JPH0898691A - 血小板糖タンパク質ＧＰＩａ遺伝子のイントロン配列および血小板表面抗原ＨＰＡ−５の遺伝子型判定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒト血小板表面の糖タンパク質ＧＰＩａをコ
ードする遺伝子上の、血小板表面抗原ＨＰＡ−５の遺伝
子型を決定する点変異部位の３塩基下流に介在するイン
トロン遺伝子の配列を決定し、これを利用して血小板表
面抗原ＨＰＡ−５の遺伝子型を遺伝子増幅法により判定
する。遺伝子増幅法では、型特異的プライマーと、非型
特異的プライマーからなるプライマーセットを用いて、
血小板表面抗原ＨＰＡ−５の遺伝子型を決定する点変異
部位を含む一定領域を型特異的に増幅処理し、増幅の有
無により遺伝子型を判定する。 【効果】 ＨＰＡ−５の遺伝子型が簡便かつ正確に判定
でき、血小板型の不一致に起因する疾患の予測、予防に
有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、血小板表面の糖タンパ
ク質ＧＰＩａの遺伝子中に介在するイントロンのＤＮＡ
配列を有するＤＮＡ、その断片からなるオリゴヌクレオ
チド、並びにそれを用いてＨＰＡ−５の遺伝子型を判定
する方法および試薬に関する。血小板遺伝子型の判定は
血小板の表面抗原型に起因する疾患の予測および予防に
有用である。

【０００２】

【従来の技術】血小板輸血の際不応状態となる血小板輸
血不応状態 (ＰＴＲ) の症例より、血小板表面抗原が見
い出され、更に、新生児同種免疫性血小板減少性紫斑病
(ＮＡＩＴＰ）や血小板輸血後紫斑病（ＰＴＰ）にも血
小板表面抗原が関与していることが明らかになってき
た。

【０００３】血小板表面抗原は血小板の膜表面の糖タン
パク質上に存在するアロ抗原で、現在ＨＰＡ−１〜ＨＰ
Ａ−５の５種類が既に知られており、更に数種類存在す
ることが学会等で報告されている。血小板表面抗原型
は、この糖タンパク質をコードする遺伝子の点変異によ
りアミノ酸が変異したアロ抗原により決定され、ＨＰＡ
−１〜ＨＰＡ−５の各々についてａ型とｂ型の２種類に
分類される。この血小板表面抗原型の不一致に起因し
て、上記のＰＴＲ、ＮＡＩＴＰ、ＰＴＰなどの疾患が引
き起こされる可能性が示唆されている。

【０００４】現在、ＰＴＲの患者からは糖タンパク質Ｇ
ＰＩｂ上に存在するＨＰＡ−２に対する抗体である抗Ｈ
ＰＡ−２抗体が高頻度に検出されている。また、ＮＡＩ
ＴＰの場合は、母体から糖タンパク質ＧＰIII ａ上に存
在するＨＰＡ−１とＨＰＡ−４に対する抗体が高頻度に
検出されており、それぞれ疾患との関連が示唆されてい
る。糖タンパク質ＧＰIIｂ上に存在するＨＰＡ−３と糖
タンパク質ＧＰＩａ上に存在するＨＰＡ−５について
は、現段階では疾患との特異性は確認されていないが、
ＰＴＲとＮＡＩＴＰの両方の症例において、これらに対
する抗体が検出されたという報告がある。疾患との関連
性を検討するには、まず正確に型判定が行われることが
必要だが、ＨＰＡ−５については、現段階ではヒトの抗
血清を使用した方法しかなく、型の不一致と疾患の関連
等のデータは少ないのが現状である。従って、ＨＰＡ−
５について簡便かつ正確な型判定方法が待望されてい
る。

【０００５】血小板表面抗原型を判定する従来の方法に
は、ヒト抗血清を用いるＭＰＨＡ法および、遺伝子型を
判定するプローブ法とＲＦＬＰ法があるが、ＨＰＡ−５
の型判定には抗血清を用いるＭＰＨＡ法が利用できるの
みであった。この方法は、検査する血小板を丸底のプレ
ートにコーティングし、ＨＰＡ−５のａ型、ｂ型のそれ
ぞれに対する抗体（抗ＨＰＡ−５ａ抗体、抗ＨＰＡ−５
ｂ抗体）の存在が確認されているヒト血清と反応させ
る。コーティングした血小板に、反応させたヒト血清中
の抗ＨＰＡ−５抗体（ａ型及びｂ型）に対する抗原が存
在すると、抗原抗体反応により抗体が結合する。次に抗
ヒト抗体を感作させた赤血球を反応させると、ヒト抗体
である抗ＨＰＡ−５抗体に結合し、プレート上では凝集
像を呈する。逆に、プレート上の血小板に目的とする抗
原が存在せず、抗体が反応しなかった場合は、赤血球は
自らの重さで丸底プレートの底に沈澱してしまう。この
ように凝集の有無により判定を行うことができ、具体的
には、ＨＰＡ−５の抗原型がａ／ａのホモの場合、ａ型
の抗血清で凝集像を呈し、ｂ型の抗血清では沈澱像を呈
する。ａ／ｂのヘテロの場合、ａ型の抗血清、ｂ型の抗
血清とも凝集像を呈する。ｂ／ｂのホモの場合、ａ型の
抗血清では沈澱像を呈し、ｂ型の抗血清では凝集像を呈
する。

