CN101090764A - 稳定地制造微孔膜的方法、以及该微孔膜在核酸分离纯化方法中的用途 - Google Patents

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Abstract

一种制造多孔膜的方法，该方法包括：使聚合物溶液在载体上流延，从而形成经流延的聚合物溶液，其中，在流延之前的所述聚合物溶液中，聚合物被溶解于由良溶剂、不良溶剂和非溶剂形成的混合物中；使所述经流延的聚合物溶液干燥，从而形成流延薄膜；以及对流延薄膜进行相分离，其中多孔膜是采用以下条件制备的：流延表面的温度低于聚合物溶液的温度，并且聚合物溶液的温度变化和流延表面的温度变化分别被保持在±3.0℃之内。

Description

稳定地制造微孔膜的方法、以及该微孔膜在核酸分离纯化方法中的用途
技术领域
本发明涉及稳定地制造微孔膜的方法。更具体地说，本发明涉及稳定地制造一种核酸吸附性微孔膜的方法，该微孔膜用于从含核酸的样品溶液中分离并纯化核酸的方法中；并且本发明还涉及所述微孔膜在核酸分离纯化方法中的用途。
背景技术
醋酸纤维素微孔膜在市场上出售已经有很长时间了，并被广泛地用作分离膜或滤膜。人们已提出了用于制造醋酸纤维素微孔膜的多种方法(如专利文献JP-B-43-15698和JP-B-55-6406)。此外，人们还提出了这样一种制造方法，该制造方法包括对醋酸纤维素微孔膜进行皂化处理从而制成纤维素微孔膜(如专利文献JP-B-45-4633)。这种纤维素微孔膜已在市场上出售，并被用作耐溶剂滤膜。
众所周知的是，核酸已经以各种形式应用于各个领域中。例如，在核酸重组技术领域中，需要将核酸以探针、基因组核酸或质粒核酸的形式使用。
核酸还用于诊断领域的各种方法中。例如，核酸探针日常用于检测和诊断人类病原体。核酸还用于检测遗传性疾病或食品污染物。此外，核酸日常也因各种目的而用于确定预定核酸的位置、或者鉴定或分离这些预定核酸，其中所述目的包括基因图谱的制备以及通过克隆或基因重组进行的基因表达。
然而，在多数情况下，只有极微量的核酸可以利用。核酸的分离和纯化需要复杂的操作过程，因此要使用大量时间。这种耗时的复杂步骤可能容易导致核酸损失，从而产生不利结果。此外，在对血清、尿或由细菌培养所得的样品中所含的核酸进行纯化的过程中，还会伴随有污染物产生或形成假阳性结果的问题。
作为一种用来解决上述问题的简捷有效的核酸分离纯化方法，在(例如)专利文献JP-A-2003-128691中公开了一种方法，该方法包括使得核酸被吸附到多孔膜上、或是从多孔膜上解吸附，其中所述的多孔膜是由其表面上含有羟基的有机聚合物(例如纤维素)制成的。
发明内容
然而，在核酸分离纯化过程中使用上述核酸吸附性微孔膜产生了一些问题。具体地说，按照相关技术方法制成的微孔膜的诸如孔径之类的特征随着长度方向上的位置变化而有轻微差异。因此，当使用相关技术的微孔膜对悬浮物含量相对较高的核酸样品进行处理时，随着所选取的膜试样在微孔膜的长度方向上的位置的不同，核酸纯化所需的时间会出现一些差异，或者是发生堵塞而丧失纯化能力。此外，尽管不会导致完全堵塞，但是分离和纯化核酸仍要花费相当长的时间。因此，需要通过改善核酸吸附性微孔膜的制造方法来解决这些问题，以提供性能比以前的产品更为稳定的微孔膜，其中膜的诸如孔径之类的特征随着长度方向上的位置变化没有差异。
因此本发明的目的是提供一种核酸吸附性微孔膜、以及制造该膜的方法，所述微孔膜的诸如孔径之类的特征随着长度方向上的位置变化而产生的差异被降低，因此其性质比以前更为稳定。
本发明人对各种因素进行了大量的研究以解决上述问题。结果发现，使用由以下多孔膜制造方法制成的多孔膜可以消除膜的特征随着长度方向上的位置变化而产生的差异，并解决上述的诸如堵塞及纯化时间不定的问题，而这些问题都是在此前从悬浮物含量相对较高的样品中纯化核酸的过程中已经发生过的，所述多孔膜制造方法包括以下步骤：使溶液在载体上流延，该溶液是通过将聚合物溶解于由良溶剂、不良溶剂和非溶剂形成的混合物中而制成的；使流延薄膜干燥；然后对流延薄膜进行相分离。在所述方法中，多孔膜的制造是采用以下条件来实施的，所述条件为：使流延表面的温度预定为低于聚合物溶液的温度、并且聚合物溶液的温度变化和流延表面的温度变化分别被保持在±3.0℃之内。本发明是基于这些认识而完成的。换言之，本发明包括以下方面。
(1)一种制造多孔膜的方法，该方法包括：
使聚合物溶液在载体上流延，从而形成经流延的聚合物溶液，在流延之前的所述聚合物溶液中，聚合物被溶解于由良溶剂、不良溶剂和非溶剂形成的混合物中；
使所述的经流延的聚合物溶液干燥，从而形成流延薄膜；以及
对所述的流延薄膜进行相分离，
其中，所述的多孔膜是采用以下条件制备的：流延表面的温度低于所述聚合物溶液的温度，并且所述聚合物溶液的温度变化和所述流延表面的温度变化分别被保持在±3.0℃之内。
(2)如上述(1)所述的方法，
其中，所述的聚合物溶液是由纤维素的酯类衍生物形成的聚合物溶液。
(3)如上述(2)所述的方法，
其中，所述的纤维素的酯类衍生物含有选自纤维素羧酸酯、纤维素硝酸酯、纤维素硫酸酯、纤维素磺酸酯、纤维素磷酸酯、纤维素膦酸酯和纤维素焦磷酸酯中的至少一种。
(4)如上述(2)所述的方法，
其中，所述的纤维素的酯类衍生物是醋酸纤维素。
(5)如上述(4)所述的方法，
其中，所述的醋酸纤维素是三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物。
(6)如上述(1)到(5)中任意一项所述的方法，
其中，所述的良溶剂是二氯甲烷，所述的不良溶剂是甲醇，而所述的非溶剂是水。
(7)一种制造多孔膜的方法，该方法包括：
对通过如上述(2)到(6)中任意一项所述的方法制成的多孔膜进行皂化处理。
(8)如上述(1)到(7)中任意一项所述的方法，
其中，所述多孔膜的最小孔径为0.1μm或更大。
(9)如上述(1)到(8)中任意一项所述的方法，
其中，所述的多孔膜具有彼此不对称的前表面和后表面。
(10)如上述(1)到(9)中任意一项所述的方法，
其中，所述多孔膜的最大孔径与最小孔径之比为2或更大。
(11)如上述(1)到(10)中任意一项所述的方法，
其中，所述多孔膜的厚度为10μm到500μm。
(12)如上述(1)到(11)中任意一项所述的方法，
其中，所述多孔膜的孔隙率为50％到95％。
(13)如上述(1)到(12)中任意一项所述的方法，
其中，所述多孔膜的泡点为0.1kgf/cm2到10kgf/cm2。
(14)如上述(1)到(13)中任意一项所述的方法，
其中，所述多孔膜的压力损失为0.1kPa到100kPa。
(15)如上述(1)到(14)中任意一项所述的方法，
其中，在25℃的温度和1kg/cm2的压力下，所述多孔膜的透水度为每分钟1mL/cm2到5000mL/cm2。
(16)如上述(1)到(15)中任意一项所述的方法，
其中，每毫克所述多孔膜的核酸吸附量为0.1μg或更多。
(17)一种通过如上述(1)到(16)中任意一项所述的方法制成的多孔膜在核酸分离纯化方法中的用途，所述的核酸分离纯化方法包括：
(1)使含核酸的样品溶液穿过所述的多孔膜，使得所述核酸被吸附到所述多孔膜的内部；
