CN106987632A - 一种能特异性检测Swia抗原基因的试剂及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能特异性检测人血小板Swia血型抗原基因的试剂及检测方法，该试剂由2×预混液、Swia上游引物、Swia下游引物、内参上游引物、内参下游引物、阳性对照和无DNA酶/RNA酶的水组成，在使用时将血液基因组或阳性对照与试剂混合进行PCR扩增反应，再将PCR产物进行电泳鉴定。通过上述方式，本发明为特异性检测Swia抗原基因的试剂及检测方法，通过设计得到Swia抗原基因特异性的引物，并利用该引物建立了简便快速、敏感特异的检测方法，突破了传统血清学检测方法的限制，有利于大规模、自动化的对Swia抗原进行筛检，也可以为临床上Swia抗原的检测和鉴定及配血工作提供有效的参考。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测试剂及方法领域，特别是涉及一种能特异性检测人血小板Swia抗原基因的试剂及检测方法。
背景技术
胎母同种异体免疫血小板减少症（fetomaternal alloimmunethrombocytopenia，FMAIT）是由于胎儿遗传自父亲的血小板抗原刺激母体产生IgG型的抗血小板抗体，该抗体能通过胎盘进入胎儿体内并与具有相应抗原的血小板结合。此致敏血小板在胎儿的血液循环中被清除而使得胎儿血小板减少，出现瘀点和瘀斑，其严重者会导致神经系统损伤（占已报道病例的20%）、颅内出血（15%-20%）甚至死亡（10%）。因多数病例在出生后才得以诊断，故此病也称作新生儿同种异体免疫血小板减少症（neonatalalloimmune thrombocytopenia，NAIT）。
Swia抗原位于血小板糖蛋白GPIa，是由于核苷酸3347C>T突变引起1087T>M所导致。最早是Kroll H等在一例FMAIT患者血清中发现了其抗体，证明了该抗原抗体与新生儿血小板减少症的相关性。
目前，国际上和国内都没有针对Swia抗原特异性的基因检测产品。而且，基于PCR-SSP的基因检测方法，突破了血清学方法依赖谱细胞和单克隆抗体的限制，适合于大标本和自动化检测，可以针对性的对某特定地区或者某些特定人群进行大范围的筛检，也可以为临床上Swia抗原的检测和鉴定及配血工作提供有效的参考。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种能特异性检测人血小板Swia抗原基因的试剂及检测方法，该检测方法简便快速、敏感特异。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种能特异性检测人血小板Swia抗原基因的试剂，包括2×预混液、Swia上游引物、Swia下游引物、内参上游引物、内参下游引物、阳性对照和无DNA酶/RNA酶的水，所述Swia上游引物和Swia下游引物为2条特异性寡核苷酸引物，所述Swia上游引物为5’ TGCCAGCTTCTCTGCA 3’，所述Swia下游引物为5’GGGTGTGATATGCTCACCA 3’。
在本发明一个较佳实施例中，所述内参上游引物和内参下游引物为2条特异性寡核苷酸引物，所述内参上游引物为5’ATGCAGGCAGATGAGCAC 3’，所述内参下游引物为5’GGGAGAAGGCATCCACTC 3’。
在本发明一个较佳实施例中，所述2×预混液由Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、反应缓冲液和染料配制而成。
提供一种非诊断、非治疗目的的特异性检测人血小板Swia抗原基因的方法，包括步骤为：将血液基因组与所述能特异性检测Swia抗原基因的试剂混合进行PCR扩增反应，再将PCR产物进行电泳鉴定。
在本发明一个较佳实施例中，所述PCR反应体系中各组分的比例为：当所述PCR反应体系为20 μL时，所述2×预混液为10 μL，所述浓度为10μM的Swia上游引物为0.4 μL，所述浓度为10μM的Swia下游引物为0.4 μL，所述浓度为10μM的内参上游引物为0.2 μL，所述浓度为10μM的内参下游引物为0.2 μL，所述血液基因组或阳性对照为20-50 ng，所述无DNA酶/RNA酶的水补足至20 μL，所述PCR反应体系为20 μL或50 μL。
在本发明一个较佳实施例中，所述阳性对照为含有Swia抗原基因的DNA片段。
在本发明一个较佳实施例中，所述Swia上游引物和Swia下游引物的PCR产物大小为169 bp，所述内参上游引物和内参下游引物的PCR产物大小为235 bp。
在本发明一个较佳实施例中，所述电泳鉴定是在2.0%的琼脂糖凝胶中进行的。
在本发明一个较佳实施例中，所述Swia上游引物、所述Swia下游引物、所述内参上游引物和所述内参下游引物所共用的退火温度为51℃。
本发明的有益效果是：本发明的能特异性检测人血小板Swia抗原基因的试剂及检测方法，通过设计得到Swia抗原基因特异性的引物，并利用该引物建立了简便快速、敏感特异的检测方法，突破了传统血清学检测方法的限制，有利于大规模、自动化的对Swia抗原进行筛检，也可以为临床上Swia抗原的检测和鉴定及配血工作提供有效的参考。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
图1是本发明的空白对照、阳性对照、人血液基因组经过特异性检测人血小板Swia抗原基因后的结果示意图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
选用的试剂：试剂盒包括250 μL的2×预混液、1 mL无RNA酶/DNA酶的水、25 μL浓度为10μM的Swia上游引物、25μL浓度为10μM的Swia下游引物、25 μL浓度为10μM的内参上游引物、25 μL浓度为10μM的内参下游引物、25 μL阳性对照。