【０００６】この方法の問題点は、検査に使用できるよ
うな抗血清の調達が困難であることが挙げられる。ＨＰ
Ａ−５も他の血小板表面抗原と同様にａ型とｂ型の存在
比率が大きく異なるため、抗体を有する血清が発見され
にくい。また、検査に使用するには、抗血清が高力価の
抗ＨＰＡ−５抗体を有すること、他の血小板表面抗原に
対する抗体を持たないことなどの条件を満たす必要があ
る。更に、この方法では多種多様な抗体を含むヒト抗血
清を用いるため、非特異の反応が起こる可能性も否定で
きない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、従来の血小板表面抗原ＨＰＡ−５の型判定法の問題
点を解決し、操作が簡易で正確な判定法およびそれに用
いる試薬を提供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは先に、従来
の血小板表面抗原型の判定法の欠点を解消するものとし
て、ＨＰＡ−１〜４の遺伝子型については遺伝子増幅法
を用いた簡便かつ正確な判定方法を提案した。この方法
は、血小板表面抗原型を決定する点変異部位を含む一定
領域を、型特異的プライマーを含むプライマーセットを
用いて増幅できるかどうかをみることにより判定するも
のである。

【０００９】ＧＰＩａについては、ＶＬＡタンパク質の
一部としてそのアミノ酸配列および遺伝子配列は既知で
あるが（Takada,Y. & Hemler M.E., Journal of Cell B
iology, vol. 109, 397-407 頁) 、その遺伝子配列はｍ
ＲＮＡより解読された情報である。この遺伝子配列を基
にプライマーを設定し、ヒトのゲノム遺伝子をサンプル
として、遺伝子増幅法を用いてＨＰＡ−５の遺伝子型の
判定を行ったところ、非常に大きな増幅産物が検出さ
れ、正確な型判定は困難であった。そこで、本発明者等
が検討した結果、ヒトゲノム遺伝子ではＧＰＩａ遺伝子
中にイントロンが介在していること、具体的には、ＨＰ
Ａ−５の抗原性を決定する点変異の３塩基下流から約2,
100 塩基対のイントロンが存在することが判明した。

【００１０】ｍＲＮＡより解読された遺伝子配列よりプ
ライマーを設定して遺伝子増幅を行う場合は、サンプル
よりｍＲＮＡの抽出、ＲＮＡからＤＮＡへの逆転写とい
う２段階の過程を経て、増幅反応に必要な鋳型遺伝子を
作製するか、あるいは全長2,200 塩基対以上の遺伝子増
幅を行わなくてはならないことになる。しかしながら、
ｍＲＮＡは取り扱いや保存が困難であり、ゲノム遺伝子
を鋳型とすることが望ましい。また2,200 塩基対以上の
遺伝子増幅による判定は酵素の伸長能力に起因する増幅
効率の点で問題がある。従って、遺伝子増幅法により血
小板表面抗原型を判定する方法においては、少なくとも
一方のプライマーはイントロン内に設定して、ゲノム遺
伝子を鋳型として遺伝子増幅を行うことが望ましく、そ
のためには、イントロンの遺伝子配列を明らかにするこ
とが必要である。本発明者等は、既知のＧＰＩａの遺伝
子配列より設定したプライマーセットにより、イントロ
ンを含む全長約2,200 塩基対の配列を増幅し、プラスミ
ドベクターを用いてクローニング後、ダイデオキシ法を
用いて遺伝子配列の解析を行った。その結果、全長約2,
100 塩基対のイントロンのうち、上流側767 塩基対と下
流側340 塩基対の配列が明らかになった。

【００１１】イントロンの配列決定により、遺伝子増幅
法を用いる方法、プローブを用いる方法、制限酵素を用
いる方法など、各種の遺伝子型判定法が可能となるが、
特に、遺伝子増幅法による判定方法が有利である。この
方法によれば、希少な抗血清の発見と調達が必要であっ
た従来の判定法と異なり、ＨＰＡ−５の型判定に必要な
試薬を安定に供給することが可能であるとともに、操作
が簡易で正確な判定を行うことができる。

【００１２】すなわち、本発明の要旨は、ヒト血小板表
面の糖タンパク質ＧＰＩａをコードする遺伝子配列の間
であって、血小板表面抗原ＨＰＡ−５の遺伝子型を決定
する点変異部位の３塩基下流に介在するイントロンのＤ
ＮＡ配列を有するＤＮＡである。このＤＮＡは、上流側
に配列番号１に示す塩基配列を有し、下流側に配列番号
２に示す塩基配列を有する。さらに、本発明は、このＤ
ＮＡのセンス側またはアンチセンス側に存在する少なく
とも10塩基の長さのＤＮＡ配列を含むオリゴヌクレオチ
ド、およびこのオリゴヌクレオチドを用いて、血小板表
面抗原ＨＰＡ−５の遺伝子型を判定する方法にも関す
る。