(2)在所述核酸吸附在所述多孔膜上时，使洗涤液穿过所述多孔膜，从而洗涤该多孔膜；以及
(3)使回收液穿过所述多孔膜，使得所述核酸从所述多孔膜的内部解吸附。
附图简要说明
图1是用于实施本发明的多孔膜制造方法的生产设备的示意图；
图2是用于对纤维素酯微孔膜进行皂化的装置的示意图；
图3是核酸分离纯化单元的概念图；以及
图4是核酸分离纯化单元的实例的剖面图；
其中，1表示带有温控装置的料液储槽；2表示供液泵；3表示流延模头；4表示PET基膜；5表示环形带；6表示温控转筒；7表示干燥装置；8表示干燥装置；A表示PET基膜进料辊；B表示PET基膜+微孔膜的卷取辊；C表示带有切刀的放卷机；D表示剥离杆；E表示PET基膜卷取辊；F表示微孔膜卷取辊；10表示皂化单元；11表示纤维素酯微孔膜；12表示皂化膜；15表示皂化单元；16表示中和单元；17表示漂洗单元；18表示干燥装置；25表示转筒；26表示传送带；500表示核酸分离纯化单元的容器；100表示主体；200表示盖；300表示固相(经表面皂化的三醋酸纤维素微孔膜)。
实施本发明的最佳方式
按照以下方式来实施本发明的微孔膜制造过程。
首先，制备溶液(料液)，该溶液是通过将聚合物溶解于由良溶剂、不良溶剂和非溶剂形成的混合物中而制成的。作为本发明制造方法中待使用的原料聚合物，可以使用含羟基聚合物的酯化产物。具体地说，具有多糖结构的聚合物所形成的酯类衍生物、聚乙烯醇的酯类衍生物等是优选的。
[聚合物]
本发明可使用的具有多糖结构的有机材料的具体实例包括纤维素、半纤维素、葡聚糖、琼脂糖、糊精、直链淀粉、淀粉精、淀粉、糖原、支链淀粉、甘露聚糖、葡甘露聚糖、地衣淀粉、异地衣淀粉、昆布糖、角叉菜胶、木聚糖、果聚糖、褐藻酸、透明质酸、软骨素、甲壳素和壳聚糖。此外，本发明可用的具有多糖结构的有机材料的实例还包括某些上述多糖结构的衍生物。具体地说，这些多糖结构的酯类衍生物是优选的。本发明不限于上述示例性的材料，只要使用了多糖结构及其衍生物即可。
构成多糖结构的酯类衍生物的酯优选选自羧酸酯、硝酸酯、硫酸酯、磺酸酯、磷酸酯、膦酸酯和焦磷酸酯中的一种或多种。
上述具有多糖结构的羧酸酯优选选自烷基羰基酯、烯基羰基酯、芳香基羰基酯和芳烷基羰基酯中的一种或多种。
构成上述具有多糖结构的烷基羰基酯的酯基优选选自乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、庚酰基、辛酰基、癸酰基、十二烷酰基、十三烷酰基、十六烷酰基和十八烷酰基中的一种或多种。
构成上述具有多糖结构的烯基羰基酯的酯基优选选自丙烯酰基和甲基丙烯酰基中的一种或多种。
构成上述具有多糖结构的芳香基羰基酯的酯基优选选自苯酰基和萘酰基(naphthaloyl)中的一种或多种。
具有多糖结构的硝酸酯的优选实例包括硝酸纤维素、硝酸半纤维素、硝酸葡聚糖、硝酸琼脂糖、硝酸糊精、硝酸直链淀粉、硝酸淀粉精、硝酸糖原、硝酸支链淀粉、硝酸甘露聚糖、硝酸葡甘露聚糖、硝酸地衣淀粉、硝酸异地衣淀粉、硝酸昆布糖、硝酸角叉菜胶、硝酸木聚糖、硝酸果聚糖、硝酸褐藻酸、硝酸透明质酸、硝酸软骨素、硝酸甲壳素和硝酸壳聚糖。
上述具有多糖结构的硫酸酯的优选实例包括硫酸纤维素、硫酸半纤维素、硫酸葡聚糖、硫酸琼脂糖、硫酸糊精、硫酸直链淀粉、硫酸淀粉精、硫酸糖原、硫酸支链淀粉、硫酸甘露聚糖、硫酸葡甘露聚糖、硫酸地衣淀粉、硫酸异地衣淀粉、硫酸昆布糖、硫酸角叉菜胶、硫酸木聚糖、硫酸果聚糖、硫酸褐藻酸、硫酸透明质酸、硫酸软骨素、硫酸甲壳素和硫酸壳聚糖。
上述具有多糖结构的磺酸酯优选选自烷基磺酸酯、烯基磺酸酯、芳香基磺酸酯和芳烷基磺酸酯中的任意一种或多种。
具有多糖结构的磷酸酯的优选实例包括磷酸纤维素、磷酸半纤维素、磷酸葡聚糖、磷酸琼脂糖、磷酸糊精、磷酸直链淀粉、磷酸淀粉精、磷酸糖原、磷酸支链淀粉、磷酸甘露聚糖、磷酸葡甘露聚糖、磷酸地衣淀粉、磷酸异地衣淀粉、磷酸昆布糖、磷酸角叉菜胶、磷酸木聚糖、磷酸果聚糖、磷酸褐藻酸、磷酸透明质酸、磷酸软骨素、磷酸甲壳素和磷酸壳聚糖。
上述具有多糖结构的膦酸酯的优选实例包括膦酸纤维素、膦酸半纤维素、膦酸葡聚糖、膦酸琼脂糖、膦酸糊精、膦酸直链淀粉、膦酸淀粉精、膦酸糖原、膦酸支链淀粉、膦酸甘露聚糖、膦酸葡甘露聚糖、膦酸地衣淀粉、膦酸异地衣淀粉、膦酸昆布糖、膦酸角叉菜胶、膦酸木聚糖、膦酸果聚糖、膦酸褐藻酸、膦酸透明质酸、膦酸软骨素、膦酸甲壳素和膦酸壳聚糖。
上述具有多糖结构的焦磷酸酯的优选实例包括焦磷酸纤维素、焦磷酸半纤维素、焦磷酸葡聚糖、焦磷酸琼脂糖、焦磷酸糊精、焦磷酸直链淀粉、焦磷酸淀粉精、焦磷酸糖原、焦磷酸支链淀粉、焦磷酸甘露聚糖、焦磷酸葡甘露聚糖、焦磷酸地衣淀粉、焦磷酸异地衣淀粉、焦磷酸昆布糖、焦磷酸角叉菜胶、焦磷酸木聚糖、焦磷酸果聚糖、焦磷酸褐藻酸、焦磷酸透明质酸、焦磷酸软骨素、焦磷酸甲壳素和焦磷酸壳聚糖。
通过以任意取代度对任何上述多糖结构的羟基进行醚化而得到的那些化合物也是优选使用的。在使用纤维素作为多糖的情况下，本发明可使用的醚类衍生物的实例包括甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、羧乙基-氨基甲酰乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基甲基纤维素、氰乙基纤维素和氨基甲酰乙基纤维素。在这些醚类衍生物中，羟甲基纤维素和羟乙基纤维素是优选的。然而，本发明不限于这些醚类衍生物，也不限于所述的多糖和醚的种类。
通过以任意取代度对任何上述多糖结构的羟基进行卤代而得到的那些化合物也是优选使用的。
作为具有多糖结构的聚合物的酯类衍生物，可优选使用纤维素的酯类衍生物(例如三醋酸纤维素、二醋酸纤维素和单醋酸纤维素，特别是三醋酸纤维素)。更优选的是，三醋酸纤维素和二醋酸纤维素混合使用。
[溶剂]
以纤维素的酯类衍生物为例，上文所述的良溶剂是能够溶解纤维素的酯类衍生物的溶剂。本发明可使用的良溶剂的实例包括卤代烃类(例如亚甲基氯(等于二氯甲烷)和氯仿)、酯类(例如醋酸甲酯、醋酸乙酯、甲酸甲酯和乙二醇单甲醚乙酸酯(methyl glycol acetate))和酮类(例如丙酮和甲乙酮)。在这些良溶剂中，二氯甲烷是优选的。
上文所述的不良溶剂是这样一种溶剂，其能与上述良溶剂互溶、并且其沸点高于上述良溶剂，其仅能使纤维素的酯类衍生物溶胀，但基本不能使纤维素的酯类衍生物溶解。本发明可使用的不良溶剂的实例包括醇类(例如甲醇、乙醇和丁醇)、醚类(例如异丙醚)和四氢呋喃。在这些不良溶剂中，甲醇是优选的。
上文所述的非溶剂是这样一种溶剂，其能与上述良溶剂或不良溶剂互溶、并且其沸点高于上述良溶剂，其不能使纤维素的酯类衍生物溶解或溶胀。本发明可使用的非溶剂的具体实例包括烃类(例如庚烷、癸烷和甲苯)、多价醇类(例如乙二醇和乙二醇单乙醚)、多价醇的醚以及水。在这些非溶剂中，水是优选的。
良溶剂与不良溶剂的用量比可预定为5∶5到8∶2，优选为6∶4到7∶3。可加入的非溶剂的量为1质量％到8质量％，优选为4质量％到6质量％。(在本说明书中，质量％等于重量％。)纤维素的酯类衍生物以1％到30％、优选为5％到10％的浓度溶解于这种混合溶剂中。
