로 하는 세포 증폭반응용 칩.
8. 제 1 항에 있어서,

   상기 생물학적 시료용액은 게놈의 DNA가 포함된 것을 특징으로 하는 세포 증폭반응용 칩.
9. 외부로부터 생물학적 시료용액이 유입되는 시료 유입구, 상기 시료 유입구와 연결되어 유입된 상기 생물학적 시료용액을 수용하는 제 1 유로, 외부로부터 시약이 유입되는 시약 유입구, 상기 시약 유입구와 연결되어 유입된 상기 시약을 수용하는 제 2 유로, 및 상기 제 1 유로 및 제 2 유로와 연결되어 외력에 의해 유동하는 상기 생물학적 시료용액 및 시약을 수용하는 반응챔버를 포함하는 세포 증폭반응용 칩;

   상기 칩이 안착되는 공간을 제공하는 칩 안착부가 구비된 하우징;

   상기 하우징 내부의 온도를 제어하여 상기 칩에 수용된 생물학적 시료용액을 증폭반응시키는 온도조절수단;

   상기 시료 유입구 및 시약 유입구에 접촉되도록 상기 하우징 내부에 구비되어 공기를 분사하는 분사노즐;

   상기 분사노즐 및 온도조절수단의 동작을 제어하는 제어부; 및

   상기 하우징의 외부에 구비되고 상기 제어부와 연결되어 발열온도 및 발열시간을 입력받는 입력수단;

   을 포함하는 칩을 이용한 등온증폭반응기.
10. 삭제
11. 제 9 항에 있어서,

    상기 온도조절수단에 의한 발열이 종료되면 제어부에 의해 상기 분사노즐로 공기가 주입되어 상기 제 1 유로에 수용된 생물학적 시료용액과 제 2 유로에 수용된 시약이 상기 반응챔버로 유입되어 혼합되는 것을 특징으로 하는 칩을 이용한 등온증폭반응기.

Images