【００１３】上記方法は、遺伝子増幅法によるのが好適
であり、より詳細には、(1) 血小板表面抗原ＨＰＡ−５
の遺伝子型を決定する点変異部位に応じた塩基配列を3'
末端あるいはその近傍に有する型特異的プライマーと、
非型特異的プライマーからなるプライマーセットを用い
て、前記点変異部位を含む一定領域を型特異的に増幅処
理する工程、および(2) それぞれの型特異的プライマー
を含むプライマーセットを用いて行った遺伝子増幅によ
り得られる増幅産物の検出を行い、その有無により遺伝
子型を判定する工程、を含む、遺伝子増幅法によって血
小板表面抗原ＨＰＡ−５の遺伝子型を判定する方法にお
いて、型特異的プライマーまたは非型特異的プライマー
のいずれかが上記オリゴヌクレオチドである方法であ
る。

【００１４】さらに、本発明は、ＨＰＡ−５ａ型または
ｂ型の点変異部位に対応した塩基配列を3'末端あるいは
その近傍に有する型特異的プライマーと、非型特異的プ
ライマーからなるプライマーセットを含む、血小板表面
抗原ＨＰＡ−５遺伝子型判定用キットにも関する。

【００１５】以下に、本発明を詳細に説明する。

【００１６】本発明の、ヒトゲノムＤＮＡにおいて血小
板表面の糖タンパク質ＧＰＩａをコードする遺伝子配列
の間に介在するイントロンの遺伝子配列は次のようにし
て決定された。

【００１７】前述のように、ＧＰＩａはＶＬＡタンパク
質の一部として知られており、その遺伝子配列はｍＲＮ
Ａより解析されたものが既知である。この既知の配列に
基づいてイントロンを含む領域を増幅するプライマーを
設定し、これを用いてヒトゲノムＤＮＡから調製したサ
ンプルを増幅処理した。この増幅処理はポリメラーゼチ
ェインリアクション法（ＰＣＲ法）等により行うことが
できる。ＰＣＲ法は常法により、ＤＮＡの熱変性、アニ
ーリングおよび耐熱性ポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の伸
長を繰り返すことにより行えばよい。この増幅処理によ
り、プライマーに挟まれた部分、すなわちイントロンを
含む領域を増幅できる。

【００１８】増幅産物は、アガロース電気泳動後バンド
を切り出し、抽出する等の適宜方法で分離する。塩基配
列の決定はこの増幅産物を使用しても可能であるが、ク
ローニングを行った後に行うのが好ましい。クローニン
グは、例えば実施例に記載の、プラスミドに組み込む方
法で行うことができる。目的とするイントロン部分を含
有するＤＮＡが組み込まれたプラスミドを用いて、ダイ
デオキシ法等により配列を決定する。

【００１９】その結果、イントロンは約2,100 塩基対で
あり、ＨＰＡ−５の抗原性を決定する点変異部位の３塩
基下流に存在することが判明し、このイントロン配列の
うち上流側767 塩基対と下流側340 塩基対の配列が解明
された。これらはそれぞれ、後記配列表において配列番
号１および２として示されている。

【００２０】図１に今回決定したイントロンの上流の配
列を、既知のＧＰＩａの配列の一部と共に示す。同図中
にはＨＰＡ−５の抗原性を決定する点変異の位置、イン
トロンの開始点、および増幅に使用するプライマーＨＰ
Ａ−５Ｆ（後述）の位置が記載されている。図２に今回
決定したイントロンの下流の配列を、既知のＧＰＩａの
配列の一部とともに示す。同図中には増幅に使用するプ
ライマーＨＰＡ−５Ｒ（後述）の位置およびイントロン
の終了点が記載されている。

【００２１】このように、血小板表面抗原ＨＰＡ−５が
存在する糖タンパク質ＧＰＩａをコードする遺伝子には
約2,100 塩基対のイントロンが介在し、しかもその位置
は点変異部位の近傍であるため、ＨＰＡ−５の遺伝子型
の判定法においてはイントロン部分の遺伝子配列を利用
することになる。判定法としては、遺伝子増幅法、プロ
ーブを用いる方法、制限酵素を用いる方法等があるが、
特に遺伝子増幅法を用いる方法が有利である。

【００２２】本発明の遺伝子増幅法を用いるＨＰＡ−５
の型判定方法は、次の手順によりＨＰＡ−５の抗原性を
決定する遺伝子の点変異を含む一定領域の増幅の有無を
検出することにより遺伝子型を判定するものである。

【００２３】(1) 遺伝子を型特異的プライマーと非型特
異的プライマーからなるプライマーセットにより増幅処
理する。

【００２４】(2) 増幅産物の有無の検出により遺伝子型
を判定する。

【００２５】この方法に使用するサンプルは、ヒトのゲ
ノム遺伝子である。

【００２６】下記にＨＰＡ−５ａ型と５ｂ型を決定する
点変異部位を含む遺伝子配列のセンス側を９塩基示す。
矢印の部分が点変異部位であり、ＧあるいはＡと点変異
することによりアミノ酸が変異し、抗原性を生じる。