关于溶剂(特别是良溶剂和不良溶剂)使用方法的详细情况，可参见专利文献JP-B-55-31418、JP-A-50-12256、JP-A-51-76360等。
上文所述的料液可含有各种添加剂(例如增塑剂、抗静电剂、防劣化剂、防紫外线剂、表面活性剂、脱模剂、着色剂、增强剂和交联剂)，根据不同的目的将这些添加剂加入到料液中。这些添加剂可以在料液制备过程中的任何时间加入。然而，也可在料液制备的最终步骤中引入一个加入添加剂的步骤。可供选用的另一种方式是，可以使用这些添加剂来浸渍由此制备的膜。
优选的是，将上述料液通过滤纸过滤，然后进行脱气。
[微孔膜的制备]
以下将结合附图对本发明的多孔膜制造方法的实施方式进行描述。
图1是用于实施本发明的多孔膜制造方法的生产设备的示意图。
以下说明该生产设备的操作：使由料液储槽(1)经供液泵(2)供应的料液通过流延模头(3)在聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)基膜(4)上流延，然后进行干燥，其中，从PET基膜进料辊(A)将所述基膜输送到流延装置中的环形带(5)上。把由此形成的流延薄膜与PET一起从环形带(5)上剥离下来、在干燥装置(8)中干燥、然后将其卷在用于卷绕PET基膜和微孔膜的辊(B)上。
在所述的生产设备中，将设置有温控装置的料液储槽(1)中的料液控制为预定温度±3.0℃。随后，将被控制为基本恒定温度的料液从料液储槽(1)经供液泵(2)供入，然后通过流延模头(3)使其在被输送到流延带上的PET基膜(4)上流延。在这个操作过程中，将PET基膜的流延表面的温度控制在低于料液温度的一个恒定值的±3.0℃以内。
料液的温度优选被控制在处于5℃到50℃范围内的一个恒定值的±3.0℃以内，更优选的是被控制在处于15℃到40℃范围内的一个恒定值的±3.0℃以内，例如35.0℃±3.0℃。
为了将料液储槽中的料液的温度精确地控制在一个恒定值的±3.0℃以内，可以为料液储槽设置温控装置。
为此，可以使用带夹套的不锈钢容器作为料液储槽，所述夹套使得恒温的液体介质围绕所述容器流动。不锈钢容器可连接有其温度精度为±2.0℃、循环泵能力为10L/分钟或更高的恒温循环装置(例如，东京理化器械株式会社生产的NCC-2100型恒温循环装置)，使得恒温的液体介质可循环通过不锈钢容器。可供选用的另一种方式是，将循环泵能力为10L/分钟或更高的泵与温度精度被控制为±2.0℃的浴槽连接，使得恒温的液体介质可循环通过所述的浴槽。然而，本发明不限于这些构造，只要料液储槽中的料液的温度可以被控制在一个恒定值的±3.0℃以内即可。
流延表面的温度优选被控制在处于-10℃到47℃范围内的一个恒定值的±3.0℃以内(比料液的温度低3.0℃到60℃)，例如10.0℃±3.0℃；更优选的是，被控制在处于0℃到45℃范围内的一个恒定值的±3.0℃以内(比料液的温度低5℃到50℃)；甚至更优选的是，被控制在处于15℃到25℃范围内的一个恒定值的±3.0℃以内(比料液的温度低5℃到15℃)。
为了将流延表面的温度精确地控制在一个恒定值的±3.0℃以内，可以为输送转筒设置能够将转筒表面的温度精确地控制在一个恒定值的±3.0℃以内的温控装置，其中，所述的输送转筒被设置在料液通过流延模头而在PET基膜(4)上流延的位置处。
为此，可以使用具有双筒式空心转筒结构的转筒作为输送转筒，该结构在外空心转筒和内空心转筒之间具有间隙，并且在内转筒的端部形成有用于使液体流过的孔。输送转筒连接有其温度精度为±2.0℃、循环泵能力为10L/分钟或更高的恒温循环装置(例如，东京理化器械株式会社生产的NCC-2100型恒温循环装置)。在这种构造中，液体介质从轴承流入介于外转筒和内转筒之间的间隙中，并且液体介质可在内转筒的所述端部从该间隙进入内转筒中。然后液体介质向轴承侧排出。由此，可以使恒温的液体介质循环。可供选用的另一种方式为，可以将循环泵能力为10L/分钟或更高的泵与温度精度被控制为±2.0℃的浴槽连接。在这种构造中，液体介质从轴承流入介于外转筒和内转筒之间的间隙内，并且液体介质可在内转筒的所述端部从该间隙进入内转筒中。然后液体介质向轴承侧排出。由此，可以使恒温的液体介质循环。然而，本发明不限于这些结构，只要输送转筒的温度被控制在一个恒定值的±3.0℃以内即可。
通过上述方式将料液温度和流延表面的温度各自控制在一个恒定值的±3.0℃以内，就可以消除由此制成的微孔膜的诸如孔径之类的特征随着长度方向上的位置变化而产生的差异，从而可以得到性质比以前的产品更稳定的核酸吸附性微孔膜。
然后将如此流延而得到的微孔膜进行干燥。关于干燥条件，优选将微孔膜在30℃到110℃下干燥15分钟到50分钟，更优选的是在40℃到100℃下干燥20分钟到40分钟。
然后将如此干燥而得到的微孔膜卷绕在卷取辊(B)上。
[微孔膜的皂化处理]
本发明的微孔膜优选为经皂化的纤维素的酯类衍生物的微孔膜。
经皂化的纤维素的酯类衍生物的微孔膜优选为经表面皂化的醋酸纤维素微孔膜。如上文所述，醋酸纤维素可以是单醋酸纤维素、二醋酸纤维素和三醋酸纤维素中的任意一种，尤其可以是三醋酸纤维素。更优选的是，将三醋酸纤维素和二醋酸纤维素混合使用。
为了制备经皂化的微孔膜，优选的是，使用碱性皂化溶液(例如NaOH、KOH)只在膜结构的与碱性皂化溶液接触的表面上进行皂化处理。而膜结构材料中的醋酸纤维素不必发生改变。空间中羟基的量(密度)可由表面皂化度(表面皂化率)和微孔膜的结构来控制。因为膜结构是由醋酸纤维素构成的，所以可以得到坚固的固相。用于仅仅向膜结构的表面引入羟基的醋酸纤维素表面皂化处理是指仅仅使膜结构的表面转化成纤维素，而该结构的其余部分中的醋酸纤维素没有发生变化。因为纤维素如果用作原材料的话是不能被溶解的，所以在工业上不可能将其制成多孔膜或平膜。
例如，作为三醋酸纤维素微孔膜，市售的有FM500型微滤膜(由富士胶片株式会社制造)。
为了对微孔膜进行表面皂化处理，可将微孔膜浸渍在碱性水溶液中。为了改变表面皂化率，可以改变碱性水溶液的浓度或浸渍时间。例如，可将微孔膜在浓度为0.1摩尔/L到1.0摩尔/L的氢氧化钠水溶液中浸渍10分钟到120分钟。
皂化率可由任何已知的方法容易地测量。例如，残留乙酰基的量可由乙酰度滴定法或者是利用测量仪器(例如NMR、IR和XPS)进行的结构分析法来定量地测量。
在使用经皂化的微孔膜来分离核酸的情况下，微孔膜中的羟基的数量优选为尽可能地大以提高分离核酸的效率。例如，由醋酸纤维素(例如三醋酸纤维素)制成的微孔膜优选具有约5％到100％的表面皂化率，更优选具有10％或更高的表面皂化率。其表面皂化率满足上述限定范围的微孔膜在用作核酸分离纯化的吸附材料时表现出充足的吸附性。为了得到上述限定的皂化率，微孔膜浸渍在0.4摩尔/L氢氧化钠水溶液中的时间优选为10分钟或更长。
[皂化装置]
以下将参照附图来说明对纤维素微孔膜进行皂化的实施方式。
图2是用于对纤维素酯类微孔膜进行皂化的装置的示意图。设置皂化装置10，使得纤维素酯类微孔膜11(下文中有时简称为“纤维素酯类薄膜”)在以薄片的形式被相继输送、或者是以连续的形式被连续输送的同时经受预定的处理，从而形成皂化膜12。皂化装置10包括皂化单元15、中和单元16、漂洗单元17和干燥单元18。
