CN104372074A - 一种能特异性检测Mia抗原基因的试剂及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能特异性检测Mia抗原基因的试剂及检测方法，该试剂由2×预混液、Mia上游引物、Mia下游引物、内参上游引物、内参下游引物和无DNA酶/RNA酶的水组成，在使用时将血液基因组与试剂混合进行PCR扩增反应，再将PCR产物进行电泳鉴定。通过上述方式，本发明为特异性检测Mia抗原基因的试剂及检测方法，通过设计得到Mia抗原基因特异性的引物，并利用该引物建立了简便快速、敏感特异的检测方法，突破了传统血清学检测方法的限制，有利于大规模、自动化的对Mia抗原进行筛检，也可以为临床上Mia抗原的检测和鉴定及配血工作提供有效的参考。

Description

一种能特异性检测Mia抗原基因的试剂及检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学检测试剂及方法，特别是涉及一种用于Miltenberger血型系统中Mia抗原的特异性基因检测试剂及方法。

背景技术

1927年Landsteiner和Levine发现了人类MNS血型，该血型系统抗原的多态性数目仅次于Rh血型系统。Miltenberger血型系统是MNS系统中一类相对稀有的子系统，是因血型糖蛋白A（GPA）和血型糖蛋白B（GPB）编码基因发生重组交换而形成的一组变异抗原，由Mia、Vw、Mur、Hil、Hut、MUT、Hop、Nob、DANE、TSEN和MINY共11种抗原交叉组成11种不同的表现型。其中Mia和Mur这两种抗原因常引起急性溶血性输血反应和新生儿溶血病而愈加受到临床重视。

Mia抗原（MNS7）多见于东南亚国家人群中，在白种人中极为罕见。我国南方地区Mia抗原表达频率较高，上海为5.4%，台湾7.3%，香港6.2%，重庆巴县3.6%，而云南省西双版纳傣族Mia抗原阳性率达24.7%，明显高于日本人群的0.3%，稍低于泰国清迈地区的30%。

研究表明（Wolfgang Dahr，Vox Sang 1992；62:129-135）Mia抗原序列内存在²⁴QTNDMHKRDTY³⁴或²⁴QTNDKHKRDTY³⁴氨基酸序列，这段序列代表了GYPA外显子2的3 端和GYBP假外显子的连接部位，该序列存在于GP(B-A-B)Mur、GP(B-A-B)Hop、GP(B-A-B)Bun、GP(B-A-B)HF上，也存在于和GP.Hut和GP.Vw相关的假设GP(B-A-B)分子上，这给Mia的基因检测提供了分子基础及理论依据。

目前，国际上和国内都没有针对Mia抗原特异性的基因检测产品。而且，基于PCR-SSP的基因检测方法，突破了血清学方法依赖谱细胞和单克隆抗体的限制，适合于大标本和自动化检测，可以针对性的对某特定地区或者某些特定人群进行大范围的筛检，也可以为临床上Mia抗原的检测和鉴定及配血工作提供有效的参考。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种能特异性检测Mia抗原基因的试剂及检测方法，该检测方法简便快速、敏感特异。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种能特异性检测Mia抗原基因的试剂，包括2×预混液、Mia上游引物、Mia下游引物、内参上游引物、内参下游引物和无DNA酶/RNA酶的水，所述Mia上游引物和Mia下游引物为2条特异性寡核苷酸引物，所述Mia上游引物为5’AGCACAAACGGGACACATA 3’，所述Mia下游引物为5’GTCTCCACTTGCCATTTTATG 3’。

在本发明一个较佳实施例中，所述内参上游引物和内参下游引物为2条特异性寡核苷酸引物，所述内参上游引物为5' CCTAATAGTGCGGTGGTG 3'，所述内参下游引物为5' TGAGGTGACTGCGTGGA 3'。

在本发明一个较佳实施例中，所述2×预混液由Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl₂、反应缓冲液和染料配制而成。