【００２７】

【数１】

【００２８】本発明方法では、この点変異の検出を遺伝
子増幅法により行う際に、３’末端あるいはその近傍に
上記点変異部位を導入した２種類の型特異的プライマー
（ＨＰＡ−５ａ型特異的プライマーおよびＨＰＡ−５ｂ
型特異的プライマー）を設計し、各々を片側としたプラ
イマーセット（ＨＰＡ−５ａセットおよびＨＰＡ−５ｂ
セット）を用いて２種類の増幅処理を行うことを特徴と
する。３’末端あるいはその近傍に点変異部位を導入し
たプライマーを用い、適正温度で遺伝子増幅を行った場
合、３’末端およびその近傍がマッチした場合とミスマ
ッチを起こした場合では、増幅効率に極端な差が生じ
る。理由として考えられるのは、３’末端およびその近
傍にミスマッチがある場合、増幅反応時のアニーリング
の過程でプライマーの３’末端と鋳型となる遺伝子が２
重鎖を形成できず、立体構造的に次の過程である伸長反
応が起こりにくくなるためと考えられる。本発明ではこ
の性質を利用することにより遺伝子上の点変異を検出
し、遺伝子型を判定することに特徴がある。

【００２９】増幅処理は上記型特異的プライマーと、そ
れに対になるように設計した非型特異的プライマーを用
いる。型特異的プライマーをセンス側に設定する場合、
このプライマーの３’末端またはその近傍が上記点変異
部位となるようにするので、アンチモンセンス側に設定
される非型特異的プライマーはイントロンの配列に基づ
く。また、型特異的プライマーをアンチセンス側に設定
する場合は、点変異部位の３塩基対下流よりイントロン
配列となるため、型特異的プライマーがイントロン配列
を含むように設定され、センス側の非型特異的プライマ
ーは既知のＧＰＩａ遺伝子の上流に設定される。また、
型特異的プライマーおよび非型特異的プライマーを含む
プライマーセットは、点変異部位を含む一定領域、すな
わち、点変異部位を含む数十〜数百塩基対程度の範囲の
増幅の有無を見るように設定する。各プライマーの長さ
は、塩基配列によっても異なるが通常10〜30塩基程度が
好ましい。

【００３０】ＨＰＡ−５ａ型、ＨＰＡ−５ｂ型特異的プ
ライマーおよび非型特異的プライマーの好適態様として
は実施例に記載の配列があるが、何らこれに限定される
ものではなく、上記の条件を満たすプライマーであれば
増幅の条件に応じ種々の種類のものが使用できる。型特
異的プライマーとしては３’末端または近くに上記点変
異部位を有し、長さが10〜30塩基の範囲でセンス側ある
いはアンチセンス側に設定できる。非型特異的プライマ
ーとしては、イントロン内またはGPIa遺伝子の上流部分
に任意に設定できる。ＨＰＡ−５の場合、イントロンの
開始点付近にＡの繰り返し配列が存在するため、センス
側に型特異的プライマー、アンチセンス側に非型特異的
プライマーを設定することが好ましい。

【００３１】遺伝子の増幅にはポリメラーゼチェインリ
アクション法（ＰＣＲ法）等が使用できる。ＰＣＲ法は
常法に従い、遺伝子を熱変性した後、温度を下げて上記
プライマーセットをアニールさせ、次いで耐熱性ポリメ
ラーゼ、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、
ＴＴＰ）によって伸長させる。この熱変性→アニーリン
グ→伸長の工程を繰り返すことにより、プライマーセッ
トに挟まれた遺伝子部分を増幅できる。

【００３２】遺伝子増幅の際の増幅産物の産生量は、遺
伝子増幅用の溶液の調製時に持ち込む遺伝子の量と増幅
反応時の繰り返しの回数等によって調節できる。これら
の増幅産物が検出可能で、かつ非特異的増幅反応が起こ
らないように適宜決定すれば良い。

【００３３】ＰＣＲ法を用いた遺伝子増幅を行う場合、
熱変性とアニーリング温度の適正化が重要となる。熱変
性時の温度は、高すぎると耐熱性のポリメラーゼがダメ
ージを受け、増幅の効率が低下する。逆に、低すぎると
熱変性がうまく行われず、十分に１本鎖にならないため
増幅の効率が低下する。アニーリング時の温度は、高す
ぎるとプライマーが鋳型の遺伝子にアニーリングしにく
くなり、増幅効率が低下する。逆に、低すぎると２つの
問題が生ずる。１つは、ＨＰＡ−５ａおよび５ｂの型特
異的プライマーは３’末端あるいはその近傍以外の配列
は同じため、温度が低いとミスアニーリングを起こし、
本来では伸長反応が起こらない遺伝子を鋳型としても増
幅反応が起こってしまう。つまり５ａ、５ｂとも増幅効
率に差がなくなり、全てａ／ｂのヘテロとして判定され
る可能性がある。２つ目はプライマーが全く別の領域に
ミスアニーリングを起こし、別の増幅産物を生じてしま
うことである。このことは判定の妨げとなるだけでな
く、目的の遺伝子増幅とは別の増幅反応にプライマー、
ポリメラーゼ、ｄＮＴＰが消費されてしまい、目的の増
幅産物の産生が少なくなってしまうこともある。

【００３４】温度条件の適正化のうちアニーリングの温
度については、設定したプライマーの長さ、塩基配列、
ＧＣ含量、そして型特異的プライマーの場合は点変異部
位の導入位置なども関係してくる。短いプライマー、Ｇ
Ｃ含量の少ないプライマーおよびミスマッチを含むプラ
イマーのアニーリング温度は低下する。標的遺伝子に対
する特異性の向上と増幅効率の向上は、適宜プライマー
の配列を工夫し、アニーリング温度を適正化すればよ
い。より良い判定結果を得るためには上記諸条件を個々
にではなく全体として調節することが必要となる。