皂化单元15中设有皂化罐(图中未示出)。皂化罐中装有用于对纤维素酯类薄膜11进行皂化的碱性水溶液，从而形成皂化膜12。
中和单元16中设置有中和层(图中未示出)。中和层中装有酸性水溶液，该溶液用于中和残留在经皂化反应制成的皂化膜12的表面上或内部中的碱性水溶液。
漂洗单元17中设有带搅拌装置的漂洗机器(图中未示出)。漂洗机器中设有吸水口和排水口。洗涤用水由供水部分20经吸水口适当地输送到漂洗机器中。只有使用过的水通过排水口被适当地排放到漂洗机器外。
干燥单元18包括转筒25来作为用于加热皂化膜12的加热单元。干燥单元18还具有用于输送皂化膜12的传送带26，使得皂化膜12插入转筒25和传送带26之间，以提高加热皂化膜12的效率。干燥单元18还具有用于移动传送带26的输送辊27。转筒25设有用于驱动转筒25转动的电机25a、以及温控装置25b，该温控装置用于检测转筒25的表面温度，并根据检测结果来控制转筒25的表面温度。干燥单元18还包括室31，室31上形成有用于排放内部空气的排出口31a。空气是通过室31的进口而进入室31的，其中皂化膜12经过该进口而进入室31。
在皂化单元15中，使用碱性水溶液来皂化纤维素酯类薄膜11。例如，将纤维素酯类薄膜11在常温(15℃到35℃)下在搅拌的、浓度为0.1摩尔/L到1.0摩尔/L的氢氧化钠水溶液中浸渍10分钟到120分钟。
优选的是，在皂化反应后尽可能快地对如此皂化所得到的薄膜12进行中和处理。中和步骤中使用的酸的浓度和种类、以及中和作用的时间都是任意的，只要这些条件足以使皂化步骤中附着在膜12上的碱性水溶液被中和即可。例如，可将皂化膜在浓度为0.1摩尔/L到1.0摩尔/L的水溶液中浸渍10分钟到60分钟，以进行中和处理。皂化膜的中和处理也可以通过任何其它方法进行，例如，将酸性水溶液喷射到皂化膜12上。
随后，在漂洗单元17中，对皂化膜12进行充分漂洗。连续供水，同时连续排水，使得洗涤操作可以在水流中完成。按照这种流动水处理方法，可提高洗涤效率和洗涤效果。在用流动水处理的情况下，漂洗时间优选为60分钟或更长。在贮水处理的情况下，漂洗操作的时间优选大于60分钟，同时适当换水。
洗涤用水是经过过滤的水。这种经过过滤的水不含核酸酶和粒径为0.5μm或更大的颗粒。核酸酶是一类能够切割DNA和RNA的酶。使用不含核酸酶的水作为洗涤用水可以防止核酸分离纯化的收率降低。
在本实施方案中，不含核酸酶的水不仅被用作漂洗步骤中的洗涤用水，而且还被用在所有其它的处理溶液(包括用于皂化步骤中的碱性水溶液和用于中和步骤中的酸性水溶液)中，从而可以更加可靠地防止核酸分离纯化的收率降低。
洗涤用水可以与水溶性有机溶剂混合。水溶性有机溶剂优选选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇及其异构体。可以选择多种水溶性有机溶剂。
以下将说明使用干燥单元18进行的干燥步骤。本实施方案中使用的加热单元是如上文所述的接触型转筒25。通过输送辊27的作用而连续循环的传送带26环绕转筒25延伸。已经通过漂洗单元17的皂化膜12由输送辊21等输送到传送带26上。随后，由传送带26将皂化膜12引导到表面被加热的转筒25上。接着，皂化膜12在转筒25上被加热。在加热期间，一边输送皂化膜一边将该皂化膜插入到转筒25和传送带26之间。皂化膜即使在离开转筒25之后仍在被加热的传送带26上继续被干燥。因此，皂化膜在离开室31时是完全干燥的。当皂化膜经过了干燥步骤时，就得到纤维素微孔膜。
通过这种在皂化膜插入到转筒和传送带之间的同时来加热皂化膜的方式，可以提高加热皂化膜12的效率；同时还可以防止膜破裂和其它问题。这是因为这种加热方法可以使皂化膜12随着该皂化膜中所含水分的蒸发而发生的收缩受到抑制。皂化膜的破裂归因于皂化膜的收缩。因此，按照本实施方案，可以防止皂化膜的破裂，这种破裂是迄今为止在使用框架支持的方法(其中涉及在膜的侧边对膜施加支持作用)中边输送皂化膜边进行干燥时都会发生的现象。
根据皂化膜12的厚度、皂化膜12的含水量和输送速度等来确定转筒25的温度。根据皂化膜12的强度等来确定输送速度。转筒25的表面温度优选为约100℃到200℃。输送速度优选为0.05m/分钟到5.0m/分钟。当转筒25的表面温度降到低于100℃时，皂化膜12受热不充分，因此不能完全干燥。然而另一方面，当转筒25的表面温度超过200℃时，皂化膜12会发生劣化。此外，当输送速度降到低于0.05m/分钟时，对生产率不利。然而另一方面，当输送速度超过5.0m/分钟时，由于会发生干燥不充分的情况，所以也是不利的。
此外，在当输送皂化膜12并将该皂化膜插入到转筒和传送带之间的同时对其进行加热和干燥的情况下，得到的皂化膜12可具有优异的平整性。因为皂化膜12具有这种优异的平整性，所以通过将皂化膜12切割成预定尺寸而得到的薄片可以被精确地容纳在核酸分离纯化柱中。
[微孔膜的性质]
本发明的微孔膜的最小孔径通常为约0.01μm到8μm。然而，如果本发明的微孔膜用于分离和纯化核酸，那么为了提高提取核酸的效率，则该微孔膜的最小孔径优选为0.1μm或更大，更优选为0.5μm到5μm。
可以通过泡点法来测量微孔膜的最小孔径。
本发明的微孔膜中的孔的形状可以为各种形状。例如，微孔膜的孔的形状表里之间可以对称或不对称。然而，如果本发明的微孔膜用于分离和纯化核酸，那么为了防止堵塞，则该微孔膜的孔的形状优选为表里之间不对称。
如果本发明的微孔膜用于分离和纯化核酸，那么为了使核酸吸附到膜上并防止堵塞，则该微孔膜的最大孔径与最小孔径之比优选为2或更高，更优选为5或更高。
可以使用电子显微镜来测量微孔膜的最大孔径。
如果本发明的微孔膜用于分离和纯化核酸，那么为了便于膜的洗涤，则该微孔膜的厚度优选为10μm到500μm，更优选为50μm到250μm。
可以使用厚度计(例如数显厚度计)来测量微孔膜的厚度。
如果本发明的微孔膜用于分离和纯化核酸，那么为了防止堵塞并便于核酸回收，则该微孔膜的孔隙率优选为50％到95％，更优选为65％到80％。
可以通过计算膜的密度来确定孔隙率。
如果本发明的微孔膜用于分离和纯化核酸，那么为了防止堵塞并便于核酸回收，则该微孔膜的泡点优选为0.1kgf/cm2到10kgf/cm2，更优选为0.2kgf/cm2到4kgf/cm2。
可以使用泡点法来测量泡点。
如果本发明的微孔膜用于分离和纯化核酸，那么为了使用压力系统进行自动化处理，则该微孔膜的压力损失优选为0.1kPa到100kPa，更优选为0.5kPa到50kPa。
可以使用差压计来测量压力损失。
如果本发明的微孔膜用于分离和纯化核酸，那么为了使用压力系统进行自动化处理，则在25℃的温度、1kg/cm2的压力下，该微孔膜的透水度优选为每分钟1mL/cm2到5,000mL/cm2，更优选为每分钟5mL/cm2到1,000mL/cm2。
当本发明的微孔膜的性质满足上述限定的范围时，该微孔膜可更优选地用于核酸分离纯化方法中。
当本发明的微孔膜用于核酸分离纯化方法中时，每毫克该微孔膜的核酸吸附量优选为0.1μg或更多，更优选为0.9μg或更多。
[核酸分离纯化方法]
本发明的微孔膜被用于核酸分离纯化方法中，该方法包括以下多个步骤：