所述2×预混液是近岸蛋白质科技有限公司的产品，其成分是由Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、反应缓冲液和染料预先配制成的混合物。所述Swia上游引物和Swia下游引物为2条特异性寡核苷酸引物，所述Swia上游引物为5’ TGCCAGCTTCTCTGCA 3’，所述Swia下游引物为5’ GGGTGTGATATGCTCACCA 3’。所述内参上游引物和内参下游引物为2条特异性寡核苷酸引物，所述内参上游引物为5’ ATGCAGGCAGATGAGCAC 3’，所述内参下游引物为5’GGGAGAAGGCATCCACTC 3’。
本实施例中阴性对照为水对照，即为空白对照；阳性对照为本发明中构建的含有Swia抗原基因的DNA片段；取人的新鲜抗凝血200 μL，按照血液基因组提取试剂盒的操作步骤，提取人的血液基因组，利用NanoDrop 2000测定血液基因组的浓度以及纯度。
将试剂盒中的试剂按比例加入，反应体系可以为20 μL或50 μL，具体比例见下表：
对所述反应体系进行PCR扩增反应，可以在20 μL体系中进行。反应程序如下表所示：
因为2×预混液中添加了染料，PCR反应结束后，取5μL的PCR产物于2.0%的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，分析结果。结果如图1所示，图1中Swia阳性片段为169 bp，内参片段为235bp，M为D600，其中1代表空白对照，2代表阳性对照，3代表样品1（Swia阳性），4代表样品2（Swia阴性）。
在本发明中，试剂盒中提供的特异性预混液最大限度的减少了人为误差，实验者使用方便快捷，只需准备待测模板，然后按比例加入试剂盒中提供的引物和水补足体积即可进行PCR扩增反应，反应结束后，PCR产物可直接用于琼脂糖凝胶电泳检测结果，无需使用上样缓冲液。
本发明通过采用上述检测试剂和技术方案，设计得到了Swia抗原基因特异性的引物，并利用该引物建立了简便快速、敏感特异的检测人血小板Swia抗原基因的PCR-SSP方法，将其应用在PCR快速检测试剂盒中。本发明突破了传统血清学检测方法的限制，有利于大规模、自动化的对Swia抗原进行筛检，也可以为临床上Swia抗原的检测和鉴定及配血工作提供有效的参考。
本发明基于Swia抗原基因的分子遗传学基础，根据现有的研究发现Swia抗原基因的分子构成特点，发明设计了聚合酶链反应-序列特异性引物法（PCR-SSP）检测引物，并优化引物序列，摸索最佳退火温度及引物浓度等条件，组装成Swia抗原基因检测试剂盒。本发明试剂盒可以对人血小板Swia抗原基因进行特异性的扩增。
本发明不仅能够特异性的检测到Swia抗原基因，在同一个PCR反应体系中加入的内参引物可以印证结果的准确性，阴阳性对照的设立也可以使结果更加可靠。本发明中的Swia抗原基因检测试剂和试剂盒适合于人血小板Swia抗原基因的常规鉴定与研究。此试剂和试剂盒可解决Swia抗原的鉴定问题，保障临床上的输血安全。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (9)
1.一种能特异性检测人血小板Swia抗原基因的试剂，其特征在于，包括2×预混液、Swia上游引物、Swia下游引物、内参上游引物、内参下游引物、阳性对照和无DNA酶/RNA酶的水，所述Swia上游引物和Swia下游引物为2条特异性寡核苷酸引物，所述Swia上游引物为5’TGCCAGCTTCTCTGCA 3’，所述Swia下游引物为5’ GGGTGTGATATGCTCACCA 3’。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述内参上游引物和内参下游引物为2条特异性寡核苷酸引物，所述内参上游引物为5’ATGCAGGCAGATGAGCAC 3’，所述内参下游引物为5’GGGAGAAGGCATCCACTC 3’。
3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述2×预混液由Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、反应缓冲液和染料配制而成。
4.根据权利要求1所述的非诊断、非治疗目的的特异性检测人血小板Swia抗原基因的方法，其特征在于，包括步骤为：将血液基因组与所述能特异性检测Swia抗原基因的试剂混合进行PCR扩增反应，再将PCR产物进行电泳鉴定。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系中各组分的比例为：当所述PCR反应体系为20 μL时，所述2×预混液为10 μL，所述浓度为10μM的Swia上游引物为0.4 μL，所述浓度为10μM的Swia下游引物为0.4 μL，所述浓度为10μM的内参上游引物为0.2 μL，所述浓度为10μM的内参下游引物为0.2 μL，所述血液基因组或阳性对照为20-50ng，所述无DNA酶/RNA酶的水补足至20 μL，所述PCR反应体系为20 μL或50 μL。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述阳性对照为含有Swia抗原基因的DNA片段。
7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述Swia上游引物和Swia下游引物的PCR产物大小为169 bp，所述内参上游引物和内参下游引物的PCR产物大小为235 bp。
8.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述电泳鉴定是在2.0%的琼脂糖凝胶中进行的。
9.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述Swia上游引物、所述Swia下游引物、所述内参上游引物和所述内参下游引物所共用的退火温度为51℃。
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