【００３５】上記のようにして増幅処理を行った後、増
幅産物の検出を行い、その有無により遺伝子型を判定す
る。増幅産物の有無の検出には、ある程度その増幅産物
が目的としているものかどうかの判定ができる方法が望
ましい。それには、配列自体の相同性を見たり、増幅産
物の大きさが判定できればよい。本発明の方法でいう増
幅産物の有無の「無」は増幅効率の歴然とした差によっ
て検出できないということで、全くの「無」ではない。
つまり、高感度の検出方法を用いると本来の「無」を
「有」として検出してしまうことがあり、かえって判定
が混乱することがある。簡便で、有用な方法にアガロー
スゲルによる電気泳動法がある。電気泳動後、エチジウ
ムブロマイドで遺伝子を染色し、紫外線照射下で観察す
ると、増幅効率の差が歴然とした結果として検出され、
さらに増幅産物の大きさも判別できるため容易に判定が
できる。

【００３６】ヒトは必ずＨＰＡ−５ａ遺伝子とＨＰＡ−
５ｂ遺伝子の少なくとも一方は持っているので（遺伝子
欠損症の場合は除く）、電気泳動による検出の場合、少
なくともどちらかに対応するバンドは検出される。検出
される増幅産物のバンドが５ａのプライマーセットのみ
ならばＨＰＡ−５はａ／ａのホモ、５ｂのプライマーセ
ットのみならばｂ／ｂのホモ、両方検出されればａ／ｂ
のヘテロと判定できる。

【００３７】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

【００３８】

【実施例１】イントロン遺伝子配列の解析 ＜ターゲット遺伝子の増幅＞解析に使用するゲノムＤＮ
Ａは、ヒト全血よりＤＮＡ抽出キット（住友金属工業）
を使用して調製した。

【００３９】既知のＧＰＩａの遺伝子配列より、ＨＰＡ
−５の抗原性を決定する点変異の下流に存在するイント
ロンを含む領域を増幅するプライマーを下記のように設
定した。既知のＧＰＩａの配列はｍＲＮＡより解析した
ため、イントロンの全長は不明であった。

【００４０】 ＨＰＡ−５Ｆ：5'−ＡＣＡＣＣＡＴＴＡＣＡＧＡＣＧＴＧＣＴＣ−3' ＨＰＡ−５Ｒ：5'−ＡＡＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＧＣＴＧＡＡＣＣ−3' このプライマーをＤＮＡ合成機により合成して使用し、
下記組成の遺伝子増幅液25μｌを調製して遺伝子増幅を
行った。

【００４１】 10ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ 8.3 50ｍＭ 塩化カリウム 1.5 ｍＭ 塩化マグネシウム 0.001 ％ ゼラチン 100 μＭ ｄＮＴＰｓ １μＭ ＨＰＡ−５Ｆ １μＭ ＨＰＡ−５Ｒ 25Ｕ／ｍl タックポリメラーゼ 20μｇ／ｍl ゲノムＤＮＡ 上記、遺伝子増幅液にミネラルオイルを適量添加し、サ
ーマルサイクラー (QTP-1 、日本ジェネティクス) にセ
ットした。温度条件は、95℃で１分→65℃で１分→72℃
で１分のサイクルを30回繰り返して遺伝子を増幅した。

【００４２】その結果、約2,200 塩基対の増幅産物が検
出され、イントロンは全長約2,100塩基対であることが
判明した。

【００４３】＜ＴＡクローニング＞この増幅産物をアガ
ロースゲルで電気泳動の後、ターゲットのバンドを切り
出し、ゲルからの抽出を行った。抽出した増幅産物は、
プラスミドｐＵＣ１９ (東洋紡) より作製したＴベクタ
ーにクローニングし、16℃、一晩ライゲーション反応
〔ＤＮＡライゲーションキット (宝酒造) 使用〕させた
後、E.coli. JM109 のコンピテントセル（コンピテント
ハイ、東洋紡）を形質転換し組み込み体を作製した。。
アンピシリン（宝酒造）、イソプロピル−β−Ｄ−チオ
ガラクトピラノシド (ＩＰＴＧ、宝酒造) 、５−ブロモ
−４−クロル−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド
(Ｘ−ｇａｌ、宝酒造）を含む、エルブロス（ＬＢ）プ
レートで37℃、一晩培養し、形質転換された菌の選別
を、Ｘ−ｇａｌの発色の有無によって行った。選別した
菌は別のＬＢプレートにサブクローニングの後、液体の
ＬＢ培地で37℃、一晩培養を行った。

【００４４】＜プラスミドの精製＞培養した菌を遠心分
離で集め、アルカリ−ＳＤＳ法にてプラスミドの抽出を
行った。抽出したプラスミドはＲＮａｓｅ処理を行い、
さらにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈澱を行って
精製をした。精製したプラスミドの一部を制限酵素(Eco
RI およびHind III) 処理し、目的とする約2,200 塩基
対の遺伝子が組み込まれていることを確認した。