步骤(1)，使含核酸的样品溶液穿过多孔膜，使得核酸被吸附在多孔膜的内部；
步骤(2)，使洗涤液穿过多孔膜，从而对核酸保持吸附在其上的多孔膜进行洗涤；以及
步骤(3)，使回收液穿过多孔膜，使得核酸从多孔膜的内部解吸附。
本文中使用的术语“核酸”是指单链核酸或双链核酸。对核酸的分子量没有限定。
在核酸分离纯化方法中，优选使用具有这样一种固相的核酸分离纯化单元来进行核酸的吸附和解吸附，该固相由微孔膜制成，所述微孔膜被容纳在具有至少两个开口的容器中。
更优选的是，使用这样一种核酸分离纯化单元来进行核酸的吸附和解吸附，该核酸分离纯化单元具有：(a)由微孔膜制成的固相；(b)具有至少两个开口的容器，用于容纳固相；以及(c)与所述容器的一个开口连接的压力差产生装置。
上述核酸分离纯化方法的第一实施方案包括以下步骤：
步骤(a)，将核酸分离纯化单元的一个开口插入到含核酸的样品溶液中；
步骤(b)，借助于容器内的降低的压力，吸入含核酸的样品溶液，使得样品溶液与由微孔膜制成的固相接触，所述降低的压力是通过使用与核酸分离纯化单元的其它开口连接的压力差产生装置来实现的；
步骤(c)，借助于容器内的升高的压力，将上述吸入的含核酸的样品溶液排出容器，所述升高的压力是通过使用与核酸分离纯化单元的其它开口连接的压力差产生装置来实现的；
步骤(d)，将核酸分离纯化单元的一个开口插入到核酸洗涤缓冲液中；
步骤(e)，借助于容器内的降低的压力，吸入核酸洗涤缓冲液，使得核酸洗涤缓冲液与由微孔膜制成的固相接触，所述降低的压力是通过使用与核酸分离纯化单元的其它开口连接的压力差产生装置来实现的；
步骤(f)，借助于容器内的升高的压力，将上述吸入的核酸洗涤缓冲液排出容器，所述升高的压力是通过使用与核酸分离纯化单元的其它开口连接的压力差产生装置来实现的；
步骤(g)，将核酸分离纯化单元的一个开口插入到能够使吸附到由微孔膜制成的固相上的核酸解吸附的溶液中；
步骤(h)，借助于容器内的降低的压力，吸入能够使吸附到由微孔膜制成的固相上的核酸解吸附的溶液，使得能够使吸附到由微孔膜制成的固相上的核酸解吸附的溶液与由微孔膜制成的固相接触，所述降低的压力是通过使用与核酸分离纯化单元的其它开口连接的压力差产生装置来实现的；以及
步骤(i)，借助于容器内的升高的压力，将上述能够使吸附到由微孔膜制成的固相上的核酸解吸附的溶液排出容器，所述升高的压力是通过使用与核酸分离纯化单元的其它开口连接的压力差产生装置来实现的。
上述核酸分离纯化方法的第二实施方案可包括以下步骤：
步骤(a)，由试验样品制备含核酸的样品容液，并将含核酸的样品溶液注入到核酸分离纯化单元的第一开口中；
步骤(b)，借助于容器内的升高的压力，将上述注入的含核酸的样品溶液通过其它开口排出容器，使得样品溶液与由微孔膜制成的固相接触，所述升高的压力是通过与核酸分离纯化单元的第一开口连接的压力差产生装置来实现的；
步骤(c)，将核酸洗涤缓冲液注入到核酸分离纯化单元的第一开口中；
步骤(d)，借助于容器内的升高的压力，将上述注入的核酸洗涤缓冲液通过其它开口排出容器，使得核酸洗涤缓冲液与由微孔膜制成的固相接触，所述升高的压力是通过与核酸分离纯化单元的第一开口连接的压力差产生装置来实现的；
步骤(e)，将能够使吸附在由微孔膜制成的固相上的核酸解吸附的溶液注入到核酸分离纯化单元的第一开口中；以及
步骤(f)，借助于容器内的升高的压力，将上述能够使被吸附在由微孔膜制成的固相上的核酸解吸附的溶液通过其它开口排出容器，使得被吸附在由微孔膜制成的固相上的核酸从固相上解吸附，并被排出容器，所述升高的压力是通过使用与核酸分离纯化单元的第一开口连接的压力差产生装置来实现的。
以下将进一步说明使用微孔膜的核酸分离纯化方法。优选的是，使含核酸的样品溶液与由微孔膜制成的固相接触，使得样品溶液中的核酸被吸附到固相上。随后，使用所需的溶液(在下文中说明)，使被吸附到固相上的核酸从固相上解吸附。更优选的是，含核酸的样品溶液是通过向核酸分散体中加入水溶性有机溶剂而得到的溶液，所述核酸分散体是通过使用能够使试验样品中的细胞膜和核膜分解的溶液来处理含细胞或病毒的试验样品而得到的。
对本发明使用的含核酸的样品溶液没有限定。然而，在诊断领域中，样品溶液可以是：体液，例如全血、血浆、血清、尿、粪便和唾液；或者是生物材料，例如植物(或其一部分)、动物(或其一部分)或者它们的溶液或匀浆。
首先，使用其中含有能够使细胞膜分解的试剂的水溶液来处理试验样品，从而溶解核膜。以这样的方式，细胞膜和核膜都被分解，从而使核酸分散在水溶液中。为了使细胞膜分解并溶解核膜，在分析样品为全血的情况下，需要进行以下操作：(1)除去红细胞，(2)除去各种蛋白质，以及(3)使白细胞和核膜分解。需要进行除去红细胞的操作(1)和除去各种蛋白质的操作(2)是为了防止固相的非特异性吸附，并防止多孔膜堵塞。需要进行使白细胞和核膜分解的操作(3)是为了使待提取的核酸溶解。具体地说，使白细胞和核膜分解的操作(3)是一个重要的步骤，在该步骤中，必须使核酸溶解。在下文所述的例子中，当使用盐酸胍、Triton X-100以及蛋白酶(由SIGMA公司生产)将试验样品在60℃温育10分钟时，便可同时满足上述操作(1)、(2)和(3)的要求。
作为核酸溶解试剂，可以使用含有胍盐、表面活性剂和蛋白水解酶的溶液。作为胍盐，优选使用盐酸胍。然而，也可以使用其它胍盐(异硫氰酸胍和硫氰酸胍)。溶液中胍盐的浓度为不低于0.5M到不高于6M，优选为不低于1M到不高于5M。
作为表面活性剂，可以使用Triton X-100。除了Triton X-100，还可以使用：阴离子表面活性剂，例如SDS、胆酸钠和肌氨酸钠；非离子型表面活性剂，例如吐温20和Megafac；以及其它各种两性表面活性剂。优选使用非离子型表面活性剂，例如聚氧乙烯辛基酚醚(Triton X-100)。溶液中表面活性剂的浓度通常优选为0.05质量％到10质量％，特别是0.1质量％到5质量％。
作为蛋白水解酶，可以使用蛋白酶K。然而，还可以使用其它蛋白酶。因为蛋白酶是一类酶，所以优选将其加热到37℃到70℃、特别是50℃到65℃的温度。
接着，向含核酸的水溶液(核酸已经以上述方式分散在水溶液中)中加入水溶性有机溶剂，从而使核酸能够与微孔膜接触。以这样的方式，样品溶液中的核酸被吸附到微孔膜上。为了使按照本文上述过程溶解的核酸被吸附到由微孔膜制成的固相上，就必须使以上述方式溶解的核酸混合溶液与水溶性有机溶剂混合，并且使混合后的核酸溶液中含有盐。
换言之，当位于核酸周围的水分子的水合结构被破坏时，核酸以不稳定的状态溶解。据信，当核酸以这样的状态与由微孔膜制成的固相接触时，核酸表面的极性基团与固相表面的极性基团发生相互作用，使得核酸被吸附到固相的表面。通过将按照上述方式溶解的核酸混合溶液与水溶性有机溶剂混合，并使最后得到的混合后的核酸溶液中含有盐，就可以使核酸处于不稳定的状态。
本发明中可以使用的水溶性有机溶剂的实例包括乙醇、异丙醇和丙醇。在这些水溶性有机溶剂中，优选乙醇。水溶性有机溶剂的浓度优选为5质量％到90质量％，更优选为20质量％到60质量％。乙醇的浓度优选为尽可能得高，只要不产生凝聚即可。