提供一种能特异性检测Mia抗原基因的方法，包括步骤为：将血液基因组与所述能特异性检测Mia抗原基因的试剂混合进行PCR扩增反应，再将PCR产物进行电泳鉴定。

在本发明一个较佳实施例中，所述PCR反应体系中各组分的比例为：当所述PCR反应体系为25 μL时，所述2×预混液为12.5 μL，所述浓度为10μM/L的Mia上游引物为0.5 μL，所述浓度为10μM/L的Mia下游引物为0.5 μL，所述浓度为10μM/L的内参上游引物为0.5 μL，所述浓度为10μM/L的内参下游引物为0.5 μL，所述血液基因组为20-50 ng，所述无DNA酶/RNA酶的水补足至25 μL，所述PCR反应体系为25 μL或50 μL。

在本发明一个较佳实施例中，所述方法中阳性对照是将阳性对照基因与所述能特异性检测Mia抗原基因的试剂混合进行PCR扩增反应，再将PCR产物进行电泳得到结果，所述阳性对照基因为含有Mia抗原基因的DNA片段。

在本发明一个较佳实施例中，所述Mia上游引物和Mia下游引物的PCR产物大小为500 bp，所述内参上游引物和内参下游引物的PCR产物大小为100 bp。

在本发明一个较佳实施例中，所述电泳鉴定是在1.5%的琼脂糖凝胶中进行的。

在本发明一个较佳实施例中，所述Mia上游引物、所述Mia下游引物、所述内参上游引物和所述内参下游引物所共用的退火温度为55.5℃。

本发明的有益效果是：本发明的能特异性检测Mia抗原基因的试剂及检测方法，通过设计得到Mia抗原基因特异性的引物，并利用该引物建立了简便快速、敏感特异的检测方法，突破了传统血清学检测方法的限制，不依赖于难以获得的抗-Mia单克隆抗体和珍贵稀少的抗-Mia血清进行检测，有利于大规模、自动化的对Mia抗原进行筛检，也可以为临床上Mia抗原的检测和鉴定及配血工作提供有效的参考。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1是本发明的空白对照、阳性对照、人血液基因组经过特异性检测Mia抗原基因后的结果示意图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

选用的试剂：试剂盒包括250 μL的2×预混液、1 mL无RNA酶/DNA酶的水、25 μL浓度为10μM/L的Mia上游引物、25浓度为10μM/L的Mia下游引物、25 μL浓度为10μM/L的内参上游引物、25 μL浓度为10μM/L的内参下游引物、25 μL阳性对照。

所述2×预混液是近岸蛋白质科技有限公司的产品，其成分是由Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl₂、反应缓冲液和染料预先配制成的混合物。所述Mia上游引物和Mia下游引物为2条特异性寡核苷酸引物，所述Mia上游引物为5’AGCACAAACGGGACACATA 3’，所述Mia下游引物为5’GTCTCCACTTGCCATTTTATG 3’。所述内参上游引物和内参下游引物为2条特异性寡核苷酸引物，所述内参上游引物为5' CCTAATAGTGCGGTGGTG 3'，所述内参下游引物为5' TGAGGTGACTGCGTGGA 3'。

本实施例中阴性对照为水对照，即为空白对照；阳性对照为本发明中构建的含有Mia抗原基因的DNA片段；取人的新鲜抗凝血200 μL，按照血液基因组提取试剂盒的操作步骤，提取人的血液基因组，利用NanoDrop 2000测定血液基因组的浓度以及纯度。

将试剂盒中的试剂按比例加入，反应体系可以为25 μL或50 μL，具体比例见下表：

对所述反应体系进行PCR扩增反应，可以在25 μL体系中进行。反应程序如下表所示： 

因为2×预混液中添加了染料，PCR反应结束后，取5μL的PCR产物于1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，分析结果。结果如图1所示，图1中Mia阳性片段为500 bp，内参片段为100 bp，M为DL 2000 plus，其中1代表空白对照，2代表阳性对照，3代表样品1（Mia阳性），4代表样品2（Mia阴性）。

在本发明中，试剂盒中提供的特异性预混液最大限度的减少了人为误差，实验者使用方便快捷，只需准备待测模板，然后按比例加入试剂盒中提供的引物和水补足体积即可进行PCR扩增反应，反应结束后，PCR产物可直接用于琼脂糖凝胶电泳检测结果，无需使用上样缓冲液。