【００４５】＜遺伝子シークエンス＞精製したプラス
ミドをサンプルとしてダイデオキシ法を用いた遺伝子シ
ークエンスを行った。蛍光物質で標識されたシークエン
スプライマーはｐＵＣ１９用に設定された市販品 (オー
トシークエンシングキット、ファルマシア) を用い、オ
ートシークエンサー (ファルマシア) を使用して、上流
側と下流側の両方からシークエンスを行った。

【００４６】上流側からの解析の結果、前記＜ターゲッ
ト遺伝子の増幅＞の項で使用したプライマーＨＰＡ−５
Ｆに対応する塩基配列の７６塩基下流にイントロンの配
列が存在していることが分かった。この位置はＨＰＡ−
５の抗原性を決定する点変異の３塩基下流である。それ
とは逆に下流側からの解析の結果より、ＨＰＡ−５Ｒに
対応する塩基配列の６０塩基上流までがイントロンの配
列であることが確認された。

【００４７】＜遺伝子シークエンス＞ここまでの方法
では、全長約2,100 塩基対のイントロンのうち、上流、
下流、各々の側から300 塩基程度しか解析できないた
め、制限酵素を使用して断片とし、組み合わせて解析し
ていくことにした。種々の制限酵素を試した結果、まず
プラスミドをＨｉｎｃIIで処理し、約1,700 塩基対の挿
入断片 (一部ｐＵＣ１９の配列を含む）と約500 塩基対
の挿入断片を含むプラスミド (全長約3,200 塩基対) に
分けた。後者はそのまま前述のライゲーションキットに
よりセルフライゲーションを行い、コンピテントセルに
組み込んで培養した。前者は更にＲｓａＩで処理した
後、アルカリホスファターゼ処理したブラントエンドの
プラスミド (ｐＵＣ１８ＳｍａＩ／ＢＡＰ、ファルマシ
ア）にクローニングを行い、ライゲーション反応の後、
E.coli. JM109 のコンピテントセルに組み込んで培養を
行った。プラスミド精製後、制限酵素処理して挿入断片
の大きさを概算した結果、約900、約400 、約300 、約2
00 塩基対の断片が確認された。以上４種類の大きさの
断片を含むプラスミドと前述のセルフライゲーションし
たプラスミド、およびＲｓａＩ処理せず、1,700 塩基対
の断片のまま組み込んだプラスミドについて、ダイデオ
キシ法の遺伝子シークエンスを行った。

【００４８】結果 １）セルフライゲーションした約500 塩基対の断片 上流の配列が、前記＜遺伝子シークエンス＞の項で判
明した上流側の配列と一致した。上流と下流から解析し
た結果、大きさは約470 塩基であることが分かった。

【００４９】２) 約1,700 塩基対の断片 下流の配列が前記＜遺伝子シークエンス＞の項で判断
した下流の配列と一致した。

【００５０】３) 約900 塩基対の断片 下流の配列が上記約1,700 塩基対の断片の下流、および
＜遺伝子シークエンス＞の項で判明した下流の配列と
一致した。このことからこの断片はイントロンの下流末
端部分であることが分かった。

【００５１】４) 約400 塩基対の断片 上流の配列が約1,700 塩基対の断片の上流部分と一致し
た。上流と下流から解析した結果、ほとんどの部分が重
なり、大きさは約380 塩基であることが分かった。

【００５２】５) 約300 塩基対、約200 塩基対の断片 ともに、上流と下流から解析した結果、完全に重なり、
約310 塩基と約210 塩基であることが分かった。

【００５３】＜遺伝子シークエンス＞ (1) セルフライゲーションした、約500 塩基対の断片を
含むプラスミドの配列が、今回遺伝子増幅法によって遺
伝子型の判定を行う際に重要なので、それを確認するこ
と、(2) 約400 塩基対の断片の上流末端と約500 塩基対
の断片の下流末端が接触するかどうかの確認すること、
および(3) イントロン下流域のシークエンスが下流→上
流の一方向のシークエンスの結果しかないため、上流→
下流についても確認をすること、以上の３点を行うため
に４種類の蛍光標識プライマーをこれまで解析した配列
をもとに設定し、合成した。このプライマーを使用し、
前記＜遺伝子シークエンス＞の項で使用した全長を含
むプラスミドを使用してシークエンスを行った。

【００５４】その結果、イントロン上流の配列を決定
し、セルフライゲーションした約500塩基対の配列に続
いて約400 塩基対の断片が接続することを確認した。更
に、イントロン下流末端部分についても上流→下流の解
析が可能であり、この部分の配列も決定した。

【００５５】＜遺伝子シークエンス＞判明したイント
ロンの配列を基に、イントロンの開始点から約140 塩基
程度下流にリバース側のプライマーを設定し合成した。
このプライマーと前記＜遺伝子シークエンス＞で使用
したプライマーＨＰＡ−５Ｆを使用して数種類の検体に
ついて遺伝子増幅を行ったところ、全て目的とする大き
さのバンドが検出された。この増幅断片を前記＜ＴＡク
ローニング＞＜プラスミドの抽出＞の項で記載したと同
様の方法で処理した後にシークエンスを行い、配列を解
析したところ、本イントロンの上流部分は安定な配列で
あることが分かった。