以上述方式得到的混合后的核酸溶液中所含的盐的优选实例包括各种离液材料(胍盐、碘化钠和高氯酸钠)、氯化钠、氯化钾、氯化铵、溴化钠、溴化钾、溴化钙和溴化铵。具体地说，胍盐是优选的，这是因为它们具有使细胞膜分解和溶解核酸的双重效果。
随后，将其上吸附有核酸的微孔膜与核酸洗涤缓冲液接触。这种核酸洗涤缓冲液能够洗涤微孔膜，从而除去样品溶液中与核酸一起被吸附到微孔膜上的杂质。因此，核酸洗涤缓冲液必须具有这样的成分，该成分使得核酸不能从微孔膜上解吸附，但是能够使杂质从微孔膜上解吸附。核酸洗涤缓冲液由含有主要试剂、缓冲剂和可选可不选的表面活性剂的水溶液构成。作为主要试剂，可以使用浓度为约10质量％到100质量％(优选为约20质量％到100质量％，更优选为约40质量％到80质量％)的以下试剂的水溶液，所述试剂为：甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、丁醇、丙酮等。作为缓冲剂和表面活性剂，可以分别使用现有的缓冲剂和表面活性剂。在这些核酸洗涤缓冲液中，优选含有乙醇、Tris和Triton X-100的溶液。Tris和Triton X-100的浓度各自优选为10mM到100mM和0.1质量％到10质量％。
随后，将上述经过如此洗涤的微孔膜与能够使被吸附到微孔膜上的核酸解吸附的溶液接触。与微孔膜接触后的溶液中含有需要的核酸。因此，回收该溶液并进行其后的处理过程，例如，通过PCR(聚合酶链式反应)使核酸扩增。作为能够使核酸解吸附的溶液，优选使用盐浓度低(特别是0.5M或更低)的溶液。作为这种溶液，可以使用纯净的蒸馏水、TE缓冲液等等。
[核酸分离纯化单元]
核酸分离纯化单元具有由微孔膜制成的固相，该固相被容纳在具有至少两个开口的容器中。对容器构成材料没有特别的限定，只要其能够容纳微孔膜并具有至少两个开口即可。为了易于生产，塑料是优选的。例如，可优选使用诸如聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、尼龙和聚碳酸酯之类的透明或不透明的树脂。
图3是所述容器的概念图。大体而言，如果容器被设置成以下方式就可以满足需要，所述方式为：具有能够容纳固相的固相容纳部分；能够防止在样品溶液等的吸入和排放期间固相脱离容纳部分；并且设有与其开口连接的压力差产生装置，例如注射器。因此，优选的是，当容器容纳固相以后，该容器由连接在一起的两部分构成。此外，为了防止固相脱离容纳部分，可以在固相的顶部和底部设置由不会污染DNA的材料制成的网。
对将被容纳在上述容器中的微孔膜的形状也没有特别限定。微孔膜的形状可以是圆形、正方形、长方形、椭圆形、圆筒状、卷状或任何其它任意的形状。为了提高生产率，微孔膜优选的形状是诸如圆形、正方形、圆筒状和卷状之类的高度对称的形状。
将上述容器的一个开口插入到含核酸的样品溶液中，同时，从其它开口抽吸样品溶液，从而使样品溶液与微孔膜接触。然后排放样品溶液。随后，吸入核酸洗涤缓冲液，并将其排放。随后，吸入能够使吸附到微孔膜上的核酸解吸附的溶液，并将其排放。然后，将上一步骤中的排放溶液回收，以便得到所需的核酸。
还可以通过以下操作来得到所需的核酸，该操作为：将微孔膜依次浸渍在含核酸的样品溶液中、核酸洗涤缓冲液中以及能够使吸附到微孔膜上的核酸解吸附的溶液中。
核酸分离纯化单元优选包括：(a)由微孔膜制成的固相；(b)用于容纳固相的具有至少两个开口的容器；以及(c)与所述容器的一个开口连接的压力差产生装置。参照这种核酸分离纯化单元来进一步说明本发明。
通常，以多个部件(即，主体和盖体，其中主体用于容纳由微孔膜制成的固相)的方式制备所述容器。这两个部件各自具有至少一个开口。其中，一个开口被用作含核酸的样品溶液、核酸洗涤缓冲液和能够使吸附到固相上的核酸解吸附的溶液(下文中称之为“样品溶液等”)的进口和出口。其它开口与能够降低或升高容器内的压力的压力差产生装置连接。对主体的形状没有特别限定。然而，该主体优选具有圆形部分，以便有利于生产该主体，以及有利于使样品溶液等分散到固相的整个表面上。该主体部分还优选为长方形，以免产生所述固相的裁剪废料。
上述盖体必须以这样的方式与主体连接：该方式使得容器内的压力可以通过压力差产生装置来降低或升高。可以选择任何连接方法，只要可以达到这种状态即可。本发明可使用的连接方法的实例包括使用粘合剂、螺纹连接、装配连接和超声波热熔接。
容器的内部容积仅由待处理的样品溶液的量来确定，但是通常由容器内容纳的固相的体积来表示。具体地说，所述容器的尺寸优选大到足够容纳约1个到6个固相薄片，其中所述薄片的厚度为约1mm或更薄(例如约50μm到500μm)，而直径为约2mm到20mm。
固相的边缘优选为与容器的内壁紧密接触，使得样品溶液等不能从固相边缘与容器内壁之间的间隙通过。
与用作样品溶液等的进口的那个开口相对放置的固相不与容器的内壁紧密接触，使得在该固相以下形成空间，从而形成使得样品溶液等尽可能均匀地分散在固相的整个表面上的排布方式。
在与其它开口(即，与压力差产生装置连接的那个开口)相对放置的固相上面，优选的是，设置一个穿有孔的元件，该孔大体上位于该元件的中心部分。该元件具有在保持固相的同时有效地排放样品溶液等作用。该元件优选为漏斗状或杯状，从而使得样品溶液等聚集在该元件的中心处。所述的孔的尺寸、倾斜的角度以及该元件的厚度都可以由本领域的技术人员根据待处理的样品溶液等的量、以及用于容纳固相的容器的尺寸等来适当地确定。在所述元件和所述开口之间优选形成一个用于储存样品溶液等(是指溢出固相的那部分溶液)的空间，从而防止样品溶液等被吸入到压力差产生装置中。本领域的技术人员还可以适当地确定所述空间的尺寸。为了有效地收集核酸，优选的是，被吸入的含核酸的样品溶液的量等于或大于使得容器中整个固相都被浸没时的量。
为了防止样品溶液等只集中在吸入开口的正下方的部分处，从而达到使样品溶液等能够相对均匀地穿过固相，优选的是，在所述固相和所述元件之间也形成一个空间。因此，优选的是，该元件具有多个面向固相形成的突起。这些突起的尺寸和数量可由本领域的技术人员适当地确定，但是优选的是，将其确定成在所述固相和所述元件之间保持充足的空间的同时，使得固相的开放区域能够保持尽可能得大。
不用说，当容器上形成有三个或更多开口时，在伴随压力降低或升高的同时，必须将多出来的开口暂时关闭，以便使溶液能够被吸入或排出。
操作时，压力差产生装置首先降低容器(其中容纳有固相)内的压力，以便吸入含核酸的样品溶液。本发明可使用的压力差产生装置的实例包括注射器、移液管以及能够吸气和压缩气体的泵(例如Perista泵)。在这些压力差产生装置中，注射器适用于人工操作，而泵适用于自动化操作。此外，移液管是有利的，因为其便于单手操作。优选的是，压力差产生装置以可拆卸的方式与容器的一个开口连接。
以下将说明使用上述核酸分离纯化单元来纯化核酸的方法。首先，将上述核酸分离纯化单元的第一开口插入含核酸的样品溶液中。随后，使用与核酸分离纯化单元的其它开口连接的压力差产生装置来降低纯化单元内的压力，以便将样品溶液吸入到容器中。以这样的方式，使样品溶液与固相接触，从而使样品溶液中的核酸被吸附到固相上。优选的是，样品溶液被吸入一定的量使得样品溶液在该过程中能够与固相的几乎整个主体接触。然而，当样品溶液被吸入压力差产生装置中时，所述装置被污染。所以应该以适当调节的量吸入样品溶液。