本发明通过采用上述检测试剂和技术方案，设计得到了Mia抗原基因特异性的引物，并利用该引物建立了简便快速、敏感特异的检测Miltenberger血型中Mia抗原基因的PCR-SSP方法，将其应用在PCR快速检测试剂盒中。本发明突破了传统血清学检测方法的限制，不依赖于难以获得的抗-Mia单克隆抗体以及珍贵稀少的抗-Mia血清，有利于大规模、自动化的对Mia抗原进行筛检，也可以为临床上Mia抗原的检测和鉴定及配血工作提供有效的参考。

本发明基于中国人群Miltenberger血型抗原系统基因和Mia抗原基因的分子遗传学基础，根据现有的研究发现Mia抗原基因的分子构成特点，发明设计了聚合酶链反应-序列特异性引物法（PCR-SSP）检测引物，并优化引物序列，摸索最佳退火温度及引物浓度等条件，组装成Mia抗原基因检测试剂盒。本发明试剂盒可以对Miltenberger血型抗原系统中的Mia抗原基因进行特异性的扩增。

本发明不仅能够特异性的检测到Mia抗原基因，在同一个PCR反应体系中加入的内参引物可以印证结果的准确性，阴阳性对照的设立也可以使结果更加可靠。本发明中的Mia抗原基因检测试剂和试剂盒适合于Miltenberger血型系统中Mia抗原基因的常规鉴定与研究。此试剂和试剂盒可解决Mia抗原的鉴定问题，保障临床上的输血安全。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国科学院苏州生物医学工程技术研究所

 

<120>  一种能特异性检测Mia抗原基因的试剂及检测方法

 

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人类（Homo sapiens）

 

<400>  1

agcacaaacg ggacacata                                                    19

 

 

<210>  2

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人类（Homo sapiens）

 

<400>  2

gtctccactt gccattttat g                                                 21

 

 

<210>  3

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人类（Homo sapiens）

 

<400>  3

cctaatagtg cggtggtg                                                     18

 

 

<210>  4

<211>  17

<212>  DNA

<213>  人类（Homo sapiens）

 

<400>  4

tgaggtgact gcgtgga                                                      17

 

 

Claims (9)

1.一种能特异性检测Mia抗原基因的试剂，其特征在于，包括2×预混液、Mia上游引物、Mia下游引物、内参上游引物、内参下游引物和无DNA酶/RNA酶的水，所述Mia上游引物和Mia下游引物为2条特异性寡核苷酸引物，所述Mia上游引物为5’AGCACAAACGGGACACATA 3’，所述Mia下游引物为5’GTCTCCACTTGCCATTTTATG 3’。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述内参上游引物和内参下游引物为2条特异性寡核苷酸引物，所述内参上游引物为5' CCTAATAGTGCGGTGGTG 3'，所述内参下游引物为5' TGAGGTGACTGCGTGGA 3'。

3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述2×预混液由Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl₂、反应缓冲液和染料配制而成。

4.根据权利要求1所述的特异性检测Mia抗原基因的方法，其特征在于，包括步骤为：将血液基因组与所述能特异性检测Mia抗原基因的试剂混合进行PCR扩增反应，再将PCR产物进行电泳鉴定。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系中各组分的比例为：当所述PCR反应体系为25 μL时，所述2×预混液为12.5 μL，所述浓度为10μM/L的Mia上游引物为0.5 μL，所述浓度为10μM/L的Mia下游引物为0.5 μL，所述浓度为10μM/L的内参上游引物为0.5 μL，所述浓度为10μM/L的内参下游引物为0.5 μL，所述血液基因组为20-50 ng，所述无DNA酶/RNA酶的水补足至25 μL，所述PCR反应体系为25 μL或50 μL。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述方法中阳性对照是将阳性对照基因与所述能特异性检测Mia抗原基因的试剂混合进行PCR扩增反应，再将PCR产物进行电泳得到结果，所述阳性对照基因为含有Mia抗原基因的DNA片段。

7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述Mia上游引物和Mia下游引物的PCR产物大小为500 bp，所述内参上游引物和内参下游引物的PCR产物大小为100 bp。

8.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述电泳鉴定是在1.5%的琼脂糖凝胶中进行的。

9.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述Mia上游引物、所述Mia下游引物、所述内参上游引物和所述内参下游引物所共用的退火温度为55.5℃。