【００５６】以上の結果より、イントロンの上流767 塩
基の配列 (配列表の配列番号１）および下流340 塩基の
配列（配列表の配列番号２）が決定された。

【００５７】

【実施例２】遺伝子増幅法によるＨＰＡ−５の遺伝子型判定 ＜サンプル調製法＞サンプルはヒト全血から抽出したゲ
ノム遺伝子を用いた。抽出にはスマイテストＨＰＡジェ
ノタイプ（住友金属）を使用した。全血に血球溶解液を
加えて血球成分を破壊し、遠心分離を行って核分画を集
めた。これにグアニジンを含むタンパク溶解液を加えて
核膜を破壊し、ゲノム遺伝子を溶出させた。この液に抽
出液を加えて遺伝子を析出させ、遠心分離によって沈澱
させ、集めた。この沈澱物を洗浄液で洗浄し、乾燥後に
滅菌水を加えて溶かし、サンプルとした。サンプル中の
遺伝子量は260 ｎｍの吸光度を測定して概算した。

【００５８】＜遺伝子増幅＞ＨＰＡ−５ａの点変異部位
（Ｇ）を３' 末端に有するセンズ側の型特異的プライマ
ー (５ａ) 、ＨＰＡ−５ｂの点変異部位（Ａ）を３' 末
端に有するセンス側の型特異的プライマー (５ｂ) 、お
よびイントロンの配列をもとに設定したアンチセンス側
の非型特異的プライマー (５Ｒ) の３種類のプライマー
を合成した。

【００５９】 ５ａ：５' −ＧＴＣＴＡＣＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＴＣＡＡＡＧ−３’ （配列番号３） ５ｂ：５’−ＧＴＣＴＡＣＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＴＣＡＡＡＡ−３’ （配列番号４） ５Ｒ：５’−ＴＧＴＡＡＡＣＣＡＴＡＣＴＡＴＣＴＧＴＧＣ−３’ （配列番号５） プライマー５ａとプライマー５Ｒとを組み合わせたプラ
イマーセット５ａ、およびプライマー５ｂとプライマー
５Ｒとを組み合わせたプライマーセット５ｂについて遺
伝子増幅液を作製し、上記で得たサンプルについて遺伝
子増幅によってＨＰＡ−５の遺伝子型判定を行った。

【００６０】液組成 10ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ 8.3 50ｍＭ 塩化カリウム 1.5 ｍＭ 塩化マグネシウム 0.001 ％ ゼラチン 100 μＭ ｄＮＴＰｓ １μＭ ５ａまたは５ｂ １μＭ ５Ｒ 25Ｕ／ｍl タックポリメラーゼ 20μｇ／ｍl ゲノムＤＮＡ 25μl スケールで行い、ミネラルオイルを一滴重層して
サーマルサイクラー（ＱＴＰ−１、日本ジェネティク
ス）にセットし、温度条件は95℃で１分→62℃で１分→
72℃で１分のサイクルを30サイクル繰り返して増幅を行
った。アニーリング温度を60℃まで下げるとフォールス
ポジティブのバンドが検出され、逆に65℃まで上げると
バンドが薄くなった。

【００６１】＜検出および判定＞増幅反応終了後、エチ
ジウムブロマイドを含む２％アガロースゲルで100 Ｖ、
15分程度電気泳動を行い、紫外線照射下で写真撮影して
ターゲットの位置のバンドの有無を検出した。判定は下
記の一覧表に示すようにして行った。

【００６２】

【表１】

【００６３】＜結果＞21検体について検出および判定を
行った結果は、以下に示す通りである。但し、存在比率
の低い、ａ／ｂ型とｂ／ｂ型の検体については、既に血
清学的にＨＰＡ−５の型がａ／ｂ型、およびｂ／ｂ型で
あることが証明されている検体を使用しており、実際の
存在比率と今回の出現頻度とは無関係である。

【００６４】ＨＰＡ−５ ａ／ａ 19 検体 ＨＰＡ−５ ａ／ｂ 1 検体 ＨＰＡ−５ ｂ／ｂ 1 検体

【００６５】

【実施例３】型特異的プライマー、非型特異的プライマ
ーともプライマーの塩基数、設定位置について種々の変
更を行って試験した結果、温度および液組成条件を調製
することによって、いくつかの組み合わせで検出および
判定が可能であった。

【００６６】例えば、実施例２で示したものと同様のプ
ライマーセットで、液組成のマグネシウム濃度を 1.5mM
から倍濃度の 3.0mMにした場合、アニーリング温度65℃
で目的とするバンドの検出が可能であり、ＨＰＡ−５の
遺伝子型が判定できた。

【００６７】

【発明の効果】本発明によれば、型特異的プライマーを
用いた遺伝子増幅法によって、ＨＰＡ−５の遺伝子型が
簡便かつ正確に判定できる。血小板型の判定は、血小板
型の不一致に起因する疾患の予測、予防に必要であるの
で、本発明により、ＨＰＡ−５の遺伝子型が簡便かつ正
確に判定できることは極めて有用である。