在吸入适量的样品溶液之后，接着通过压力差产生装置来升高所述单元内的压力，从而排放以上述方式吸入的溶液。在吸入操作和排放操作之间不需要设置一定的时间间隔。在样品溶液被吸入之后，可以紧接着进行排放样品溶液的操作。
随后，按照与上述相同的减压操作和升压操作将核酸洗涤缓冲液吸入容器中，然后排放，从而对容器的内部进行洗涤。这种核酸洗涤缓冲液能够将容器中余留的样品溶液、以及样品溶液中的与核酸一起被吸附到固相上的杂质一块儿洗出。因此，核酸洗涤缓冲液必须具有这样的成分：该成分不会使核酸从微孔膜上解吸附，但能使杂质从微孔膜上解吸附。核酸洗涤缓冲液由含有主要试剂、缓冲剂和可选可不选的表面活性剂的水溶液构成。作为主要试剂，可以使用浓度为约10质量％到90质量％(优选为约50质量％到90质量％)的甲醇、乙醇、丁醇或丙酮等的水溶液。作为缓冲剂和表面活性剂，可以分别使用现有的缓冲剂和表面活性剂。在这些核酸洗涤缓冲液中，优选含乙醇、Tris和Triton X-100的溶液。Tris和Triton X-100的浓度各自优选为10mM到100mM和0.1质量％到10质量％。
随后，按照与上述相同的减压操作和升压操作将能够使吸附到固相上的核酸解吸附的溶液引入容器中，然后从容器中排出。如此排放的溶液含有所需的核酸。因此，可以将该溶液回收，并提供给随后的处理过程，例如通过PCR(聚合酶链式反应)使核酸扩增。
图4为核酸分离纯化单元的实例的剖面图。但是，图中没有示出压力差产生装置。用于容纳固相的容器500具有主体100和盖200，并且该容器由透明的聚苯乙烯制成。主体100容纳有多孔膜作为固相300，其中该多孔膜由经过表面皂化的三醋酸纤维素制成。主体100还具有开口101，样品溶液等经由该开口被吸入。自该开口延伸而形成的底表面102为漏斗形。在底表面102和固相300之间形成空间121。框架103与底表面102一体形成，以便支承固相300并保持空间121。
主体的内径为20.1mm，深度为5.9mm，而从底表面102到开口101的长度为约70mm。容纳于主体中的固相300的直径为20.0mm。固相300中的单张薄片的厚度为约50μm到500μm。例如，固相300中的单张薄片的厚度为100μm。
图4中，漏斗状的压件130置于固相的上面。压件130具有在其中心位置处形成的孔131、以及在压件的下表面上形成的一组突起132。在压件130和固相300之间形成空间122。为了使样品溶液等难以由固相300与主体100的壁104之间的间隙泄露出去，以如下方式设置壁104，所述方式为：使所述的壁的上部的直径比固相的直径大；并且将压件130的边缘置于台阶105上。
通过超声波加热将盖200与主体100连接。盖200具有在大体为盖中心的位置处形成的开口201，压力差产生装置被连接到该开口上。在盖200和压件130之间形成了用于保留由孔131流出的样品溶液等的空间123。空间123具有约0.1mL的容积。
[实施例]
在以下实施例中进一步说明本发明，但是本发明不能被解释为只限于这些实施例。
[实施例1]
(1)制备核酸吸附性微孔膜
制备纤维素酯料液。参照料液制备中所述的溶解方法，首先将聚合物成分溶解于二氯甲烷中。随后，按比例向该溶液中加入甲醇。然后，按比例向这种溶液中加入甘油和纯净水，从而得到其中几乎不含不溶物的料液。随后，通过滤纸过滤料液。所述料液的配方如下。
二醋酸纤维素            2.42％
(乙酰度：54.5％)
三醋酸纤维素            3.43％
(乙酰度：60.8％)
甘油                    0.18％
二氯甲烷                55.50％
甲醇                    33.22％
纯净水                  5.05％
将上述料液加入带有温控装置的料液储槽(图1中的(1))中。料液储槽(1)的温度被控制为35.0℃±3.0℃。随后，使用齿轮泵(2)泵送被保持为35.0℃±3.0℃的料液，过滤，然后通过模头(3)使料液在聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜(4)上流延，其中该膜是被置于环形带(5)上进行输送的。在该过程中，转筒(6)的温度被控制为10.0℃±3.0℃，从而将流延表面的温度保持在±3.0℃的波动范围以内。然后，使用温度为20℃到40℃的干燥空气对如此形成的经流延的料液(经流延的聚合物溶液)干燥20分钟(如参考标号7所示)，从而形成流延薄膜。
将流延薄膜与PET一起从环形带(5)上剥离，用温度为80℃到120℃的热空气干燥15分钟(如参考标号8所示)，然后由卷取机器(B)卷绕。从而在PET上形成醋酸纤维素微孔膜。
使成卷的流延薄膜(B)通过带有切刀的放卷机(C)，流延薄膜在此被切割成宽为43cm的膜。使宽为43cm并带有PET的醋酸纤维素膜通过剥离杆(D)，所述薄膜在此被分成PET部分(E)和醋酸纤维素微孔膜(F)。如此得到的醋酸纤维素微孔膜的平均孔径为1.2μm，平均厚度为70μm。
然后，使1.5L甲醇和13.5L不含核酸酶的水这二者的混合物被吸附到醋酸纤维素微孔膜上。使醋酸纤维素微孔膜通过皂化单元15，在该皂化单元中，用温度为20℃到30℃的0.4摩尔/L的NaOH水溶液将所述微孔膜皂化60分钟。
在中和单元16中，将醋酸纤维素微孔膜浸渍在温度为20℃到30℃的0.1摩尔/L的盐酸中，由此对醋酸纤维素微孔膜进行中和操作。
关于醋酸纤维素微孔膜的漂洗，用自动洗涤机作为漂洗单元17，并且用不含核酸酶的水作为漂洗用水。
随后，使用接触型转筒干燥装置18来干燥醋酸纤维素微孔膜，从而得到所需的核酸吸附性微孔膜。
(2)核酸分离纯化柱的制备
由高抗冲聚苯乙烯制备核酸分离纯化柱容器，其中容器的内径为7mm，并且该容器具有用于容纳核酸吸附性微孔膜的部分。在微孔膜(1)的长度方向上的1m、50m、100m、150m和200m的位置处取样，并将所选取的膜试样分别容纳在核酸分离纯化柱容器内的用于容纳核酸吸附性多孔膜的位置处，从而制成核酸分离纯化柱。
(3)核酸溶解试剂溶液和洗涤液的制备
按照以下配方来制备核酸溶解试剂溶液和洗涤液。
(核酸溶解试剂溶液)
                                                              
盐酸胍(由Life Technology有限公司制造)    382g
Tris(由Life Technology有限公司制造)      12.1g
Trion X-100(由ICN公司制造)               10g
蒸馏水                                   1,000mL
                                                               
(洗涤液)
                                                               
100mM    NaCl
10mM     Tris-HCl
65％     乙醇
                                                               