【００６８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：７６７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源： 生物名：ヒト 配列 GTAAAAAAAA AAAAATAAAC TAATAGTTTA ACTGCTTTAG TACTGGTAAT TGAACTTGCA 60 TTTGGAAAGA AAAATTTATT ATTATCTGAA TGATAATTTG CACAGATAGT ATGGTTTACA 120 TTTCATCATT TTTGAGGATG TCCCCATTAA GTTATGGATT TCAAAAATCA CATTAACAAG 180 GAAAAACTAG AGTTGAATGT ATAGTGTACT GCCATTTTCC ATGAGAGGTC CCTGTATATA 240 TAGTCTCTTA TGCCCCTAAA GCCCTTATTA GTGCCCATCG TTTATTGAAA TATGCGGCAC 300 ACACAACCAC TTTGTGGTAT TTCTCTAGGT ATCACATGTA ATTTTTTGCG ATAAAGACAA 360 CAATAACAGG GCAATGCTTT CCTGTTATCA GTTGACAGTG AAAAACAGAA GTTTCAACCA 420 AGCACTTTGT AAATTCCTTG TGATCTCAGA TGCTTCCTAC ATTAGTTTAG TCAGGAAGTG 480 TCATTGCTTA GTGTAACATT TAGGCATGCT ATCCAACTCT TGAAGTTTCA AGTCCTTCCA 540 CAAAAAAACA CCATACATTA ACATGGCAAA GCATAATTTT TCCAATTTGT GGACTGAACT 600 CTCTAAATCC ATGTATATAA GTGTAGTCGA CCTCCATGAA ATAAAAGAGA GGACAACCAA 660 ATTGAAGGCA CAGATTGACA TAGAAGGTTA TATGCTCCTT AGTATATAAG AAGAGGAGAA 720 GCTGATGTAA ATAGTAAATA CTATGTTTAA GTATTGTGAT ATTTTGT 767 配列番号：２ 配列の長さ：３４０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源： 生物名：ヒト 配列 TGGGACTGCT TTGTCACCCG GCTGTGTGCA CTGGTTGGTA TAGCTGACTG CAGGCCCTAT 60 TCCTAGGCTA GCATTCCTCC TTCTTCAGCC TCCTGAGAGC TAGGACTACA GCTGTGTGCC 120 ACCACTCCTG GCTACCTTTT ACAAAAATGT TTTATAGAGA CCAAGGTCTC ACTATTGCTC 180 AAGCAGGTCT CAAATCCCTG GCTTCAAGAT AGTCCTTCTG CCTCAGCCTC TGGAGTCTTT 240 GGGATTACAG GCATGAGCCA CCACACCCCA GCTGCTCTGA ATTTTAATTA TACAAGTTGT 300 AAGGTTTGCT TTAATCATCC TTTTGTTTCC CCTTTGCAAG 340 配列番号：３ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTCTACCTGT TTACTATCAA AG 22 配列番号：４ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTCTACCTGT TTACTATCAA AA 22 配列番号：５ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGTAAACCAT ACTATCTGTG C 21

【図面の簡単な説明】

【図１】既知のＧＰＩａの配列の一部およびイントロン
の上流の配列を示す図である。

【図２】イントロンの下流の配列および既知のＧＰＩａ
の配列の一部を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 鶴本 直子 大阪市中央区北浜４丁目５番33号 住友金 属工業株式会社内

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト血小板表面に存在する糖タンパク質
   ＧＰＩａをコードする遺伝子上の、血小板表面抗原ＨＰ
   Ａ−５の遺伝子型を決定する点変異部位の３塩基下流に
   介在するイントロン遺伝子のＤＮＡ配列を有するＤＮ
   Ａ。
2. 【請求項２】 上流側に配列番号１に示す塩基配列を有
   し、下流側に配列番号２に示す塩基配列を有する、請求
   項１記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項１記載のＤＮＡのセンス側または
   アンチセンス側に存在する少なくとも10塩基の長さのＤ
   ＮＡ配列を含むオリゴヌクレオチド。
4. 【請求項４】 請求項３記載のオリゴヌクレオチドを用
   いて、血小板表面抗原ＨＰＡ−５の遺伝子型を判定する
   方法。
5. 【請求項５】 遺伝子増幅法により行う請求項４記載の
   方法。
6. 【請求項６】 (1) 血小板表面抗原ＨＰＡ−５の遺伝子
   型を決定する点変異部位に応じた塩基配列を3'末端ある
   いはその近傍に有する型特異的プライマーと、非型特異
   的プライマーからなるプライマーセットを用いて、前記
   点変異部位を含む一定領域を型特異的に増幅処理する工
   程、および(2) それぞれの型特異的プライマーを含むプ
   ライマーセットを用いて行った遺伝子増幅により得られ
   る増幅産物の検出を行い、その有無により遺伝子型を判
   定する工程、を含む、遺伝子増幅法によって血小板表面
   抗原ＨＰＡ−５の遺伝子型を判定する方法において、型
   特異的プライマーまたは非型特異的プライマーのいずれ
   かが請求項３記載のオリゴヌクレオチドである方法。
7. 【請求項７】 請求項６記載の方法で用いるプライマー
   セットであって、ＨＰＡ−５ａ型またはｂ型の点変異部
   位に対応した塩基配列を3'末端あるいはその近傍に有す
   る型特異的プライマーと、非型特異的プライマーからな
   るプライマーセットを含む、血小板表面抗原ＨＰＡ−５
   遺伝子型判定用キット。