(4)DNA分离纯化的操作
向200μL人全血试验样品中加入200μL实施例1制备的核酸溶解试剂溶液、和20μL蛋白酶(细菌“蛋白酶”XXIV型，由SIGMA公司制造)。然后将试验样品在60℃温育10分钟。然后，在搅拌条件下向如此温育所得到的试验样品中加入200μL乙醇，从而制成含核酸的样品溶液。然后，通过各个核酸分离纯化柱的第一开口将含核酸的样品溶液注入到各个核酸分离纯化柱中，其中核酸分离纯化柱中分别装有在步骤(2)中制备的、在微孔膜的长度方向上的不同位置处取样而得到的核酸吸附性微孔膜。随后，将上述开口与压力差产生装置连接，然后通过该压力差产生装置来升高核酸分离纯化单元内的压力，使得含核酸的样品溶液穿过核酸吸附性微孔膜，从而使所述样品溶液与核酸吸附性微孔膜接触。然后，由核酸分离纯化柱的其它开口将样品溶液从核酸分离纯化柱内排出。随后，由核酸分离纯化柱的第一开口将步骤(3)制备的洗涤液注入到核酸分离纯化柱中。将压力差产生装置与核酸分离纯化柱的第一开口连接，然后通过该压力差产生装置来升高核酸分离纯化单元内的压力，从而使上述被注入的洗涤液穿过核酸吸附性微孔膜。然后通过核酸分离纯化单元的其它开口将洗涤液从核酸分离纯化单元内排出。将该操作重复进行3次。随后，通过核酸分离纯化柱的第一开口向核酸分离纯化柱内注入回收液。将压力差产生装置与核酸分离纯化柱的第一开口连接，然后通过该压力差产生装置来升高核酸分离纯化单元内的压力，从而使上述被注入的回收液穿过核酸吸附性微孔膜。通过核酸分离纯化单元的其它开口将回收液从核酸分离纯化单元内排出，然后回收该回收液。记录在每个核酸分离纯化柱上含核酸的样品溶液穿过核酸吸附性微孔膜所需要的时间(见表1)。
[对比例1]
按照实施例1的过程实施本对比例，不同之处在于流延表面的温度被控制为10.0℃±5.0℃。
[对比例2]
按照实施例1的过程实施本对比例，不同之处在于聚合物溶液的温度被控制为35.0℃±5.0℃。
表1
 微孔膜的长度方向上的位置 实施例1 对比例1 对比例2
 1m50m100m150m200m     5.2秒4.9秒5.8秒4.8秒4.6秒   5.5秒8.5秒26.3秒15.6秒5.6秒     12.5秒4.8秒5.9秒21.4秒48.7秒
由上述实施例1与对比例1和2的对比可以看出，在对比例1的制造条件(聚合物溶液的温度：35.0℃±3.0℃；流延薄膜表面的温度：10.0℃±5.0℃)或对比例2的制造条件(聚合物溶液的温度：35.0℃±5.0℃；流延薄膜表面的温度：10.0℃±3.0℃)下得到的微孔膜显示出这样的特点：随着所取的样在微孔膜的长度方向上的位置的不同，核酸分离纯化所需要的时间极为不同。与此形成对比的是，在实施例1的制造条件(聚合物溶液的温度：35.0℃±3.0℃；流延薄膜表面的温度：10.0℃±3.0℃)下得到的微孔膜则显示出这样的特点：尽管所取的样在微孔膜的长度方向上的位置不同，但核酸分离纯化所需要的时间基本稳定。因此，实施例1的微孔膜具有稳定的性质。
工业实用性
根据本发明可以得到孔性质稳定的膜，而与所使用的膜在膜的长度方向上的位置无关。
本发明还提供了这样一种膜的制造方法，所述的膜在作为核酸吸附性微孔膜时(特别是在从含核酸的样品溶液中分离和纯化核酸的方法中使用的情况下)具有比相关技术产品更为稳定的性质。
因此，使用本发明的微孔膜来分离和纯化核酸可以解决由于膜的特征随着长度方向上的位置变化而产生的轻微差异所引起的相关技术问题，这即使在以下情况下也做得到：核酸样品中的的悬浮物含量相对较高，即，核酸纯化时间不一致、由于堵塞而不能进行纯化、以及即使不会导致完全堵塞但分离和纯化核酸也需要相当长的时间。所以，本发明可以得到性能稳定的核酸分离纯化体系，而与所使用的膜在膜的长度方向上的位置无关。
本申请要求的外国优先权所对应的各外国专利申请的全部内容都以引用方式并入本文，如同将其全部内容在此描述一样。

Claims (17)

1.一种制造多孔膜的方法，该方法包括：
使聚合物溶液在载体上流延，从而形成经流延的聚合物溶液，其中，在流延之前的所述聚合物溶液中，聚合物被溶解于由良溶剂、不良溶剂和非溶剂形成的混合物中；
使所述的经流延的聚合物溶液干燥，从而形成流延薄膜；以及
对所述的流延薄膜进行相分离，
其中，所述多孔膜是采用以下条件制备的：流延表面的温度低于所述聚合物溶液的温度，并且所述聚合物溶液的温度变化和所述流延表面的温度变化分别被保持在±3.0℃之内。
2.根据权利要求1所述的方法，
其中，所述的聚合物溶液是由纤维素的酯类衍生物形成的聚合物溶液。
3.根据权利要求2所述的方法，
其中，所述的纤维素的酯类衍生物含有选自纤维素羧酸酯、纤维素硝酸酯、纤维素硫酸酯、纤维素磺酸酯、纤维素磷酸酯、纤维素膦酸酯和纤维素焦磷酸酯中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的方法，
其中，所述的纤维素的酯类衍生物是醋酸纤维素。
5.根据权利要求4所述的方法，
其中，所述的醋酸纤维素是三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物。
6.根据权利要求1到5中任意一项所述的方法，
其中，所述的良溶剂是二氯甲烷，所述的不良溶剂是甲醇，而所述的非溶剂是水。
7.一种制造多孔膜的方法，该方法包括：
对根据权利要求2到6中任意一项所述的方法制成的多孔膜进行皂化处理。
8.根据权利要求1到7中任意一项所述的方法，
其中，所述多孔膜的最小孔径为0.1μm或更大。
9.根据权利要求1到8中任意一项所述的方法，
其中，所述的多孔膜具有彼此不对称的前表面和后表面。
10.根据权利要求1到9中任意一项所述的方法，
其中，所述多孔膜的最大孔径与最小孔径之比为2或更大。
11.根据权利要求1到10中任意一项所述的方法，
其中，所述多孔膜的厚度为10μm到500μm。
12.根据权利要求1到11中任意一项所述的方法，
其中，所述多孔膜的孔隙率为50％到95％。
13.根据权利要求1到12中任意一项所述的方法，
其中，所述多孔膜的泡点为0.1kgf/cm2到10kgf/cm2。
14.根据权利要求1到13中任意一项所述的方法，
其中，所述多孔膜的压力损失为0.1kPa到100kPa。
15.根据权利要求1到14中任意一项所述的方法，
其中，在25℃的温度和1kg/cm2的压力下，所述多孔膜的透水度为每分钟1mL/cm2到5,000mL/cm2。
16.根据权利要求1到15中任意一项所述的方法，
其中，每毫克所述多孔膜的核酸吸附量为0.1μg或更多。
17.一种根据权利要求1到16中任意一项所述的方法制成的多孔膜在核酸分离纯化方法中的用途，所述的核酸分离纯化方法包括：
(1)使含核酸的样品溶液穿过所述的多孔膜，从而使得所述核酸被吸附到所述多孔膜的内部；
(2)在所述核酸吸附在所述多孔膜上时，使洗涤液穿过所述多孔膜，从而洗涤该多孔膜；以及
(3)使回收液穿过所述多孔膜，使得所述核酸从所述多孔膜的内部解吸附。
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